CN114787373A - 测量通过效应子进行的细胞介导的杀伤的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供了用于评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞(例如，可以诱导性地表达报告蛋白的肿瘤细胞)群的作用的组合物、方法和试剂盒。

Description

测量通过效应子进行的细胞介导的杀伤的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年7月25日提交的美国临时专利申请第62/878,717号的优先权权益，其内容通过引用以其整体并入本文中。
技术领域
本公开提供了用于评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞(例如可以诱导性地表达报告蛋白的肿瘤细胞)的作用的组合物、方法和试剂盒。
背景技术
细胞培养物可以被用作研究疾病过程(例如癌症)和测试用于治疗疾病的潜在治疗剂的模型。单层培养的细胞可能不能充分地模拟细胞最初分离出来的体内环境。这是因为疾病的发病机制可能受到三维(3D)组织结构背景的影响，这可能涉及基质和上皮区室中不同细胞类型之间的相互作用以及与细胞外基质的相互作用(Hanahan和Weinberg，《细胞(Cell.)》144(5)646-74.2011)。在三维(例如，球状体)结构中生长的共培养细胞比在二维(2D)单层中生长的细胞更真实地代表体内生物环境，并且包括诸如细胞形态、生长动力学、基因表达和对药物的应答的因素(Burdett等人，《组织工程:B部分(Tissue Engineering：Part B)》第16卷，第3期(2010)，351-9.；Mehta等人，《控释杂志(J.Control.Release)》164(2)192-204(2012))。因此，在球状体条件下建立细胞杀伤测定可能为筛选和评估新的治疗化合物和免疫疗法候选物提供有用的工具。
一些用于测量细胞杀伤的方法涉及荧光成像。细胞的活力与荧光信号负相关。使用这些报告物在三维条件下准确地定量细胞杀伤是困难的，因为球状体不容易被成像。此外，向球状体中添加不同的细胞群(例如基质细胞)会削弱荧光信号并降低检测的灵敏度。需要新的方法以在三维培养系统中灵敏地和可再现地检测细胞杀伤剂对细胞的杀伤。
分泌的报告系统为当前的报告方法提供了一种替代方法。分泌的报告蛋白在细胞培养基中积累，并且可以用于在多个时间点监测测定。先前的一项研究将分泌型荧光素酶确定为细胞活力的灵敏和实时报告物，表明细胞活力与荧光素酶发光之间的线性关系在少至40个细胞的值中是一致的(Lupold等人，(2012)“通过β-肌动蛋白启动子和增强子对哺乳动物细胞活力和细胞毒性进行实时的基于长腹水蚤荧光素酶的非侵入性报告物测定(AReal Time Metridia Luciferase Based Non-Invasive Reporter Assay of MammalianCell Viability and Cytotoxicity via theβ-actin Promoter and Enhancer)”.PLoSONE 7(5))。然而，随着时间的推移，分泌的报告蛋白在培养基中的连续积累可能会降低灵敏度和/或影响细胞毒性测定的准确性。
发明内容
本申请提供了用于评估细胞杀伤剂的有效性的新的测定方法和系统。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸；b)允许所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关。
在根据上述任何方法的一些实施例中，接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且确定步骤在随后的评估阶段进行。
在根据上述任何方法的一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之后(例如，在诱导步骤之后约2至约48小时，或在诱导步骤之后约12至约24小时)进行。
在根据上述任何方法的一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。
在根据上述任何方法的一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，在诱导步骤之前约2至约48小时，在诱导步骤之前约4至约48小时，在诱导步骤之前约4至约24小时，或在诱导步骤之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行至少约24小时。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行约4至约48小时(例如约4至约8小时、约24至约48小时、约4至约24小时或约12至约24小时)。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行高达约6天(例如，约1、2、3、4、5或6天中的任一个)。在一些实施例中，诱导步骤进行约4至约48小时(例如，约4至约8小时、约12至约48小时、约24至约48小时、或约12至约24小时)。
在根据上述任何方法的一些实施例中，诱导步骤包括用诱导剂处理肿瘤细胞，例如选自由以下组成的组的诱导剂：四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸(cumate)或其任意组合。
在根据上述任何方法的一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，报告蛋白选自由荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和分泌型荧光蛋白或其任意组合组成的组。在一些实施例中，报告蛋白是荧光素酶，例如选自由深海虾荧光素酶(Oplophorusluciferase)、甲虫荧光素酶(beetle luciferase)、海肾荧光素酶(Renilla luciferase)、长腹水蚤荧光素酶(Metridia luciferase)、高斯荧光素酶(Gaussia luciferase)和NANOLUC荧光素酶或其任意组合组成的组的荧光素酶。
在根据上述任何方法的一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。
在根据上述任何方法的一些实施例中，肿瘤细胞存在于包含第二细胞群的混合物中，例如选自由成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞或其任意组合/变体或其任意组合组成的组的第二细胞群。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞。
在根据上述任何方法的一些实施例中，肿瘤细胞存在于3D球状体或2D单层中。
在根据上述任何方法的一些实施例中，所述细胞杀伤剂选自由以下组成的组：细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物或其任意组合。
在根据上述任何方法的一些实施例中，细胞杀伤剂是免疫细胞，例如选自由自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞(例如CTL)、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组的免疫细胞。在一些实施例中，细胞杀伤剂是NK细胞、T细胞(例如CTL)或PBMC。
在根据上述任何方法的一些实施例中，细胞杀伤剂为免疫调节剂，并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，免疫细胞选自由自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞(例如，CTL)、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。在一些实施例中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂(例如抗体)。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子。在一些实施例中，细胞杀伤剂是抑制PD-1或PD-L1的免疫检查点抑制剂(例如抗体)。
在根据上述任何方法的一些实施例中，细胞杀伤剂是抗体，例如选自由以下组成的组的抗体：抗PD-1抗体(例如，纳武单抗(nivolumab)如
Figure BDA0003561933820000031
帕博利珠单抗(pembrolizumab)、或西米普利单抗(cemiplimab))、抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)或德瓦鲁单抗(durvalumab))、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗(trastuzmab)如
Figure BDA0003561933820000041
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合。在一些实施例中，抗体是单特异性的(例如，抗PD-1抗体如纳武单抗、抗HER2抗体如曲妥珠单抗或抗PD-L1抗体如阿特珠单抗或德瓦鲁单抗)。在一些实施例中，抗体是多特异性的，例如抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。
在根据上述任何方法的一些实施例中，进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是免疫检查点抑制剂，例如抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子的免疫检查点抑制剂(例如抗体)。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抗体，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的siRNA、CRISPR/Cas、ZFN或TALEN构建体(“KO构建体”)，其例如被转导到肿瘤细胞中。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是选自由自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞(例如，CTL)、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组的免疫细胞。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂的接触与细胞杀伤剂的接触同时进行。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂的接触在细胞杀伤剂的接触之后(例如，之后约5分钟至约48小时，或之后约2小时至约24小时)，但在诱导步骤之前进行。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂的接触在细胞杀伤剂的接触之前(例如，之前约5分钟至约48小时，或之前约2小时至约24小时)进行。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂与细胞杀伤剂相同。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂(例如，抗HER2抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体)不同于细胞杀伤剂(例如NK细胞、T细胞如CTL或PBMC)。
在根据上述任何方法的一些实施例中，通过逆转录病毒或慢病毒载体系统将编码报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)的核酸引入到肿瘤细胞中。
在根据上述任何方法的一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)如GFP的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达也由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，即编码报告蛋白的核酸和编码第二报告蛋白的第二核酸都在相同的启动子控制下。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，诱导型启动子和第二诱导型启动子是相同的(例如，两者都是TetOn启动子)。在一些实施例中，诱导型启动子和第二诱导型启动子是不同的。在一些实施例中，编码第二报告蛋白的第二核酸和编码报告蛋白的核酸在相同的载体上，或者在相同的启动子控制下，或者在不同启动子的控制下。在一些实施例中，编码第二报告蛋白的第二核酸和编码报告蛋白的核酸在不同的载体上。在一些实施例中，第二报告蛋白与报告蛋白相同。
在一个方面中，本公开提供了一种包含肿瘤细胞群的组合物，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，报告蛋白选自由荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和分泌型荧光蛋白或其任意组合组成的组。在一些实施例中，报告蛋白是选自由以下组成的组的荧光素酶：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包含第二细胞群，例如选自由成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞或其任意组合/变体或其任意组合组成的组的第二细胞群。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，组合物是3D球状体或2D单层。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包含细胞杀伤剂。在一些实施例中，细胞杀伤剂选自由以下组成的组：细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物，或其任意组合。在一些实施例中，细胞杀伤剂是免疫细胞。在一些实施例中，细胞杀伤剂是免疫调节剂，并且组合物进一步包含免疫细胞。在一些实施例中，免疫细胞选自由NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。在一些实施例中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4，或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子的免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，细胞杀伤剂是抗体。在一些实施例中，抗体选自由以下组成的组：抗PD-1抗体(例如，纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000051
帕博利珠单抗、或西米普利单抗)、抗PD-L1抗体(例如，阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗)、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000052
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合。在一些实施例中，抗体是单特异性的(例如，抗PD-1抗体如纳武单抗、抗HER2抗体如曲妥珠单抗或抗PD-L1抗体如阿特珠单抗或德瓦鲁单抗)。在一些实施例中，抗体是多特异性的，例如抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包含第二细胞杀伤剂。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是免疫检查点抑制剂，例如抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子的免疫检查点抑制剂(例如抗体)。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抗体，例如抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是选自由自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞(例如，CTL)、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组的免疫细胞。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂与细胞杀伤剂相同。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂(例如，抗HER2抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体)不同于细胞杀伤剂(例如NK细胞、T细胞如CTL或PBMC)。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包含选自由以下组成的组的诱导剂：四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸或其任意组合。在一些实施例中，诱导剂是多西环素。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，所述组合物进一步包含由肿瘤细胞分泌的报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)。
在根据上述任意组合物的一些实施例中，所述组合物、每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)(例如细胞内荧光蛋白，例如GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达也由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，即编码报告蛋白的核酸和编码第二报告蛋白的第二核酸都在相同的启动子控制下。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，诱导型启动子和第二诱导型启动子是相同的(例如，两者都是TetOn启动子)。在一些实施例中，诱导型启动子和第二诱导型启动子是不同的。在一些实施例中，编码第二报告蛋白的第二核酸和编码报告蛋白的核酸在相同的载体上，或者在相同的启动子控制下，或者在不同启动子的控制下。在一些实施例中，编码第二报告蛋白的第二核酸和编码报告蛋白的核酸在不同的载体上。在一些实施例中，将两种不同的载体同时或依次地转导到肿瘤细胞中。在一些实施例中，第二报告蛋白与报告蛋白相同。在一些实施例中，第二报告蛋白(例如，GFP)不同于报告蛋白(例如，荧光素酶)。在一些实施例中，第二报告蛋白选自由荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和分泌型荧光蛋白或其任意组合组成的组。在一些实施例中，第二报告蛋白是选自由以下组成的组的荧光素酶：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。
在根据任何上述组合物的一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向肿瘤细胞的抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的siRNA、CRISPR/Cas、ZFN或TALEN构建体(“KO构建体”)的第三核酸。在一些实施例中，第三核酸的表达也由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，即编码报告蛋白的核酸和编码KO构建体的第三核酸都在相同的启动子控制下。在一些实施例中，第三核酸的表达由第三诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，诱导型启动子和第三诱导型启动子是相同的(例如，两者都是TetOn启动子)。在一些实施例中，诱导型启动子和第三诱导型启动子是不同的。在一些实施例中，编码KO构建体的第三核酸和编码报告蛋白的核酸在相同的载体上，或者在相同的启动子控制下，或者在不同启动子的控制下。在一些实施例中，编码KO构建体的第三核酸和编码报告蛋白的核酸在不同的载体上。在一些实施例中，将两种不同的载体同时或依次地转导到肿瘤细胞中。
本发明进一步提供了编码报告蛋白的分离的核酸、包含在诱导型启动子下编码报告蛋白的此类核酸的载体(例如，在相同或不同的启动子控制下，可以进一步包含在相同载体上的编码第二报告蛋白和/或KO构建体的第二核酸)、包含此类载体的肿瘤细胞、以及用于进行本文所述的任何方法的试剂盒。
附图说明
图1A-1B描绘了本发明的示例性方法。
图2描绘了用于在本发明的方法中诱导表达双重报告eGFP和snLuc的示例性分子构建体。
图3A-3B展示了当与NK92细胞共培育时，在本公开的双重报告肿瘤细胞(乳腺癌SK-BR-3)样品中检测到的荧光强度(EGFP)与样品中的活肿瘤细胞的数量之间的线性相关性。
图4A展示了在不同双重报告肿瘤细胞类型的样品中检测到的snLuciferase发光与样品中活肿瘤细胞的数量之间的线性相关性。对照样品不与诱导剂接触。图4B显示，诱导使多种双重报告肿瘤细胞中snLuciferase的表达增加约50至约850倍。
图5描绘了由示例性的细胞杀伤测定产生的双重报告SK-BR-3细胞上的NK92细胞的
Figure BDA0003561933820000071
介导的ADCC的剂量应答曲线。
图6A显示了在不同浓度的
Figure BDA0003561933820000072
抗体和固定量的NK92细胞(E:T比率为3:1)的存在下双重报告SK-BR-3肿瘤细胞中的EGFP信号。明场图片用作实验条件的对照。图6B说明基于荧光和snLuciferase强度的双重报告SK-BR-3肿瘤细胞存活与
Figure BDA0003561933820000073
抗体浓度之间的剂量依赖性关系。
图7A-7D展示了使用示例性的方法在各种癌细胞系中在各种抗体浓度和肿瘤与效应细胞比率下的效应细胞杀伤效果。
图8A-8B展示了在不同的效应子与肿瘤细胞比率(1:1或5:1)和不同浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体下在不同癌细胞系中的示例性细胞杀伤方法的连续实时监测。
图9A-9D展示了在不同浓度下，使用三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(图9A-9B)或三特异性抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体(图9C-9D)连续监测抗体介导的效应细胞(刺激的或未刺激的PBMC)对由成纤维细胞形成的三维肿瘤球状体的杀伤。
图10展示了在PBMC的存在下使用多种细胞杀伤免疫调节剂(抗PD-1抗体和三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体)监测肿瘤细胞(MDA-MB-231)杀伤的示例性方法。
图11展示了在PBMC的存在下使用多种细胞杀伤免疫调节剂(抗PD-1抗体和三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体)对示例性肿瘤细胞(MDA-MB-231)杀伤方法的连续实时监测。
图12A-12B展示了改变总反应时间可以影响由所述方法产生的剂量-应答曲线。总反应时间(抗体/肿瘤细胞/效应细胞培育、dox-诱导、snLuciferase测量)在图12A的每个图的顶部示出。
图13A-13B表明，snLuciferase和EGFP报告物的水平和与T细胞共培养的活的双重报告肿瘤细胞(LnCaP、MDA-MB-231和MDA-MB-468)相关。图13B显示了明场和EGFP图像。
图14描绘了在不同的抗体浓度和不同的报告物诱导时间下，三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体介导的双重报告MDA-MB-231细胞的PBMC杀伤。
图15A-15D描绘了双特异性抗HER2/抗CD3抗体(图15A)和三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(图15B)介导的T细胞对各种双重报告肿瘤细胞的杀伤，其与肿瘤抗原表达水平相关(图15C)。
图16A-16D描绘了不同的E:T比率对抗HER2/抗CD3抗体介导的效应细胞杀伤双重报告MDA-MB-231细胞的影响。
图17A-17C描述了当与不同浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体和不同的受刺激的相对于未受刺激的T细胞内容物共培育时，受刺激的T细胞增加了对MDA-MB-468细胞的T细胞介导的杀伤(图17B-17C)，但对MDA-MB-231细胞没有(图17A)。
图18A-18C描绘了调节PD-1/PD-L1阻断可以影响效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
图19A-19D描绘了双重报告SK-BR-3细胞上抗HER2抗体曲妥珠单抗
Figure BDA0003561933820000091
介导的NK细胞ADCC，其受dox诱导报告蛋白的时间的影响。图19A示出了通过snLuc信号测量的ADCC效应。图19B和19D示出了由EGFP信号测量的ADCC效应。
图20A-20B描绘了肿瘤抗原(HER2)表达水平影响各种双重报告肿瘤细胞上的曲妥珠单抗
Figure BDA0003561933820000092
介导的NK细胞ADCC。
图21A-21D描绘了通过未刺激的PBMC，不同的E:T比率对SK-BR-3细胞上的抗HER2抗体曲妥珠单抗介导的ADCC的影响。
图22A-22B描绘了可以在患者血清中检测到由NK92细胞在双重报告SK-BR-3细胞上的曲妥珠单抗介导的ADCC。
图23A-23D描绘了由NK92细胞在3D LnCaP球状体上的曲妥珠单抗介导的ADCC。图23A-23C描绘了EGFP信号测量。图23B-23D描绘了snLuciferase信号测量。
具体实施方式
本申请提供了使用表达报告蛋白如分泌型报告蛋白的肿瘤细胞来评估细胞杀伤剂的有效性的方法。本文所述的测定包括两个阶段：1)细胞杀伤阶段和2)评估阶段。在细胞杀伤阶段期间，使细胞杀伤剂与肿瘤细胞接触并允许发挥细胞杀伤作用。在随后的评估阶段期间，确定表达的报告蛋白的量，其与细胞杀伤剂的有效性负相关。这种方法允许我们半量化靶细胞对细胞杀伤剂的应答。
在一种示例性的方法中，肿瘤细胞包含编码与诱导型启动子可操作地连接的报告蛋白的核酸。所述方法包括两个阶段：沉默阶段和表达阶段。在沉默阶段中，肿瘤细胞已经与细胞杀伤剂接触，但尚未被诱导以表达报告蛋白。当肿瘤细胞被诱导以表达报告蛋白时，沉默阶段结束。通过确定由肿瘤细胞产生的报告蛋白的量，任选地通过与没有细胞杀伤剂的对照样品进行比较，和/或任选地通过和与细胞杀伤剂接触但没有报告蛋白诱导的对照样品进行比较，可以确定细胞杀伤的量。将沉默(细胞杀伤)阶段和表达阶段(细胞杀伤可以在表达阶段中继续发生)解耦允许广泛的应用。
具有沉默阶段的一个优点是报告蛋白的背景表达可能较少。如果报告蛋白被组成型表达，由于细胞杀伤剂而死亡的肿瘤细胞可以将报告蛋白释放到培养基中，从而产生高背景水平的报告蛋白。此外，随着时间的推移，分泌的报告蛋白在培养基中的持续积累可能会降低灵敏度和/或影响细胞毒性测定的准确性。通过具有无表达的沉默阶段，随后是表达阶段，本文的方法提供了更高的灵敏度。
此外，具有沉默阶段可以提供一种用于控制检测肿瘤杀伤的时间，优化测定条件以实现最大的细胞毒性的方法。例如，如果已知细胞杀伤需要许多天，则表达阶段可以延迟更长的时间。如果已知细胞杀伤需要几个小时，则可以在接触步骤(使肿瘤细胞和细胞杀伤剂接触)之后更快地开始表达阶段。表达阶段的时间可以根据所使用的细胞杀伤剂的类型和/或本公开的方法的实验条件而变化。
在一些情况下，肿瘤细胞包含编码与组成型启动子可操作地连接的可分泌报告蛋白的核酸。沉默阶段和表达阶段是通过移除和更换培养基来创建的。每一轮移除和更换培养基都会“重置”培养基中可分泌报告蛋白的量，并导致新的表达阶段。例如，当细胞杀伤剂与组成型地表达可分泌报告蛋白的肿瘤细胞接触时，可能会出现沉默阶段。当培养基被移除和更换时，表达阶段开始。在这个新的表达阶段，可以确定分泌的报告蛋白的量，从而确定细胞杀伤剂的有效性。
沉默阶段的时间可以根据细胞杀伤剂(例如，PBMC、NK细胞、T细胞、CAR-T细胞、治疗化合物、抗体-药物缀合物(ADC)、抗体如BiTE等)和实验条件(例如，2D或3D培养、效应子:肿瘤(E:T)细胞比率、总细胞数量、肿瘤细胞类型、肿瘤抗原表达水平等)变化。例如，在2D条件下的NK细胞杀伤很快并且通常在数小时内发生。相比之下，在3D球状体条件下的T细胞杀伤可以持续数天。在表达阶段期间，可以通过报告蛋白的表达水平来监测靶细胞活力/存活率。
当肿瘤细胞与其它类型的细胞如基质细胞(例如，成纤维细胞)混合时，本文所述的方法在3D球状体肿瘤模型中特别有用。3D球状体模拟了癌症与基质细胞之间复杂的肿瘤微环境，但由于球状体结构的复杂性和非肿瘤细胞的潜在稀释效应，细胞杀伤的检测更具挑战性。在本申请的一个实施例中，使用分泌的报告蛋白，其进一步提高了测定的灵敏度。
在如本文所述的可诱导系统下表达可分泌报告蛋白是有利的，包括但不限于：1)可以用于模拟在体内肿瘤微环境中观察到的免疫抑制(例如，PD-1/PD-L1阻断的免疫抑制效应)，并研究细胞杀伤剂的细胞毒性，例如通过敲除肿瘤细胞PD-L1表达或在肿瘤细胞上过度表达PD-L1；2)可以用于在2D和3D培养系统(例如，球状体)中和/或与其它细胞类型共培养以模拟癌症微环境中灵敏地和可再现地检测由细胞杀伤剂引起的细胞杀伤；3)可以用于在各种作用机制(例如，ADCC，非特异性免疫细胞杀伤，将效应细胞靶向肿瘤细胞的多特异性抗体)下，由各种细胞杀伤剂在各种靶细胞类型(例如，各种癌症类型)上诱导的细胞毒性，所述各种细胞杀伤剂例如不同的化合物、免疫效应细胞(如工程改造的或未工程改造的，如CTL、NK、CAR-T、PBMC等)或免疫疗法候选物(例如免疫检查点抑制剂、抗肿瘤抗原抗体、将效应细胞靶向肿瘤细胞的多特异性抗体)等；3)提供灵敏的、半定量的测定系统以研究细胞杀伤效应，例如，可以在低靶抗原表达水平下检测ADCC；4)可以用于在一段时间内实时连续监测细胞杀伤效果；5)可以在高浓度的患者血清中使用本发明对ADCC进行定量和监测，由于当前ADCC测定的低敏感性，这通常很难检测到—表明当前的系统可以用作评估潜在疫苗的效力的有用工具；6)可以用于以敏感和高通量的方式筛选新的和/或改进的化合物、工程改造的免疫效应细胞或免疫疗法候选物；7)通过控制总反应时间和当报告蛋白从肿瘤细胞表达时的时间，可以优化实验条件，并且可以选择当细胞毒性被最大化时的时间，导致高度灵敏和通用的测定；和8)可以用于检测患者对候选治疗剂的应答的患者间变化。
因此，本申请在一个方面中提供了评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸。在另一个方面中，提供了包含肿瘤细胞的组合物，所述肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其可用于进行本文所述的细胞杀伤测定。在一些实施例中，报告蛋白的表达在诱导型启动子的控制下。还提供了可用于实施本文所述的方法的试剂盒和制品。
定义
如本文所使用的，“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”通常是指一种细胞毒性形式，其中结合到存在于某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、NKT细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上的Fc受体上的分泌型免疫球蛋白(Ig)使这些细胞毒性效应细胞能够特异性地结合至携带抗原的靶细胞。效应细胞随后可以用细胞毒素杀伤靶细胞。可以测定任何特定的抗体通过ADCC介导靶细胞杀伤的能力。为了评定ADCC活性，可以将感兴趣的抗体与免疫效应细胞联合添加到靶细胞中，所述免疫效应细胞可以被抗原-抗体复合物活化，导致靶细胞的细胞溶解。
如本文所使用的，“细胞杀伤剂”通常是指直接和/或间接参与杀伤细胞的药剂。直接细胞杀伤剂可以是与肿瘤细胞直接相互作用以便诱导杀伤的那些。间接细胞杀伤剂是与肿瘤细胞间接相互作用以便诱导杀伤的那些。术语“细胞杀伤剂”包括用于细胞杀伤的直接和间接作用机制。因此，细胞杀伤剂(例如小分子、免疫效应细胞、抗体和/或免疫疗法)可以各自既是直接细胞杀伤剂又是间接细胞杀伤剂，这取决于其作用机制。例如，小分子可以通过与肿瘤细胞上的受体结合或穿过肿瘤细胞膜直接杀伤肿瘤细胞。小分子还可以通过充当另一个细胞受体上的变构调节剂来间接杀伤肿瘤细胞，这将活化免疫细胞以用于杀伤肿瘤细胞。作为另一个实例，免疫疗法可以结合至免疫细胞并活化它以用于杀伤肿瘤细胞，由此免疫疗法不直接结合至肿瘤细胞。在一些情况下，免疫疗法可以直接结合肿瘤细胞并杀伤它，例如通过补体依赖性细胞毒性(CDC)或通过抗体-药物缀合物(ADC)。在一些情况下，由于其作用机制(例如，通过BiTE形式与免疫细胞相互作用)，免疫疗法可以直接结合肿瘤细胞并间接杀伤细胞。例如，在抗体依赖性细胞毒性(ADCC)中，抗体通过肿瘤抗原结合结构域与靶肿瘤细胞结合，并且抗体Fc与免疫效应细胞(例如NK细胞、NKT细胞)上的FcR(例如CD16)结合，并将免疫效应细胞靶向肿瘤部位以用于杀伤。巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞也可以影响ADCC。在抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)中，抗体可以通过其Fc结构域与吞噬细胞上的特异性受体结合并引发吞噬作用来消除结合的靶细胞。单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突细胞可以介导ADCP。细胞杀伤剂可以指单独的任何细胞杀伤剂，并且可以指基于其作用机制杀伤细胞的细胞杀伤剂的任意组合。例如，细胞杀伤剂可以指单独的效应细胞或免疫细胞、单独的抗体、单独的小分子、或单独的免疫疗法，或者所述术语可以指效应细胞或免疫细胞与抗体、免疫疗法或药物的组合。
“抗体效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性，并且随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(如B细胞受体)的下调；和B细胞活化。“降低的或最小化的”抗体效应子功能是指从野生型或未修饰的抗体降低了至少50％(可替代地60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。抗体效应子功能的测定可由本领域普通技术人员容易地确定和测量。在一个优选的实施例中，补体结合、补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性的抗体效应子功能受到影响。在一些实施例中，效应子功能通过消除糖基化的恒定区中的突变来消除，例如，“无效应子突变”。在一些实施例中，无效应子突变是CH2区中的N297A或DANA突变(D265A+N297A)。Shields等人，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》276(9)：6591-6604(2001)。可替代地，导致降低或消除的效应子功能的额外突变包括：K322A和L234A/L235A(LALA)。可替代地，可以通过生产技术来降低或消除效应子功能，例如在不糖基化或导致改变的糖基化模式的宿主细胞(例如大肠杆菌)中的表达，所述改变的糖基化模式在促进效应子功能方面无效或不太有效(例如，Shinkawa等人，《生物化学杂志》278(5)：3466-3473(2003)。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或ADCC是指一种细胞毒性形式，其中与某些细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FCR)结合的分泌的Ig使这些细胞毒性效应细胞能够特异性地与携带抗原的靶细胞结合，并且随后用细胞毒素杀伤靶细胞。抗体“武装”细胞毒性细胞，并且是通过这种机制杀伤靶细胞所必需的。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在造血细胞上的Fc表达被总结在Ravetch和Kinet，《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》9：457-92(1991)的第464页中的表2中。为了评定感兴趣的分子的ADCC活性，可以执行体外ADCC测定，例如在美国专利第5,500,362号或第5,821,337号中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。可替代地或另外地，感兴趣的分子的ADCC活性可以在体内评定，例如在动物模型中例如在Clynes等人，《美国国家科学院院刊(PNAS USA)》，95:652-656(1998)中公开的动物模型中。
本文中的术语“Fc区”、“片段可结晶区”或“Fc结构域”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人IgG重链Fc区通常被定义为从Cys226位的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。例如，在抗体的生产或纯化期间，或通过重组工程改造编码抗体的重链的核酸，可以去除Fc区的C-末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)。因此，完整抗体的组合物可以包括去除所有K447残基的抗体群、没有去除K447残基的抗体群、以及具有含和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群。用于本文所述的抗体的合适的天然序列Fc区包括人IgG1、IgG2(IgG2A、IgG2B)、IgG3和IgG4。
术语“Fc受体”或“FcR”描述与抗体的Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体(γ受体)并包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的FcR，包括这些受体的等位基因变体和可替代地剪接形式，FcγRII受体包括FcγRIIA(一种“活化性受体”)和FcγRIIB(一种“抑制性受体”)，它们具有主要在其胞质结构域中不同的相似氨基酸序列。活化性受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制性受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见M.
Figure BDA0003561933820000131
《免疫学年度评论》15:203-234(1997).FcR在Ravetch和Kinet，《免疫学年度评论》9：457-92(1991)；Capel等人，《免疫方法(Immunomethods)》4：25-34(1994)；和de Haas等人，《实验室与临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.)》126：330-41(1995)中综述。其它FcR(包括将来识别的FcR)在本文中都被术语“FcR”涵盖。
术语“Fc受体”或“FcR”也包括新生儿受体FcRn，其负责将母体IgG转移至胎儿。Guyer等人，《免疫学杂志(J.Immunol.)》117：587(1976)和Kim等人，《免疫学杂志》24：249(1994)。测量与FcRn结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward，《今日免疫学(Immunol.Toda)》18：(12)：592-8(1997)；Ghetie等人，《自然生物技术(NatureBiotechnology)》15(7)：637-40(1997)；Hinton等人，《生物化学杂志》279(8)：6213-6(2004)；WO 2004/92219(Hinton等人)。可以在例如表达人FcRn的转基因小鼠或转染的人细胞系中，或在施用具有变体Fc区的多肽的灵长类动物中测定人FcRn高亲和力结合多肽在体内与FcRn的结合和血清半衰期。WO 2004/42072(Presta)描述了改善或减少与FcR结合的抗体变体。还参见，例如，Shields等人，《生物化学杂志》9(2)：6591-6604(2001)。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化是通过补体系统的第一组分(C1q)与抗体(适当亚类的)的结合而启动的，抗体与其同源抗原结合。为了评定补体活化，可以进行CDC测定，例如如在Gazzano-Santoro等人，《免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》202：163(1996)中描述的。具有改变的Fc区氨基酸序列和增加或减少的C1q结合能力的抗体变体描述于美国专利第6,194,551B1号和WO99/51642中。那些专利公开的内容明确地以引用的方式并入本文中。还参见Idusogie等人，《免疫学杂志》164：4178-4184(2000)。
半最大抑制浓度(IC50)是物质(如抗体)在抑制特定生物或生化功能方面的有效性的量度。它表明需要多少特定的药物或其它物质(抑制剂，例如抗体)以将给定的生物过程抑制一半。这些值通常被表示为摩尔浓度。IC50与激动剂药物或其它物质(例如抗体或细胞因子)的“EC50”相当。EC50还代表在体内获得最大效应的50％所需的血浆浓度。如本文所使用的，“IC50”用于指示在体外中和50％的抗原生物活性所需的抗体的有效浓度。IC50或EC50可以通过生物测定来测量，例如通过FACS分析(竞争结合测定)、基于细胞的细胞因子释放测定或扩增发光邻近均相测定(AlphaLISA)抑制配体结合。
如本文所使用的，以单数或复数形式使用的“肿瘤细胞”通常是指已经经历恶性转化的细胞，所述恶性转化使细胞对宿主生物体来说是病理性的。通过诸如组织学检查的技术，可以很容易地将原发性癌症细胞与非癌性细胞区分开来。肿瘤细胞可以是指原发性癌症细胞，和源自肿瘤细胞祖先的任何细胞，包括转移的肿瘤细胞，以及源自肿瘤细胞的体外培养物和细胞系。
术语“抗体”或“抗体部分”以最广泛的意义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、全长抗体及其抗原结合片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性。抗体可以是嵌合的、人源化的、人抗体或非人来源的抗体(例如，小鼠Ab)。
碱性的4链抗体单元是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个碱性异四聚体单元和被称为J链的附加多肽组成，并且包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2-5个碱性4链单元，它们可以聚合以形成与J链结合的多价组装体(assemblages)。在IgG的情况下，4链单元通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键被连接到H链，而两条H链通过一个或多个二硫键相互连接，这取决于H链同种型。每个H和L链还具有规则间隔的链内二硫键。每条H链在N末端都具有可变结构域(VH)，随后是用于每个α和γ链的三个恒定结构域(CH)和用于μ和ε同种型的四个CH结构域。每条L链在N末端都具有可变结构域(VL)，随后在其另一端处具有恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。来自任何脊椎动物物种的L链可以根据其恒定结构域的氨基酸序列被分配到两种不同类型(被称为κ和λ)中的一种。根据其重链(CH)的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分为不同的类别或同种型。存在五类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，具有分别被命名为α、δ、ε、γ和μ的重链。根据CH序列和功能的相对较小的差异，γ和α类被进一步分为子类，例如人类表达以下子类:IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
“抗体片段”或“抗原结合片段”包含完整抗体的一部分，优选地完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；双抗体(diabodies)；线性抗体(参见美国专利号5,641,870，实例2；Zapata等人，《蛋白质工程(Protein Eng.)》8(10)：1057-1062(1995))；单链抗体(scFv)分子；单结构域抗体(如VHH)和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体的木瓜蛋白酶消化产生了两个相同的抗原结合片段，被称为“Fab”片段和残留的“Fc”片段，所述名称反映了易于结晶的能力。Fab片段由完整的L链以及H链的可变结构域(VH)和重链的第一个恒定结构域(CH1)组成。就抗原结合而言，每个Fab片段是单价的，即它具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大F(ab′)2片段，所述片段大致对应于两个具有不同抗原结合活性的二硫键连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于，在CH1结构域的羧基末端处具有一些额外的残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab′-SH在本文中是Fab′的名称，其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab'片段对的形式产生的，在它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学缀合也是已知的。
如本文所使用的，术语“特异性地结合”、“特异性地识别”或“特异于”是指可测量的和可再现的相互作用，例如靶与抗原结合蛋白之间的结合，其决定了在包括生物分子的异质分子群的存在下靶的存在。例如，特异性地结合靶的抗原结合蛋白是以比它结合其它靶更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合所述靶的抗原结合蛋白。在一些实施例中，抗原结合蛋白与不相关靶的结合程度小于抗原结合蛋白与靶结合的约10％，如通过例如放射免疫测定(RIA)测量的。在一些实施例中，特异性地结合靶的抗原结合蛋白具有≤10-5M、≤10-6M、≤10-7M、≤10-8M、≤10-9M、≤10-10M、≤10-11M或≤10-12M的解离常数(KD)。在一些实施例中，抗原结合蛋白特异性地结合在来自不同物种的蛋白质中保守的蛋白质上的表位。在一些实施例中，特异性结合可以包括但不需要排他性结合。抗体或抗原结合结构域的结合特异性可以通过本领域中已知的方法通过实验确定。此类方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA测试、RIA测试、ECL测试、IRMA测试、EIA测试、BIACORETM测试和肽扫描。
术语“特异性”是指抗原结合蛋白对抗原的特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。如本文所使用的，术语“多特异性”表示抗原结合蛋白具有多表位特异性(即，能够特异性地结合至一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位，或者能够特异性结合至两个、三个或更多个不同的生物分子上的表位)。如本文所使用的，“双特异性”表示抗原结合蛋白具有两种不同的抗原结合特异性。除非另有说明，否则其中列出被双特异性抗体结合的抗原的顺序是任意的。即，例如，术语“抗-CD3/HER2”、“抗-HER2/CD3”、“CD3×HER2”和“HER2×CD3”可以可互换使用，以指代特异性地结合至CD3和HER2的双特异性抗体。如本文所使用的，术语“单特异性”表示具有一个或多个结合位点的抗原结合蛋白，每个结合位点结合相同抗原的相同表位。
如本文所使用的，术语“价”表示在抗原结合蛋白中存在指定数量的结合位点。例如天然抗体或全长抗体具有两个结合位点并且是二价的。因此，术语“三价”、“四价”、“五价”和“六价”分别表示在抗原结合蛋白中存在两个结合位点、三个结合位点、四个结合位点、五个结合位点和六个结合位点。
本文所述的编码构建体、抗体或其抗原结合片段的“分离的”核酸分子是被鉴定并与至少一种污染物核酸分子分离的核酸分子，所述污染物核酸分子在其产生的环境中通常与其缔合。优选地，分离的核酸不与与生产环境相关的所有组分缔合。编码本文所述多肽的分离的核酸分子的形式不同于其在自然界中发现的形式或环境。因此，分离的核酸分子不同于编码天然存在于细胞中的本文所述的多肽和抗体的核酸。分离的核酸包括包含在细胞中的核酸分子，所述细胞通常包含所述核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置。
如本文所使用的，术语“载体”通常是指能够增殖与其连接的另一种核酸的核酸分子。所述术语可以包括作为自我复制的核酸结构的载体以及掺入到其已被导入的肿瘤细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。
如本文所使用的，术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源性核酸转移或引入到肿瘤细胞中的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已经被引入外源性核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化细胞和由其衍生的后代，而与传代次数无关。后代在核酸含量方面可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括具有与在原始转化细胞中筛选或选择的相同功能或生物活性的突变后代。
除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个指示物。
应理解，本文所描述的本发明的实施例包括“由…组成”和/或“主要由…组成”的实施例。
本文中提及“约”一个值或参数包括(并且描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包含对“X”的描述。
本文使用的术语“约X-Y”与“约X至约Y”具有相同的含义。
如本文所使用的，提及“不是”一个值或参数大体上意指和描述“不是”一个值或参数。例如，所述方法不用于治疗X类型的癌症意味着所述方法用于治疗除了X以外的类型的癌症。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请均被明确且单独地指示通过引用并入一样。
如本领域技术人员在阅读本公开内容后将明显的，本文描述和图示的每个单独的实施例具有离散的组分和特征，这些组分和特征可以容易地与其它几个实施例中任一个的特征分离或组合，而不脱离本公开的方法、组合物和试剂盒的范围或精神。任何列举的方法都可以按照列举的事件的顺序或者逻辑上可能的任何其它顺序来执行。
本申请的方法
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体例如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，GFP或荧光素酶)的核酸；允许所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关。在一些实施例中，接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，接触步骤在检测之前进行至少约24小时。在一些实施例中，接触步骤在检测之前进行约4至约48小时(例如约24至约48小时)。在一些实施例中，接触步骤进行高达约6天(例如，约1、2、3、4、5或6天中的任一个)。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，GFP或荧光素酶)的第二核酸。
在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体例如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，GFP或荧光素酶)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体例如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，GFP或荧光素酶)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行至少约24小时。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行约4至约48小时(例如，约24至约48小时)。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行高达约6天(例如，约1、2、3、4、5或6天中的任一个)。在一些实施例中，诱导步骤进行约4至约48小时(例如，约4至约8小时，或约24至约48小时)。在一些实施例中，诱导步骤包括用诱导剂(例如，四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸或其任意组合)处理肿瘤细胞。在一些实施例中，报告蛋白选自由荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和分泌型荧光蛋白或其任意组合组成的组。在一些实施例中，荧光素酶选自由深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶和NANOLUC荧光素酶或其任意组合组成的组。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于包含第二细胞群(例如，成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源抑制细胞或其任意组合/变体或其任意组合)的混合物中。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于3D球状体或2D单层中。在一些实施例中，细胞杀伤剂选自由细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物或其任意组合组成的组。在一些实施例中，细胞杀伤剂是免疫细胞。在一些实施例中，细胞杀伤剂是免疫调节剂，并且其中接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，免疫细胞选自由自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。在一些实施例中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂(例如，抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA、CTLA-4或其任意组合)。在一些实施例中，细胞杀伤剂是抗体(例如，PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合)。在一些实施例中，抗体是多特异性的(例如，抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体)。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂(例如抗体)抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的siRNA或CRISPR/Cas构建体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂的接触与细胞杀伤剂的接触同时进行。在一些实施例中，编码报告蛋白的核酸通过逆转录病毒或慢病毒载体系统被引入到肿瘤细胞中。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同的诱导型启动子控制。
在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，其中接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。
在一些实施例中，诱导步骤可以与接触步骤同时进行。由于诱导后蛋白质表达的延迟，报告蛋白可以在随后的评估步骤期间被准确确定。因此，在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，其中接触步骤与诱导步骤同时进行；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。
在一个方面，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中所述细胞杀伤剂包含细胞毒素、药物、小分子和/或小分子化合物，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制；b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)，其中每个肿瘤细胞包括编码报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的量，其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。
在一个方面，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包含免疫细胞和抗体，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生报告蛋白，和c)确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗，例如
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)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000232
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体特异性地识别免疫细胞和肿瘤细胞。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括抗体，其中每个肿瘤细胞包括编码报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)的核酸，其中核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的量，其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000241
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000242
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体特异性地识别免疫细胞和肿瘤细胞。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中细胞杀伤剂包括细胞毒素、药物、小分子和/或小分子化合物，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括细胞毒素、药物、小分子和/或小分子化合物，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是相同或不同的。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸在相同的载体或不同的载体上。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中细胞杀伤剂包括细胞毒素、药物、小分子和/或小分子化合物，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括细胞毒素、药物、小分子和/或小分子化合物，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如，TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，第一报告蛋白是可分泌的荧光素酶并且第二报告蛋白是细胞内的GFP。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。因此，在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中细胞杀伤剂包含细胞毒素、药物、小分子和/或小分子化合物，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如，TetOn)-编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是免疫细胞，例如NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抗体并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗，例如
Figure BDA0003561933820000261
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000262
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体特异性地识别免疫细胞和肿瘤细胞。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是相同或不同的。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸在相同的载体或不同的载体上。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核，)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如，TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，第一报告蛋白是可分泌的荧光素酶并且第二报告蛋白是细胞内的GFP。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。因此，在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中细胞杀伤剂包含免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如，TetOn)-编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是免疫调节抗体并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000281
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000282
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述细胞杀伤剂包括抗体，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括抗体，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如TetOn)可操作连接的第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是相同或不同的。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸在相同的载体或不同的载体上。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中细胞杀伤剂包括抗体，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括抗体，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如TetOn)-编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000291
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000301
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体特异性地识别免疫细胞和肿瘤细胞。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，第一报告蛋白是可分泌的荧光素酶并且第二报告蛋白是细胞内的GFP。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。因此，在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中所述细胞杀伤剂包含抗体，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包含：诱导型启动子(例如，TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第三细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第三细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。在一些实施例中，第三细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述细胞杀伤剂包括免疫细胞和抗体，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞和抗体，其中每个肿瘤细胞包括编码与第一诱导型启动子(例如TetOn)可操作地连接的第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸，和编码与第二诱导型启动子(例如，TetOn)可操作地连接的第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，第一诱导型启动子和第二诱导型启动子是相同或不同的。在一些实施例中，第一核酸和第二核酸在相同的载体或不同的载体上。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞和抗体，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包括免疫细胞和抗体，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包括：诱导型启动子(例如TetOn)-编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如，IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如，GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗，例如
Figure BDA0003561933820000311
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000321
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体特异性地识别免疫细胞和肿瘤细胞。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，第一报告蛋白是可分泌的荧光素酶并且第二报告蛋白是细胞内的GFP。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。因此，在一些实施例中，提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中所述细胞杀伤剂包含免疫细胞和抗体，其中每个肿瘤细胞从上游到下游包含:诱导型启动子(例如，TetOn)-编码第一报告蛋白(例如荧光素酶)的第一核酸-连接序列(例如IRES或编码自切割2A肽如P2A的核酸)-编码第二报告蛋白(例如GFP)的第二核酸，b)诱导两种核酸的表达以产生两种报告蛋白，和c)确定两种报告蛋白的量，其中每种报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合))对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中细胞杀伤剂包含抗体，其中所述接触在免疫细胞的存在下进行，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述核酸的表达受由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的量，其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000331
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000332
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体，或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体特异性地识别免疫细胞和肿瘤细胞。在一些实施例中，抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。在一些实施例中，报告蛋白由肿瘤细胞分泌。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第三细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第三细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。在一些实施例中，第三细胞杀伤剂是特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体(例如，BiTE)。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的核酸，其中所述报告蛋白由肿瘤细胞分泌，并且其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的量，其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些实施例中，报告蛋白选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述肿瘤细胞存在于3D球状体中，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述报告蛋白是由肿瘤细胞分泌的可分泌蛋白(例如荧光素酶)，并且其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的量，其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，肿瘤细胞存在于具有第二细胞群的3D球状体中。在一些实施例中，第二细胞群是成纤维细胞或基质细胞。在一些实施例中，报告蛋白选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。在一些实施例中，细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)。在一些实施例中，细胞杀伤剂包含抗体(例如，抗肿瘤抗原)。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂，或特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体)并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述报告蛋白是由肿瘤细胞分泌的可分泌报告蛋白(例如荧光素酶)，并且其中所述核酸的表达由诱导型启动子(例如，TetOn)控制，b)诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的量，其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL或PBMC)。在一些实施例中，细胞杀伤剂包含抗体(例如，抗肿瘤抗原)。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂，或特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体)并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测报告蛋白。在一些实施例中，报告蛋白选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)的第二核酸。在一些实施例中，第二核酸的表达由第二诱导型启动子(例如，TetOn)控制。在一些实施例中，第二核酸的表达由相同载体中的相同诱导型启动子控制。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中所述肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述报告蛋白是由肿瘤细胞分泌的可分泌蛋白(例如荧光素酶)，其中所述肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白的第二核酸，其中所述第二报告蛋白是细胞内报告蛋白(如GFP)，并且其中所述两种核酸的表达由诱导型启动子(如TetOn)控制，b)诱导两种核酸的表达以产生所述报告蛋白，和c)确定所述报告蛋白的每种量，其中所述报告蛋白的每种量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关，其中所述接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中所述确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，细胞杀伤剂包括免疫细胞(例如NK、CTL、PBMC)。在一些实施例中，细胞杀伤剂包含抗体(例如，抗肿瘤抗原)。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂(例如，免疫检查点抑制剂，或特异性地靶向肿瘤细胞和免疫细胞的抗体)并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测每种报告蛋白。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。在一些实施例中，第二报告蛋白是GFP。在一些实施例中，编码第一报告蛋白和第二报告蛋白的核酸在相同的载体上，两者都在相同的诱导型启动子控制下。在一些实施例中，编码第一报告蛋白和第二报告蛋白的核酸通过IRES或自切割2A肽例如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A连接。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第二细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。
在一个方面中，本公开提供了一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a)使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中肿瘤细胞存在于具有包含成纤维细胞或基质细胞的第二细胞群的3D球状体中，其中细胞杀伤剂包含免疫细胞(例如NK、CTL、PBMC)和抗体，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述报告蛋白是由肿瘤细胞分泌的可分泌蛋白(例如荧光素酶)，其中所述肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白的第二核酸，其中所述第二报告蛋白是细胞内报告蛋白(例如GFP)，并且其中两种核酸的表达由诱导型启动子控制，b)诱导两种核酸的表达以产生报告蛋白，和c)确定每种量的报告蛋白，其中每种量的报告蛋白与细胞杀伤剂的有效性负相关，其中接触步骤在细胞杀伤阶段进行，并且其中确定步骤在随后的评估阶段进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前(例如，之前约4至约48小时，或之前约24至约48小时)进行。在一些实施例中，接触步骤与诱导步骤同时进行。在一些实施例中，免疫细胞是NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和/或PBMC细胞。在一些实施例中，抗体是免疫调节剂并且接触步骤在免疫细胞的存在下进行。在一些实施例中，抗体是免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，免疫检查点抑制剂(例如，Ab)抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4。在一些实施例中，抗体选自由抗PD-1抗体(例如，纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000371
)、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体(例如，曲妥珠单抗如
Figure BDA0003561933820000372
)、抗CD20抗体和抗CD3抗体，或其任意组合组成的组。在一些实施例中，抗体是多特异性的(例如，抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体)。在一些实施例中，确定步骤包括在不同的时间点检测每种报告蛋白。在一些实施例中，第一报告蛋白和/或第二报告蛋白选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。在一些实施例中，第二报告蛋白是GFP。在一些实施例中，编码第一报告蛋白和第二报告蛋白的核酸在相同的载体上，两者都在相同的诱导型启动子控制下。在一些实施例中，编码第一报告蛋白和第二报告蛋白的核酸通过IRES或自切割2A肽例如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV 2A连接。在一些实施例中，每个肿瘤细胞进一步包含编码靶向抑制性检查点分子(例如，PD-L1)的CRISPR/Cas的第三核酸。在一些实施例中，所述方法进一步包括使肿瘤细胞与第三细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)接触。在一些实施例中，第三细胞杀伤剂是抑制PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和/或CTLA-4的免疫检查点抑制剂(例如抗体)，例如抗PD-1抗体。
图1A描绘了本公开的方法的示例性实施例。在一些实施例中，肿瘤细胞110可以在培养基105中培养。在一些实施例中，肿瘤细胞110可以在三维球状体中生长。在一些实施例中，肿瘤细胞110可以在具有第二细胞群111的球状体中生长。在一些实施例中，第二细胞群111可以是肿瘤微环境促进细胞，例如成纤维细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞110可以包含编码报告蛋白的核酸，其可操作地连接至诱导型启动子。在一些实施例中，报告蛋白可以是可分泌的。因为报告蛋白可以是可分泌的，所以用第二细胞群111培养肿瘤细胞不会稀释报告蛋白信号(即，在培养基中检测报告蛋白)。这可以允许肿瘤细胞在具有任何附加和/或支持细胞类型的生物学相关三维条件下生长，而不会降低检测细胞杀伤剂对肿瘤细胞的细胞介导的杀伤的能力。
在一些实施例中，肿瘤细胞110可以通过步骤115与细胞杀伤剂120接触。细胞杀伤剂120可以直接或间接地杀伤肿瘤细胞110。使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触开始沉默阶段时间段121。在与细胞杀伤剂培育一定量的时间后，或在添加细胞杀伤剂的同时，可以如步骤125中那样诱导肿瘤细胞内编码可分泌报告蛋白的核酸(例如，使用诱导剂)。诱导导致可分泌报告蛋白130表达和分泌到肿瘤细胞110在其中生长的培养基105中。诱导开始表达阶段126。在一些实施例中，对照样品不包含细胞杀伤剂。在对照样品中，肿瘤细胞110在培养基105中培养。在与细胞杀伤剂培育一定量的时间后，或在添加细胞杀伤剂的同时，可以如步骤125中那样诱导肿瘤细胞内编码可分泌报告蛋白的核酸(例如，使用诱导剂)。诱导导致可分泌报告蛋白130表达和分泌到肿瘤细胞110在其中生长的培养基中。通过比较具有细胞杀伤剂的样品与没有细胞杀伤剂的对照样品之间产生的报告蛋白的量，可以确定通过细胞杀伤剂对细胞杀伤的量。在所述方法中发生的细胞杀伤越多(例如，由于细胞杀伤剂)，在培养基中检测到的分泌型报告蛋白的量就越低。在所述方法中发生的细胞杀伤越少，在培养基中检测到的分泌型报告蛋白的量就越高。换言之，报告蛋白的量与细胞杀伤剂在杀伤肿瘤细胞方面的有效性负相关。
图1B描绘了本公开的方法的另一个示例性实施例。可使包含编码可分泌的报告蛋白的核酸(其可操作地连接至诱导型启动子)的肿瘤细胞与细胞杀伤剂如抗体和可以用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的效应细胞(例如T细胞如细胞毒性T细胞)接触。抗体可以是免疫调节剂。在此时间期间(即沉默阶段)可以发生通过细胞杀伤剂的细胞杀伤。在与细胞杀伤剂培育一定量的时间后，或在加入细胞杀伤剂(例如抗体)的同时，诱导可分泌报告蛋白的表达(例如使用多西环素)。诱导导致可分泌报告蛋白表达和分泌到肿瘤细胞在其中生长的培养基中(即表达阶段)。在一些实施例中，对照样品不包含细胞杀伤剂(例如抗体)。在一些实施例中，在对照样品中，肿瘤细胞在具有效应细胞(例如，T细胞，例如细胞毒性T细胞)的培养基中培养。在一些实施例中，对照样品不包含效应细胞。在与细胞杀伤剂培育一定量的时间后，或在加入细胞杀伤剂的同时，可以诱导肿瘤细胞内编码可分泌报告蛋白的核酸(例如，使用多西环素)。诱导导致可分泌报告蛋白表达和分泌到肿瘤细胞在其中生长的培养基中。通过比较在具有抗体的样品和没有抗体的对照样品之间，或在具有效应细胞的样品和没有效应细胞的对照样品之间产生的报告蛋白的量，可以确定由抗体介导的效应细胞杀伤的量。在所述方法中发生的细胞杀伤越多(例如，由于抗体介导的效应细胞杀伤)，在培养基中可以检测到的分泌型报告蛋白的量就越低。在所述方法中发生的细胞杀伤越少，在培养基中可检测到的分泌型报告蛋白的量就越高。换句话说，报告蛋白的量与ADCC的有效性负相关。
细胞培养方法
本公开提供了用于评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的作用的方法。肿瘤细胞可以根据需要在标准组织培养皿(例如多培养皿和微孔板)中，或在其它容器中培养。本公开的方法可以在96孔板、386孔板或其它多孔板、微流体装置、毛细管等中进行。
用于测定的肿瘤细胞可以在二维单层、三维球状体中或在任何三维结构中培养。肿瘤细胞可以在三维支撑物上生长以生成肿瘤球状体。可使用诸如悬滴、在非粘附表面上培养细胞、旋转烧瓶、NASA旋转细胞培养系统、具有多孔膜的多层微流体装置、包括凹形微孔和平面细胞培养室的微流体阵列的方法来产生肿瘤球状体。
在一些实施例中，肿瘤球状体是通过在超低附着板(例如，来自Corning)中培养产生的。在一些实施例中，肿瘤球状体是通过在超低附着板中培养具有等数量的真皮人成纤维细胞的肿瘤细胞产生的。板可以在振荡器中以200rpm培育1至6天。在一些情况下，板可以在振荡器中以200rpm培育四天。
肿瘤球状体可以通过例如以下方式产生:(1)器官型外植体培养，其中收获整个器官或器官元件或切片并在培养基中的底物上生长；(2)固定或旋转微载体培养物，其中解离的细胞聚集在具有粘附性质的多孔圆形或圆柱形底物周围；(3)微团培养(micromasscultures)，其中细胞被造粒并悬浮在含有适量的营养物和分化因子的培养基中；(4)在旋转容器中的游离细胞，其彼此粘附并最终形成组织或器官样结构(所谓的旋转壁容器或微重力生物反应器)；和(5)基于凝胶的技术，其中细胞被包埋在底物如琼脂糖或基质凝胶中，所述底物可以含有或可以不含有模拟ECM的胶原或其它有机或合成纤维的支架。肿瘤球状体可以在有或没有非肿瘤细胞的情况下培养至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少6天、至少1周或至少2周。
可以使包含在诱导型启动子的控制下编码报告蛋白的核酸的肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，例如通过培育、共培养、共转导(例如，针对PD-L1 KO的KO构建体的共转导)、扩散、渗透等。这开始了沉默阶段。在沉默阶段期间，可能会发生细胞杀伤。
细胞杀伤剂可以用于诱导抗体依赖性效应细胞介导的针对肿瘤细胞的细胞毒性(ADCC)。为此，可以在生理学上可接受的溶液(例如培养基、细胞培养溶液、缓冲液)中自由施用细胞杀伤剂。在细胞杀伤剂直接起作用的情况下，它们可以被直接施用于肿瘤细胞。在细胞杀伤剂间接起作用的情况下，它们可以在接触肿瘤细胞之前首先被混合在一起，或者它们可以顺序或同时被添加到肿瘤细胞培养物中。例如，可以首先混合效应细胞(例如NK细胞、CTL或PBMC)和免疫治疗剂(或使用任何其它产生活化效应子的方法)，从而形成活化的效应细胞。然后使活化的效应细胞与肿瘤细胞培养物接触，并且活化的效应细胞可以通过免疫疗法杀伤肿瘤细胞。在另一个实例中，效应细胞和免疫疗法可以分别同时或依次被添加到肿瘤细胞培养物中。
可以将细胞杀伤剂添加到肿瘤细胞以任何浓度在其中生长的培养基中。例如，细胞杀伤剂可以以在约0ng/mL至约3000ng/mL，例如约0ng/mL至约2000ng/mL、约0ng/mL至约1000ng/mL、约0ng/mL至约500ng/mL、约0ng/mL至约200ng/mL、或约0ng/mL至约100ng/mL中任一个的范围内的浓度被添加。例如，细胞杀伤剂可以以在0.0128ng/mL至40ng/mL的范围内的浓度被添加。在一些实施例中，细胞杀伤剂可以以至少0.001、0.01、0.1、1、10或100ng/mL的浓度被添加。在一些实施例中，细胞杀伤剂可以以最多0.001、0.01、0.1、1、10或100ng/mL的浓度被添加。在一些实施例中，细胞杀伤剂可以以连续稀释加入，例如2倍或5倍连续稀释。
肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段的培育可以进行至少约30分钟、1、2、3、4、5、6、12、24、36、48、54、60、66或72小时或更长时间中的任一个。肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段的培育可以进行最多约30分钟、1、2、3、4、5、6、12、24、36、48、54、60、66或72小时中的任一个。肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段的培育可以进行至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天或更多天中的任一个。肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段的培育可以进行最多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天中的任一个。在一些实施例中，肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段期间被培育至少约24小时。在一些实施例中，肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段期间被培育约4至约48小时，例如约4至约8小时、约12至约48小时、约24至约48小时、约4至约24小时或约12至约24小时中的任一个。在一些实施例中，肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段期间被培育高达约6天(例如，约1、2、3、4、5或6天中的任一个)。在一些情况下，肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段期间被培育约24小时。在一些情况下，肿瘤细胞和细胞杀伤剂在沉默阶段期间被培育约48小时。
诱导方法
当诱导样品以开始表达报告蛋白时，沉默阶段可以结束。在一些实施例中，可以通过向包含肿瘤细胞的样品中添加诱导剂(例如分子、光或热)来进行诱导。诱导可以进行至少约30分钟、1、2、3、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或72小时或更长时间中的任一个。诱导可以进行最多约30分钟、1、2、3、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或72小时中的任何一个。在一些实施例中，诱导步骤进行约4至约48小时，例如约4至约8小时、约12至约48小时、约24至约48小时或约12至约24小时。在一些情况下，诱导进行约24小时。
诱导可以在使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触的步骤之后进行，或者它可以与使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触的步骤同时进行。即使诱导与接触步骤同时进行，由于诱导中涉及的转录和翻译的时间延迟，仍可能存在沉默阶段(例如，约4小时的沉默阶段)。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前，例如在诱导步骤之前至少约30分钟、1、2、3、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或72小时或更长时间中的任一个进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前约4至约48小时，例如在诱导步骤之前约4至约8小时、约24至约48小时、约4至约24小时或约12至约24小时进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行至少约24小时。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行约24至约48小时。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之前进行高达约6天(例如，约1、2、3、4、5或6天中的任一个)。
在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之后，例如在诱导步骤后至少约30分钟、1、2、3、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44，或48小时或更长时间中的任一个进行。在一些实施例中，接触步骤在诱导步骤之后约2至约48小时(例如，约12至约24小时)进行。
诱导的时间(即，确定沉默阶段的长度)可能取决于不同的因素，例如细胞杀伤剂杀伤细胞所需的时间、细胞培养条件的类型(例如单层细胞相对于球状体)，效应细胞与肿瘤细胞的比率，细胞杀伤剂的作用机制，以及肿瘤细胞的总数。例如，与例如未刺激的PBMC相比，使用NK细胞的细胞介导的杀伤可能发生得相对较快，因此等待更长的诱导时间可能会导致更多的非特异性细胞杀伤。作为另一个实例，未刺激的PBMC在诱导之前可能具有较长的沉默阶段，因为活化未刺激的T细胞可能需要一些滞后时间。在另一个实例中，在球状体条件下细胞介导的杀伤在诱导前可能具有比单层更长的沉默阶段。在另一个实例中，用更多的效应细胞进行的细胞介导的杀伤可能在诱导前具有更短的沉默阶段。在另一个实例中，不同的抗体可以具有不同的作用机制(例如，一些使用ADCC，一些通过其CD3结合位点活化T细胞)。在一些情况下，在本公开的方法中使用更多的肿瘤细胞可能意味着在诱导之前需要更长的沉默阶段。
在一些情况下，肿瘤细胞可以同时与细胞杀伤剂和诱导剂接触。这可能会导致约4小时的沉默阶段，其中可能发生细胞杀伤，但报告蛋白尚未表达(由于诱导时间滞后)。在一些情况下，肿瘤细胞可以依次与细胞杀伤剂和诱导剂接触。当在诱导剂之前使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触时，细胞杀伤剂可以在将诱导剂加入到肿瘤细胞中之前与肿瘤细胞接触至少约30分钟、1、2、3、4、8、12、16、20、24或48小时或更长时间中的任一个。在将诱导剂加入到肿瘤细胞中之前，细胞杀伤剂可以与肿瘤细胞接触至少约1、2、3、4、5、6、7或8天或更长时间中的任一个。
报告蛋白的表达的诱导可以导致报告蛋白的表达增加至少约2倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、24倍、60倍、80倍、100倍、120倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍或900倍或更多中的任一个。
在编码报告蛋白的核酸已经被诱导(即开始表达阶段)之后，产生报告蛋白。报告蛋白可以是可分泌的。可分泌的报告蛋白可以被分泌到细胞外并被分泌到细胞在其中生长的培养基和/或生物溶液中。可分泌的报告蛋白可以通过细胞的正常分泌途径(即包括粗面内质网、高尔基体和囊泡)分泌。
确定报告蛋白的量的方法
本公开提供了确定从肿瘤细胞产生的报告蛋白(分泌的或非分泌的)的量的方法。确定报告蛋白的量的步骤可以包括检测报告蛋白的存在或不存在。可以通过任何合适的方法来检测报告蛋白的存在或不存在。用于检测报告蛋白的示例性方法可以包括但不限于检测报告蛋白的荧光、检测报告蛋白的发光、检测报告蛋白的RLU、使用微孔板读取器(即，GloMax Discover微孔板读取器)检测蛋白、使用蛋白质印迹检测、使用质谱、ELISA、FISH、PCR等检测。
可以通过任何合适的方法来检测荧光素酶。存在用于检测荧光素酶的商业方法(例如，Pierce(TM)荧火虫荧光素酶发光检测试剂盒(Firefly Luciferase Glow AssayKit)、Sigma-Aldrich(R)荧光素酶报告基因检测试剂盒(Luciferase Reporter GeneDetection Kit))。检测荧光素酶的机制包括通过荧光素酶的生物发光释放光。所述机制涉及在三磷酸腺苷(ATP)和氧气的存在下氧化底物，即荧光素，以产生一磷酸腺苷(AMP)、焦磷酸盐和二氧化碳。
报告蛋白的检测可以包括添加试剂以允许测量报告蛋白的酶活性。示例性的试剂可以包括但不限于自由基清除剂，例如二硫苏糖醇(DTT)、胞苷核苷酸、AMP、焦磷酸盐、辅酶A、螯合剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去污剂如
Figure BDA0003561933820000431
N-101(壬基苯氧基聚乙氧基乙醇)、缓冲剂如HEPES、N-[2-羟乙基]哌嗪-N1-[2-乙磺酸]和蛋白酶抑制剂如苯乙酸(PAA)和草酸(OA)。
如由本公开的方法和组合物所公开的报道蛋白(即，荧光素酶)催化的光子发射可以被检测超过至少约5、10、20、30、40、50或60分钟或更长时间中的任一个。报告蛋白可以被检测超过至少约4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、72、96、120或144小时或更长的时间中的任一个。
确定可分泌报告蛋白的量可以包括通过在不同的时间点对细胞生长的培养基进行取样来检测可分泌报告蛋白，以便实时连续地监测报告蛋白产物(即，随后的细胞杀伤)。可在诱导开始后约5、10、20、30、40、50和/或60分钟或更长时间中的任一个获取并分析培养基样品。可以在诱导开始后约2、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、72和/或96小时或更长时间中的任一个获取并分析培养基样品。可以在诱导开始后1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更长时间获取并分析培养基样品。在一些情况下，在诱导后4小时获取并分析样品。在一些情况下，在诱导后8小时获取样品。在一些情况下，在诱导后12小时获取样品。在一些情况下，在诱导后24小时获取样品。任何采样时间点都可以与任何其它采样时间点进行比较。如果在给定时间点分泌的荧光素酶的水平与较早的时间点相比被降低，则可能表明细胞杀伤剂对细胞的杀伤增加。
随着时间的推移，可以获取多个样品。可以每隔约1、5、10、20、30、40、50或60分钟或更长时间获取样品。可以每隔约1、2、4、8、12、16、20、24天或更长时间获取样品。可以每隔约1、2、4、8、12、16、20、24、48小时或更长时间获取样品。可以每隔约1、2、3、4、5、6、7天或更长时间获取样品。在一些情况下，使用GFP作为细胞内标记物，可能不需要从培养基或培养系统中获取样品，以便对报告蛋白进行实时监测。
可以用任何合适的方法检测不可分泌的报告蛋白。用于检测不可分泌的报道蛋白的示例性方法包括但不限于荧光成像、蛋白质印迹、质谱和荧光活化细胞分选、免疫细胞化学(针对标记蛋白的抗体)、基因阵列和PCR(针对干细胞特征的mRNA测试)等。检测可以在不裂解细胞的情况下进行。
在一些实施例中，可以使用多种检测方法来检测报告蛋白。例如，如果细胞包含多于一种类型的报告蛋白(例如，可分泌的报告物，例如荧光素酶，和细胞内的报告蛋白，例如荧光蛋白)，则可以用适合于每种类型的报告蛋白的不同检测方法来检测不同的报告蛋白。例如，可以对细胞进行成像(例如，使用Nikon Ellipse TE2000-U显微镜)以检测细胞内GFP，并且可以获取培养基样品以检测分泌的荧光素酶(例如，使用GloMax Discover微孔板读取器)。
确定报告蛋白的量可以包括将检测到的报告蛋白的量与细胞存活或细胞死亡的量相关联。例如，报告蛋白可以与在本公开的方法的沉默阶段期间(即，通过一种或多种细胞杀伤剂)发生的细胞杀伤的量相关。报告蛋白的量可能与细胞杀伤剂的有效性负相关。换言之，检测到的报告蛋白越多，细胞分泌的报告蛋白就越多，因此发生的细胞杀伤就越少。在一些情况下，报告物的量与样品中活细胞(即那些未被杀伤的细胞)的数量正相关。报告蛋白的量可能仅与表达报告蛋白的细胞的数量相关。报告蛋白的量可能与共培养物中不表达报告蛋白的细胞的数量无关。
包含组成型启动子的方法
在一些实施例中，本公开提供了用于评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的作用的方法，其中所述肿瘤细胞组成性地表达本公开的报告蛋白。组成型启动子在大多数生长条件下启动连续的基因产物生产。组成型启动子可以包括花椰菜花叶病毒(CMV)、人泛素C启动子(UBC)、人延伸因子1α启动子(EF1A)、小鼠磷酸甘油酸激酶1启动子(PGK)、猿猴病毒40(SV40)；从诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒和乙型肝炎病毒等的病毒的基因组中获得的启动子。
可以将编码与任何启动子(即组成型启动子)可操作地连接的报告蛋白的核酸引入到肿瘤细胞中(例如，通过转染、转导或电穿孔)。核酸可以表达从细胞分泌到细胞在其中生长的培养基中的可分泌报告蛋白。可以在第一时间点在培养基中检测到报告蛋白。条件培养基可以用没有分泌型报告蛋白的新鲜培养基替换。替换充当“重置”培养基中分泌的报告蛋白的量的方法。随着时间的推移，活的肿瘤细胞将继续表达报告蛋白并将其分泌到培养基中。可以在第二个时间点在更换的培养基中检测到报告蛋白。可以将第一时间点和第二时间点相互比较以确定随时间发生了多少细胞杀伤。
培养基可以更换任意多次。例如，培养基可以更换至少1、2、3、4、5、6、7、8或9次或更多次。在一些实施例中，培养基可以更换最多1、2、3、4、5、6、7、8或9次或更多次。培养基可以在以前的培养基更换后约2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多时间被更换。
可以采取任意数量的时间点。每个培养基更换周期可以采用至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次或更多次时间点。每个培养基更换周期可以采用最多1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次时间点。在一些情况下，每个培养基更换周期采用一个时间点。
组合物
本文所述的任意组合物可以用于本公开的任何方法中。
细胞
本公开提供了包含肿瘤细胞(例如，“诱导型报告肿瘤细胞”，其包含在诱导型启动子的控制下编码报告蛋白的核酸)的组合物。肿瘤细胞可以是原发性肿瘤细胞。原发性肿瘤细胞可以包括从患有癌症的受试者获得的肿瘤材料。原发性肿瘤细胞可以从肿瘤组织样品获得，例如，通过手术切除获得的组织和通过活检(例如，通过芯活检或细针活检)获得的组织)。原发性肿瘤细胞可以包含来自患者来源的异种移植物的肿瘤材料，所述异种移植物是当将来自患者的原发性肿瘤的癌组织直接被植入到免疫缺陷小鼠中时产生的。
在一些实施例中，提供了肿瘤细胞(或肿瘤细胞的组合物)，其包含在诱导型启动子(例如TetOn)的相同控制下编码荧光素酶和GFP的核酸。在一些实施例中，编码GFP的核酸和编码荧光素酶的核酸通过IRES或编码自切割2A肽如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV2A的核酸连接。在一些实施例中，提供了一种肿瘤细胞(或肿瘤细胞的组合物)，其包含从上游到下游的核酸：诱导型启动子(例如，TetOn启动子)-编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的核酸-IRES或编码自切割2A肽(例如，P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A或BmIFV 2A)的核酸—编码第二报告蛋白(例如，EGFP)的核酸。在一些实施例中，提供了一种肿瘤细胞(或肿瘤细胞的组合物)，其包含从上游到下游的核酸：TetOn启动子-编码荧光素酶(snLuc)的核酸-编码P2A的核酸-编码EGFP的核酸(下文被称为“Tet-on snLuc-GFP构建体”)。在一些实施例中，此类核酸被包含在慢病毒载体中。参见实例1。在一些实施例中，诱导型启动子由多西环素诱导。
在一些实施例中，提供了一种慢病毒载体，其包含诱导型启动子(例如，TetOn启动子)-编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的核酸-IRES或编码自切割2A肽(例如，P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A或BmIFV 2A)的核酸-编码第二报告蛋白(例如，EGFP)的核酸。
原发性肿瘤细胞和/或肿瘤细胞系可以包含来自任何上皮来源的肿瘤的细胞。例如，原发性肿瘤细胞和/或肿瘤细胞系可以包括来自以下的细胞：乳腺、卵巢、子宫内膜、子宫颈、结肠、肺、胰腺、食管、前列腺、小肠、直肠、子宫或胃；和鳞状细胞癌，其可以在肺、口腔、舌、喉、食管、皮肤、膀胱、子宫颈、眼睑、结膜等中具有原发性位点。原发性肿瘤细胞和/或肿瘤细胞系可以包括来自实体器官的恶性肿瘤(包括癌、肉瘤、黑色素瘤和神经母细胞瘤)的细胞。原发性肿瘤细胞和/或肿瘤细胞系可以包括来自血液传播的(即分散的)恶性肿瘤如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病的肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是肿瘤细胞系的一部分。肿瘤细胞系包括永生化的肿瘤细胞。如本文所使用的，永生化的细胞可以指能够在培养物中生长超过15代的细胞。术语传代次数是指细胞群已经被从培养容器中移出并经历继代培养(传代)过程的次数，以便使细胞保持在足够低的密度以刺激进一步生长。示例性的肿瘤细胞系可以包括LnCaP细胞、MDA-MB-231细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-468细胞和SK-BR-3细胞等。在一些实施例中，肿瘤细胞在2D单层中培养。在一些实施例中，肿瘤细胞被培养为3D球状体。
可以在本公开的组合物或方法中培养的肿瘤细胞的数量可以在约500个肿瘤细胞至约100,000个肿瘤细胞的范围内，例如约500个肿瘤细胞至约1,000个肿瘤细胞、约1,000个肿瘤细胞至约50,000个肿瘤细胞、约10,000个肿瘤细胞至约50,000个肿瘤细胞、约1,000个肿瘤细胞至约20,000个肿瘤细胞、约1,000个肿瘤细胞至约15,000个肿瘤细胞、约1,000个肿瘤细胞至约10,000个肿瘤细胞、约1,000个肿瘤细胞至约5,000个肿瘤细胞、约5,000个肿瘤细胞至约20,000个肿瘤细胞、约5,000个肿瘤细胞至约15,000个肿瘤细胞、约5,000个肿瘤细胞至约10,000个肿瘤细胞、约10,000个肿瘤细胞至约20,000个肿瘤细胞、约10,000个肿瘤细胞至约15,000个肿瘤细胞、或约15,000个肿瘤细胞至约20,000个肿瘤细胞中的任一个。在一些情况下，肿瘤细胞的数量为约5,000个细胞。在一些情况下，肿瘤细胞的数量为约10,000个细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞的数量为约20,000个细胞。在一些实施例中，肿瘤细胞的数量为约15,000个细胞。
肿瘤细胞可以与一个或多个额外的细胞群(例如，在3D球状体构造中)共培养。肿瘤细胞可以与至少1、2、3、4、5、6、7、8或9个或更多额外的细胞群一起培养。肿瘤细胞可以与最多1、2、3、4、5、6、7、8或9个额外的细胞群一起培养。在一些情况下，本公开的肿瘤细胞与一种额外的细胞群例如成纤维细胞一起培养。在一些实施例中，额外的细胞群是肿瘤细胞。在一些实施例中，额外的细胞群是非肿瘤细胞。
额外的细胞群可以包括非肿瘤细胞。例如，非肿瘤细胞可以是肿瘤微环境促进细胞。在癌症的背景下，肿瘤微环境可以由恶性细胞和非恶性细胞组成。虽然恶性细胞中的转化或致癌性改变可能是未调节的生长和肿瘤进展的基础，但非恶性细胞和由恶性细胞和非恶性细胞的并置产生的肿瘤微环境可能影响肿瘤的发生。非恶性细胞和肿瘤微环境可能与肿瘤进展和支持遗传不稳定性和升高的突变频率的条件的维持有关。正常起作用以支持肿瘤微环境内的炎性和免疫应答的非恶性细胞可能能够促进肿瘤进展，例如，通过产生直接或间接支持肿瘤内恶性细胞的生长和活力的介质(mediator)，或通过产生直接或间接抑制恶性细胞的生长和活力的介质，或通过抑制以其它方式将阻碍肿瘤进展的应答。肿瘤微环境还可能通过改变肿瘤部位的药物代谢或药代动力学和/或促进耐药性的产生来影响肿瘤对治疗干预的可及性。示例性的非肿瘤细胞(即，肿瘤微环境促进细胞)可以包括基质细胞、胎儿成纤维细胞、骨髓成纤维细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞或其任意组合/变体。在一些情况下，非肿瘤细胞(即，肿瘤微环境促进细胞)是成纤维细胞。
可以在本公开的组合物或方法中培养的非肿瘤细胞的数量可以在从约500个非肿瘤细胞到约100,000个非肿瘤细胞的范围内，例如从约500个非肿瘤细胞至约1,000个非肿瘤细胞、约1,000个非肿瘤细胞至约50,000个非肿瘤细胞、约10,000个非肿瘤细胞至约50,000个非肿瘤细胞、约1,000个非肿瘤细胞至约20,000个非肿瘤细胞、约1,000个非肿瘤细胞至约15,000个非肿瘤细胞、约1,000个非肿瘤细胞至约10,000个非肿瘤细胞、约1,000个非肿瘤细胞至约5,000个非肿瘤细胞、约5,000个非肿瘤细胞至约20,000个非肿瘤细胞、约5,000个非肿瘤细胞至约15,000个非肿瘤细胞、约5,000个非肿瘤细胞至约10,000个非肿瘤细胞、约10,000个非肿瘤细胞至约20,000个非肿瘤细胞、约10,000个非肿瘤细胞至约15,000个非肿瘤细胞、或约15,000个非肿瘤细胞至约20,000个非肿瘤细胞中的任一个。在一些情况下，非肿瘤细胞的数量为约5,000个细胞。在一些情况下，非肿瘤细胞的数量为约6,000个细胞。在一些情况下，非肿瘤细胞的数量为约10,000个细胞。
本公开的组合物和方法可以包括不同比率的肿瘤细胞和非肿瘤细胞。培养物中肿瘤细胞与非肿瘤细胞的比率可以是至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1或更多中的任一个。培养物中肿瘤细胞与非肿瘤细胞的比率可以是最多约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1中的任一个。培养物中非肿瘤细胞与肿瘤细胞的比率可以是至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1，或9:1或更多中的任一个。培养物中非肿瘤细胞与肿瘤细胞的比率可以最多约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1中的任一个。在一些情况下，肿瘤细胞与非肿瘤细胞的比率为约1:1。
肿瘤细胞和/或肿瘤共培养物(即，包括肿瘤细胞和非肿瘤细胞)可以在任何合适的拓扑结构中生长或培育。例如，肿瘤细胞和/或肿瘤共培养物(即，与非肿瘤细胞)可以在2D单层或3D球状体中生长或培育。在2D单层细胞培养中，肿瘤细胞可以与成纤维细胞或其它细胞的“饲养层”共培养，以向肿瘤细胞(如原发性肿瘤细胞)提供营养和其它因素。
三维(3D)球状体可以包括肿瘤细胞的聚集体，所述肿瘤细胞的聚集体包括肿瘤细胞的小块或团块。应当注意，术语“球状体”并不意味着聚集体是几何球体。聚集体可以是高度组织化的，具有明确定义的形态，或者可以是无组织的物质。球状体可以包括单一细胞类型或多于一种细胞类型(即，细胞群)。细胞可以是初级分离物，或永久细胞系，或两者的组合。球状体可以包括乳腺球状体(mammospheres)、类器官培养物和器官型培养物。肿瘤细胞球状体可以在平板、毛细血管、微流体、3D结构等中生长或培育。
肿瘤球状体的直径可以小于约5cm、小于约4cm、小于约3cm、小于约2cm、小于约1cm、小于约5mm、小于约2.5mm、小于约1mm、小于约500μm、小于约100μm、小于约50μm、小于约25μm、小于约10μm或小于约5μm。在一些情况下，肿瘤球状体具有约10μm至约500μm的直径。在一些情况下，肿瘤球状体具有约40μm至约100μm的直径。
报告蛋白
本公开提供了包含编码报告蛋白的核酸的肿瘤细胞。报告蛋白是充当在细胞中发生的任何变化(即，诸如酶促变化、形态变化、细胞信号传导变化或ADCC等)的读数的蛋白质。报告蛋白可以包括片段、变体和重组形式的报告蛋白。
报告蛋白可以是可分泌的。可分泌的报告蛋白可以指可以从其被表达到细胞外位置中的细胞中分泌的报告蛋白。取决于生物体或细胞的特性，细胞外位置可以在生物体或细胞的内部或外部。细胞外位置在其范围内包括在其中体外培养表达报告蛋白的细胞的培养基。可分泌的报告蛋白可以包含其任何修饰和重组形式。例如，可分泌的报告蛋白可以是在其天然形式下不可分泌但已被修饰为可分泌的蛋白质(即，通过用信号肽，即分泌信号标签修饰)。“信号肽”可以指确保进入分泌途径的前导序列。信号肽可以是短氨基酸序列，其指导新合成的分泌蛋白或膜蛋白到达并通过细胞膜，诸如内质网。分泌信号肽可以是同源的、异源的、杂合的和合成的信号肽。异源分泌信号序列通常在本质上与所表达的异源基因相关，或者源自另一种非哺乳动物基因。杂合的信号序列通常包含两种不同信号序列的元素。
可分泌的报告蛋白可以通过使用本领域技术人员熟悉的标准重组DNA方法将分泌性信号序列与野生型报告蛋白融合而产生。分泌性信号序列可以位于所需报告蛋白的N末端，但也可以放置在任何合适的位置以允许报告蛋白的分泌。合适的分泌性信号序列可以包括已知分泌蛋白的信号序列或信号序列的衍生物。已经鉴定了多种分泌蛋白。它们包括但不限于某些生长因子，例如成纤维细胞生长因子4-6、表皮生长因子和淋巴因子，例如白介素2-6。
示例性的可分泌报告蛋白可以包括深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、NANOLUC荧光素酶、可分泌型荧光蛋白(例如，可分泌的GFP、YFP、CFP、RFP)、分泌型碱性磷酸酶、可分泌的β-半乳糖苷酶、与外泌体相关的蛋白质、与分泌的囊泡相关的蛋白质或其任意组合。在一些情况下，报告蛋白是可分泌的荧光素酶。在一些情况下，报告蛋白是具有与分泌的荧光素酶相似的灵敏度和/或动态范围的蛋白质。在一些情况下，报告蛋白是可分泌的GFP或EGFP。
报告蛋白可能是不可分泌的。不可分泌的报告蛋白可以指在表达后保留在细胞或细胞膜内而不是分泌到细胞外培养基(即细胞内)中的报告蛋白。不可分泌的报告蛋白包括任何修饰的和重组的多肽或其片段形式。示例性的不可分泌的报告蛋白可以包括但不限于荧光蛋白GFP、BFP、CFP、YFP、EGFP、EYFP、Venus、Citrine、phiYFP、copGFP CGFP、ECFP、Cerulean、CyPet、T-Sapphire、Emerald、YPet、AcGFP1、AmCyan、AsRed2、dsRed、dsRed2、dsRed-Express、EBFP、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、J-Red、TurboGFP、Kusabira Orange、Midoriishi Cyan、mOrange、DsRed-单体、mStrawberry、mRFP1、tdTomato、mCherry、mPlum和mRaspberry、lacZ、β-半乳糖苷酶、不可分泌的荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶等。在一些情况下，报告蛋白是不可分泌的GFP。
编码本公开的报告蛋白的核酸可以存在于载体(例如，质粒、人工染色体、BAC等)上。载体组分通常可以包括但不限于以下中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因和增强子元件、启动子和转录终止序列。
用于真核宿主的载体可以包含编码信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特定切割位点的其它多肽的插入物。选择的异源信号序列可以是被肿瘤细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。选择的异源信号序列可能不是被肿瘤细胞识别和加工(即，被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)信号。这种前体区域的DNA可以在阅读框中被连接到编码本公开的报告蛋白的DNA。
表达和克隆载体可以包含选择基因，其也被称为选择性标记物。典型的选择基因编码这样的蛋白质，所述蛋白质(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型，或(c)提供从复杂培养基中无法获得的关键营养物。
表达和克隆载体可以包含被宿主生物体识别并且可操作地连接到编码报告蛋白的核酸的启动子。当核酸与另一个核酸序列处于功能关系时，核酸是“可操作连接的”。例如，如果前序列(presequence)或分泌前导的DNA作为参与多肽的分泌的前蛋白被表达，则它可以与多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它可以与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点可以被定位以便于翻译，则它可以与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列是邻接的，和/或在阅读框中是邻接的。增强子可能不必是邻接的。连接是通过在方便的限制性位点处连接来完成的。如果此类位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
启动子可以指能够在细胞中结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列的转录的DNA调节区。启动子可以在其3'末端被转录起始位点结合，并向上游(5'方向)延伸，以包括在高于背景可检测的水平上启动转录所需的最小数量的碱基或元件。在启动子序列内可能存在转录起始位点，和/或负责结合RNA聚合酶的蛋白质结合区。真核启动子可以包含TATA盒和CAT盒。各种启动子，包括诱导型启动子，可以用于驱动表达。
可操作地连接到编码报告蛋白(或KO构建体，例如CRISPR/Cas)的核酸的启动子可以是可诱导的。诱导型启动子是那些基于诱导剂(即分子)的存在而控制报告蛋白的表达的启动子。示例性的诱导型启动子可以包括雌激素诱导型、雌二醇诱导型、ACE1启动子、IN2启动子、四环素诱导型启动子(例如，TetOn)、组织特异性启动子(即，用于肌肉特异性表达的肌球蛋白重链启动子、溶酶体酸性脂肪酶启动子、淀粉酶启动子、叶酰聚-γ-谷氨酸合成酶启动子、神经限制性沉默元件、HGH启动子、催乳素启动子和α1(VI)胶原蛋白启动子)，细胞类型特异性启动子(即，E2F 1启动子；细胞周期蛋白A启动子；细胞周期蛋白B启动子；细胞周期蛋白C启动子；细胞周期蛋白D启动子；细胞周期蛋白E启动子；等等)，发育阶段特异性启动子(即，notch、numb、同源基因、鼠同源盒启动子)、受细胞周期控制的启动子、受昼夜节律控制的启动子和其活性响应于外部或内部信号而增加(例如，活化)或减少(例如，抑制)的启动子或其任意组合。示例性的诱导剂(即分子)可以包括四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸等。在一些实施例中，诱导型启动子是TetOn系统。诱导表达的其它示例性方法可以包括将肿瘤细胞暴露于光或热。
在一些实施例中，可操作地连接到编码报告蛋白(或KO构建体，例如靶向PD-L1的CRISPR/Cas)的核酸的启动子可以是组成型的。组成型启动子允许异源基因(也被称为转基因)在细胞中组成型表达。本文考虑的示例性的组成型启动子包括但不限于，巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、人延长因子-1α(hEF1α)、泛素C启动子(UbiC)、磷酸甘油激酶启动子(PGK)、猿病毒40早期启动子(SV40)、鸡β-肌动蛋白启动子联合CMV早期增强子(CAGG)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、多瘤增强剂/单纯疱疹胸苷激酶(MC1)启动子、β肌动蛋白(β-ACT)启动子、“骨髓增殖性肉瘤病毒增强剂，阴性对照区缺失，d1587rev引物结合位点取代(MND)”启动子。此类组成型启动子在驱动转基因表达方面的效率已在大量研究中进行了广泛比较。在一些实施例中，与编码针对内源性PD-L1的KO构建体(例如，CRISPR/Cas)的核酸可操作性连接的启动子是CMV。
可以通过将增强子序列插入到载体中来增加编码本公开的报告蛋白的DNA的转录。增强子序列可以包括来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)或真核细胞病毒的序列，例如复制起点晚期侧的SV40增强子(100-270bp)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在多肽编码序列的5'或3'位置处被剪接到载体中。
用于真核肿瘤细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物的有核细胞)中的表达载体可以包含用于终止转录和用于稳定mRNA的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区获得。这些区域包含在多肽编码mRNA的非翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。
表达载体可以具有限制性位点以提供编码报告蛋白的核酸序列的插入。可能存在在表达肿瘤细胞中可操作的选择性标记物。可以制备包含转录起始区、编码序列或其片段和转录终止区的表达载体。
在一些情况下，表达载体可以包括编码病毒蛋白的编码序列。病毒蛋白可以是病毒载体的组分，其可以用于病毒转导以便在本公开的肿瘤细胞中表达编码报告蛋白的核酸。示例性的病毒载体可以包括但不限于逆转录病毒载体，例如慢病毒载体；腺病毒载体；腺相关病毒(AAV)病毒载体、猫免疫缺陷病毒(FIV)载体、狂犬病病毒载体、禽肉瘤白血病病毒(ASLV)载体或其任意组合。
载体可以编码一种或多种病毒蛋白，例如酶，例如聚合酶、衣壳蛋白、包膜蛋白、调节性蛋白等。载体可以被配置为携带用于掺入外源核酸、用于选择和/或用于将核酸转移到本公开的肿瘤细胞中的序列。
可以使用标准重组技术获得编码本公开的报告蛋白(或KO构建体，例如靶向PD-L1的CRISPR/Cas)的多核酸序列。可以从细胞中分离和测序所需的多核酸序列。可替代地，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术来合成多核苷酸。一旦获得，可以将编码多肽的序列插入到能够在肿瘤细胞中复制和表达异源多核苷酸的重组载体中。
可以通过任何方法将编码报告蛋白(或KO构建体，例如靶向PD-L1的CRISPR/Cas)的核酸引入到本公开的肿瘤细胞中。例如，可以通过逆转录病毒或慢病毒转导将编码报告蛋白(或KO构建体，例如靶向PD-L1的CRISPR/Cas)的核酸引入到细胞中。病毒颗粒可以通过在所谓的生产细胞(例如293T人胚胎肾细胞)中共表达病毒粒子包装元件和载体基因组来产生。这些细胞可以用许多核酸(例如，病毒组分)瞬时转染。用于引入编码报告蛋白的核酸的其它示例性方法可以包括：转染、瞬时转染、稳定转染、电穿孔等。
本公开的肿瘤细胞可以包含任何数量的编码报告蛋白(或KO构建体，例如靶向PD-L1的CRISPR/Cas)的不同核酸。例如，肿瘤细胞可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8或9种或更多种编码不同报告蛋白的不同核酸。肿瘤细胞可以包含最多1、2、3、4、5、6、7、8或9种编码不同报告蛋白的不同核酸。肿瘤细胞可以包含编码第一报告蛋白(例如，荧光素酶)的第一核酸和编码不同报告蛋白(例如，GFP)的一个或多个另外的核酸。在一些情况下，细胞可以包含第一报告核酸，所述第一报告核酸包含可分泌的报告蛋白(例如，可分泌的荧光素酶)，并且细胞可以包含编码细胞内报告蛋白(例如，荧光蛋白)的第二核酸。
当本发明的肿瘤细胞表达两种报告蛋白时，两种报告蛋白可以是相同或不同的，例如，一种是不可分泌的GFP并且一种是可分泌的GFP，或者一种是不可分泌的GFP并且一种是可分泌的荧光素酶。编码两种报告蛋白的核酸可以在相同的载体上或在不同的载体上。编码两种报告蛋白的核酸可以在相同载体上的相同启动子(例如，通过IRES或编码自切割2A肽如P2A、T2A、E2A、F2A、BmCPV 2A、BmIFV2A的核酸连接在它们之间)、在不同载体上的相同启动子(例如，两个TetOn)、在相同载体上的不同启动子、或在不同载体上的不同启动子(例如，一个是诱导型的，一个是组成型的)的控制下。当存在于不同的载体上时，载体可以同时或依次被转导到肿瘤细胞中。在一些实施例中，编码两种报告蛋白(荧光素酶和GFP)的核酸在相同的诱导型启动子(例如，TetOn)的控制下。
细胞杀伤剂
本公开提供了包含细胞杀伤剂的组合物。细胞杀伤剂可以直接与肿瘤细胞相互作用。细胞杀伤剂可以间接与肿瘤细胞相互作用。与肿瘤细胞的间接相互作用可以指例如与免疫细胞相互作用以调节免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力的细胞杀伤剂。如本文所使用的，术语“细胞杀伤剂”包括直接和间接的细胞杀伤剂。例如，细胞杀伤剂可以指如本文所述的抗体(即免疫调节抗体)和免疫细胞的组合。在一些实施例中，细胞杀伤剂作用靶向特异性杀伤(例如，通过ADCC、BiTE等)。在一些实施例中，细胞杀伤剂影响非特异性杀伤，例如NK细胞，其可以在没有抗体靶向的情况下通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)识别肿瘤细胞上的MHC来进行非特异性杀伤。
细胞杀伤剂可以是细胞毒素。细胞毒素可以是对细胞有害的任何药剂。示例性的细胞毒素可以包括但不限于紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭、依米丁(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽二酮(dihydroxy anthracinedione)、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素及其类似物或同系物。其它毒素包括，例如，蓖麻毒素(ricin)、CC-1065和类似物、倍癌霉素(duocarmycins)。还有其它毒素包括白喉毒素和蛇毒(snake venom)(例如眼镜蛇毒)、DNA、RNA、RNAi、微型RNA、诱导细胞凋亡的分子、半胱天冬酶活化剂、细胞因子活化剂等。
细胞杀伤剂可以是细胞。当细胞杀伤剂是细胞时，它可以被称为“效应细胞”。效应细胞可以参与抗体依赖性细胞介导的杀伤(ADCC)，从而效应细胞能够通过与抗体的相互作用杀伤肿瘤细胞。细胞杀伤剂可以是任何细胞。细胞杀伤剂可以是免疫细胞。示例性的杀伤细胞的免疫细胞(或效应细胞)可以包括NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR T细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、白细胞、淋巴细胞、T淋巴细胞(例如杀伤T细胞(Tc、细胞毒性T淋巴细胞或CTL)、辅助T细胞(Th)、调节性T细胞(Treg)或γδT细胞)、B淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞，或其任意组合。当细胞杀伤剂是免疫细胞并且可以直接杀伤肿瘤细胞(例如CAR-T细胞)时，其可以用来检测患者是否产生了特定的抗癌记忆T细胞。在一些实施例中，效应细胞被刺激。在一些实施例中，效应细胞未被刺激。
当细胞杀伤剂是细胞(即，效应细胞)时，可以将细胞杀伤剂与不同比率(E:T比率)的肿瘤细胞一起培育。培养物中肿瘤细胞与细胞杀伤剂(即效应细胞)的比率可以是至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1或更高中的任一个。培养物中肿瘤细胞与细胞杀伤剂(即效应细胞)的比率可以最多为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1的任一个。培养物中细胞杀伤剂(即效应细胞)与肿瘤细胞的比率可以是至少约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、15:1、20:1、25:1或更多中的任一个。培养物中细胞杀伤剂(即效应细胞)与肿瘤细胞的比率可以最多为约1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1.、10:1、15:1、20:1或25:1中的任一个。在一些情况下，细胞杀伤剂(即效应细胞)与肿瘤细胞的比率为约3:1。在一些情况下，细胞杀伤剂(即效应细胞)与肿瘤细胞的比率为约1:1。在一些实施例中，细胞杀伤剂(即效应细胞)与肿瘤细胞的比率为约9:1。在一些情况下，细胞杀伤剂(即效应细胞)与肿瘤细胞的比率为约25:1、10:1或5:1。
可以在本公开的组合物或方法中培养的细胞杀伤剂(即效应细胞)的数量可以在从约500个细胞到约100,000个细胞的范围内，例如从约1,000个细胞至约50,000个细胞、约500个细胞至约1,000个细胞、约10,000个细胞至约50,000个细胞、约1,000个细胞至约30,000个细胞、约1,000个细胞至约25,000个细胞、约1,000个细胞至约20,000个细胞、约1,000个细胞至约15,000个细胞、约1,000个细胞至约10,000个细胞、约1,000个细胞至约5,000个细胞、约5,000个细胞至约30,000个细胞、约5,000个细胞至约25,000个细胞、约5,000个细胞至约20,000个细胞、约5,000个细胞至约15,000个细胞、约5,000个细胞至约10,000个细胞、约10,000个细胞至约30,000个细胞、约10,000个细胞至约25,000个细胞、约10,000个细胞至约20,000个细胞、约10,000个细胞至约15,000个细胞、约15,000个细胞至约30,000个细胞、约15,000个细胞至约25,000个细胞、约15,000个细胞至约20,000个细胞、约20,000个细胞至约30,000个细胞、约20,000个细胞至约25,000个细胞或约25,000个细胞至约30,000个细胞中的任何一个。在一些实施例中，效应细胞的数量为约30,000个细胞。在一些情况下，效应细胞的数量为约15,000个细胞。在一些情况下，效应细胞的数量为约5,000个细胞。
细胞杀伤剂可以是抗体。抗体可以包含重链和轻链。重链可以包含VH结构域。所述重链可以进一步包括一个或多个恒定结构域，如CH1、CH2、CH3或其任意组合。轻链可以包含VL结构域，并且可以进一步包含恒定结构域，例如CL。重链和轻链可以通过多个二硫键相互连接。抗体可以包含Fc，例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc片段。在一些实施例中，抗体不包含Fc片段。在一些实施例中，所述抗体因Fc功能而被灭活或降低，例如通过LALA突变。
在一些实施例中，抗体是抗原结合片段，例如本领域中已知的任何抗原结合片段形式，例如scFv、VH、VL、scFv-scFv、Fv、Fab、Fab'、(Fab')2、微型抗体、双抗体、结构域抗体变体(dAb)、单结构域抗体(sdAb)，例如骆驼抗体(VHH)或VNAR、纤连蛋白3结构域变体、锚蛋白重复变体，或来自其它蛋白质支架的其它抗原特异性结合结构域。
抗体可以包含单个多肽链(例如，scFv或scFv-scFv)。抗体可以包含多于一个(例如2、3、4或更多个)多肽链。多肽链可以具有任何长度，例如至少约10、20、50、100、200、300、500或更多个氨基酸长中的任一个。在多链抗体的情况下，编码多肽链的核酸序列可以被可操作地连接到相同的启动子或不同的启动子。
抗体可以是天然抗体，例如单克隆抗体。天然抗体是与特定抗原发生免疫反应的免疫球蛋白分子。抗体可以是激动性抗体。抗体可以是拮抗性抗体。抗体可以是单克隆抗体。抗体可以是多克隆抗体。抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。在一些实施例中，抗体是非人类来源的，例如小鼠、大鼠、兔、山羊等。
抗体可以是单价抗体。抗体可以是多价抗体，例如二价抗体或四价抗体。抗体可以是单特异性的(例如，抗PD-1抗体例如纳武单抗、抗HER2抗体例如曲妥珠单抗或抗PD-L1抗体例如阿特珠单抗或德瓦鲁单抗)。抗体可以是多特异性的(例如双特异性的)，例如抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。多特异性抗体可以具有针对至少两种不同抗原或表位的结合特异性(例如，双特异性抗体具有针对两种抗原或表位的结合特异性)。
○免疫检查点分子
在一些实施例中，抗体可以特异性地识别免疫检查点分子(例如抗PD-1、抗PD-L1或抗PD-L2全长抗体)。充当检查点抑制剂的抗体可以被称为“免疫调节剂”。免疫检查点是免疫系统中上调(刺激性分子)或下调信号(抑制性分子)的分子。免疫检查点蛋白可以调节和维持自身耐受性以及生理免疫反应的持续时间和幅度。刺激性检查点分子可以包括但不限于属于肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的CD27、CD40、OX40、GITR和CD137，以及属于B7-CD28超家族的CD28和ICOS。抑制性检查点分子包括但不限于程序死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3、HAVCR2)、T细胞活化的V结构域Ig抑制因子(VISTA、B7-H5)、B7-H3、B7-H4(VTCN1)、HHLA2(B7-H7)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、腺苷A2A受体(A2AR)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、2B4(CD244)及其配体。许多检查点蛋白已被广泛研究，例如CTLA-4及其配体CD80(B7-1)和CD86，以及PD-1(CD279)及其配体PD-L1(B7-H1、CD274)和PD-L2(B7-DC、CD273)。
特异性地识别免疫检查点分子的抗体可以是免疫检查点抑制剂(抑制性免疫检查点分子的抑制剂)或刺激性免疫检查点分子的活化剂。特异性地识别免疫检查点分子的抗体可以是刺激性免疫检查点分子的活化剂，例如激动剂抗体，例如抗CD28、抗OX40、抗-ICOS、抗GITR、抗-4-1BB、抗CD27、抗CD40、抗CD3和抗HVEM。特异性地识别免疫检查点分子的抗体可以是免疫检查点抑制剂，例如PD-1(CD279)、PD-L1(B7-H1、CD274)、PD-L2(B7-DC、CD273)、LAG-3、TIM-3(HAVCR2)、BTLA、CTLA-4、TIGIT、VISTA(B7-H5)、B7-H4(VTCN1)、CD160(BY55)、HHLA2(B7-H7)、2B4(CD244)、CD73、B7-1(CD80)、B7-H3(CD276)、CD20、Her2、KIR或IDO的抑制剂。
识别免疫检查点分子的抗体(即细胞杀伤剂)可以是免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂可以靶向免疫细胞(即T细胞)。免疫检查点抑制剂可以靶向肿瘤细胞。例如，在一些情况下，当肿瘤细胞附着至特定的T细胞受体时，它们可以关闭活化的T细胞。然而，免疫检查点抑制剂可能会阻止肿瘤细胞附着至T细胞，从使得T细胞保持活化。免疫检查点抑制剂可以是靶向抑制性免疫检查点蛋白(例如，在免疫细胞上)的抗体(例如拮抗剂抗体)，包括但不限于抗-CTLA-4、抗-TIM-3、抗LAG-3、抗KIR、抗PD-1(例如，纳武单抗如
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西米普利单抗或帕博利珠单抗)、抗PD-L1(例如，阿特珠单抗、阿维鲁单抗或德瓦鲁单抗)、抗CD73、抗B7-H3、抗CD47、抗BTLA、抗VISTA、抗A2AR、抗B7-1、抗B7-H4、抗CD52、抗IL-10、抗IL-35和抗TGF-β。当抗体靶向肿瘤细胞(例如，通过CDC)时，它可以被称为直接细胞杀伤剂。当抗体靶向免疫细胞(例如，通过ADCC)时，它可以被称为间接细胞杀伤剂。
在一些实施例中，细胞杀伤剂是特异性地识别靶细胞(例如，肿瘤细胞)抗原和/或效应细胞分子(例如，CD3)的抗体。在一些实施例中，靶抗原是细胞表面分子(例如，受体/配体的细胞外结构域)。在一些实施例中，靶抗原充当与特殊疾病状态相关的靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的细胞表面标记物。被抗体的抗原结合结构域特异性识别的靶抗原(例如，肿瘤抗原、受体/配体的细胞外结构域)可以是单个患病细胞上的抗原或在不同细胞上表达的抗原，这些细胞各自促成疾病。被抗原结合结构域特异性识别的靶抗原可能直接或间接参与疾病。
○肿瘤抗原
在一些实施例中，靶细胞抗原是肿瘤抗原。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的可以引发免疫应答，特别是T细胞介导的免疫应答的蛋白质。本发明的靶向抗原的选择将取决于待治疗的癌症的特定类型。示例性的肿瘤抗原包括，例如，神经胶质瘤相关抗原、BCMA(B细胞成熟抗原)、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CAIX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、前列腺素、PSMA、HER2/neu、生存素和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。在一些实施例中，肿瘤抗原包含一种或多种与恶性肿瘤相关的抗原性癌症表位。恶性肿瘤表达许多蛋白质，这些蛋白质可以作为免疫攻击的靶抗原。这些分子包括但不限于组织特异性抗原，例如黑色素瘤中的MART-1、酪氨酸酶和gp100，以及前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子的组，例如致癌基因HER2/Neu/ErbB-2。另一组靶抗原是癌-胎儿抗原，例如癌胚抗原(CEA)。在B细胞淋巴瘤中，肿瘤特异性独特型免疫球蛋白构成了真正的肿瘤特异性免疫球蛋白抗原，所述抗原是个体肿瘤独有的。B细胞分化抗原如CD19、CD20和CD37是B细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选者。
在一些实施例中，肿瘤抗原是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是肿瘤细胞独有的，并且不会出现在身体的其它细胞上。TAA不是肿瘤细胞独有的，而是在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可能发生在使免疫系统能够对抗原应答的条件下。TAAs可能是在胎儿发育期间(当免疫系统不成熟且无法应答时)在正常细胞上表达的抗原，或者它们可能是正常情况下在正常细胞上以极低水平存在，但在肿瘤细胞上以高得多的水平表达的抗原。TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，例如MART-1/MelanA(MART-1)、gp 100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5；过表达的胚胎抗原，例如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，例如p53、Ras、HER2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，例如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大的基于蛋白质的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23HI、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS 1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\\亲环素C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在一些实施例中，肿瘤抗原选自由以下组成的组：间皮素、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、Tn Ag、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、白介素11受体a(IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板衍生的生长因子受体-β(PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、叶酸受体α、ERBB2(Her2/neu)、MUC1、表皮生长因子受体(EGFR)、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受体、CAIX、LMP2、gp100、bcr-abl、酪氨酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙酰基-GD2、叶酸受体β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、CLDN18.2、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、豆荚蛋白(legumain)、HPV E6、E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相关抗原1、p53、p53突变体、prostein、生存素和端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突变体、hTERT、肉瘤易位断点、ML-IAP、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5和IGLL1。
在一些实施例中，肿瘤抗原是HER2。在一些实施例中，特异性地识别HER2的抗原结合结构域衍生自曲妥珠单抗(例如，
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)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(例如，
Figure BDA0003561933820000582
)、玛格妥昔单抗(margetuximab)或7C2。在一些实施例中，特异性地识别HER2的抗原结合结构域包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、玛格妥昔单抗或7C2中任一种的重链CDR、轻链CDR或所有6个CDR。在一些实施例中，特异性地识别HER2的抗原结合结构域包含曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、玛格妥昔单抗或7C2的VH和/或VL。
○细胞表面配体或受体
在一些实施例中，细胞杀伤剂是特异性地识别配体或受体，例如配体/受体的细胞外结构域的抗体。在一些实施例中，配体或受体衍生自选自由NKG2A、NKG2C、NKG2F、NKG2D、BCMA、APRIL、BAFF、IL-3、IL-13、LLT1、AICL、DNAM-1和NKp80组成的组的分子。在一些实施例中，配体衍生自可以结合至BCMA的APRIL和/或BAFF。在一些实施例中，受体是FcR并且配体是含Fc的分子。在一些实施例中，FcR是Fcγ受体(FcγR)。在一些实施例中，FcγR选自由FcγRIA(CD64A)、FcγRIB(CD64B)、FcγRIC(CD64C)、FcγRIIA(CD32A)、FcγRIIB(CD32B)、FcγRIIIA(CD16a)和FcγRIIIB(CD16b)组成的组。
○免疫细胞表面抗原
在一些实施例中，细胞杀伤剂是特异性地识别免疫细胞表面抗原的抗体。免疫细胞具有不同的细胞表面分子。例如，CD3是T细胞上的细胞表面分子，而CD16、NKG2D或NKp30是NK细胞上的细胞表面分子，而CD3或不变T细胞受体(TCR)是NKT细胞上的细胞表面分子。在其中免疫细胞是T细胞的一些实施例中，活化分子是CD3例如CD3ε、CD3δ或CD3γ；或CD27、CD28、CD40、CD134、CD137和CD278中的一种或多种。在其中免疫细胞是NK细胞的其它一些实施例中，细胞表面分子是CD16、NKG2D或NKp30。在其中免疫细胞是NKT细胞的一些实施例中，细胞表面分子是CD3或不变TCR。在一些实施例中，所述免疫细胞选自由单核细胞，树突细胞，巨噬细胞，B细胞，杀伤T细胞(TC，细胞毒性T淋巴细胞，或CTL)，辅助T细胞(Th)、调节性T细胞(Treg)、γδT细胞、自然杀伤T(NKT)细胞和自然杀伤(NK)细胞组成的组。
在一些实施例中，免疫细胞表面抗原选自由CD3(例如CD3ε、CD3δ、CD3γ)、CD4、CD5、CD8、CD16、CD27、CD28、CD40、CD64、CD89、CD134、CD137、CD278、NKp46、NKp30、NKG2D、TCRα、TCRβ、TCRγ和TCRδ组成的组。在一些实施例中，免疫细胞表面抗原是CD3、CD4或CD8。
CD3包含三个不同的多肽链(ε、δ和γ链)，是由T细胞表达的抗原，包括细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和T辅助细胞(CD4+初始T细胞)。三个CD3多肽链与TCR和ζ链缔合以形成TCR复合物，其具有活化T细胞中信号传导级联的功能。目前，许多治疗策略靶向TCR信号转导，以使用抗人CD3单克隆抗体治疗疾病。CD3特异性抗体OKT3是第一个批准用于人类治疗用途的单克隆抗体，并且在临床上用作用于治疗同种异体移植排斥的免疫调节剂。奥昔珠单抗(Otelixizumab)(TRX4)是一种特异性地靶向CD3ε的单克隆抗体，并且被开发用于治疗1型糖尿病和其它自身免疫性疾病。在一些实施例中，特异性地识别CD3的抗原结合结构域或抗体包含OKT3或奥昔珠单抗的重链CDR、轻链CDR或所有六个CDR。在一些实施例中，特异性地识别CD3的抗原结合结构域包含OKT3或奥昔珠单抗的VH和/或VL。
CD4是一种在诸如T辅助细胞(CD4+T辅助细胞)、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的免疫细胞的表面上表达的糖蛋白。CD4是TCR的共同受体，并且帮助TCR与抗原呈递细胞通讯。示例性的抗CD4抗体包括但不限于MAX.16H5和IT1208。MAX.16H5是一种抗人CD4抗体，其在用于治疗自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎)和肾同种异体移植物移植后急性迟发型排斥的临床试验中被静脉施用。IT1208是一种去岩藻糖基化的人源化抗CD4消耗抗体，其目前正在临床试验中用于治疗晚期实体瘤。在一些实施例中，特异性地识别CD4的抗原结合结构域包含MAX.16H5或IT1208的重链CDR、轻链CDR或所有六个CDR。在一些实施例中，特异性地识别CD4的抗原结合结构域包含MAX.16H5或IT1208的VH和/或VL。
CD8是一种跨膜糖蛋白，其作为TCR的共同受体。CD8结合至MHC I类蛋白并特异于MHC I类蛋白。CD8最常见的形式是由CD8-α和CD8-β链组成。CD8主要在细胞毒性T细胞的表面上表达，但也可以在自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突细胞上发现。CD8是细胞毒性T细胞群的标记物。CD8在T细胞淋巴母细胞淋巴瘤和色素减退蕈样肉芽肿中表达。
在一些实施例中，细胞杀伤剂是siRNA、CRISPR/Cas、ZFN或TALEN构建体，其靶向本文所述的抑制性免疫检查点分子，以敲低(KD)或敲除(KO)此类抑制性检查点分子在靶细胞(例如肿瘤细胞)中的内源性表达。在一些实施例中，将此类细胞杀伤剂与诱导型报告基因表达构建体一起引入到肿瘤细胞中。例如，编码此类细胞杀伤剂(例如，针对PD-L1的siRNA或CRISPR/Cas)的核酸和编码报告蛋白的核酸在相同的载体上，或者在相同的启动子的控制下，或者在不同的启动子控制下。在一些实施例中，编码此类细胞杀伤剂(例如，针对PD-L1的siRNA或CRISPR/Cas)的核酸和编码报告蛋白的核酸在不同的载体上，在相同或不同启动子的控制下。不同的载体可以同时或依次被转导到肿瘤细胞中，但在细胞杀伤测定之前，以获得稳定的细胞系。在一些实施例中，编码此类细胞杀伤剂(例如，针对PD-L1的siRNA或CRISPR/Cas)的核酸在组成型启动子(例如，CMV)的控制下。在一些实施例中，编码此类细胞杀伤剂(例如，针对PD-L1的siRNA或CRISPR/Cas)的核酸在诱导型启动子的控制下。通过这样做，可以克服免疫抑制或将免疫抑制恢复到一定水平(例如，诱导型报告肿瘤细胞中的PD-L1 KO)。
细胞杀伤剂可以是免疫细胞和免疫调节剂(例如抗体、免疫检查点抑制剂)的组合。抗体，例如检查点抑制剂可以通过调节免疫系统的内源性T细胞调节机制发挥作用。例如，伊匹单抗(Ipilimumab)(一种作为免疫检查点抑制剂的抗体)结合并阻断由T细胞(一种免疫细胞)表面共抑制分子细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)介导的抑制性信号传导。在一些实施例中，本文所述的组合物或方法中的细胞杀伤剂是抗HER2抗体和免疫效应细胞(例如NK、CTL或PBMC)的组合。在一些实施例中，本文所述的组合物或方法中的细胞杀伤剂是抗HER2/抗CD3抗体和免疫效应细胞(例如NK、CTL或PBMC)的组合。在一些实施例中，本文所述的组合物或方法中的细胞杀伤剂是抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体和免疫效应细胞(例如、NK、CTL或PBMC)的组合。在一些实施例中，本文所述的组合物或方法中的细胞杀伤剂是1)抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体，2)抗HER2/抗CD3抗体，抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体，或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体，和3)免疫效应细胞(例如，NK、CTL或PBMC)的组合。
免疫调节剂和免疫细胞可以被预培育形成细胞杀伤剂，然后与本公开的肿瘤细胞接触。在一些实施例中，免疫调节剂和免疫细胞未被预培育以形成细胞杀伤剂。而是，可以将免疫调节剂和免疫细胞依次或同时添加到肿瘤细胞中，从而免疫调节剂和免疫细胞可以结合在一起以形成细胞杀伤剂。可以在添加免疫细胞之前将免疫调节剂添加到肿瘤细胞中。在免疫细胞被加入到肿瘤细胞中后，可以将免疫调节剂加入到肿瘤细胞中。免疫调节剂可以与免疫细胞同时加入到肿瘤细胞中。当免疫调节剂与免疫细胞(即在免疫细胞上表达的蛋白质或受体)结合时，反应可以形成细胞杀伤剂。
培养基
肿瘤细胞可以在支持肿瘤细胞生长的任何合适的培养基中生长。培养基组成可以包括必需氨基酸、盐、维生素、矿物质、微量金属、糖、脂质和核苷。细胞培养基试图提供必要的组分，以满足在受控的、人工和体外环境中生长细胞所需的营养需求。营养配方、pH和渗透压根据参数而变化，例如采用的细胞类型、细胞密度和培养系统。许多细胞培养基配方被记录在文献中，并且许多培养基是可商购的。
商业上可获得的培养基例如Ham's F10(Sigma)、基本必需培养基((MEM)、(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和杜氏改良伊格尔培养基((DMEM)，Sigma)适合于培养肿瘤细胞，或本公开的任何细胞。任何培养基都可以补充有激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液(例如HEPES)、核苷酸(例如腺苷和胸苷)、氨基酸(例如L-谷氨酰胺)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(被定义为通常以微摩尔范围的最终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括任何其它必要的补充剂。培养条件，例如温度、pH等，是先前与选择用于表达的肿瘤细胞一起使用的那些，并且对于普通技术人员将是显而易见的。
一旦培养基与细胞一起培育，本领域技术人员将其称为“用过的”或“条件培养基”。条件培养基含有培养基的许多原始组分，以及多种细胞代谢物和分泌的蛋白，包括例如生物活性的生长因子、炎症介质和其它细胞外蛋白。在一些情况下，条件培养基包含本公开的可分泌的报告蛋白。
在一些实施例中，提供了一种组合物，所述组合物包含肿瘤细胞(例如，诱导型报告肿瘤细胞)、非肿瘤细胞(例如，成纤维细胞)、细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)、编码报告蛋白的核酸(例如，在诱导型启动子控制下)、诱导剂(例如，多西环素)和培养基中的分泌的报告蛋白(例如荧光素酶或GFP)或其任意组合。例如，在一些实施例中，提供了一种包含本公开的肿瘤细胞的组合物，所述肿瘤细胞在肿瘤细胞生长的培养基中包含编码报告蛋白(例如，在诱导型启动子下)的核酸和分泌的报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)。在一些实施例中，提供了一种包含肿瘤细胞的组合物，所述肿瘤细胞在肿瘤细胞生长的培养基中包含编码报告蛋白(例如，在诱导型启动子下)的核酸、分泌的报告蛋白(例如，荧光素酶或GFP)和细胞杀伤剂(例如，小化合物、免疫效应细胞、抗体如多特异性抗体、ADC、免疫调节剂如免疫检查点抑制剂等或其任意组合)。在一些实施例中，所述组合物进一步包含由肿瘤细胞分泌的第二报告蛋白。在一些实施例中，所述组合物进一步包含诱导剂(例如，多西环素)。
试剂盒
本公开提供了可用于实施本公开的方法的试剂盒。试剂盒可以包括本文所述的任何组分，包括但不限于肿瘤细胞、非肿瘤细胞(例如，成纤维细胞)、细胞杀伤剂(或细胞杀伤剂的组合)和诱导剂、编码与诱导型启动子可操作地连接的报告蛋白的核酸或其任意组合。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含编码与第二诱导型启动子可操作地连接的第二报告蛋白的第二核酸。在一些实施例中，所述试剂盒进一步包含编码KO构建体(例如，siRNA、CRISPR/Cas、ZFN或TALEN)的第三核酸，例如用于靶向内源性抑制性检查点分子(例如，PD-L1)。
所述试剂盒还可以包含本文所述的和/或可用于实施本公开的方法的任何试剂。试剂可以包括用于生长细胞的试剂、用于将编码报告蛋白的核酸掺入细胞中的试剂、用于稀释试剂盒的组分的试剂和用于溶解试剂盒的组分的试剂。试剂可以包括缓冲液。用于本申请的合适的缓冲剂可以包括有机酸和无机酸及其盐。例如，柠檬酸盐、磷酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、草酸盐、乳酸盐、乙酸盐。缓冲剂可以包括组氨酸和三甲胺盐，例如Tris。
本公开的试剂盒可以为合适的包装。合适的包装包括但不限于小瓶、瓶子、罐、柔性包装(例如密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒的组分可以存在于单独的容器中，或者多种组分可以存在于单个容器中。例如，肿瘤细胞和非肿瘤细胞可以在单独的容器中提供，或者可以在单个容器中提供。
除上述组分外，所述试剂盒可以进一步包括使用所述试剂盒的组分来实施本公开的方法的说明书。用于实施所述方法的说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以被印刷在诸如纸或塑料等的基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中，存在于试剂盒的容器或其组件的标签中(即，与包装或子包装相关联)等。说明书可以作为电子存储数据文件存在于合适的计算机可读存储介质(例如，CD-ROM、软盘、硬盘驱动器(HDD)等)上。实际的说明书可能不会存在于试剂盒中，但是提供了用于例如经由因特网(即，通过云中的存储)从远程源获得说明书的手段。所述实施例的实例是这样的试剂盒，所述试剂盒包括网址，可以在所述网址中查看说明书和/或从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的这种手段被记录在合适的基材上。
示例性的实施例
实施例1.一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：a.使肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子控制；b.诱导所述核酸的表达以产生报告蛋白；和c.确定报告蛋白的量，其中报告蛋白的量与细胞杀伤剂的有效性负相关。
实施例2.根据实施例1所述的方法，其中接触步骤在诱导步骤之前进行。
实施例3.根据实施例1所述的方法，其中接触步骤与诱导步骤同时进行。
实施例4.根据实施例1或2所述的方法，其中接触步骤在诱导步骤之前进行至少约24小时。
实施例5.根据实施例4所述的方法，其中接触步骤在诱导步骤之前进行约4至约48小时。
实施例6.根据实施例1所述的方法，其中接触步骤在诱导步骤之前进行长达约6天。
实施例7.根据实施例1-6中任一项所述的方法，其中诱导步骤进行约4-8小时。
实施例8.根据实施例1-7中任一项所述的方法，其中诱导步骤包括用诱导剂处理所述肿瘤细胞。
实施例9.根据实施例8所述的方法，其中所述诱导剂选自由以下组成的组：四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸或其任意组合。
实施例10.根据实施例1-9中任一项所述的方法，其中所述报告蛋白由所述肿瘤细胞分泌。
实施例11.根据实施例10所述的方法，其中所述报告蛋白是荧光素酶。
实施例12.根据实施例10所述的方法，其中所述报告蛋白选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。
实施例13.根据实施例1-12中任一项所述的方法，其中确定步骤包括在不同的时间点检测所述报告蛋白。
实施例14.根据实施例1-13中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞存在于包含第二细胞群的混合物中。
实施例15.根据实施例14所述的方法，其中所述第二细胞群选自由成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞或其任意组合/变体或其任意组合组成的组。
实施例16.根据实施例1-15中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞存在于3D球状体或2D单层中。
实施例17.根据实施例1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂选自由以下组成的组：细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物，或其任意组合。
实施例18.根据实施例1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂是免疫细胞。
实施例19.根据实施例18所述的方法，其中所述免疫细胞选自由NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。
实施例20.根据实施例1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂是免疫调节剂，并且其中接触步骤在免疫细胞的存在下进行。
实施例21.根据实施方式20所述的方法，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
实施例22.根据实施例21所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA、CTLA-4和CD20或其任意组合组成的组。
实施例23.根据实施例1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂是抗体。
实施例24.根据实施例24所述的方法，其中所述抗体选自由抗PD-1、抗PD-L1、抗CD47、抗HER2、赫赛汀、抗CD20和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。
实施例25.根据实施例1-24中任一项所述的方法，其中所述核酸通过逆转录病毒或慢病毒载体系统被引入到细胞中。
实施例26.根据实施例1所述的方法，其中所述肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白的第二核酸。
实施例27.根据实施例26所述的方法，其中所述第二核酸的表达由诱导型启动子控制。
实施例28.根据实施例27所述的方法，其中第二报告蛋白是GFP。
实施例29.一种组合物，所述组合物包含：肿瘤细胞群，其中每个肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子控制。
实施例30.根据实施例29所述的组合物，其中所述报告蛋白由肿瘤细胞分泌。
实施例31.根据实施例29或30所述的组合物，其中所述报告蛋白是荧光素酶。
实施例32.根据实施例31所述的组合物，其中所述荧光素酶是选自由以下组成的组的荧光素酶：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。
实施例33.根据实施例29-32中任一项所述的组合物，其中组合物进一步包含第二细胞群。
实施例34.根据实施例33所述的组合物，其中所述第二细胞群选自由成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源性抑制细胞、或其任意组合/变体、或其任意组合组成的组。
实施例35.根据实施例29-34中任一项所述的组合物，其中所述组合物是3D球状体或2D单层。
实施例36.根据实施例29-35中任一项所述的组合物，其进一步包含细胞杀伤剂。
实施例37.根据实施例36所述的方法，其中所述细胞杀伤剂选自由以下组成的组：细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物，或其任意组合。
实施例38.根据实施例36所述的组合物，其中所述细胞杀伤剂是免疫细胞。
实施例39.根据实施例38所述的组合物，其中所述免疫细胞选自由NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。
实施例40.根据实施例36所述的组合物，其中所述细胞杀伤剂是免疫调节剂，并且其中接触步骤在免疫细胞的存在下进行。
实施例41.根据实施例40所述的组合物，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
实施例42.根据实施例41所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA、CTLA-4和CD20或其任意组合组成的组。
实施例43.根据实施例36所述的组合物，其中所述细胞杀伤剂是抗体。
实施例44.根据实施例43所述的组合物，其中所述抗体选自由抗PD-1、抗PD-L1、抗CD47、抗HER2、赫赛汀、抗CD20和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。
实施例45.根据实施例29-44中任一项所述的组合物，其进一步包含选自由以下组成的组的诱导剂：四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸或其任意组合。
实施例46.根据实施例29-45中任一项所述的组合物，其进一步包含由肿瘤细胞分泌的报告蛋白。
实施例47.根据实施例46所述的组合物，其中所述报告蛋白是荧光素酶。
实施例48.根据实施例47所述的组合物，其中所述荧光素酶是选自由以下组成的组的荧光素酶：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶、分泌型荧光蛋白和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。
实施例49.根据实施例29-48中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白的第二核酸。
实施例50.根据实施例49所述的组合物，其中所述第二报告蛋白包含细胞内荧光蛋白。
实施例51.根据实施例50所述的组合物，其中所述第二蛋白质是GFP。
实施例52.根据实施例29-51中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含免疫调节剂，并且其中所述组合物进一步包含免疫细胞。
实例
以下实例是以举例说明的方式而非限制的方式提供的。
实例1：用于表达双重报告snLuciferase和GFP的分子构建体
所述实例显示了用于在Tet-on系统(以下被称为“Tet-on snLuc-GFP构建体”)下表达双重报告蛋白(即荧光素酶和GFP)的示例性分子构建体“pHR-eGFP-T2A-secNluc-tetOCMV:EF1αtet”。如图2所示，在没有诱导剂如多西环素的情况下，Tet阻遏物(repressor)在EF1α启动子下组成型表达，并在CMV启动子下抑制报道基因的转录。添加多西环素(“dox”)可活化双重标记物GFP和snLuciferase的转录。将所述构建体克隆到自灭活(SIN)慢病毒载体中，并转导到各种肿瘤细胞系(以下被称为“双重报告肿瘤细胞”)中用于后续实验。
实例2：在与免疫效应细胞共培养条件下(非特异性杀伤)，肿瘤细胞中产生的GFP信号与活肿瘤细胞的数量成比例
所述实例表明，由样品中的双重报告肿瘤细胞产生的GFP信号与所述样品中的活肿瘤细胞的数量成比例。用实例1中的Tet-on snLuc-GFP构建体转导SK-BR-3细胞(人乳腺癌细胞系)，以在dox诱导系统下表达GFP和snLuciferase(以下被称为“双重报告SK-BR-3细胞”)。NK92-MI(
Figure BDA0003561933820000671
CRL-2408)细胞(天然杀伤细胞系)在不同浓度的双重报告SK-BR-3细胞(连续稀释2倍，范围从每孔约5000个细胞至约313个细胞)存在下，以15,000个细胞/孔被涂铺在96孔板中。不添加细胞杀伤剂。NK细胞可以通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)识别肿瘤细胞上的MHC来进行非特异性杀伤。在多西环素诱导24小时后，使用NikonEllipse TE2000-U显微镜分析双重报告SK-BR-3细胞。使用从ImageJ获得的校正的总细胞荧光(CTCF)测量值对GFP信号强度进行量化。发现GFP强度与活的双重报告SK-BR-3细胞的数量线性相关(R2＝0.952)，如图3A-3B所示。这些结果表明，在本公开的方法中，GFP可以用作监测活肿瘤细胞的半定量标记物。
实例3：snLuciferase可以作为活肿瘤细胞的半定量标记物
所述实例表明，从样品中的双重报告肿瘤细胞产生的snLuciferase信号与所述样品中活肿瘤细胞的数量相关。用实例1中的Tet-on snLuc-GFP构建体转导表达可变量的HER2抗原的五种靶肿瘤细胞系(具有高HER2表达的人乳腺癌细胞系SK-BR-3、具有中等HER2表达的人前列腺癌细胞系LnCAP、具有低HER2表达的人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231、具有类似于健康组织细胞的正常HER2表达的人乳腺癌细胞系MCF-7、以及不具有HER2表达的人乳腺癌细胞系MDA-MB-468)，以在dox诱导系统下表达GFP和snLuciferase。将转导的肿瘤细胞以不同的浓度涂铺在96孔锥形底板中，并从每孔约50,000至约50个细胞连续稀释2倍。在多西环素诱导后24小时，使用GloMax Discover微孔板读取器测量snLuciferase。还在非doxed条件下分析这些双重报告肿瘤细胞以确定snLuciferase的基础表达水平(即渗漏性)。线性回归图是从四个重复测量中生成的，如图4A所示。观察到snLuciferase发光与活肿瘤细胞的数量之间的线性关系，表明snLuciferase可以作为半定量标记物以在本公开的方法中监测活肿瘤细胞。
图4B显示诱导可以将snLuciferase的表达增加约50倍至约850倍。snLuciferase报告物的高基础表达水平可以对检测的灵敏度产生负面影响，特别是对于需要较长培育时间(即多天)的方法。严格控制报告蛋白的表达有助于降低本公开的方法中的背景噪声。
实例4：使用snLuciferase测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
所述实例显示本公开的方法可以用于基于snLuciferase测量来测定抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。将15,000个NK92细胞(效应细胞)和如在实例2中构建的5,000个双重报告SK-BR-3细胞(乳腺癌肿瘤细胞)涂铺在96孔锥形底板中，产生3:1的效应细胞与肿瘤细胞比率。将连续稀释2倍的不同浓度的
Figure BDA0003561933820000681
(抗HER2抗体)添加到实验孔中(100％相对效力被定义为10ng/mL-0.31ng/mL抗体)。对照孔不提供
Figure BDA0003561933820000682
将细胞杀伤反应培育8小时。在8小时培育后，将多西环素添加到细胞混合物中以诱导来自剩余的双重报告SK-BR-3细胞的双重报告物的表达。多西环素诱导24小时后，使用GloMax Discover微孔板读取器测量snLuciferase。细胞存活百分比被计算为含有
Figure BDA0003561933820000683
的孔中的相对光单位(RLU)与不含
Figure BDA0003561933820000684
的对照孔中的RLU的比率。剂量应答曲线由四次重复生成，如图5所示。ADCC活性以50％、75％、100％和125％的相对效力区分。效力与不同浓度的抗体有关(即，在125％效力下测试的最高剂量是12.5ng，在100％效力下测试的最高剂量是10ng，在75％效力下测试的最高剂量是7.5ng，在50％效力下测试的最高剂量为5ng)。如图5所示，当与效应细胞NK92共同培育时，
Figure BDA0003561933820000689
在双重报告SK-BR-3细胞上显示出浓度依赖性ADCC。这些结果证明本公开的snLuciferase和伴随方法可以用作灵敏的、半定量标记物以监测ADCC活性。
实例5：使用GFP测量抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)
所述实例显示本公开的方法可以用于基于GFP测量来测定ADCC。将15,000个NK92细胞(效应细胞)和如在实例2中构建的5,000个双重报告SK-BR-3细胞(肿瘤细胞)涂铺在96孔锥形底板中，产生3:1的效应细胞与肿瘤细胞的比率。将系列稀释2倍(范围从10ng/mL-0.31ng/mL)的不同浓度的
Figure BDA0003561933820000685
添加到实验孔中。对照孔未提供
Figure BDA0003561933820000686
(0ng/mL)。将细胞杀伤反应培育8小时。在培育8小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中以诱导来自剩余的双重报告SK-BR-3细胞的双重报告物的表达。多西环素诱导后24小时，使用NikonEllipse TE2000-U显微镜分析肿瘤细胞的GFP，并且使用GloMax Discover微孔板读取器测量snLuciferase。使用ImageJ量化GFP信号。细胞存活百分比被计算为含有
Figure BDA0003561933820000687
的孔中校正的总细胞荧光(CTCF)与不含
Figure BDA0003561933820000688
的对照孔中CTCF的比率。观察到GFP信号与抗体浓度之间的剂量依赖性关系，如图6A-6B所示。这些结果表明GFP可以作为标记物以观测和监测ADCC。
对于snLuciferase测量，细胞存活百分比被计算为含有
Figure BDA0003561933820000691
的孔中的相对光单位(RLU)与不含
Figure BDA0003561933820000692
的对照孔中的RLU的比率。如图6B所示，由snLuciferase测量产生的剂量应答曲线从由GFP测量产生的曲线向左移动，这可以通过难以获得定量荧光显微镜测量结果来解释。因此，snLuciferase可以作为比GFP更敏感的半定量标记物。
实例6：使用snLuciferase测量由免疫疗法介导的免疫效应细胞杀伤
所述实例表明，通过免疫治疗剂的细胞杀伤取决于细胞杀伤剂的类型、细胞杀伤剂的剂量、肿瘤细胞的抗原表达水平(细胞类型)和测定中使用的效应子与靶的比率。在5,000或50,000个未刺激的PBMC(效应细胞)的存在下，将如实例3中构建的表达不同量的HER2抗原的双重报告肿瘤细胞系SK-BR-3(高HER2表达)、LnCaP(中等HER2表达)、MDA-MB-231(低HER2表达)、MCF-7(与健康组织细胞相似的正常HER2表达)和MDA-MB-468(无HER2表达)以5,000个肿瘤细胞/孔被涂铺到96孔锥形底板的孔中，导致肿瘤细胞与效应细胞的比率为1:1或1:10。将各种抗体(单克隆抗HER2抗体
Figure BDA0003561933820000693
双特异性抗HER2/抗CD3抗体和三特异性抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体)以不同的浓度(5倍连续稀释，范围从200ng/mL到0.0128ng/mL)添加到细胞的混合物中。对照孔不提供抗体。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中以诱导来自活的双重报告肿瘤细胞的双重报告物的表达。多西环素诱导后24小时，取出细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上监测发光。剂量应答曲线由两次重复测量生成。如图如图7A-7D所示，基于本公开的方法的细胞杀伤应答取决于所使用的抗体的类型、抗体的剂量、肿瘤细胞的抗原表达水平以及效应子与靶的比率。
图7A显示本公开的方法可以通过
Figure BDA0003561933820000694
介导的ADCC通过未刺激的PBMC中CD16(Fc受体，“FcR”)阳性细胞(即NK和NKT细胞)检测抗原依赖性(HER2)和剂量依赖性杀伤。如图7A和7D所示，
Figure BDA0003561933820000695
介导的效应细胞对表达高HER2水平的肿瘤细胞的ADCC强于表达低HER2水平的肿瘤细胞(比较SK-BR-3、LnCAP和MDA-MB-231)；肿瘤与效应细胞的比率越小(即，效应细胞越多)，ADCC效应越强(例如，将MDA-MB-231组中的1:10与1:1进行比较)。
Figure BDA0003561933820000696
在具有正常HER2表达的肿瘤细胞(如在健康组织细胞(MCF-7)中)上或在不表达HER2的肿瘤细胞(MDA-MB-468)上不介导效应细胞的抗体浓度依赖性ADCC。在MCF-7和MDA-MB-468细胞中在1:10和1:1的肿瘤与效应细胞的比率下的不同细胞存活率可能是由于通过PBMC的
Figure BDA0003561933820000697
的非依赖性细胞杀伤(例如，NK细胞非特异性杀伤)。
本实验中使用的双特异性抗HER2/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。图7B显示本公开的方法可以通过未刺激的PBMC中的CD3阳性细胞(即T细胞)检测抗原依赖性(HER2)和剂量依赖性细胞杀伤。如图7B和7D所示，双特异性抗HER2/抗CD3抗体将CD3+效应细胞靶向HER2+肿瘤细胞以用于细胞杀伤，对表达高HER2水平的肿瘤细胞的细胞杀伤作用强于表达低HER2水平的肿瘤细胞(比较SK-BR-3、LnCAP和MDA-MB-231)；肿瘤与效应细胞的比率越小(即，效应细胞越多)，细胞杀伤作用越强(例如，将MDA-MB-231组中的1:10与1:1相比)。双特异性抗HER2/抗CD3抗体在具有正常HER2表达的肿瘤细胞上(如在健康组织细胞中(MCF-7))，或在不表达HER2的肿瘤细胞(MDA-MB-468)上不介导抗体浓度依赖性效应细胞杀伤。在MDA-MB-468细胞中，在1:10和1:1的肿瘤与效应细胞比率下不同的细胞存活率可能是由于通过PBMC(例如NK细胞)的抗体依赖性非特异性细胞杀伤—E:T比率越高，非特异性细胞杀伤越高。
本实验中使用的三特异性抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。所有肿瘤细胞系均表达CD47(在SK-BR-3、MDA-MB-231、LnCaP、MCF-7和MDA-MB-468细胞中相对较高)和/或PD-L1(在MDA-MB-231中较高，并且在SK-BR-3、LnCaP、MCF-7和MDA-MB-468中低/无)。还参见图15C。图7C显示本公开的方法可以通过未刺激的PBMC中的CD3阳性细胞(即T细胞)检测抗原依赖性(PD-L1或CD47)和剂量依赖性杀伤。如图7C-7D所示，对于几乎所有测试的肿瘤细胞，肿瘤与效应细胞的比率越小(即，效应细胞越多)，细胞杀伤作用越强。然而，较高的非特异性杀伤(例如，来自NK细胞)与较小的肿瘤与效应细胞比率相关。
实例7：通过监测snLuciferase测量由免疫疗法介导的T细胞杀伤的动力学
所述实例表明，本公开的方法允许随着时间的推移测定免疫疗法介导的肿瘤细胞的效应细胞杀伤。在30,000或150,000个未刺激的PBMC(效应细胞)的存在下，将如实例3中构建的表达不同量的HER2抗原的双重报告肿瘤细胞LnCaP、MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-468以30,000个肿瘤细胞/孔涂铺到96孔锥形底板的孔中，导致效应细胞与靶细胞的比率为1:1或5:1。将三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)以不同的浓度(连续稀释5倍，从200ng/mL到0.0128ng/mL)添加到细胞中。对照孔不提供抗体。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中以诱导来自活的双重报告肿瘤细胞的双重报告物的表达。在诱导后的不同时间点在GloMax Discover微孔板读取器上监测发光。时间进程由两次重复测量产生。如图8A-8B所示，基于本公开的方法的细胞杀伤活性(例如，由细胞活力反映)可以连续和实时地测量。
三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。包含CD47抗原结合结构域允许三特异性抗体绕过HER2依赖性杀伤(例如，比较图8B和图7B中对MCF-7细胞(正常HER2表达，如健康组织细胞中，高CD47表达)和MDA-MB-468细胞(无HER2表达，高CD47表达)的抗体介导的效应细胞杀伤)。包含CD47抗原结合结构域还允许三特异性抗体与HER2抗原结合结构域协同作用，以实现效应子介导的肿瘤细胞杀伤(例如，比较图8A和图7B中MDA-MB-231(低HER2表达)细胞的1:1的E:T比率的细胞毒性)。图8A-8B显示本公开的方法可以通过CD3阳性细胞(即T细胞)检测抗原依赖性(HER2和/或CD47)和抗体剂量依赖性效应细胞杀伤。如从图8A-8B可以看出，更高的抗体浓度和/或更高的效应细胞与肿瘤细胞的比率可以导致对肿瘤细胞的较强的抗体介导的效应细胞杀伤。
实例8：在3D成纤维细胞球状体中测量肿瘤细胞的抗体介导的T细胞杀伤
本实例表明，可以在多细胞3D球状体中检测到抗体介导的非活化和活化T细胞介导的杀伤。在6,000个人类真皮成纤维细胞的存在下，将如在实例3中构建的双重报告SK-BR-3、LnCaP、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞以6,000个肿瘤细胞/孔涂铺到96孔超低附着板的孔中。将细胞的混合物培育4天以形成3D球状体。在12,000个刺激的或未刺激的PBMC(效应细胞)的存在下，将各种抗体(三特异性抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体或三特异性抗HER 2/抗CD47/抗CD3抗体)以不同的浓度加入到3D球状体中。为了获得不同的浓度，将抗体连续稀释5倍，从200ng/mL到0.0128ng/mL。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中以诱导来自活的双重报告肿瘤细胞的双重报告物的表达。在GloMax Discover微孔板读取器上在不同的时间点监测发光。时间进程图由两次重复测量生成。如图9A-9D所示，可以使用本公开的方法连续监测多细胞3D球状体中抗原依赖性(HER2、PD-L1和/或CD47)和抗体剂量依赖性T细胞介导的杀伤。如从图9A-9D可以看出，更高的抗体浓度和/或PBMC刺激(相对于非刺激)可以导致在3D球状体中形成的肿瘤细胞上更强的抗体介导的效应细胞杀伤。
三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体和三特异性抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体(均为内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。与实例7中讨论的相似，包含CD47抗原结合结构域可以允许三特异性抗体绕过HER2依赖性杀伤(例如，比较图9B和图7B中对MDA-MB-468细胞(无HER2表达，高CD47表达)的抗体介导的效应细胞杀伤或PD-L1依赖性杀伤(例如，比较图9D中对MDA-MB-468细胞(无HER2，高CD47，无PD-L1)相对于MDA-MB-231细胞(低HER2，高CD47，高PD-L1)的抗体介导的效应细胞杀伤。包含CD47抗原结合域也可能允许三特异性抗体与HER2或PD-L1抗原结合结构域协同作用以实现效应子介导的肿瘤细胞杀伤。
实例9：监测联合细胞杀伤剂对T细胞功能的影响
所述实例显示本公开的方法可以量化细胞杀伤剂的组合(即组合疗法，例如如抗PD-1抗体和三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体)对T细胞介导的肿瘤细胞杀伤的作用。在5,000个未刺激的PBMC的存在下，将如在实例3中构建的双重报告MDA-MB-231细胞以5,000个细胞/孔涂铺到96孔锥形底板的孔中。向每个孔中加入不同浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(连续稀释5倍，200ng/mL-0.064ng/mL)，进一步添加或不添加抗PD-1抗体(300ng/mL或1000ng/mL)。三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中以诱导来自活的双重报告MDA-MB-231细胞的双重报告物的表达。多西环素诱导后24小时，获取细胞培养基样品，并在GloMax Discover微孔板读取器上监测发光。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。如图10所示，结果证明本公开的方法可以量化组合的细胞杀伤剂对效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤的作用。如在图10中可以看出，抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体以抗体浓度依赖性方式介导对HER2+MDA-MB-231细胞的T细胞杀伤；抗PD-1抗体增强三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体介导的对HER2+MDA-MB-231细胞的T细胞杀伤；并且提供的抗PD-1抗体越多，细胞毒性越强。这些发现与Chang等人《癌症研究(CancerResearch)》77(19)5384-94(2017)》报告的结果一致，所述结果显示在抗PD-1抗体的存在下，抗Trop-2/抗CD3双特异性抗体介导的T细胞对MDA-MB-231球状体的杀伤的效力增强。
实例10：在联合细胞杀伤剂的存在下监测T细胞介导的肿瘤细胞杀伤动力学
所述实例显示，本公开的方法可以量化联合疗法(即抗PD-1抗体和三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体)随时间对T细胞功能的影响。在5,000个未刺激的PBMC的存在下，将如实例3中构建的双重报告MDA-MB-231细胞以5,000个细胞/孔涂铺到96孔锥形底板的孔中。向每个孔中加入不同浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(200ng/mL或40ng/mL)，进一步加入或不加入不同浓度的抗PD-1抗体(300ng/mL或1000ng/mL)。三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中以诱导来自活的双重报告MDA-MB-231细胞的双重报告物的表达。在诱导后的不同时间点采集细胞培养基样品，并在GloMax Discover微孔板读取器上监测发光。时间进程由三个重复测量生成。如图11所示，结果证明，本公开的方法可以量化组合的细胞杀伤剂随时间对效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤的作用。如在图11中可以看出，抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体的浓度越高，T细胞介导的对HER2+MDA-MB-231细胞的杀伤越强；抗PD-1抗体增强三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体介导的T细胞对HER2+MDA-MB-231细胞的杀伤作用:并且提供的抗PD-1抗体越多，细胞毒性越强(参见40ng/mL三特异性抗体组)。
实例11：总反应时间可以影响细胞杀伤的剂量应答曲线
本实例说明了在研究细胞介导的细胞毒性中使用分泌的诱导型报告物的益处。由于分泌的报告蛋白会随着时间在培养基中积累，因此可以从同一个样品孔中获取多次测量结果。这允许我们分析细胞介导的细胞毒性在总反应时间内和在不同的报告物诱导时间下是如何变化的。将15,000个未刺激的PBMC和如在实例2中构建的5,000个双重报告SK-BR-3细胞(3E:1T)涂铺在具有不同浓度的
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抗体(连续稀释5倍，200ng/mL-0.0128ng/mL)的96孔锥形底板中。通过在不同的时间点添加多西环素来改变报道物表达阶段的时间:抗体、肿瘤细胞和PBMC培育后0、12、24和48小时(图12A中的dox，0、12、24或48小时时)。在加入多西环素后24和48小时(图12A中的luc，24小时时和luc，48小时时)测量snLuciferase。总反应时间被计算为加入多西环素前的培育时间加上测量snLuciferase前的多西环素诱导时间(在图12A中的各图顶部指示)。剂量应答曲线由两次重复生成。如图12A-12B所示，结果表明剂量应答曲线可以随时间变化。如果总反应时间太短，即使报告表达在早期被诱导，检测到的细胞杀伤作用也可能很弱，因为没有经过足够的时间发生细胞溶解(将luc，24小时时和dox，0小时时与图12A-12B中的其它进行比较)。如果总反应时间过长，即使细胞溶解具有足够的时间发生，检测到的细胞杀伤作用也可能很弱，因为大多数靶肿瘤细胞已经被溶解(将dox，48小时时和luc，48小时时与图12A-12B中的其它进行比较)。因此，在总反应时间、诱导报告物表达的时间和报告蛋白检测的时间之间存在良好的平衡。本文描述的诱导型报告系统允许我们优化实验条件并选择细胞毒性被最大化的时间，导致高度灵敏和通用的测定。
实例12：当与原代未刺激的T细胞共培养时，双重报告表达水平与活肿瘤细胞数量相关
将如在实例3中构建的不同浓度的双重报告LnCaP、MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞涂铺在含有15,000个未刺激的原代T细胞的非细胞培养处理的96孔锥形底板中。没有添加另外的细胞杀伤剂。双重报告肿瘤细胞被连续稀释2倍，范围为每孔0-20,000个肿瘤细胞。多西环素在涂铺后立即添加到细胞的混合物中，以诱导双重报告物的表达。多西环素诱导24小时后，使用Nikon Ellipse TE2000-U显微镜分析双重报告肿瘤细胞的EGFP(以及作为实验条件和细胞数量对照的明场)，并使用GloMax Discover微孔板读取器测量snLuciferase。如从图13A-13B中可以看出，snLuciferase和EGFP信号与活的双重报告肿瘤细胞相关，其中snLuciferase与来自0-20,000的活的双重报告肿瘤细胞数量线性相关，并且EGFP与来自0-5,000的活的双重报告肿瘤细胞数量线性相关。与实例5的结果相似，此处的结果表明snLuciferase和EGFP都可以用于量化活肿瘤细胞数量，而snLuciferase可以用作比EGFP更敏感的半定量标记物(与snLuciferase测量相比，EGFP具有有限的线性范围)。
实例13：在效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤测定中优化报告物诱导时间
所述实例说明了报告物表达阶段开始的时间如何可以影响效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤，以及如何优化本发明的实验条件。
将15,000个未受刺激的PBMC和如在实例3中构建的5,000个双重报告MDA-MB-231细胞(3E:1T)涂铺在含有不同浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(连续稀释5倍，200ng/mL-0.0128ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。通过在以下不同的时间点添加多西环素来改变报告物表达阶段的时间：-24小时(在共培育抗体/肿瘤细胞/PBMC前24小时在双重报告MDA-MB-231细胞中诱导dox，以模拟“组成型”表达)，以及与抗体共培育后0、24、48和72小时。多西环素诱导后24小时，从每个孔中取出培养基并使用GloMaxDiscover微孔板读取器测量snLuciferase发光。从三个重复生成剂量应答曲线。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的snLuciferase读数(RLU)。
如图14所示，在“组成型”表达系统中未观察到细胞毒性T细胞介导的肿瘤细胞杀伤，其中在使肿瘤细胞与抗HER2/抗CD47/抗CD3三特异性抗体和PBMC接触前24小时或当在抗体/肿瘤细胞/效应细胞培育(dox，0小时时)的同时加入多西环素，诱导双重报告物表达。然而，当在抗体/肿瘤细胞/效应细胞培育后24、48和72小时添加多西环素时，观察到抗体剂量依赖性细胞杀伤曲线。这些结果表明，通过控制报告蛋白从肿瘤细胞中表达的时间和总反应时间，我们可以优化实验条件并选择细胞毒性被最大化的时间，导致高度灵敏和通用的测定。总反应时间和多西环素诱导时间的优化应根据两个阶段的时间来确定，所述两个阶段为作用阶段，即大多数靶肿瘤细胞被细胞溶解的时间；和检测阶段，即测量报告物的时间。
图14证明本发明的诱导型报告系统优于组成型表达系统(例如，在EF1-α或CMV等的启动子控制下的那些)。如果在细胞溶解具有足够的时间发生之前诱导snLuciferase，则大多数靶细胞将存活并分泌随着时间在培养基中积累的snLuciferase，从而使最终的RLU读数出现偏差。这将导致检测到的肿瘤细胞杀伤的完全丧失(参见“组成型(t＝-24小时)”和dox，0小时时)。所以，本发明的诱导型报告系统允许我们减少与分泌的报告蛋白相关的背景表达。
此外，报告物表达的诱导越晚，检测到的细胞毒性越强。如在图14中看到的，当在抗体/肿瘤细胞/效应细胞培育后48小时加入多西环素时(dox，48小时时)，达到最大细胞毒性，当没有发生足够的细胞溶解时的较早诱导(dox，24小时时)或当更多或大部分细胞已经溶解时的较迟诱导(dox，72小时时)都显示较少的细胞毒性效应。因此，在可诱导系统下表达报告蛋白允许我们优化和选择当细胞毒性被最大化时的时间，导致高度灵敏和通用的测定。
实例14：肿瘤抗原表达水平影响抗体介导的效应细胞对肿瘤细胞的杀伤
本实例评估肿瘤抗原表达水平对效应细胞介导的细胞杀伤的影响。
将15,000个未刺激的PBMC和如在实例3中构建的5,000个双重报告肿瘤细胞(LnCaP、MDA-MB-231和MDA-MB-468)(3E:1T)涂铺在含有不同浓度的双特异性抗HER2/抗CD3抗体或三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(连续稀释5倍，200ng/mL-0.064ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。双特异性抗HER2/抗CD3抗体和三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(均内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中(t＝48小时)，以诱导来自活的双重报告肿瘤细胞的双重报告物的表达。在用多西环素诱导后一天(t＝72小时)获取细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
肿瘤抗原(HER2、CD47、PD-L1)的表达使用FACS测量。简而言之，在4℃下，将肿瘤细胞与
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(用APC抗人IgG二次染色)、Alexa
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647抗人CD47克隆CC2C6(BioLegend，目录号323117)或PE抗人PD-L1克隆MIH3(BioLegend，目录号374511)培育45分钟，并且在使用
Figure BDA0003561933820000753
easyCyte分析前洗涤3次。肿瘤抗原表达水平总结在图15C中：LnCaP(中等HER2，高CD47，无PD-L1)；MDA-MB-231(低HER2、高CD47、高PD-L1)；MDA-MB-468(无HER2，高CD47，无PD-L1)。
如图15A和15D所示，双特异性抗HER2/抗CD3抗体以抗体浓度依赖性和抗原表达水平依赖性方式介导T细胞杀伤—肿瘤抗原(HER2，参见图15C)表达越高，和/或抗体的浓度越高，可以检测到的T细胞介导的肿瘤细胞杀伤越强。这表明本发明中描述的方法可以检测抗原依赖性细胞杀伤。
如图15B和15D所示，向抗HER2/抗CD3抗体中添加抗CD47抗原结合结构域增强了T细胞介导的肿瘤细胞对LnCaP细胞(中等HER2，高CD47)和MDA-MB-231细胞(低HER2，高CD47)的杀伤，并绕过了对MDA-MB-468细胞(无HER2，高CD47)的HER2依赖性杀伤。发现MDA-MB-231细胞对抗体介导的T细胞杀伤表现出一定的抗性，这可能是因为与其它细胞相比，MDA-MB-231细胞上的高PD-L1表达(图15C)。
实例15：效应子与靶细胞的比率影响抗体介导的对双重报告肿瘤细胞的细胞杀伤
将来自不同患者供体的未刺激的PBMC或T细胞和如在实例3中构建的双重报告MDA-MB-231细胞以不同的E:T比率涂铺在具有不同浓度的双特异性抗HER2/抗CD3抗体(连续稀释5倍，200ng/mL-0.0128ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。双特异性抗HER2/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中(t＝48小时)，以诱导来自活肿瘤细胞的双重报告物的表达。在用多西环素诱导后一天(t＝72小时)获取细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
如图16A-16D所示，E:T比率极大地影响抗体介导的效应细胞杀伤—E:T比率越高，细胞毒性越强。所有患者都没有显示出1E:1T比率的CTL杀伤，部分应答在3E:1T的比率出现(供体2和3显示出CTL杀伤，但供体1没有显示出CTL杀伤)，并且所有患者均显示出9E:1T的CTL杀伤。这一结果与以下发现一致：肿瘤微环境(例如，肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的百分比)可以显著影响患者对免疫疗法的应答，并且较高的肿瘤浸润与更好的免疫疗法的临床结果相关。此处的结果还表明，本发明中描述的方法可以检测患者之间的差异，例如，尽管供体1和供体2都用PBMC进行了测试，但只有供体2对抗体介导的CTL杀伤有应答。此外，与实例14(3E:1T)相比，此处的结果表明所述测定可以检测个体供体与供体免疫细胞的差异，并且增加E:T比率可以绕过在MDA-MB-231中观察到的免疫抑制(高PD-L1表达)。
实例16：受刺激的T细胞不能克服在具有高PD-L1表达的双重报告MDA-MB-231细胞中观察到的免疫抑制
未刺激的和刺激的T细胞(效应子)与不同含量的刺激T细胞(0％刺激至100％刺激的T细胞)和如在实例3中构建的双重报告肿瘤细胞(MDA-MB-231和MDA-MB-468)的混合物以1E:1T的比率涂铺在具有不同浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(连续稀释5倍，100ng/mL-0.0064ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中(t＝48小时)，以诱导来自活肿瘤细胞的双重报告物的表达。在用多西环素诱导后一天(t＝72小时)获取细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
如从图17A中可以看出，针对MDA-MB-231细胞，没有观察到抗体介导的T细胞杀伤的显著差异，其中刺激的T细胞相对于未刺激的T细胞的比率不同。然而，抗体介导的针对MDA-MB-468细胞的T细胞杀伤(使用IC50值量化)随着T细胞的混合物中刺激的T细胞数量的增加而增加(图15B-15C)。如图15C所示，MDA-MB-231细胞具有高PD-L1表达，而MDA-MB-468细胞没有PD-L1表达。这些结果表明PD-1/PD-L1通路可能会阻断CTL对肿瘤细胞的活性。这与临床数据一致(Alsaab等人，《药理学前沿(Front Pharmacol.)》2017；8:561)一致，这表明PD-1/PD-L1通路可以阻断CD8+T细胞效应功能。
实例17：调节PD-1/PD-L1阻断可以影响效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤
本实例在体外评估了PD-1/PD-L1阻断对CTL活性的影响，并评估了纳武单抗(抗PD-1抗体)对来自PD-1/PD-L1阻断的CTL活性的挽救作用。
通过共转导如在实例1中构建的Tet-on snLuc-GFP构建体和靶向PD-L1的CRISPR/Cas9构建体，构建了具有PD-L1敲除(KO)的双重报告MDA-MB-231细胞系(以下被称为“双重报告MDA-MB-231PD-L1 KO细胞”或“MDA-MB-231KO”)。通过在超低附着平板中共培养10,000个人类真皮成纤维细胞和10,000个双重报告MDA-MB-231细胞(“MDA-MB-231WT”)或双重报告MDA-MB-231PD-L1 KO细胞持续3天，来生成3D肿瘤成纤维细胞球状体。在球状体形成后，在增加浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(连续稀释5倍，1000ng/mL-0.032ng/mL)的存在下，并且在有或没有抗PD-1抗体纳武单抗(0.5μg/mL)的情况下加入30,000个未刺激的原代T细胞(3E:1T)。对照孔未添加抗体。
通过共转导如在实例1中构建的Tet-on snLuc-GFP构建体和在CMV启动子控制下的PD-L1表达构建体，来构建过表达PD-L1的双重报告MDA-MB-468细胞系(以下被称为“双重报告MDA-MB-468PD-L1过表达细胞”)。将10,000个双重报告MDA-MB-468细胞(“MDA-MB-468WT”)或双重报告MDA-MB-468PD-L1过表达细胞与30,000个未刺激的原代T细胞(3E:1T)在未处理的锥形底板中在增加浓度的三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(连续稀释5倍，200ng/mL-0.0032ng/mL)的存在下共培养。对照孔未添加抗体。
三特异性抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体(内部制造)由于LALA突变而没有Fc功能并且不能介导ADCC。将细胞杀伤反应培育48小时。在培育48小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中(t＝48小时)，以诱导来自活肿瘤细胞的双重报告物的表达。在用多西环素诱导后一天(t＝72小时)获取细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
如在图18A和18C中可以看到的，PD-L1 KO显著地增强了抗体介导的T细胞对双重报告MDA-MB-231细胞的杀伤(比较“231WT”和“231KO”)。与抗PD-1抗体纳武单抗共培育挽救了T细胞对双重报告MDA-MB-231细胞的杀伤(比较“231WT+PD-1Ab”和“231WT”)，并且细胞毒性拯救效果与在PD-L1 KO中看到的T细胞细胞毒性相似或者甚至更好(比较“231WT+PD-1Ab”和“231KO”)。这些结果还表明本发明中描述的方法可以用于检测3D肿瘤-成纤维细胞球状体模型中效应细胞介导的杀伤。如在图18B和18C中可以看到的，PD-L1在MDA-MB-468细胞中的过表达消除了抗体介导的T细胞杀伤作用(比较“468WT”和“468PD-L1”)。这些结果表明，调节PD-1/PD-L1阻断可以影响效应细胞介导的肿瘤细胞杀伤。
总而言之，已经产生了一种可以模拟在体内肿瘤微环境中观察到的免疫抑制的测定系统。本文所述的诱导型报告物测定能够敏感地分析PD-1/PD-L1阻断对CTL杀伤的免疫抑制作用。此外，已证明添加抗PD-1抗体(纳武单抗如
Figure BDA0003561933820000781
)可以挽救对细胞毒性T细胞的免疫抑制。因此，本文所述的系统可以提供以敏感和高通量方式筛选新的和/或改进的免疫疗法候选物的机会。
实例18：优化由NK细胞介导的ADCC的报告物诱导时间
本实例说明了报告物表达阶段开始的时间如何可以影响由NK细胞介导的ADCC，以及如何使用诱导型报告系统最大化ADCC。
将15,000个NK92(CD16+)细胞和如在实例3中构建的5,000个双重报告SK-BR-3细胞(3E:1T)涂铺在具有不同浓度的抗HER2抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0003561933820000791
连续稀释5倍，200ng/mL-0.0128ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。通过在以下不同的时间点添加多西环素来改变报告物表达阶段的时间：-24小时(在共培育抗体/肿瘤细胞/NK92前24小时在双重报告SK-BR-3细胞中诱导dox，以模拟“组成型”表达)，以及抗体/肿瘤细胞/NK92培育后0、4和12小时。在多西环素诱导后24小时，从每个孔中取出培养基并使用GloMaxDiscover微孔读板机测量snLuciferase发光，并且使用Nikon Ellipse TE2000-U显微镜来捕获EGFP信号。从三个重复生成剂量应答曲线。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的snLuciferase读数(RLU)。
如从图19A-19C中可以看到的，snLuciferase可以用作比EGFP更灵敏的半定量标记物。图19A-19D显示NK细胞ADCC是以抗体浓度依赖的方式介导的；并且与通过在使肿瘤细胞与曲妥珠单抗和NK92接触之前至少24小时诱导双重报告表达所代表的“组成型”表达系统相比，或者与当多西环素与抗体/肿瘤细胞/效应细胞培育同时加入时(dox，0小时时)相比，在抗体/肿瘤细胞/效应细胞培育后4小时或12小时加入的多西环素可以获得更强的ADCC。这些结果表明，通过控制总反应时间和报告蛋白从肿瘤细胞中表达的时间，我们可以优化实验条件并选择细胞毒性被最大化的时间，导致高度灵敏和通用的测定。
实例19：肿瘤抗原表达水平影响由NK细胞介导的ADCC
本实例评估了肿瘤抗原表达水平对NK细胞介导的ADCC的影响。
将15,000个NK92(CD16+)细胞和如在实例3中构建的5,000个双重报告肿瘤细胞(SK-BR-3、LnCaP、MDA-MB-231、MCF-7和MDA-MB-468)(3E:1T)涂铺在具有不同浓度的抗HER2抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0003561933820000792
连续稀释5倍，1000ng/mL-0.32ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。在培育8小时后，将多西环素(t＝8小时)添加到细胞的混合物中以诱导双重报告物的表达。在抗体/肿瘤细胞/NK细胞培育后一天(t＝24小时)获取细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
肿瘤抗原(HER2)的表达使用FACS测量。简而言之，将肿瘤细胞与抗HER2抗体曲妥珠单抗
Figure BDA0003561933820000801
在4℃下培育45分钟并洗涤3次。将细胞与靶向抗-人IgG1的二级抗体在4℃下培育30分钟，并且在分析前用
Figure BDA0003561933820000802
easyCyte清洗3次。将各种癌细胞系的肿瘤抗原表达水平针对MDA-MB-468归一化，MDA-MB-468不表达HER2并用作对照(图20B)。
如图20A-20B所示，由NK细胞介导的ADCC呈抗体浓度依赖性和抗原表达水平依赖性方式—肿瘤抗原(HER2，参见图20B)的表达越高，和/或抗HER2抗体曲妥珠单抗的浓度越高，可以检测到的在肿瘤细胞上的NK细胞介导的ADCC越强。不表达HER2的双重报告基MDA-MB-468细胞用作没有观察到ADCC的对照。这些结果表明，本发明中描述的方法可以以灵敏的方式检测抗原依赖性ADCC，这优于通常需要在肿瘤靶细胞上非常高的抗原表达水平的其它已知ADCC测定。
实例20：效应子与靶细胞的比率影响双重报告肿瘤细胞上的ADCC
将来自不同患者供体的未刺激的PBMC和如在实施3中构建的双重报告SK-BR-3细胞以不同的E:T比率涂铺在含有不同浓度的抗HER2抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0003561933820000803
连续稀释5倍，1000ng/mL-0.32ng/mL)的96孔锥形底板中。对照孔未添加抗体。在培育8小时后，将多西环素(t＝8小时)添加到细胞的混合物中以诱导双重报告物的表达。在抗体/肿瘤细胞/PBMC培育后一天(t＝24小时)获取细胞培养基，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
如图21A-21D所述，E:T比率极大地影响通过PBMC的曲妥珠单抗介导的ADCC—E:T比率越高，ADCC越强(用IC50表示)。在5E:1T比率下观察到部分应答(供体2和4显示ADCC，但供体1和3没有显示ADCC)，并且所有患者在10E:1T和25E:1T显示ADCC。这一结果以下发现一致：肿瘤微环境(例如，肿瘤中的百分比效应免疫细胞)可以显著影响患者对免疫疗法的应答，并且较高的肿瘤浸润与更好的免疫疗法的临床结果相关。此处的结果还表明，本发明中描述的方法可以检测患者之间的差异，参见供体2和4显示通过PBMC的不同水平的ADCC，但供体1和3没有。设计实验条件时应牢记较高的E:T比率也可能导致较高水平的非特异性杀伤。
实例21：在癌症患者血清存在下对曲妥珠单抗的ADCC进行量化
将15,000个NK92(CD16+)细胞和如在实例3中构建的5,000个双重报告SK-BR-3细胞(3E:1T)涂铺在96孔锥形底板中，所述锥形底板具有在含有10％FBS(“对照”)的培养基或含有1/10最终稀释度的人类癌症患者血清(“血清”)的培养基中的不同浓度的抗HER2抗体曲妥珠单抗(
Figure BDA0003561933820000811
连续稀释2倍，1000ng/mL-0.122ng/mL)。对照孔未添加抗体。在培育24小时后，将多西环素添加到细胞的混合物中(t＝24小时)，以诱导来自活肿瘤细胞的双重报告物的表达。在用多西环素诱导后一天(t＝48小时)获取细胞培养基，并在GloMaxDiscover微孔板读取器上测量发光。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的发光读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
患者血清含有IgG的混合物，其可以竞争与NK细胞上的CD16结合，因此大多数ADCC测定使用较高的1/20稀释度。如图22A-22B所示，即使在大量患者血清(1/10稀释度)下也可以检测到NK细胞介导的对双重报告肿瘤细胞的ADCC活性，并且在存在对照血清和患者血清的情况下测量的ADCC没有显著差异(参见图22B)。这表明本发明中描述的方法和测定系统可以用作检测患者血清中ADCC的有用临床工具。
实例22：曲妥珠单抗在3D肿瘤球状体中的ADCC的评估
通过在超低附着板中培养10,000个如在实例3中构建的双重报告LnCaP细胞持续3天来产生3D肿瘤球状体。在球状体形成后，在增加浓度的抗HER2抗体曲妥珠单抗
Figure BDA0003561933820000812
连续稀释5倍，1000ng/mL-0.32ng/mL)的存在下，加入30,000个NK92(CD16+)细胞(3E:1T)。对照孔未添加抗体。在培育12小时后，向反应中加入多西环素(t＝12小时)以诱导来自活肿瘤细胞的双重报告物的表达。在用多西环素诱导后(t＝24、48和72小时)每天获取细胞培养基样品，并在GloMax Discover微孔板读取器上测量发光。使用Nikon EllipseTE2000-U显微镜在相同的时间点监测EGFP信号。细胞存活百分比被定义为相对于没有抗体的平均读数在各种抗体浓度下的信号读数。从三个重复测量中生成剂量应答曲线。
图23A和23C展示了NK细胞介导的ADCC可以通过荧光信号EGFP随时间的变化而观测。图23C-23D展示了NK细胞介导的ADCC可以通过以抗体浓度依赖性方式和/或随时间变化的snLuciferase信号的变化而观测(图23D)。此外，图23B-23C表明snLuciferase可以用作比EGFP更敏感的半定量标记物。这些结果表明，本发明的方法可用于以灵敏的方式在3D肿瘤球状体模型中检测NK细胞介导的ADCC。
总而言之，此处提供的实例表明CD8+T细胞(CTL)和自然杀伤(NK)细胞在抗癌免疫应答中起关键作用。细胞接触依赖性细胞毒性是T细胞和NK细胞应答的标志。此处，我们开发了一种基于细胞的细胞毒性测定，其可以在正常培养条件和3D球状体模型中测量通过CTL和NK细胞的肿瘤的细胞溶解作用，这将是筛选和评定新的治疗策略的疗效的有价值的工具。此处提供的数据表明，即使在低抗原表达水平下，也可以使用所述的方法和系统来检测抗原依赖性ADCC—这表明此处提供的诱导型报告系统可以以灵敏的方式监测ADCC活性。此外，我们提供的证据表明，ADCC可以在3D肿瘤模型和高浓度患者血清中使用本文所述的测定进行量化和监测，由于当前ADCC测定的低灵敏度，它们难以检测到。此处的测定和系统在检测高浓度的患者血清中的ADCC方面的能力表明它们可以用作评估潜在疫苗的效力的有用工具。

Claims (57)

1.一种评估细胞杀伤剂对肿瘤细胞群的有效性的方法，所述方法包括：
a.使所述肿瘤细胞与细胞杀伤剂接触，其中每个所述肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子控制；
b.诱导所述核酸的表达以产生所述报告蛋白；和
c.确定所述报告蛋白的量，
其中所述报告蛋白的量与所述细胞杀伤剂的有效性负相关。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤在所述诱导步骤之前进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触步骤与所述诱导步骤同时进行。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述接触步骤在所述诱导步骤之前进行至少约24小时。
5.根据权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在所述诱导步骤之前进行约24至约48小时。
6.根据权利要求1、2和4中任一项所述的方法，其中所述接触步骤在所述诱导步骤之前进行长达约6天。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述诱导步骤进行约4至约48小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述诱导步骤包括用诱导剂处理所述肿瘤细胞。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述诱导剂选自由四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸(cumate)或其任意组合组成的组。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述报告蛋白由所述肿瘤细胞分泌。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述报告蛋白选自由荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和分泌型荧光蛋白或其任意组合组成的组。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述荧光素酶选自由深海虾荧光素酶(Oplophorus luciferase)、甲虫荧光素酶(beetle luciferase)、海肾荧光素酶(Renillaluciferase)、长腹水蚤荧光素酶(Metridia luciferase)、高斯荧光素酶(Gaussialuciferase)和NANOLUC荧光素酶或其任意组合组成的组。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述确定步骤包括在不同的时间点检测所述报告蛋白。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞存在于包含第二细胞群的混合物中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二细胞群选自由成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源抑制细胞或其任意组合/变体或其任意组合组成的组。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞存在于3D球状体或2D单层中。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂选自由细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物或其任意组合组成的组。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂是免疫细胞。
19.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂是免疫调节剂，并且其中所述接触步骤在免疫细胞的存在下进行。
20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述免疫细胞选自由自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子。
23.根据权利要求1至16和19至22中任一项所述的方法，其中所述细胞杀伤剂是抗体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述抗体选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。
25.根据权利要求23或24所述的方法，其中所述抗体是多特异性的。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体是抗HER2/抗CD3抗体、抗HER2/抗CD47/抗CD3抗体或抗PD-L1/抗CD47/抗CD3抗体。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其进一步包括使所述肿瘤细胞与第二细胞杀伤剂接触。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述第二细胞杀伤剂抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二细胞杀伤剂是抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二细胞杀伤剂是靶向所述抑制性检查点分子的siRNA或CRISPR/Cas构建体。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述第二细胞杀伤剂的接触与所述细胞杀伤剂的接触同时进行。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的方法，其中编码所述报告蛋白的所述核酸通过逆转录病毒或慢病毒载体系统被引入到所述肿瘤细胞中。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中每个所述肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白的第二核酸。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二核酸的表达由第二诱导型启动子控制。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述第二核酸的表达也由所述诱导型启动子控制。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的方法，其中所述第二报告蛋白是GFP。
37.根据权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述诱导型启动子和/或所述第二诱导型启动子是TetOn启动子。
38.一种包含肿瘤细胞群的组合物，其中每个所述肿瘤细胞包含编码报告蛋白的核酸，其中所述核酸的表达由诱导型启动子控制。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述报告蛋白由所述肿瘤细胞分泌。
40.根据权利要求38或39所述的组合物，其中所述报告蛋白选自由荧光素酶、分泌型碱性磷酸酶和分泌型荧光蛋白或其任意组合组成的组。
41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述荧光素酶选自由以下组成的组：深海虾荧光素酶、甲虫荧光素酶、海肾荧光素酶、长腹水蚤荧光素酶、高斯荧光素酶和NANOLUC荧光素酶或其任意组合。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含第二细胞群。
43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述第二细胞群选自由成纤维细胞、基质细胞、内皮细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源抑制细胞或其任意组合/变体或其任意组合组成的组。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的组合物，其中所述组合物是3D球状体或2D单层。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的组合物，其进一步包含细胞杀伤剂。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述细胞杀伤剂选自由细胞毒素、药物、小分子和小分子化合物或其任意组合组成的组。
47.根据权利要求45所述的组合物，其中所述细胞杀伤剂是免疫细胞。
48.根据权利要求45所述的组合物，其中所述细胞杀伤剂是免疫调节剂，并且其中所述组合物进一步包含免疫细胞。
49.根据权利要求47或48所述的组合物，其中所述免疫细胞选自由NK细胞、NKT细胞、T细胞、CAR-T细胞、CD14+细胞、树突细胞和PBMC细胞或其任意组合组成的组。
50.根据权利要求48或49所述的组合物，其中所述免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
51.根据权利要求50所述的组合物，其中所述免疫检查点抑制剂抑制选自由PD-1、PD-L1、PD-L2、Siglec、BTLA和CTLA-4或其任意组合组成的组的抑制性检查点分子。
52.根据权利要求45和48至51中任一项所述的组合物，其中所述细胞杀伤剂是抗体。
53.根据权利要求52所述的组合物，其中所述抗体选自由抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CD47抗体、抗HER2抗体、抗CD20抗体和抗CD3抗体或其任意组合组成的组。
54.根据权利要求38至53中任一项所述的组合物，其进一步包含选自由四环素、多西环素、雌激素受体和4-异丙基苯甲酸或其任意组合组成的组的诱导剂。
55.根据权利要求38至54中任一项所述的组合物，其进一步包含由所述肿瘤细胞分泌的报告蛋白。
56.根据权利要求38至55中任一项所述的组合物，其中每个所述肿瘤细胞进一步包含编码第二报告蛋白的第二核酸。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述第二报告蛋白是GFP。
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