CN111748580A

CN111748580A - 一种检测免疫检查点抗体活性的方法

Info

Publication number: CN111748580A
Application number: CN201910244673.4A
Authority: CN
Inventors: 黄俊杰; 吴晓云; 李胜峰; 俞金泉
Original assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Current assignee: Bio Thera Solutions Ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN111748580B

Abstract

本发明涉及一种检测免疫检查点抗体活性的方法，包括a)准备抗原呈递类似细胞，抗原呈递类似细胞表面上展示T细胞受体激活物和免疫检查点配体；b)准备效应细胞，效应细胞在其表面上展示T细胞受体和免疫检查点受体，效应细胞的基因组中整合有报告基因；T细胞受体激活物与T细胞受体相互作用，免疫检查点配体与免疫检查点受体相互作用，可激活或抑制报告基因表达报告蛋白；c)培养抗原呈递类似细胞和效应细胞，并加入抗体；抗体为待检测的免疫检查点抗体；以及d)检测所述报告蛋白的信号，以指示抗体。从而实现快速高效地检测免疫检查点抗体活性的目的。

Description

一种检测免疫检查点抗体活性的方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种检测免疫检查点抗体活性的方法。

背景技术

在肿瘤学领域，通过对免疫检查点阻断治疗多种恶性肿瘤患者取得了很大的成功。免疫检查点阻断治疗方式主要是开发针对免疫检查点靶标的抗体，这些抗体可以是激动剂也可以是拮抗剂。这些靶标可以是存在于肿瘤细胞表面也可以是存在于T细胞、NK细胞等细胞表面。通过这些抗体的作用可以恢复T细胞或NK细胞的功能，从而增强对肿瘤的免疫。常见的这些免疫检查点靶标有B7-1、B7-2、CD28、CTLA-4、PD-1、PD-L1、LAG-3、TIGIT、TIM-3、VISTA、ICOS等等，这些靶标都属于免疫检查点超家族成员(Rennert 2016)。

TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，有免疫球蛋白和免疫受体酪氨酸抑制基序的T细胞免疫受体)作为一种新发现的免疫检查点受体(Yu,Hardenet al.2009)，进年来越来越受到国内外制药公司和研究机构的青睐。TIGIT表达在激活的T细胞和NK细胞表面，其主要配体PVR(Poliovirus receptor，脊髓灰质炎病毒受体)表达肿瘤细胞表面、抗原递呈细胞表面、感染的细胞表面(Johnston,Comps-Agrar et al.2014,Pauken and Wherry 2014,Martinet and Smyth 2015,Blake,Dougall et al.2016)。随着对TIGIT靶点的深入研究，发现阻断TIGIT与其配体PVR不仅可以恢复CD8+T细胞的功能(Johnston,Comps-Agrar et al.2014)，也可以恢复NK细胞(Natural killer cell，自然杀伤细胞)的功能，而NK细胞功能的恢复不仅仅发挥直接的抗肿瘤作用，而且对CD8+T细胞正常功能的发挥有着至关重要的辅助作用(Zhang,Bi et al.2018)，整体上提高免疫系统对肿瘤的免疫能力，这个靶点的优势是PD-1/PD-L1、CTLA-4靶点所不具备的，因此开发此靶点的抗体药物也许具有很好的治疗前景和市场前景。已经有很多制药公司将抗TIGIT抗体推入到临床阶段，治疗手段为单药或和其它药物联用。抗体的生物学活性实验是在体外模拟信号通路的传导，可以作为在体外评价药效的一种强有力的手段，也可以作为生产上对产品放行品控的一个强有力的质量指标。由于TIGIT所处的信号通路网络中，有多种分子与其直接或间接相互作用，如CD226、CD96、CD122、PVR、CD113等等(Martinet and Smyth 2015)，这就决定了开发TIGIT靶标抗体生物学活性方法的难度。

用于测定针对免疫阻断受体(immunoblockade receptor)的抗体的传统方法具有许多缺点：例如，通过荷瘤小鼠中肿瘤块的表型分析、小鼠的平均存活时间、总体存活率等，动物模型可用于评估单克隆抗体的抗肿瘤效果。这种分析的主要缺点是成本和时间过长。作为替代方案，新鲜分离的外周血单核细胞(PBMC)可用于于研究免疫治疗药物对细胞因子产生的抑制性影响。然而，PBMC的分离是繁琐耗时的，并且这种实验在结果中产生很大的变异性，无法用于治疗性药物产品的放行。有研究者开发了基于细胞水平测定过表达免疫检查点受体的Jurkat细胞中IL-2的产生(基于ELISA方法)，在这种方法体系中用到了2种细胞，一种是人白血病单核细胞THP-1，另一种是过表达人TIGIT(hTIGIT)的工程化的Jurkat细胞(Jurkat-hTIGIT)。THP-1细胞组成型表达PVR(Oosterhoff,Weerd et al.2015)，该细胞可以在通过存在有丝分裂原条件下活化T淋巴细胞(Tsuchiya,Yamabe et al.1980)。THP-1的人类白细胞抗原(HLA)类型有HLA-A*02、HLA-B*15、HLA-C*03、HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*15、HLA-DRB5*01/02、HLA-DQB1*05、HLA-DQB1*06等，这些基因复合物编码主要组织相容性复合体蛋白(MHC)，因此THP-1在一定条件下可以发挥专职性抗原递呈细胞(APC)的功能。Jurkat细胞是用于研究急性T细胞白血病，T细胞信号传导以及易受病毒侵入的各种趋化因子受体(特别是HIV)表达的永生化人T淋巴细胞系。Jurkat细胞具有产生白细胞介素2的能力，并且用于涉及癌症对药物和辐射敏感性的研究。将Jurkat细胞中转染人TIGIT基因，使其过表达hTIGIT分子，然后和THP-1细胞共培养的条件下，就可以研究抗TIGIT抗体存在的情况下对IL-2分泌水平的影响，从而评价anti-TIGIT的生物学功能了解抗体的生物学活性。然而这种测定在需要在抗体刺激后最少48小时候才能进行，总体上需要花费大量的人力和物力。由此可见开发一种简便的，快速的，高效的检测免疫检查点抗体的生物学方法具有很强的迫切性。

发明内容

基于此，有必要针对传统检测免疫检查点抗体活性繁琐、时间长的问题，提供一种检测免疫检查点抗体活性的方法。

在其中一些实施方式中，包括

a)准备抗原呈递类似细胞，抗原呈递类似细胞表面上展示T细胞受体激活物和免疫检查点配体；

b)准备效应细胞，效应细胞在其表面上展示T细胞受体和免疫检查点受体，效应细胞的基因组中整合有报告基因；T细胞受体激活物与T细胞受体相互作用，可激活报告基因表达报告蛋白；免疫检查点配体与免疫检查点受体相互作用，可激活或抑制报告基因表达报告蛋白；

c)培养抗原呈递类似细胞和效应细胞，并加入抗体；抗体为待检测的免疫检查点抗体；以及

d)检测报告蛋白的信号，以指示抗体。

在其中一些实施方式中，T细胞受体激活物为抗分化簇抗体或其片段；优选地，T细胞受体激活物包括序列为SEQ ID NO.3的重链可变区，和序列为SEQ ID NO.7的轻链可变区。

在其中一些实施方式中，T细胞受体激活物与信号肽连接；优选地，信号肽的序列为SEQ ID NO.1。

在其中一些实施方式中，免疫检查点配体选自PVR、PD-L1、PD-L2和B7-H4中的一种或多种；优选地，免疫检查点配体选自PVR和/或PD-L1。

在其中一些实施方式中，免疫检查点受体选自TIGIT、PD-1和CTLA-4中的一种或多种；优选地，免疫检查点受体选自TIGIT和/或PD-1。

在其中一些实施方式中，效应细胞选自T细胞；优选地，效应细胞选自Jurkat、Hut-78、CEM或原代T细胞；更优选地，效应细胞选自Jurkat。

在其中一些实施方式中，报告基因与启动子连接；优选地，启动子为IL-2启动子；更优选地，启动子的序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15；更优选地，启动子的序列为SEQ ID NO.14。

在其中一些实施方式中，报告基因包含编码以下蛋白质的基因：

荧光素酶、β-内酰胺酶、CAT、SEAP、荧光蛋白和可量化基因产物。

在其中一些实施方式中，抗体可抑制免疫检查点配体与免疫检查点受体相互作用。

在其中一些实施方式中，包括

a)准备CHO细胞，CHO细胞在其表面上展示OKT3scFv、PVR和PD-L1；

b)准备Jurkat细胞，Jurkat细胞在其表面上展示TCR、TIGIT、CD226和PD-1，Jurkat细胞的基因组中整合有荧光素酶报告基因；OKT3scFv与TCR相互作用，可激活荧光素酶报告基因表达荧光素酶；PVR与TIGIT相互作用，可抑制荧光素酶报告基因表达荧光素酶；PVR与CD226相互作用，可激活荧光素酶报告基因表达荧光素酶；PD-L1与PD-1相互作用，可抑制荧光素酶报告基因表达荧光素酶；

c)培养CHO细胞和Jurkat细胞，并加入抗体；抗体为待检测的免疫检查点抗体；以及

d)检测荧光素酶的信号，以指示抗体。

本发明通过构建与待检测抗体相关的抗原呈递类似细胞以及效应细胞，并在效应细胞内组合能够表达报告蛋白的报告基因。经待检测抗体与抗原呈递类似细胞的表面蛋白和效应细胞的表面蛋白之间的相互作用，促进报告蛋白的表达，以指示待检测抗体的活性，从而实现快速高效地检测免疫检查点抗体活性的目的。

附图说明

图1为CD33SP-OKT3scFv-CD28TC序列构建示意图。

图2为克隆进了CD33SP-OKT3scFv-CD28TC序列的pCMV2-OKT3质粒图谱。

图3为CHO-OKT3细胞株阳性率检测，a)表示阴性对照，b)表示表达OKT3的细胞。

图4为pBAT-PVR质粒图谱；质粒中，GS cDNA为谷氨酰胺合成酶基因，扩增筛选标记；PVR为目的基因；hCMV为高效启动子；beta-lactamase为氨苄抗生素筛选标记；Poly A为加尾信号；Hind III和EcoR I为限制性酶切位点。

图5为表达PVR的细胞株阳性率检测，a)表示同型对照抗体(Isotype control)，b)表示40nM TIGIT-Fc。

图6为IL-2启动子组成图，包括调控区域和核心启动子区域。

图7为pL-IL2-luc质粒图谱，质粒中插入的IL-2启动子序列含较长调控序列及核心启动子序列。

图8为pM-IL2-luc质粒图谱，质粒中插入的IL-2启动子序列含必要程度的调控序列及核心启动子序列。

图9为pS-IL2-luc质粒图谱，质粒中插入的IL-2启动子序列仅含核心启动子序列。

图10为不同长度IL-2信号肽功能鉴定，包括较长长度IL-2启动子(L-IL-2启动子)，中等长度IL-2启动子(M-IL-2启动子)，较短长度IL-2启动子(S-IL-2启动子)。

图11为成功转染荧光素酶表达元件的细胞株筛选。

图12为pCHO1.0-TIGIT/CD226质粒图谱，该质粒中包含全长的人TIGIT序列和全长的人CD226序列。

图13为细胞膜同时展示TIGIT和CD226细胞株筛选。已转染有IL2启动子和荧光素酶报告基因Jurkat细胞膜表面展示TIGIT分子和CD226分子，a)一抗为同型对照抗体(Isotype control)，二抗为anti-human Fc PE；b)检测CD226分子表达，一抗使用anti-CD226PE(R&D Systems,Inc.#FAB666P)，细胞阳性率为12.7％；c)使用anti-TIGIT(抗TIGIT抗体)，二抗为anti-human Fc PE，细胞阳性率为22.7％；

图14为TIGIT抗体生物学活性检测模型示意图。此系统含抗原递呈细胞类似细胞(sAPC)和效应免疫细胞(CTI-Jurkat)

图15为抗TIGIT抗体生物学活性检测。

图16为sAPC-PD-L1阳性率检测。a)为同型对照抗体(Isotype control)；b)为40nManti-PD-L1(抗PD-L1抗体)。

图17为CTP-Jurkat阳性率检测。a)为同型对照抗体(Isotype control)；b)为40nManti-PD-1(抗PD-1抗体)。

图18应用TIGIT/PVR和PD-1/PD-L1双信号通路系统检测抗体生物学活性模型示意图。此系统含抗原递呈细胞类似细胞(sAPC-PD-L1)和效应免疫细胞(CTP-Jurkat)。

图19为TIGIT和/或PD-1靶点抗体生物学活性检测。

图20为TIGIT和/或PD-L1靶点抗体生物学活性检测。

具体实施方式

定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语、符号及其它科学术语旨在具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解的含义的术语在本文中被定义，用以清晰和/或方便参阅，并且在本文中纳入这种定义不一定被解释为与此领域中一般理解的不同。本文中所述或参考的技术和程序一般都是被充分理解的并且通常由本领域技术人员使用常规方法来运用。

术语“免疫检查点受体”(“ICR”)是指免疫细胞(例如，T细胞、Jurkat细胞等)上的表面受体蛋白，当与其配体结合时，调节细胞的免疫活性。本发明主要采用“抑制免疫检查点受体”，在配体与受体结合时，其抑制细胞免疫活性。“抑制免疫检查点受体”包括但不限于PD-1、CLA-4、TIGIT、LAG-3、TIM-3、CD160等。

术语“免疫检查点配体”(“ICL”)是指免疫检查点受体的配体。“免疫检查点配体”通常是抗原呈递细胞(APC)上的表面展示蛋白。通过与免疫细胞展示的ICR的相互作用，调节免疫细胞对抗原呈递细胞的免疫应答。结合抑制免疫检查点受体的ICL包括但不限于PD-L1、PD-L2、B7-H4、PVR等。

“免疫检查点”、“检查点途径”和“免疫检查点途径”是指这样的途径，通过所述途径免疫检查点配体与免疫检查点受体的结合调节免疫细胞(例如，T细胞、Jurkat细胞、HuT-78、CEM、Molt-4等)活化的幅度和质量。

“免疫检查点阻断”是指通过施用或表达“阻断剂”来抑制免疫检查点途径。通常，“阻断剂”阻止免疫检查点受体和配体的相互作用，从而抑制检查点途径。阻断剂可以是结合于免疫检查点配体或免疫检查点受体并抑制ICR/ICL复合物形成的小分子、肽、抗体或其片段等。阻断剂还可以通过阻止ICR/ICL复合物的信号传导来起作用。

术语“抗原呈递类似细胞”是指通过人工的设计，工程化以表达外源基因的细胞，让细胞高表达免疫检查点配体和/或激活T细胞的分子。

术语“抗体”是指具有基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的一个或多个多肽的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其又分别限定免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。已知基础免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对具有一个“轻”链(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。每个链的N末端限定了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。

术语“抗体”在本文中以最广泛的含义使用，具体涵盖人、非人(例如，鼠)和人源化单克隆抗体(包括，全长单克隆抗体)、多克隆抗体、单链抗体和抗体片段，只要其展示所需的生物活性即可。抗体可以作为完整的免疫球蛋白或作为多种形式的修饰存在，包括例如FabFc2、Fab、Fv、Fd、(FabN)₂、仅含轻链和重链可变区的Fv片段、含有可变区和部分恒定区的Fab或(Fab)N₂片段、单链抗体(例如scFv)、CDR移植的抗体等。Fv的重链和轻链可以来源于相同的抗体或不同的抗体，从而产生嵌合Fv区。抗体可以是动物(特别是小鼠或大鼠)或人来源的或可以是嵌合的或人源化的。如本文所用，术语“抗体”包括这些各种形式。

术语“报告基因”是指一类在细胞、组织/器官或个体处于特定情况下会表达并使得他们产生易于检测、且实验材料原本不会产生的性状的基因。作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：①已被克隆和全序列已测定；②表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；③其表达产物能进行定量测定。

术语“报告蛋白”有报告基因在一定条件下编码产生，其可以被检测并且与包含报道物的系统(例如，细胞、细胞裂解物、体外系统、生物体、体内系统等)的特征和/或性质相关联。报告蛋白是可检测的标志物，例如酶，如荧光素酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶等。可选地，报告蛋白可以是荧光蛋白，例如GFP、BFP、YFP、RFP等。

本发明一实施方式中，利用IL-2分泌表达的这种信号传导通路，间接评价抗体的生物学活性。根据这种评价系统的特征，人工的设计出一种抗原递呈类似细胞(similarantigen presenting cell，sAPC)，让其高表达免疫检查点配体分子，如：PVR、PD-L1等，同时表达激活T细胞的分子，如：anti-CD3单链抗体(scFv)(Leitner,Kuschei et al.2010)。Anti-CD3scFv与T细胞受体(T cell receptor,TCR)相互作用作为T细胞活化的第一信号，PVR与T细胞过表达的TIGIT或CD226作为T细胞活化的第二信号。

而IL-2的分泌过程则可以借助于目前最常用的报告基因来间接展示，如：荧光素酶报告基因，来了解IL-2信号通路的工作状态。

对于Jurkat细胞的设计则需要透彻理解PVR-TIGIT信号通路的原理。TIGIT有2个配体，分别是PVR和CD112，TIGIT和PVR具有很高的亲和力，KD＝1-3nM(Yu,Harden etal.2009)，而TIGIT和CD112亲和力则很弱，KD＝6μM(Martinet and Smyth 2015)。TIGIT与PVR或CD112结合后会引起TIGIT胞质内Tyr225被磷酸化，进而引起一系列的信号传导，最终导致T细胞或NK细胞的功能受到抑制，细胞因子的产生受到抑制。PVR既是TIGIT的配体，又是CD226分子的配体，CD226与PVR分子的亲和力为119nM。在和CD112或PVR结合之后，CD226的胞内结构域的Ser329和Tyr322被磷酸化，进而引起一系列的信号传导，最终导致T细胞或NK细胞的功能受到激活，促进细胞因子的产生(Martinet and Smyth 2015)。存在于T细胞或NK细胞表面的TIGIT分子与CD226分子之间也发生着相互作用，表现在TIGIT分子可以直接扰乱CD226形成正常的二聚体，从而破坏CD226的正常生理功能(Johnston,Comps-Agraret al.2014)。由此可见，TIGIT和CD226如同天平的两端，通过PVR这个支点，通过共刺激和共抑制信号的传导巧妙的调节着机体的免疫功能(Pauken and Wherry 2014)。所以本发明一实施方式中设计的Jurkat工程化的细胞同时过表达TIGIT和CD226这两种分子。

越来越多的研究表明，对于免疫检查点抗体来说，联合用药是一种趋势。那么在药物筛选过程中，也需要一套系统可以满足2种靶点抗体联合效果的生物学活性评价。所以本发明另一将上述的检测anti-TIGIT生物学活性的细胞模型进行进一步改造，在sAPC细胞中转染PD-L1分子，使sAPC同时过表达PVR和PD-L1分子；将CTI-Jurkat细胞中转染PD-1分子，使CTI-Jurkat同时过表达TIGIT、CD226和PD-1分子，利用这个细胞模型则可以用来检测anti-TIGIT和anti-PD-1(或anti-PD-L1)联合用药的效果。

以下为具体实施例，实施例中的序列如表1所示，其中下划线的为信号肽氨基酸序列或基因序列。

实施例1

抗原呈递类似细胞的构建

由于CHO细胞背景比较清楚，常用来生产表达单克隆抗体，该类型细胞适合改造成抗原呈递类似细胞(similar antigen presenting cell，sAPC)。将CHO改造成sAPC分为2个步骤，步骤1：先将CHO中转染anti-CD3scFv序列，得到稳定细胞系；步骤2：在步骤1的基础上转染PVR基因，筛选得到稳定细胞系，该细胞系即为sAPC。

合成用于表达鼠抗人CD3抗体(OKT3单链抗体，OKT3scFv)的可变区序列及相关的信号肽序列(人CD33信号肽，CD33SP)以及锚定序列(CD28的跨膜段序列及胞内段序列，CD28TC)的基因序列，此基因序列命名为CD33SP-OKT3scFv-CD28TC。序列两端添加酶切位点HindIII和XbaI。如图1所示，CD33SP-OKT3scFv-CD28TC由5个部分组成，分别为编码CD33SP(SEQ ID NO.1)的基因(SEQ ID NO.2)，编码OKT3重链可变区(OKT3VH)(SEQ ID NO.3)的基因(SEQ ID NO.4)，编码连接子(SEQ ID NO.5)的基因(SEQ ID NO.6)，编码OKT3轻链可变区(OKT3VL)(SEQ ID NO.7)的基因(SEQ ID NO.8)，以及编码CD28跨膜及胞内蛋白(CD28TC)(SEQ ID NO.9)的基因(SEQ ID NO.10)。

将pCMV2载体(HG10160-M-F，北京义翘神州科技有限公司)用HindIII和XbaI双切，将CD33SP-OKT3scFv-CD28TC序列插入，重组成功后的质粒命名为pCMV2-OKT3，如图2所示。提取一些pCMV2-OKT3质粒用限制性内切酶ClaI将其线性化，然后通过电穿孔方法转染CHO。电转条件为：电压300V，1500μF，4mm电转杯，40μg线性化质粒，1000万CHO细胞(活力大于95％)。电转染之后将细胞重悬入CD CHO-AGT^TM培养基，然后将细胞均分到1块6孔板中，每孔2ml CD CHO-AGT^TM培养基。将细胞培养板放入8％CO2，37℃培养箱培养。48小时后加入50、100、200、400、600、800μg/ml潮霉素加压筛选，之后每隔4-5天补加对应浓度的潮霉素一次。约3周后取出部分细胞，用PBS洗2次之后，用终浓度40nM的Biotin-Protein L(金斯瑞生物科技，货号：M00097)蛋白在4℃条件下孵育1个小时，用PBS洗2次后再用Streptavidin PE(eBioscience，货号：12-4317-87)孵育40分钟，用PBS洗2次后，用流式分析仪鉴定阳性率，结果如图3所示，阳性率为42.6％。将阳性率较高的细胞用FACS进行亚克隆，每孔1个细胞，每孔100μl亚克隆培养基，亚克隆培养基为：

CHO clonging medium(Sigma，C6366-500ML)。约1周后补加100μl CD CHO AGT^TM培养基(潮霉素终浓度为400μg/ml)，最后挑选稳定表达OKT3scFv的稳定细胞系进行下一步操作，此稳定细胞系命名为CHO-OKT3。

采用pBAT-88作为表达载体，用Hind III和EcoR I双酶切之后，将编码PVR(SEQ IDNO.11)的基因序列(SEQ ID NO.12)插入，构建成功的重组质粒命名为：pBAT-PVR。图4为pBAT-PVR的质粒图谱。提取一些pBAT-PVR质粒，用PvuI线性化pBAT-PVR，然后通过电穿孔方法转染CHO-OKT3。电转条件为：电压300V，1500μF，4mm电转杯，40μg线性化质粒，1000万CHO-OKT3细胞(活力大于95％)。电转染之后将细胞重悬入CD CHO AGT ^TM(Gibco，12490-001)培养基培养基，然后铺10块96孔板，每孔100μl培养基，每孔细胞数量为1500个，将细胞培养板放入8％CO2，37℃培养箱培养。48小时后加入补加100培养基(50μM终浓度MSX)。约2-3周后将生长出来的细胞取出，用PBS洗2次之后，用同型对照抗体(Isotype control)或者终浓度40nM的TIGIT-Fc蛋白在4℃条件下孵育1个小时，之后用anti-human Fc-PE孵育30分钟，用PBS洗2次后用流式分析仪鉴定阳性率，结果如图5所示，表达PVR的细胞阳性率为93.2％。将阳性率较高的细胞用FACS进行亚克隆，每孔1个细胞，亚克隆培养基为：

CHOclonging medium(Sigma，C6366-500ML)，每孔100μl。约1周后补加100μl CD CHO AGT^TM培养基(MSX终浓度为25μM，潮霉素终浓度为400μg/ml)，最后挑选稳定表达OKT3scFv和PVR分子，且细胞状态好的克隆做为sAPC。

实施列2

不同长度IL-2启动子功能试验

IL-2启动子包括调控区域和核心启动子区域，其各部分组成见图6所示。IL-2启动子序列中，-326至-41区域为调控序列(SEQ ID NO.15)，该调控区域包含许多转录激活物结合位点，如：NFAT、Oct-1、NFκB、HMGI(Y)，IL-2启动子的调控区域被认为是一种增强子(enhancer)，对启动子高水平转录也起着比较关键性作用。IL-2启动子序列中，-40至+40区域为核心启动子序列(SEQ ID NO.16)，包含TATA盒子(TATA box)，对T细胞诱导表达IL-2起着至关重要的作用。

对于检测免疫检查点抗体生物学活性的荧光素酶报告基因系统来说，高效率、高水平的IL-2启动子是至关重要的，本试验中选用了3中不同长度的IL-2启动子，来测试其启动荧光素酶报告基因转录水平的高低。3种启动子分别命名为长IL-2(L-IL-2)启动子(SEQID NO.13)，特征为包括核心启动子序列，但是调控序列较长；中IL-2(M-IL-2)启动子(SEQID NO.14)，特征为包括核心启动子序列及必要的调控序列；短IL-2(S-IL-2)启动子(SEQID NO.16)，特征为仅包含核心启动子序列，无调控序列。将荧光素酶报告基因质粒pNFκB-TA-luc(碧云天，D2207)用KpnI和HindIII双酶切，然后将3种不同IL-2启动子序列插入，将克隆号的质粒分别命名为pL-IL2-luc(图7所示)、pM-IL2-luc(图8所示)、pS-IL2-luc(图9所示)。

转染前24小时将Jurkat细胞稀释传代，密度为2.5×10⁵个细胞/ml，用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche，货号：06366244001)将将构建好的质粒瞬时转染到Jurkat细胞中。将80μl Opti-MEM(Gibco)和3.2μl X-tremeGENE HP DNA转染试剂混合后与80μl 500ng(溶剂为TE)质粒混合，然后在室温条件下放置10分钟，之后将混合物加入到密度为5×10⁵个细胞/ml的用1ml 10％FBS 1640培养基悬浮的Jurkat细胞中，然后将细胞在37℃，5％CO₂条件下孵育24个小时。之后用20ng/ml佛波酯(PMA)，1μM离子霉和10mM CaCl₂素刺激细胞。刺激6个小时之后用加入荧光素酶底物然后用酶标仪检测自发荧光。结果如图10所示，结果表明含有较长的调控序列并不有利于IL-2启动子高水平启动荧光素酶报告基因转录表达，而不含调控序列的IL-2启动子也不利于IL-2启动子高水平启动荧光素酶报告基因转录表达。因此，本发明实施例中采用中等长度的IL-2启动子。

实施列3

效应T细胞的构建

从ATCC购买的Jurkat Clone E6-1(

TIB-152^TM)为人淋巴瘤T细胞，将其构建成效应T细胞分为2个步骤，步骤1：先将Jurkat细胞中稳定转染IL-2启动子，该启动子可以启动下游荧光素酶报告基因的表达；步骤2：在步骤1的基础上，将细胞电穿孔转入全长的人TIGIT(hTIGIT)基因序列(SEQ ID NO.18)和全长的人CD226(hCD226)基因序列(SEQ IDNO.20)，使细胞过表达hTIGIT和hCD266。

将荧光素酶报告基因质粒pNFκB-TA-luc(碧云天，D2207)用KpnI和HindIII双酶切，然后将IL-2启动子序列插入，将克隆号的质粒命名为pM-IL2-luc(图谱见图8所示)。将pM-IL2-luc质粒电转化大肠杆菌，提取质粒用PvuI酶将pM-IL2-luc质粒线性化，然后电穿孔转染Jurkat细胞。转染条件为：电压280V，1500μF，4mm电转杯，6-8μg线性化质粒，500万Jurkat细胞(活力大于95％)。转染后，将细胞均分到1块6孔板中，培养基(10％FBS1640medium)体积为1.5ml。转染48小时后，分别加入50、100、200、400、600、800μg/ml G418加压筛选，每隔4-5天补加一次G418。约3-4周后，将将增殖的Jurkat细胞进行有限稀释的方法进行亚克隆，每孔0.5个细胞。长出来的亚克隆细胞，取出部分细胞用PMA(50μg/ml)和离子霉素(1μg/ml)刺激6个小时后加入荧光素酶底物试剂，用酶标仪检测荧光，结果见图11所示。20号克隆诱导后诱导倍数(fold induction)约为未诱导细胞的66倍，将此株细胞命名IL2-Jurkat(clone 20)。

从https://www.uniprot.org/网站上找到全长的hTIGIT氨基酸序列，NCBI登录号：Q495A1(SEQ ID NO.17)和全长的hCD226氨基酸序列，NCBI登录号：Q15762(SEQ IDNO.19)，然后按照人密码子偏爱性对全长的hTIGIT DNA序列(SEQ ID NO.18)和全长的hCD226DNA序列(SEQ ID NO.20)进行优化。将pCHO1.0质粒(购买于Invitrogen公司，货号：A13696-01)用AvrII和BstZ17I双酶切之后，将全长的TIGIT插入，然后再将此步骤的重组质粒用EcoRV和PacI双切，将CD226插入，最后形成的质粒命名为pCHO1.0-TIGIT/CD226(图谱见图12所示)。将pCHO1.0-TIGIT/CD226质粒电转化大肠杆菌，提取质粒用PvuI酶将pCHO1.0-TIGIT/CD226质粒线性化，然后电穿孔转染IL2-Jurkat细胞。转染条件为：电压280V，1500μF，4mm电转杯，6-8μg线性化质粒，500万Jurkat细胞(活力大于95％)。转染后，将细胞均分到1块6孔板中，培养基(10％FBS1640medium)体积为1.5ml。转染48小时后，分别加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/ml嘌呤霉素加压筛选，每隔4-5天补加一次对应浓度的嘌呤霉素。约3周后，用流式分析仪检测分别检测TIGIT和CD226的表达情况(见图13所示)。然后用FACS进行亚克隆每孔1个细胞，亚克隆培养基为10％FBS 1640，约第七天时加入0.4μg/ml嘌呤霉素和200μg/ml G418，最终得到稳定表达TIGIT和CD226的工程化细胞，命名为CTI-Jurkat。

实施列4

anti-TIGIT生物学活性检测

模拟初始T细胞完全活化需要第一信号和第二信号的共同参与构建好的sAPC和效应T细胞用于anti-TIGIT(抗TIGIT抗体)生物学活性检测的细胞模型的测试，原理图见图14所示。

准备sAPC细胞。用CD CHO AGT^TM培养基(含25μM MSX和400μg/ml潮霉素)将sAPC培养至对数期，然后800rpm离心5分钟，用Ham’s F-12培养基(含10％FBS)将sAPC重悬至40万/ml，然后用排枪铺96孔板对应孔，每孔100μl，即每孔4万个细胞，然后放置于8％CO₂ 37℃培养箱中过夜培养，第二天将生长培养基倒掉，然后将细胞培养板轻轻倒扣在吸水纸上将残留的培养基吸干。

准备CTI-Jurkat细胞。用含10％FBS的1640培养基将CTI-Jurkat培养至对数期，然后用1640(1％FBS)培养基将CTI-Jurkat细胞重悬至500万/ml，然后用排枪将CTI-Jurkat细胞加入到sAPC的孔中，每孔40μl，即每孔20万个细胞。

准备抗体。将抗TIGIT抗体(抗体重链为SEQ ID NO.25，抗体轻链为SEQ ID NO.26)和同型对照抗体(Isotype control，抗体重链为SEQ ID NO.31，抗体轻链为SEQ ID NO.32)用1640(1％FBS)培养基进行稀释，起始浓度18μg/ml，1/3倍稀释。然后将一系列稀释好的抗体加入到已铺好sAPC和CTI-Jurkat细胞的孔中，每孔40μl(抗TIGIT抗体起始浓度即为9μg/ml)。

将加完样的细胞培养板放置于8％CO₂ 37℃培养箱孵育4个小时后，取出放置于室温条件下10分钟，让细胞培养板恢复到室温温度。然后将荧光素酶底物(提前2小时从-20℃冰箱取出，放置于室温)加入到对应的样品孔中，每孔80μl。将培养板放入酶标仪，震荡5s中，然后10分钟后读取荧光值，见图15。结果初步表明诱导倍数(fold induction)大于3，对该系统进行优化后完全可以作为检测抗TIGIT抗体的理想模型。

实施例5

TIGIT/PVR和PD-1/PD-L1双信号通路生物学活性模型构建

TIGIT和PD-1双靶点活性模型构建，需要在实施例1中得到的sAPC的基础上转染PD-L1，使其过表达PD-L1；同时需要在实施例2中的到的CTI-Jurkat基础上转染PD-1，使其过表达PD-1。该活性模型用来检测TIGIT/PVR信号通路和PD-1/PD-L1信号通路抗体的生物学活性。

从https://www.uniprot.org/网站上找到全长的人PD-L1氨基酸序列，NCBI登录号：Q9NZQ7(SEQ ID NO.21)，然后按照鼠密码子偏爱性对全长的PD-L1序列进行序列优化，然后在序列5’添加HindIII酶切位点及kozak序列，在3’添加EcoRI酶切位点并合成最终的DNA序列(SEQ ID NO.22)。将带有酶切位点的PD-L1全长序列克隆到HindIII/EcoRI双酶切的pcDNA3.1/Zeo(+)载体中。然后将重组质粒用限制性内切酶PvuI线性化后用电穿孔方法转染sAPC。转染条件为电压300V，1500μF，4mm电转杯，40μg线性化质粒，1000万CHO细胞(活力大于95％)。电转染之后将细胞重悬入CD CHO-AGT^TM培养基，然后将细胞均分到1块6孔板中，每孔2ml CD CHO-AGT^TM培养基。将细胞培养板放入8％CO₂，37℃培养箱培养。48小时后加入50、100、200、400、600、800μg/ml博来霉素(Invivogen，货号：ant-zn-5)以及MSX(终浓度为25μM)和潮霉素(终浓度为400μg/ml)加压筛选，之后每隔3-4天补加对应浓度的博来霉素和潮霉素一次。约2-3周后取出部分细胞，用PBS洗2次后，用终浓度40nM的anti-PD-L1(抗PD-L1抗体)(抗体重链为SEQ ID NO.29，抗体轻链为SEQ ID NO.30)在4℃条件下孵育1个小时，用PBS洗2次后再用anti-human Fc conjugation PE(Invitrogen，货号：Catalog#12-4998-82)孵育40分钟，之后用PBS洗2次后用流式分析仪鉴定阳性率，在300μg/ml博来霉素加压筛选下阳性率最高，达到40％以上(见图16所示)。将300μg/ml博来霉素加压筛选的细胞用FACS进行亚克隆，每孔1个细胞，每孔100μl亚克隆培养基，亚克隆培养基为：

CHO clonging medium(Sigma，C6366-500ML)。约1周后补加100μl CD CHOAGT^TM培养基(潮霉素终浓度为400μg/ml，MSX终浓度25μM，博来霉素300μg/ml)。最后挑选稳定表达PD-L1的稳定细胞系进行下一步操作，此稳定细胞系命名为sAPC-PD-L1。

从https://www.uniprot.org/网站上找到全长的人PD-1氨基酸序列，NCBI登录号：Q15116(SEQ ID NO.23)，然后按照人密码子偏爱性对全长的PD-1序列进行序列优化，并在序列的5’添加HindIII酶切位点及kozak序列，在3’添加EcoRI酶切位点并合成最终的DNA序列(SEQ ID NO.24)。将带有酶切位点的PD-1全长序列克隆到HindIII/EcoRI双酶切的pcDNA3.1/Zeo(+)载体(购于Invitrogen公司，货号：VPI0009)中。然后将重组质粒用限制性内切酶PvuI线性化后用电穿孔方法转染CTI-Jurkat。转染条件为：电压280V，1500μF，4mm电转杯，6-8μg线性化质粒，500万Jurkat细胞(活力大于95％)。转染后，将细胞均分到1块6孔板中，培养基(10％FBS 1640medium)体积为1.5ml。转染48小时后，分别加入50、100、200、400、600、800μg/ml博来霉素及嘌呤霉素(0.4μg/ml嘌呤霉素)和G418(终浓度为200μg/ml)加压筛选，每隔3-4天补加一次对应浓度的博来霉素、嘌呤霉素和G418。约3周后，用流式分析仪检测PD-1的表达情况，200μg/ml筛选压力压力下阳性率35.1％(见图17所示)。然后用FACS进行亚克隆每孔1个细胞，亚克隆培养基为10％FBS 1640，每孔100μl，约第七天时补加100μl含博来霉素(200μg/ml)、嘌呤霉素(0.4μg/ml)和G418(200μg/ml)的10％FBS 1640。最终挑选稳定表达PD-1、TIGIT和CD226的工程化细胞，命名为CTP-Jurkat。

实施例6

TIGIT和PD-1(或PD-L1)靶点抗体生物学活性测定

模拟初始T细胞完全活化需要第一信号和第二信号的共同参与构建好抗原递呈细胞类似细胞(sAPC-PD-L1)和效应T细胞(CTP-Jurkat)用于TIGIT和PD-1(或PD-L1)双靶点生物学活性检测，具体的说可以用来检测TIGIT/PVR信号通路抗体和PD-1/PD-L1信号通路抗体的联合生物学活性，原理图见图18所示。

准备sAPC-PD-L1细胞。用CD CHO AGT^TM培养基(含25μM MSX，400μg/ml潮霉素，博来霉素300400μg/ml)将sAPC培养至对数期，然后800rpm离心5分钟，用Ham’s F-12培养基(含10％FBS)将sAPC-PD-L1重悬至40万/ml，然后用排枪铺96孔板对应孔，每孔100μl，即每孔4万个细胞，然后放置于8％CO237℃培养箱中过夜培养，第二天将培养基倒掉，然后将细胞培养板倒扣在吸水纸上将残留的培养基吸干。

准备CTP-Jurkat细胞。用含10％FBS的1640培养基将CTI-Jurkat培养至对数期，然后用1640(1％FBS)培养基将CTP-Jurkat细胞重悬至500万/ml，然后用排枪铺将CTP-Jurkat细胞加入到sAPC-PD-L1的孔中，每孔40μl，即每孔20万个细胞。

准备抗体。将抗TIGIT抗体、抗PD-1抗体(抗体重链为SEQ ID NO.27，抗体轻链为SEQ ID NO.28)、抗PD-L1抗体、同型对照抗体Isotype control用1640(1％FBS)培养基进行梯度稀释。然后将一系列稀释好的抗体分别加入到已铺好sAPC-PD-L1和CTP-Jurkat细胞的孔中，每孔40μl。

将加完样的细胞培养板放置于8％CO₂ 37℃培养箱孵育4个小时后，取出放置于室温条件下10分钟，让细胞培养板恢复到室温温度。然后将荧光素酶底物(提前2小时从-20℃冰箱取出，放置于室温)加入到对应的样品孔中，每孔80μl。将培养板放入酶标仪，震荡5s中，然后10分钟后读取荧光值，见图19所示。结果显示当抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体单独加入时，系统的荧光值较低，表明激活T细胞的能力较弱，但是当抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体联合加入时(总浓度和单独加入时保持一致)，系统的荧光值明显上高，表明激活T细胞的能力较强，显示了两者的协同作用。

在另外一个实验中，见图20所示，验证的是TIGIT和/或PD-L1靶点抗体生物学活性测定，实验结果表明当抗TIGIT抗体和抗PD-L1抗体单独加入时，系统的荧光值较低，表明激活T细胞的能力较弱，但是当抗TIGIT抗体和抗PD-L1抗体联合加入时(总浓度和单独加入时保持一致)，系统的荧光值明显上高，表明激活T细胞的能力较强，显示了两者的协同作用。

以上结果表明，本系统完全可以用来检测抗TIGIT抗体和抗PD-1抗体(或抗PD-L1抗体)联用的生物学活性，从而更进一步的本系统可以同时用于免疫检查点TIGIT/PVR信号通路和PD-1/PD-L1信号通路的药物筛选。

表1序列表

本文提供的所有出版物和专利通过引用整体并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述组合物和方法的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施方案。事实上，对于相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所描述模式的各种修改旨在在本发明的范围内。

序列表

<110> 百奥泰生物制药股份有限公司

<120> 一种检测免疫检查点抗体活性的方法

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala

1 5 10 15

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgccgcttc tgctcttgct tccactgctt tgggctggag cactggcc 48

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 4

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgctagccc aggtccagct gcagcagtct ggggctgaac tggcaagacc tggggcctca 60

gtgaagatgt cctgcaaggc ttctggctac acctttacta ggtacacgat gcactgggta 120

aaacagaggc ctggacaggg tctggaatgg attggataca ttaatcctag ccgtggttat 180

actaattaca atcagaagtt caaggacaag gccacattga ctacagacaa atcctccagc 240

acagcctaca tgcaactgag cagcctgaca tctgaggact ctgcagtcta ttactgtgca 300

agatattatg atgatcatta ctgccttgac tactggggcc aaggcaccac ggtgaccgtg 360

agcgcc 366

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Ser

1 5 10 15

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggggaggtg gcagcggggg aggtggcagc ggcggcggga gctcc 45

<210> 7

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg Gly Gly Gly Asp Pro

100 105 110

<210> 8

<211> 381

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gggggaggtg gcagcggggg aggtggcagc ggcggcggga gctcccaaat tgttctcacc 60

cagtctccag caatcatgtc tgcatctcca ggggagaagg tcaccatgac ctgcagtgcc 120

agctcaagtg taagttacat gaactggtac cagcagaagt caggcacctc ccccaaaaga 180

tggatttatg acacatccaa actggcttct ggagtccctg ctcacttcag gggcagtggg 240

tctgggacct cttactctct cacaatcagc ggcatggagg ctgaagatgc tgccacttat 300

tactgccagc agtggagtag taacccattc acgttcggct cggggacaaa gttggaaata 360

aaccggggcg gtggggatcc c 381

<210> 9

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val

1 5 10 15

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

20 25 30

Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser

35 40 45

Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His

50 55 60

Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

65 70 75

<210> 10

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggtgga 60

gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 120

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc 180

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctcctga 240

<210> 11

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Ala Arg Ala Met Ala Ala Ala Trp Pro Leu Leu Leu Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Val Leu Ser Trp Pro Pro Pro Gly Thr Gly Asp Val Val Val Gln

20 25 30

Ala Pro Thr Gln Val Pro Gly Phe Leu Gly Asp Ser Val Thr Leu Pro

35 40 45

Cys Tyr Leu Gln Val Pro Asn Met Glu Val Thr His Val Ser Gln Leu

50 55 60

Thr Trp Ala Arg His Gly Glu Ser Gly Ser Met Ala Val Phe His Gln

65 70 75 80

Thr Gln Gly Pro Ser Tyr Ser Glu Ser Lys Arg Leu Glu Phe Val Ala

85 90 95

Ala Arg Leu Gly Ala Glu Leu Arg Asn Ala Ser Leu Arg Met Phe Gly

100 105 110

Leu Arg Val Glu Asp Glu Gly Asn Tyr Thr Cys Leu Phe Val Thr Phe

115 120 125

Pro Gln Gly Ser Arg Ser Val Asp Ile Trp Leu Arg Val Leu Ala Lys

130 135 140

Pro Gln Asn Thr Ala Glu Val Gln Lys Val Gln Leu Thr Gly Glu Pro

145 150 155 160

Val Pro Met Ala Arg Cys Val Ser Thr Gly Gly Arg Pro Pro Ala Gln

165 170 175

Ile Thr Trp His Ser Asp Leu Gly Gly Met Pro Asn Thr Ser Gln Val

180 185 190

Pro Gly Phe Leu Ser Gly Thr Val Thr Val Thr Ser Leu Trp Ile Leu

195 200 205

Val Pro Ser Ser Gln Val Asp Gly Lys Asn Val Thr Cys Lys Val Glu

210 215 220

His Glu Ser Phe Glu Lys Pro Gln Leu Leu Thr Val Asn Leu Thr Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Pro Pro Glu Val Ser Ile Ser Gly Tyr Asp Asn Asn Trp Tyr

245 250 255

Leu Gly Gln Asn Glu Ala Thr Leu Thr Cys Asp Ala Arg Ser Asn Pro

260 265 270

Glu Pro Thr Gly Tyr Asn Trp Ser Thr Thr Met Gly Pro Leu Pro Pro

275 280 285

Phe Ala Val Ala Gln Gly Ala Gln Leu Leu Ile Arg Pro Val Asp Lys

290 295 300

Pro Ile Asn Thr Thr Leu Ile Cys Asn Val Thr Asn Ala Leu Gly Ala

305 310 315 320

Arg Gln Ala Glu Leu Thr Val Gln Val Lys Glu Gly Pro Pro Ser Glu

325 330 335

His Ser Gly Ile Ser Arg Asn Ala Ile Ile Phe Leu Val Leu Gly Ile

340 345 350

Leu Val Phe Leu Ile Leu Leu Gly Ile Gly Ile Tyr Phe Tyr Trp Ser

355 360 365

Lys Cys Ser Arg Glu Val Leu Trp His Cys His Leu Cys Pro Ser Ser

370 375 380

Thr Glu His Ala Ser Ala Ser Ala Asn Gly His Val Ser Tyr Ser Ala

385 390 395 400

Val Ser Arg Glu Asn Ser Ser Ser Gln Asp Pro Gln Thr Glu Gly Thr

405 410 415

Arg

<210> 12

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggctagag ctatggctgc tgcttggcca ctgctgctgg tggccctgct ggtgctgtct 60

tggccccctc caggaaccgg cgacgtggtg gtgcaggctc caacccaggt gcctggcttc 120

ctgggcgatt ccgtgacact gccttgctac ctgcaggtgc caaacatgga ggtgacacac 180

gtgagccagc tgacatgggc tagacatgga gagtctggct ccatggccgt gttccaccag 240

acccagggcc ctagctactc tgagtccaag cgcctggagt ttgtggctgc tagactggga 300

gctgagctga ggaatgcttc cctgcggatg tttggcctga gagtggagga cgagggcaat 360

tatacatgcc tgttcgtgac ctttccacag ggcagccggt ctgtggatat ctggctgaga 420

gtgctggcca agccccagaa cacagctgag gtgcagaagg tgcagctgac aggagagcct 480

gtgccaatgg ctagatgcgt gtccacaggc ggcaggcccc ctgctcagat cacctggcac 540

tctgacctgg gcggcatgcc caatacatct caggtcccag gcttcctgtc cggcaccgtg 600

acagtgacca gcctgtggat tctggtgcct tccagccagg tggatggcaa gaacgtgacc 660

tgcaaggtgg agcatgagag ctttgagaag ccacagctgc tgacagtgaa tctgaccgtg 720

tactatccac ccgaggtgtc catcagcggc tacgacaaca attggtatct gggccagaat 780

gaggccacac tgacctgtga tgctaggtct aaccctgagc caaccggcta taattggtcc 840

accacaatgg gcccactgcc tccattcgct gtggctcagg gagctcagct gctgatcaga 900

ccagtggaca agcccatcaa caccacactg atctgtaacg tgacaaatgc tctgggcgcc 960

agacaggctg agctgaccgt gcaggtgaag gagggccctc catctgagca ttccggcatc 1020

agccgcaatg ccattatctt cctggtgctg ggcatcctgg tgttcctgat cctgctggga 1080

atcggcatct acttctactg gtccaagtgc tccagggagg tgctgtggca ttgccatctg 1140

tgcccttcct ccaccgagca tgcttctgct tccgctaacg gccacgtgtc ttactccgct 1200

gtgtccagag agaactcctc ctcccaggac cctcagacag agggcaccag gtga 1254

<210> 13

<211> 1012

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggtacctata tccgtacaat tgttcagcca gtttgtgcac tgtactgagg atgaatgaac 60

acctatccta aatatcctag tcttctgact aaaaacaaga tcatatttca taacgattat 120

tgttacattc atagtgtccc aggtgattta gaggataaat aaaaatccat taaagaggta 180

aagacataaa aacgagaaac atggactggt ttacacataa cacatacaaa gtctattata 240

aaactagcat cagtatcctt gaatgcaaac ctttttctga gtatttaaca atcgcaccct 300

ttaaaaaatg tacaatagac attaagagac ttaaacagat atataatcat tttaaattaa 360

aatagcgtta aacagtacct caagctcaat aagcatttta agtattctaa tcttagtatt 420

tctctagctg acatgtaaga agcaatctat cttattgtat gcaattagct cattgtgtgg 480

ataaaaaggt aaaaccattc tgaaacagga aaccaataca cttcctgttt aatcaacaaa 540

tctaaacatt tattcttttc atctgtttac tcttgctgtt gtccaccaca atatgctatt 600

cacatgttca gtgtagtttt atgacaaaga aaattttctg agttactttt gtatccccac 660

ccccttaaag aaaggaggaa aaactgtttc atacagaagg cgttaattgc atgaattaga 720

gctatcacct aagtgtgggc taatgtaaca aagagggatt tcacctacat ccattcagtc 780

agtctttggg ggtttaaaga aattccaaag agtcatcaga agaggaaaaa tgaaggtaat 840

gttttttcag acaggtaaag tctttgaaaa tatgtgtaat atgtaaaaca ttttgacacc 900

cccataatat ttttccagaa ttaacagtat aaattgcatc tcttgttcaa gagttcccta 960

tcactctctt taatcactac tcacagtaac ctcaactcct gccacaaagc tt 1012

<210> 14

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtaccattt tctgagttac ttttgtatcc ccaccccctt aaagaaagga ggaaaaactg 60

tttcatacag aaggcgttaa ttgcatgaat tagagctatc acctaagtgt gggctaatgt 120

aacaaagagg gatttcacct acatccattc agtcagtctt tgggggttta aagaaattcc 180

aaagagtcat cagaagagga aaaatgaagg taatgttttt tcagacaggt aaagtctttg 240

aaaatatgtg taatatgtaa aacattttga cacccccata atatttttcc agaattaaca 300

gtataaattg catctcttgt tcaagagttc cctatcactc tctttaatca ctactcacag 360

taacctcaac tcctgccaaa gctt 384

<210> 15

<211> 287

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

attttctgag ttacttttgt atccccaccc ccttaaagaa aggaggaaaa actgtttcat 60

acagaaggcg ttaattgcat gaattagagc tatcacctaa gtgtgggcta atgtaacaaa 120

gagggatttc acctacatcc attcagtcag tctttggggg tttaaagaaa ttccaaagag 180

tcatcagaag aggaaaaatg aaggtaatgt tttttcagac aggtaaagtc tttgaaaata 240

tgtgtaatat gtaaaacatt ttgacacccc cataatattt ttccaga 287

<210> 16

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attaacagta taaattgcat ctcttgttca agagttccct atcactctct ttaatcacta 60

ctcacagtaa cctcaactcc 80

<210> 17

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met Arg Trp Cys Leu Leu Leu Ile Trp Ala Gln Gly Leu Arg Gln Ala

1 5 10 15

Pro Leu Ala Ser Gly Met Met Thr Gly Thr Ile Glu Thr Thr Gly Asn

20 25 30

Ile Ser Ala Glu Lys Gly Gly Ser Ile Ile Leu Gln Cys His Leu Ser

35 40 45

Ser Thr Thr Ala Gln Val Thr Gln Val Asn Trp Glu Gln Gln Asp Gln

50 55 60

Leu Leu Ala Ile Cys Asn Ala Asp Leu Gly Trp His Ile Ser Pro Ser

65 70 75 80

Phe Lys Asp Arg Val Ala Pro Gly Pro Gly Leu Gly Leu Thr Leu Gln

85 90 95

Ser Leu Thr Val Asn Asp Thr Gly Glu Tyr Phe Cys Ile Tyr His Thr

100 105 110

Tyr Pro Asp Gly Thr Tyr Thr Gly Arg Ile Phe Leu Glu Val Leu Glu

115 120 125

Ser Ser Val Ala Glu His Gly Ala Arg Phe Gln Ile Pro Leu Leu Gly

130 135 140

Ala Met Ala Ala Thr Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val

145 150 155 160

Val Ala Leu Thr Arg Lys Lys Lys Ala Leu Arg Ile His Ser Val Glu

165 170 175

Gly Asp Leu Arg Arg Lys Ser Ala Gly Gln Glu Glu Trp Ser Pro Ser

180 185 190

Ala Pro Ser Pro Pro Gly Ser Cys Val Gln Ala Glu Ala Ala Pro Ala

195 200 205

Gly Leu Cys Gly Glu Gln Arg Gly Glu Asp Cys Ala Glu Leu His Asp

210 215 220

Tyr Phe Asn Val Leu Ser Tyr Arg Ser Leu Gly Asn Cys Ser Phe Phe

225 230 235 240

Thr Glu Thr Gly

<210> 18

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

atgcgctggt gtctgctgct gatttgggcc cagggactga gacaggctcc tctggcttca 60

ggaatgatga ccggcaccat cgagaccacc ggaaacatca gcgccgagaa gggaggaagc 120

atcatcctcc agtgccacct gagtagcaca accgcacagg tcacccaggt caattgggag 180

cagcaggacc agctgctggc catttgcaac gccgatctgg gttggcacat ctctcctagc 240

ttcaaggaca gagtggcccc aggaccagga ctgggactga cactgcagag tctgaccgtg 300

aacgacaccg gcgagtactt ctgcatctac cacacctacc cagacggcac ctacacagga 360

cggatcttcc tggaggtgct ggagtctagc gtggcagagc acggagccag attccagatc 420

cctctgctgg gagctatggc agctacactg gtcgtgatct gcaccgcagt gatcgtggtc 480

gtggctctga cacggaagaa gaaggccctg agaatccaca gcgtggaggg agacctgaga 540

agaaagagcg ccggacagga ggagtggtct cctagcgctc cttctcctcc aggctcttgt 600

gtgcaggcag aagcagctcc agcaggtctc tgcggagaac agagaggaga ggattgcgcc 660

gagctgcacg actacttcaa cgtgctgagc taccggagcc tgggcaattg cagcttcttc 720

accgagaccg gatga 735

<210> 19

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu His Val Tyr Arg Ala

1 5 10 15

Leu Cys Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn

20 25 30

Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val

35 40 45

Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser

50 55 60

Pro Thr His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr

65 70 75 80

Phe Leu Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg

85 90 95

Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr

100 105 110

Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp

115 120 125

Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro

130 135 140

Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val

145 150 155 160

Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu

165 170 175

Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro

180 185 190

Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val

195 200 205

Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu

210 215 220

Gln Ala Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val

225 230 235 240

Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala Gly Gly

245 250 255

Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile Ile Val

260 265 270

Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr

275 280 285

Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile

290 295 300

Ser Thr Ser Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp

305 310 315 320

Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val

325 330 335

<210> 20

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

atggactacc ccaccctgct gctggccctg ctgcacgtgt acagggccct gtgcgaggag 60

gtgctgtggc acacaagcgt gcctttcgcc gagaacatga gcctggagtg cgtgtaccct 120

agcatgggca tcctgaccca ggtggagtgg ttcaagatcg gcacccagca ggattccatc 180

gccatcttta gccccacaca cggcatggtg atcaggaagc cttacgccga gagagtgtac 240

ttcctgaata gcaccatggc cagcaataat atgaccctgt tctttagaaa cgcctccgag 300

gatgacgtgg gctactactc ctgttccctg tacacctacc ctcagggcac ctggcagaag 360

gtgatccagg tggtgcagtc cgatagcttt gaggccgccg tgccttccaa ctcccacatc 420

gtgagcgagc ccggcaagaa tgtgacactg acatgccagc cccagatgac ctggcccgtg 480

caggccgtga ggtgggagaa gatccagcct aggcagatcg atctgctgac ctactgtaat 540

ctggtgcacg gcagaaactt caccagcaag ttccccagac agatcgtgtc caattgttcc 600

cacggcaggt ggagcgtgat cgtgatccct gatgtgacag tgtccgactc cggcctgtac 660

agatgctacc tgcaggccag cgccggcgag aacgagacct tcgtgatgag actgaccgtg 720

gccgagggca agaccgacaa tcagtacaca ctgtttgtgg ccggcggcac agtgctgctg 780

ctgctgttcg tgatcagcat caccacaatc atcgtgatct ttctgaatag aagaaggaga 840

agagagagga gagatctgtt cacagagagc tgggataccc agaaggcccc taataactac 900

aggtccccta tctccacatc ccagcctacc aatcagtcca tggatgatac aagggaggac 960

atctacgtga attaccctac attcagcaga agacctaaga ccagagtgtg a 1011

<210> 21

<211> 290

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 22

<211> 891

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aagcttgcca ccatgaggat atttgctgtc tttatattca tgacctactg gcatttgctg 60

aacgcattta ctgtcacggt tcccaaggac ctatatgtgg tagagtatgg tagcaatatg 120

acaattgaat gcaaattccc agtagaaaaa caattagacc tggctgcact aattgtctat 180

tgggaaatgg aggataagaa cattattcaa tttgtgcatg gagaggaaga cctgaaggtt 240

cagcatagta gctacagaca gagggcccgg ctgttgaagg accagctctc cctgggaaat 300

gctgcacttc agatcacaga tgtgaaattg caggatgcag gggtgtaccg ctgcatgatc 360

agctatggtg gtgccgacta caagcgaatt actgtgaaag tcaatgcccc atacaacaaa 420

atcaaccaaa gaattttggt tgtggatcca gtcacctctg aacatgaact gacatgtcag 480

gctgagggct accccaaggc cgaagtcatc tggacaagca gtgaccatca agtcctgagt 540

ggtaagacca ccaccaccaa ttccaagaga gaggagaagc ttttcaatgt gaccagcaca 600

ctgagaatca acacaacaac taatgagatt ttctactgca cttttaggag attagatcct 660

gaggaaaacc atacagctga attggtcatc ccagaactac ctctggcaca tcctccaaat 720

gaaaggaccc atttggtaat tttgggtgca atactccttt gcctgggagt cgctctgaca 780

ttcattttca ggttgcggaa aggcaggatg atggacgtaa aaaaatgcgg catacaggac 840

acaaattcta aaaaacagtc agacactcac ctcgaagaaa cctgagaatt c 891

<210> 23

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly

165 170 175

Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys

180 185 190

Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro

195 200 205

Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly

210 215 220

Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro

225 230 235 240

Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly

245 250 255

Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg

260 265 270

Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu

275 280 285

<210> 24

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aagcttgcca ccatgcagat cccacaggcg ccctggccag tcgtctgggc ggtgctacaa 60

ctgggctggc ggccaggatg gttcttagac tccccagaca ggccctggaa cccccccacc 120

ttcttcccag ccctgctcgt ggtgaccgaa ggggacaacg ccaccttcac ctgcagcttc 180

tccaacacat cggagagctt cgtgctaaac tggtaccgca tgagccccag caaccagacg 240

gacaagctgg ccgccttccc cgaggaccgc agccagcccg gccaggactg ccgcttccgt 300

gtcacacaac tgcccaacgg gcgtgacttc cacatgagcg tggtcagggc ccggcgcaat 360

gacagcggca cctacctctg tggggccatc tccctggccc ccaaggcgca gatcaaagag 420

agcctgcggg cagagctcag ggtgacagag agaagggcag aagtgcccac agcccacccc 480

agcccctcac ccaggccagc cggccagttc caaaccctgg tggttggtgt cgtgggcggc 540

ctgctgggca gcctggtgct gctagtctgg gtcctggccg tcatctgctc ccgggccgca 600

cgagggacaa taggagccag gcgcaccggc cagcccctga aggaggaccc ctcagccgtg 660

cctgtgttct ctgtggacta tggggagctg gatttccagt ggcgagagaa gaccccggag 720

ccccccgtgc cctgtgtccc tgagcagacg gagtatgcca ccattgtctt tcctagcgga 780

atgggcacct catcccccgc ccgcaggggc tcagccgacg gccctcggag tgcccagcca 840

ctgaggcctg aggatggaca ctgctcttgg cccctctgag aattc 885

<210> 25

<211> 467

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ala His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile

35 40 45

Thr Ser Asp Tyr Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn

65 70 75 80

Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Gln Phe Phe Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gln Val Gly Leu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

145 150 155 160

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

210 215 220

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys

225 230 235 240

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

305 310 315 320

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

340 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

370 375 380

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

420 425 430

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

<210> 26

<211> 234

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp

35 40 45

Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr

100 105 110

Ser Thr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

115 120 125

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

130 135 140

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

145 150 155 160

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

165 170 175

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

180 185 190

Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

195 200 205

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

210 215 220

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 27

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 28

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 29

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 30

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 31

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr His Tyr

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe

50 55 60

Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Ser His Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

115 120 125

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

130 135 140

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

145 150 155 160

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

165 170 175

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

180 185 190

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

195 200 205

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

210 215 220

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala

325 330 335

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 32

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile

35 40 45

Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

Claims

1.一种检测免疫检查点抗体活性的方法，其特征在于，包括

a)准备抗原呈递类似细胞，所述抗原呈递类似细胞表面上展示T细胞受体激活物和免疫检查点配体；

b)准备效应细胞，所述效应细胞在其表面上展示T细胞受体和免疫检查点受体，所述效应细胞的基因组中整合有报告基因；所述T细胞受体激活物与所述T细胞受体相互作用，可激活所述报告基因表达报告蛋白；所述免疫检查点配体与所述免疫检查点受体相互作用，可激活或抑制所述报告基因表达所述报告蛋白；

c)培养所述抗原呈递类似细胞和所述效应细胞，并加入抗体；所述抗体为待检测的免疫检查点抗体；以及

d)检测所述报告蛋白的信号，以指示所述抗体。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述T细胞受体激活物为抗分化簇抗体或其片段；优选地，所述T细胞受体激活物包括序列为SEQ ID NO.3的重链可变区，和序列为SEQ ID NO.7的轻链可变区。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述T细胞受体激活物与信号肽连接；优选地，所述信号肽的序列为SEQ ID NO.1。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫检查点配体选自PVR、PD-L1、PD-L2和B7-H4中的一种或多种；优选地，所述免疫检查点配体选自PVR和/或PD-L1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫检查点受体选自TIGIT、PD-1和CTLA-4中的一种或多种；优选地，所述免疫检查点受体选自TIGIT和/或PD-1。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述效应细胞选自T细胞；优选地，所述效应细胞选自Jurkat、Hut-78、CEM或原代T细胞；更优选地，所述效应细胞选自Jurkat。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述报告基因与启动子连接；优选地，所述启动子为IL-2启动子；更优选地，所述启动子的序列为SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14或SEQID NO.15；更优选地，所述启动子的序列为SEQ ID NO.14。

8.根据权利要求1至7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述报告基因包含编码以下蛋白质的基因：

9.根据权利要求1至8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述抗体可抑制所述免疫检查点配体与所述免疫检查点受体相互作用。

10.一种检测免疫检查点抗体活性的方法，其特征在于，包括

a)准备CHO细胞，所述CHO细胞在其表面上展示OKT3scFv、PVR和PD-L1；

b)准备Jurkat细胞，所述Jurkat细胞在其表面上展示TCR、TIGIT、CD226和PD-1，所述Jurkat细胞的基因组中整合有荧光素酶报告基因；所述OKT3scFv与所述TCR相互作用，可激活所述荧光素酶报告基因表达荧光素酶；所述PVR与所述TIGIT相互作用，可抑制所述荧光素酶报告基因表达所述荧光素酶；所述PVR与所述CD226相互作用，可激活所述荧光素酶报告基因表达所述荧光素酶；所述PD-L1与所述PD-1相互作用，可抑制所述荧光素酶报告基因表达所述荧光素酶；

c)培养所述CHO细胞和所述Jurkat细胞，并加入抗体；所述抗体为待检测的免疫检查点抗体；以及

d)检测所述荧光素酶的信号，以指示所述抗体。