WO2012015023A1 - 抗がん剤のスクリーニング方法 - Google Patents

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cells
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亮 野田
竜也 村井
仁志 北山
陽子 吉田
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国立大学法人京都大学
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
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    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for an anticancer drug, and more specifically, a screening method for an anticancer drug using a natural cancer metastasis model animal, a natural cancer metastasis model animal used in the screening method, and the Cancer cell lines used for the production of model animals, screening methods for anticancer agents that select substances that increase the expression of RECK in cancer cells, mammalian cells used for the screening methods, and these screening methods
  • the present invention relates to an anticancer agent comprising a compound as an active ingredient.
  • RECK conversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs
  • RECK conversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs
  • a high frequency of expression decrease was observed in many cancers such as pancreas and prostate, and that the expression level of RECK in the tumor tissue had a positive correlation with the survival rate of patients.
  • a cancer cell line in which RECK was forcibly expressed was transplanted into nude mice, suppression of tumor growth, angiogenesis, invasion, metastasis, etc. was observed as compared with the parent line.
  • Non-Patent Document 6 As a protocol for spontaneous metastasis, a tumor is inoculated into the palm of a mouse, and when the tumor reaches a certain size, the hand is cut to remove the primary lesion, and dissected 40 to 100 days later to observe lung metastasis A method is known (Non-Patent Document 6). However, there is a problem that it takes a long time to determine, and establishment of an experimental system that can determine natural transition in a short period is desired.
  • the membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis. Cell 107, 789-800 (2001). Noda M, Oh J, Takahashi R, Kondo S, Kitayama H, Takahashi C. RECK: a novel suppressor of malignancy linking oncogenic signaling to extracellular matrix remodeling.
  • the present invention relates to a cancer cell line used for determining natural metastasis in a short period of time, a cancer natural metastasis model animal using the cancer cell line and a method for producing the same, and a screening using the cancer natural metastasis model animal It is an object to provide an anticancer agent or a cancer metastasis inhibitor obtained by the method and the screening method.
  • a further object of the present invention is to provide a screening method for selecting a substance that increases RECK expression in cancer cells, a mammalian cell used in the screening method, and an anticancer agent obtained by the screening method.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • RM72 cells (Accession number NITE BP-1110).
  • [2] A natural cancer metastasis model animal comprising the cell-derived tumor according to [1].
  • [3] The animal model for spontaneous cancer metastasis according to [2], which is a rodent.
  • [4] The animal model for spontaneous cancer metastasis according to [3], which is a mouse.
  • a method for producing a model animal with spontaneous cancer metastasis which comprises inoculating an experimental animal with the cell according to [1].
  • [6] The method for producing a model animal for spontaneous cancer metastasis according to [5], wherein the cell according to [1] is inoculated subcutaneously into an experimental animal to form a tumor.
  • a method for screening a substance having anticancer activity and / or cancer metastasis inhibiting activity comprising the step of: adding a test substance to a cancer natural metastasis model animal according to any one of [2] to [4] above , The step of evaluating the size of the tumor at the cell inoculation site and the number and / or size of metastases in the target organ after the start of administration of the test substance, the animal and test substance administered with the test substance And a step of comparing the size of the tumor at the cell inoculation site of an animal that has not been administered, and the number and / or size of metastases in the target organ.
  • a method for screening for a substance having anticancer activity and / or cancer metastasis inhibiting activity comprising the step of: adding a test substance to a cancer natural metastasis model animal according to any one of [2] to [4] above , The step of administering luciferin to the animal after the start of administration of the test substance, the step of recording a chemiluminescence image of the cell inoculation site and / or target organ of the animal after the administration of luciferin, and the administration of the test substance And a step of comparing chemiluminescence images of a cell inoculation site and / or a target organ of an animal not administered with the test substance.
  • a screening method for an anticancer substance comprising selecting a substance that increases the expression of RECK (reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs) in cancer cells.
  • the substance that increases the expression of RECK in cancer cells is a substance that enhances Reck gene promoter activity in cancer cells.
  • a cell comprising a reporter system comprising a Reck gene promoter and a reporter gene and an HRAS 12V oncogene controlled by a tetracycline expression induction system is used.
  • a CREF cell having a HRAS 12V oncogene controlled by a Tet-off system wherein a cell comprising a reporter system containing a Reck gene promoter and a reporter gene and an HRAS 12V oncogene controlled by a tetracycline expression induction system
  • a cell comprising a reporter system containing a Reck gene promoter and a reporter gene and an HRAS 12V oncogene controlled by a tetracycline expression induction system
  • a cell derived from a strain, having a 4.1 kb region upstream of the mouse Reck gene as a Reck gene promoter, a secreted alkaline phosphatase gene as a reporter gene, and further having a neomycin resistance gene and a blasticidin S resistance gene The screening method according to [11] above, wherein [13] A mammalian cell comprising a reporter system comprising a Reck gene promoter and a reporter gene and an HRAS 12V oncogene controlled by
  • Reck gene promoter and a reporter gene a cell derived CREF cell lines with a HRAS 12V oncogene which is controlled by the reporter system and the tetracycline expression induction system including, HRAS 12V controlled by Tet-off system
  • the mammalian cell according to the above [13] which has an oncogene, a fragment of the 4.1 kb region upstream of the mouse Reck gene as a Reck gene promoter, a secreted alkaline phosphatase gene as a reporter gene, and a neomycin resistance gene and a blasticidin S resistance gene.
  • the present invention can provide a cancer cell line used for determining natural metastasis in a short period of time.
  • a model animal with spontaneous cancer metastasis By inoculating the cell line into a laboratory animal, a model animal with spontaneous cancer metastasis can be prepared.
  • an anticancer agent or an inhibitor of cancer metastasis is effective.
  • Substances that can be components can be obtained.
  • a substance that can be an active ingredient of an anticancer drug can be obtained by a screening method for selecting a substance that increases the expression of RECK.
  • the screening method for selecting a substance that increases the expression of RECK is useful as a primary screening method for the screening method using the above-mentioned animal model for natural cancer metastasis.
  • FIG. 9 is a graph showing the relative tumor size and relative lung metastasis of the Pyt group and the Hr group with respect to the solvent group, as a result of evaluating the antitumor activity and the metastasis inhibitory activity of Pyt and Hr using natural lung metastasis model mice inoculated with RM72 cells. It is. Results of evaluation of antitumor activity and metastasis suppression activity of Pyt and Hr using spontaneous lung metastasis model mice inoculated with RM72 cells, and distribution of lung metastasis and tumor size of each individual in the solvent group, Pyt group and Hr group FIG.
  • the graph shows the relative tumor size and relative lung metastasis of the Gra group and the Lyc group with respect to the solvent group, as a result of evaluating the antitumor activity and metastasis inhibitory activity of Gra and Lyc using natural lung metastasis model mice inoculated with RM72 cells. It is. Results of evaluation of antitumor activity and metastasis inhibitory activity of Gra and Lyc using spontaneous lung metastasis model mice inoculated with RM72 cells, distribution of lung metastasis and tumor size in each of the solvent group, Gra group and Lyc group FIG.
  • RM72 cells The present invention relates to an RM72 cell (Accession No. NITE BP-1110 as an independent administrative agency, Product Evaluation Technology Base Organization Patent Microorganism Deposit Center (Kazusa Kamashichi 2-5-8, Kisarazu-shi, Chiba, Japan, postal code 292-0818). International deposit has been made. Date of deposit: June 22, 2011) RM72 cells are derived from a human fibrosarcoma-derived cell line HT1080 (ATCC # CCL-121), and neo (E. coli-derived kanamycin resistance gene) and Hygro (E. coli-derived hygromycin B resistance gene) as selectable markers for HT1080 cells.
  • HT1080 human fibrosarcoma-derived cell line HT1080
  • neo E. coli-derived kanamycin resistance gene
  • Hygro E. coli-derived hygromycin B resistance gene
  • RM72 cells are inoculated subcutaneously into nude mice, a tumor is formed and spontaneous metastasis to the lung is observed within 2 weeks after inoculation.
  • RM72 cells can be cultured using Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) containing, for example, 10% fetal bovine serum at 5% CO 2 and 37 ° C. It is preferable that penicillin (for example, about 100 U / ml), streptomycin (for example, about 100 ⁇ g / ml), hygromycin B (for example, about 400 U / ml) and G418 (for example, about 100 mg / ml) are added to the medium.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • penicillin for example, about 100 U / ml
  • streptomycin for example, about 100 ⁇ g / ml
  • hygromycin B for example, about 400 U / ml
  • G418 for example, about 100 mg / ml
  • the cancer natural metastasis model animal of the present invention only needs to have a tumor derived from RM72 cells.
  • the cancer natural metastasis model animal of the present invention is very useful in that tumor formation and natural cancer metastasis can be evaluated simultaneously.
  • spontaneous metastasis of cancer can be evaluated in a short time of about 2 weeks after subcutaneous inoculation of cells, and it takes a long time (40 to 100 days) to determine as in the conventional method (Non-Patent Document 6). It is very excellent in that it does not require.
  • the luciferase expression vector since the luciferase expression vector has been introduced into RM72 cells, the position and volume of the primary and metastatic lesions can be visualized by administering luciferin to animals and recording whole body chemiluminescence images.
  • it is an epoch-making animal model for natural cancer metastasis in that tumor formation and natural cancer metastasis can be evaluated without dissecting the animal.
  • the animal model for spontaneous metastasis of the present invention can be produced by inoculating RM72 cells into an experimental animal.
  • the experimental animal is not particularly limited, and examples thereof include mammals such as mice, rats, hamsters, guinea pigs, rabbits, dogs, cats and monkeys. Preferred are rodents such as mice, rats, hamsters, and guinea pigs, and more preferred are mice.
  • the animal is preferably an immunodeficient animal. Examples of immunodeficient animals include nude mice, nude rats, SCID mice, and the like.
  • the site where RM72 cells are inoculated is not particularly limited as long as the RM72 cells tend to form tumors. It is preferable to inoculate the animal subcutaneously because it is easy to inoculate and easily forms a tumor. Specifically, back subcutaneous and abdominal subcutaneous are suitable.
  • the number of RM72 cells to be inoculated can be appropriately selected according to the type and size of the animal, the site of inoculation, and the like.
  • subcutaneously inoculating nude mice for example, about 1 to 5 ⁇ 10 6 cells may be suspended in about 100 ⁇ l of PBS and inoculated using a syringe. The presence or absence of tumor formation can be confirmed about 5-7 days after inoculation. Usually, a tumor with a diameter of about 3 mm is formed about 5 to 7 days after inoculation. Animals in which tumor formation has been confirmed can be used as model animals with spontaneous cancer metastasis.
  • the screening method of the present invention only needs to include the following steps (1) to (3).
  • a substance having anticancer activity for example, tumor growth inhibition, tumor regression, tumor disappearance, etc.
  • a substance having cancer metastasis inhibiting activity for example, tumor growth inhibition, tumor regression, tumor disappearance, etc.
  • a substance having cancer metastasis inhibiting activity for example, tumor growth inhibition, tumor regression, tumor disappearance, etc.
  • a substance having both activities can be obtained. it can.
  • the test substance is not limited.
  • nucleic acid, peptide, protein, non-peptidic compound, synthetic compound, fermentation product, cell extract, cell culture supernatant, plant extract, mammalian Examples include tissue extract and plasma.
  • the test substance may be a novel substance or a known substance. These test substances may form a salt, and a salt with a physiologically acceptable acid or base is used as the salt of the test substance.
  • the dose of the test substance is not particularly limited, and may be set as appropriate based on known literature and preliminary tests.
  • the administration route may be selected according to the test substance, and can be appropriately selected from known administration routes such as oral administration, intravenous administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration, intramuscular administration, and intratumoral administration.
  • the administration period, administration interval, evaluation time, evaluation frequency, etc. are not particularly limited.
  • the screening method of the present invention can be evaluated after about 2 weeks from inoculation of RM72 cells to the animal, and has the advantage that the tumor and metastasis at the cell inoculation site can be evaluated without dissecting the animal. Therefore, based on such characteristics, the administration period, administration interval, evaluation time, and number of evaluations may be appropriately set according to the test substance to be used. It is preferable to provide a negative control group (for example, administration of a solvent) in addition to the test substance administration group. Moreover, you may provide the positive control group which administers a known anticancer substance.
  • the evaluation may be performed at any time after the start of administration of the test substance. It may be during the administration period of the test substance, at the end of the administration period, or after an arbitrary period has elapsed from the end of the administration period. As will be described later, if evaluation is performed by chemiluminescence of RM72 cells, multiple evaluations can be performed without dissecting the animal.
  • the method for evaluating the size of the tumor at the cell inoculation site is not particularly limited. For example, a method of measuring the length, width, and height of a tumor with a caliper and calculating the tumor volume, a method of extracting a tumor and measuring its weight, and the like can be mentioned.
  • the method for evaluating the number or size of metastatic lesions in the target organ is not particularly limited. Examples thereof include a method of dissecting an animal to collect a target organ and measuring the number or size of metastatic lesions with the naked eye or under a microscope.
  • the target organ may be any organ as long as it can metastasize from a tumor generated at the cell inoculation site.
  • lung, lymph node, liver, bone, brain and the like can be mentioned.
  • step (2) the animal is dissected by administering luciferin to the animal and then recording the chemiluminescence image of the cell inoculation site and the target organ.
  • the size of the tumor at the site of cell inoculation and the number and / or size of metastases in the target organ can be assessed. That is, in this case, the step (2) preferably includes the following steps (2-1) and (2-2).
  • (2-2) A step of recording a chemiluminescence image of a cell inoculation site and / or a target organ after administration of luciferin
  • d-luciferin can be suitably used as luciferin to be administered to animals.
  • the luciferin solution can be prepared by, for example, dissolving luciferin in PBS or physiological saline.
  • the administration method and administration route may be selected so that luciferin can reach the site of RM72 cells in the animal. Therefore, systemic administration such as intraperitoneal administration and intravenous administration is preferred.
  • the administration dose is not particularly limited, but in the case of systemic administration, it may be appropriately selected from the range of, for example, about 40 to 80 mg / kg.
  • the chemiluminescence image may be recorded by any method as long as the chemiluminescence image of the cell inoculation site and / or target organ of the animal can be recorded, but the whole body chemiluminescence image of the animal can be recorded under anesthesia. preferable.
  • the time until the chemiluminescence image is recorded after administration of luciferin is not particularly limited. For example, in the case of intraperitoneal administration, the clearance time is considered to be about 30 minutes. Therefore, it is preferable to record within 30 minutes after administration of luciferin. More preferably, it is within 0 to about 20 minutes after luciferin administration.
  • Whole body chemiluminescence can be recorded using a commercially available in-vivo luminescence imaging system (for example, IVIS-Imaging-System manufactured by Xenogen).
  • the obtained image can be analyzed using commercially available image analysis software (for example, Living® Image® software manufactured by Xenogen).
  • the size of the tumor at the cell inoculation site of the animal administered with the test substance and the animal not administered with the test substance, and the number and / or size of metastases in the target organ are compared.
  • An animal that has not been administered a test substance usually corresponds to a negative control group (for example, a solvent administration group). If the tumor of the animal to which the test substance is administered is smaller than the tumor size of the animal to which the test substance is not administered, the test substance has anticancer activity (eg, tumor growth inhibition, tumor regression, tumor disappearance). Etc.).
  • a test substance that reduces the tumor size to 50% or less, more preferably a test substance that reduces the tumor size to 10% or less is determined as an anticancer substance.
  • the test substance has cancer metastasis inhibitory activity. Can be determined. In addition, if the size of the metastasis in the animal to which the test substance is administered is small compared to the size of the metastasis in the target organ of the animal to which the test substance is not administered, the test substance has cancer metastasis inhibitory activity. Can be determined. Preferably, a test substance that reduces the number or size of metastases to 20% or less, more preferably a test substance that decreases to 5% or less, is determined as a cancer metastasis inhibitor.
  • the present invention provides a screening method for an anticancer substance, which comprises selecting a substance that increases the expression of RECK in cancer cells.
  • RECK is useful as a prognostic marker and is considered promising as a target molecule for cancer treatment. Therefore, a substance that increases the expression of RECK in cancer cells is considered useful as an active ingredient of an anticancer agent.
  • the method for screening an anticancer substance characterized by selecting a substance that increases the expression of RECK in a cancer cell of the present invention includes, for example, bringing a test substance into contact with a cultured cancer cell, and the RECK protein in the cell
  • a method for measuring the amount of mRNA or the amount of mRNA and analyzing the change in the amount of protein or mRNA of RECK dependent on the test substance is included, but is not limited thereto.
  • the test substance is not limited, and examples thereof include nucleic acids, peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, mammalian tissue extracts, plasma and the like. Can be mentioned.
  • the test substance may be a novel substance or a known substance. These test substances may form a salt, and a salt with a physiologically acceptable acid or base is used as the salt of the test substance.
  • the amount of RECK protein can be quantified by extracting a protein from a cell by a known method and using a known protein amount measuring method.
  • known protein amount measurement methods include Western blot method, EIA method, ELISA method, RIA method, and a method using a protein measurement reagent.
  • the amount of RECK mRNA can be quantified by extracting RNA from cells by a known method and using a known mRNA amount measuring method.
  • Known methods for measuring the amount of mRNA include Northern blotting, RT-PCR, quantitative RT-PCR, RNase protection assay, and the like.
  • the method for analyzing the change in the amount of RECK protein or mRNA dependent on the test substance is not particularly limited.
  • the test substance is brought into contact with the test substance compared to the amount of RECK protein or mRNA in a control group that is not contacted with the test substance. If the amount of RECK protein or mRNA is increased, the test substance can be selected as the target substance.
  • the degree to which the test substance increases the amount of protein or mRNA of RECK is not particularly limited, but for example, a test substance that is 150% or more compared to the amount of protein or mRNA of cells not contacted with the test substance is preferable, A test substance to be 175% or more is more preferable.
  • the present inventors established a cell line suitable for efficiently screening for a substance that increases the expression of RECK in cancer cells.
  • This cell is a cell equipped with a HRAS 12V oncogene controlled by a reporter system including a Reck gene promoter and a reporter gene and a tetracycline expression induction system.
  • This cell shows the form of a cancer cell and a normal cell depending on the presence or absence of tetracycline. Therefore, the present screening method can easily compare the induction of RECK expression in cancer cells and normal cells. It is suitable as a cell to be used.
  • the reporter is compared with the case where the test substance is not contacted in the form of cancer cells. If the gene expression level is increased, the test substance can be selected as the target substance. When the same test substance is brought into contact with cancer cells and normal cells in the presence or absence of tetracycline, the expression level of the reporter gene in both cells may be the same. It is preferable that the expression level is higher.
  • the expression level of the reporter gene in cancerous cells is more preferably 1.5 times or more, and more preferably 2 or more times higher than the expression level of reporter genes in normal form cells.
  • the cells established by the present inventors include a CREF cell line (rat fibroblast cell line, reference Fisher PB, Babiss LE, Weinstein IB, Ginsberg HS. Analysis of type 5 adenovirus transformation with a cloned rat embryo. cell line (CREF). Proc Natl Acad Sci USA 1982; 79: 3527-3531.) HRAS 12V oncogene controlled by Tet-off system, upstream of mouse Reck gene as Reck gene promoter 4 .1 kb region fragment, secretory alkaline phosphatase gene as reporter gene, neomycin resistance gene and blasticidin S resistance gene.
  • This cell can be prepared by the method described in Example 1 (1).
  • the present inventors selected one clone having the highest degree of increase in the expression of SEAP after treatment with doxycycline, which is a tetracycline antibiotic, from the cells prepared by the method described in Example 1 (1).
  • This cell line is named YM3 and is used in the screening method. Therefore, a particularly preferred cell line for efficiently screening for a substance that increases the expression of RECK in cancer cells is the YM3 cell line.
  • the present inventors use a secretory alkaline phosphatase (SEAP) gene as a reporter gene, but the present invention is not limited to this. Any commonly used reporter gene can be suitably used.
  • the reporter gene is preferably a stable and easily quantifiable activity. Examples thereof include genes encoding luciferase, ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase, chloramphenicol acetyltransferase, alkaline phosphatase, peroxidase, green fluorescent protein (GFP) and the like.
  • the present inventors use a 4.1 kb region upstream of the mouse Reck gene (Gene ID: 53614, Chromosome 4-NC_000070.5, 43884251-43888453) as the Reck gene promoter, but is not limited thereto.
  • Other mammalian Reck gene promoters can also be suitably used.
  • Other mammals include humans, chimpanzees, monkeys, dogs, cows, rats, guinea pigs and the like, preferably humans.
  • the base sequence of the Reck gene promoter region of various animals can be obtained from a known database (DDBJ / GenBank / EMBL, etc.).
  • the human RECK gene promoter region has Gene ID: 8434, Chromosome 9-NC_000009.11 36,032,644-36,036,971.
  • HRAS 12V oncogene which is controlled by the Tet-off system
  • HRAS 12V oncogene which is controlled by the Tet-on system
  • the present inventors use a neomycin resistance gene and a blasticidin S resistance gene as selection markers, but are not limited thereto. Any known selectable marker that can be used for mammalian cells can be preferably used. Specific examples include puromycin, hygromycin B, zeocin and the like.
  • the present invention includes cells suitable for efficiently screening for a substance that increases the expression of RECK in the cancer cells. That is, a mammalian cell comprising a reporter system including a Reck gene promoter and a reporter gene and an HRAS 12V oncogene controlled by a tetracycline expression induction system is also included in the present invention.
  • a cell derived from a CREF cell line comprising an HRAS 12V oncogene controlled by a reporter system including a Reck gene promoter and a reporter gene and a tetracycline expression induction system, and controlled by a Tet-off system
  • a reporter system including a Reck gene promoter and a reporter gene and a tetracycline expression induction system
  • Tet-off system A mammalian cell having a 12V oncogene, a fragment of the upstream 4.1 kb region of the mouse Reck gene as a Reck gene promoter, a secreted alkaline phosphatase gene as a reporter gene, and a neomycin resistance gene and a blasticidin S resistance gene.
  • the screening method for selecting a substance that increases the expression of RECK in cancer cells of the present invention can be suitably used for prescreening of a test substance to be used in the screening method using the above-mentioned cancer natural metastasis model animal.
  • the substance that increases the expression of RECK selected by the screening method of the present invention is useful as an active ingredient, an active ingredient candidate, or a lead compound of a Reck activator, an anticancer agent, or a cancer metastasis inhibitor.
  • the present inventors screened 880 chemical libraries using the screening method of the present invention, and selected 34 compounds that activate the Reck gene promoter in a concentration-dependent manner.
  • the present invention provides a Reck activator, anticancer agent or cancer metastasis inhibitor comprising one kind selected from the group consisting of the above 34 kinds of compounds or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. provide.
  • At least five of disulfram, harmine, pyrithione sodium salt, gramicidin and lycorine were used for anticancer activity (for example, tumor growth) by the screening method using the natural cancer metastasis model animal of the present invention. Suppression, tumor regression, tumor disappearance, etc.) and cancer metastasis inhibitory activity.
  • the present invention provides an anticancer agent comprising as an active ingredient one selected from the group consisting of disulfiram, harmine, pyrithione, graphicidin and lycorine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof,
  • an anticancer agent comprising as an active ingredient one selected from the group consisting of disulfiram, harmine, pyrithione, graphicidin and lycorine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • a cancer metastasis inhibitor comprising as an active ingredient one selected from the group consisting of harmine, pyrithione, graphicidin, and lycorine, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • “Pharmaceutically acceptable salts” include, for example, salts of alkali metals (eg, potassium, sodium, lithium, etc.), salts of alkaline earth metals (eg, calcium, magnesium, etc.), ammonium salts (eg, tetra Methylammonium salt, tetrabutylammonium salt, etc.), organic amines (eg, triethylamine, methylamine, dimethylamine, cyclopentylamine, benzylamine, phenethylamine, piperidine, monoethanolamine, diethanolamine, tris (hydroxymethyl) methylamine, lysine, Salts of arginine, N-methyl-D-glucamine, etc., acid adduct salts (for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, hydroiodide, sulfate, phosphate, nitrate); For example, acetate, trifluoroacetate, lactate, tart
  • the above-mentioned 34 kinds of compounds are all known compounds and can be produced by known methods, respectively, and commercially available products can be purchased.
  • the compound having an isomer such as an optical isomer, a stereoisomer, a positional isomer, or a rotational isomer may be either one isomer or a mixture.
  • the 34 kinds of compounds may be hydrates or solvates, and may be labeled with an isotope or the like.
  • a pharmaceutical comprising the above compound obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient is one selected from the group consisting of the above 34 types or the above 5 compounds, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and further additives can be appropriately blended to prepare a preparation.
  • oral preparations such as tablets, coated tablets, pills, powders, granules, capsules, solutions, suspensions, emulsions; parenterals such as injections, infusions, suppositories, ointments, patches, etc. can do. What is necessary is just to set suitably about the mixture ratio of a carrier or an additive based on the range normally employ
  • Carriers or additives that can be blended are not particularly limited.
  • various carriers such as water, physiological saline, other aqueous solvents, aqueous or oily bases; excipients, binders, pH adjusters, disintegrants, absorption
  • Various additives such as an accelerator, a lubricant, a colorant, a corrigent, and a fragrance are included.
  • Additives that can be mixed into tablets, capsules and the like include binders such as gelatin, corn starch, tragacanth and gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid and the like. Leavening agents, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, flavoring agents such as peppermint, red mono oil or cherry.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the above type of material.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to conventional pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil and the like.
  • aqueous liquid for injection for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) are used.
  • alcohols eg, ethanol
  • polyalcohols eg, propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80 TM , HCO-50
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • Buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • storage You may mix
  • the preparation thus obtained can be administered to, for example, humans and other mammals (eg, rats, mice, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • the dose, the number of doses, the administration interval, etc. may be appropriately set according to the condition of the animal to be administered, the target cancer type, symptoms, administration method and the like.
  • the present invention includes the following inventions.
  • A For mammals, one of the 34 or 5 compounds described above, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a method for treating cancer comprising administering an effective amount.
  • B Use of one type selected from the group consisting of the above 34 types or the above 5 types of compounds, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for producing an anticancer agent.
  • C One type selected from the group consisting of the above 34 types or the above 5 types of compounds, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, for use in the treatment of cancer.
  • D A method for inhibiting cancer metastasis, comprising administering to a mammal an effective amount of any one of the above five compounds or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Example 1 Establishment of cell line
  • the present inventors previously described a rat fibroblast cell line CREF (Fisher PB, Babiss LE, Weinstein IB, Ginsberg HS. Analysis of type 5 adenovirus transformation with a cloned rat embryo cell line (CREF). Proc Natl Acad.
  • TF323-C3 cells can be distributed from the present inventor Ryo Noda.
  • plasmids pGL4 including a luciferase gene derived from Photinus pyralis, manufactured by Promega
  • pcDNA3.1 ( ⁇ )-Hygro containing a hygromycin B phosphotransferase gene (resistance gene), manufactured by Invitrogen
  • a culture solution containing G418 (1 mg / ml) and hygromycin B (400 U / ml) to isolate a clone exhibiting high luciferase activity.
  • several clones having high gelatinase activity were selected and each was subcutaneously transplanted into nude mice. As a result, one strain showing pulmonary metastasis was found in 2 weeks, and this was named RM72.
  • Example 2 SEAP assay
  • YM3 cells were seeded at 1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l / well in a 96-well plate and incubated for 5 hours to fix the cells, and then a compound solution (500 ⁇ M, 1 ⁇ l) was added to the medium.
  • a chemical library Prestwick Chemical Library (Prestwick Chemical, Illkirch, France) consisting of 880 structurally different known biologically active compounds dissolved in nanopure dimethyl sulfoxide (DMSO, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is used. did.
  • SF reagent Nacalai
  • a 450 absorbance at 450 nm
  • the SEAP activity data were obtained by dividing “SEAP activity per cell” by “SEAP measured value / A 450 ” and dividing “SEAP activity per cell” by “SEAP activity per cell” of the negative control by “relative It was defined as “SEAP activity”, and the average value and error of “relative SEAP activity” between duplicate samples were determined.
  • SEAP activity the value obtained by dividing the SF measurement value of each compound by the SF measurement value of the negative control was defined as “relative cell number”, and the average value and error between duplicate samples were obtained. Re-experiment was conducted for those with large errors.
  • Example 3 Confirmation of concentration-dependent activity
  • DSF disulfiram
  • DXR doxorubicin
  • Gra gramicidin
  • Pyt pyrithione sodium salt
  • HT1080 cells stably transfected with pGL3-4110 were exposed to DSF, Pyt, DXR, or ammonium pyrrolidine dithiocarbamate (hereinafter “pDTC”) for 48 hours at the dose shown in FIG.
  • pDTC ammonium pyrrolidine dithiocarbamate
  • HT1080 cells stably transfected with pGL3-4110 were seeded in a 96-well plate (5 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l / well), cultured for 24 hours, and then 1 ⁇ l compound solution or solvent (DMSO) was added to the wells. Added every time.
  • Example 5 Confirmation of endogenous RECK expression induction activity (part 1)]
  • Five human malignant tumor-derived cell lines (HT1080, RZmet3, A549 (human lung adenocarcinoma cells) or SW480 (human colon adenocarcinoma cells), RM72 were allowed to act on each IC 50 with DSF, DXR, Gra and Pyt. (PZTC was also used for RZmet3 and RM72), cells were lysed 48 hours or 72 hours later, and the expression level of endogenous RECK protein was examined by immunoblotting.
  • HT1080 and A549 are 5 ⁇ 10 4 cells, RZmet3 is 1 ⁇ 10 5 cells, SW480 is 1.5 ⁇ 10 5 cells), and each compound acts with IC 50 determined by colony formation assay.
  • HPM (1 ⁇ g / ml) as a positive treatment, 1% DM as a negative control SO (solvent) was used, and the duration of action was 48 hours for HT1080, RZmet3, and RM72, and 72 hours for A549 and SW480.
  • a cell lysate was prepared, and immunization with an anti-RECK antibody (5B11D12) was used.
  • Blot assay was submitted and analyzed, followed by stripping and reprobing with anti-GAPDH antibody (6C5, Ambion) .
  • Anti-GAPDH antibody (6C5, Ambion)
  • Enhanced Chemiluminescence kit (Millipore) for visualization and HRP-labeled anti-mouse as secondary antibody IgG-F (ab ′) monoclonal antibody (Cell Signaling) was used, and images were recorded and analyzed using LAS-3000 and MultiGauge software (FUJIFILM). It is, after standardization based on the GAPDH, was determined by dividing the value after normalization of cells solvent treatment.
  • FIGS. 7 (A) to (E) The results are shown in FIGS. 7 (A) to (E).
  • (A) is the result of HT1080 cells
  • (B) is the result of RZmet3 cells
  • (C) is the result of A549 cells
  • (D) is the result of SW480 cells
  • (E) is the result of RM72 cells.
  • all of the compounds enhanced the expression of endogenous RECK in the human malignant tumor-derived cell line.
  • Example 6 Confirmation of endogenous RECK expression-inducing activity (part 2)] Induction of endogenous RECK expression on RM72 cells for lycorine (hereinafter “Lyc”, emetic alkaloid) and harmine (hereinafter “Hr”, monoamine oxidase A) among 34 compounds selected in the secondary screening The activity was confirmed. Specifically, Lyc (1.3 ⁇ M) or Hr (11 ⁇ M) corresponding to IC 30 was allowed to act on RM72 cells in culture for 48 hours, and RECK mRNA (RT-PCR method) and RECK protein (immunoblot method) were applied. Examined. The relative band intensity was obtained by normalization based on HPRT1 for mRNA and GAPDH for protein, and then dividing by the value after standardization of solvent-treated cells.
  • Lyc emetic alkaloid
  • Hr monoamine oxidase A
  • FIGS. 8 (A) and (B) show the results of RECK mRNA
  • (B) shows the result of RECK protein.
  • both the Lyc and Hr increased the expression of RECK at the mRNA level, but at the protein level, only Hr increased the expression and Lyc decreased the expression.
  • Example 7 Confirmation of the effect of DSF on tumor cells in vitro
  • the morphology and behavior of RZmet3 cells in the presence or absence of DSF were examined using a time-lapse video microscope. Specifically, RZmet3 cells (2 ⁇ 10 4 cells) were seeded in a 35 mm glass dish (IWAKI), cultured for 24 hours, and replaced with a growth medium containing 1% DMSO (solvent) or 10 ⁇ M DSF. After further incubation for 24 hours, the medium was replaced with Leibovitz's L-15 (GIBCO) containing 10% fetal bovine serum and 1% DMSO or 10 ⁇ M DSF.
  • GIBCO Leibovitz's L-15
  • FIGS. 9 (A) to (C) The results are shown in FIGS. 9 (A) to (C).
  • (A) is a differential interference contrast image of RZmet3 cells cultured for 24 hours in the presence or absence of DSF
  • (B) is the result of expressing the cell spread as a ratio to the control
  • DSF induces flattening and diffusion of RZmet3 cells and suppresses random migration rate. This result was consistent with the result of introducing the RECK expression vector into the transformed cells.
  • Example 8 Gelatin zymography
  • Gelatin zymography was performed using the culture supernatant of RM72 cells treated with DSF, DXR, Gra, Pyt, pDTC, HPM and DMSO (solvent).
  • RM72 cells were seeded in a 96-well plate (2 ⁇ 10 4 cells / well) and cultured for 24 hours, and a medium containing the above compound (DSF: 16 ⁇ M, DXR: 210 nM, Gra: 32 nM, Pyt: 5 ⁇ M).
  • HPM 1 ⁇ g / ml
  • pDTC 20 ⁇ M
  • the medium was changed to 100 ⁇ l DMEM containing 0.1% FBS, and further cultured for 12 hours. Collect the culture supernatant and remove the solids by centrifugation.
  • the literature (Takahashi C, Sheng Z, Horan TP, Kitayama H, Maki M, Hitomi K, Kitaura Y, Takai S, Sasahara RM, Horimoto A, Ikawa Y, Ratzkin BJ, Arakawa T, Noda M. Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95: 13221-13226.) Analyzed graphically. The band intensity was normalized by the number of cells measured by SF assay.
  • mice [Example 9: Confirmation of antitumor activity and metastasis inhibitory activity of DSF]
  • FIG. 15 shows the results of contrasting the degree of lung metastasis by standardizing with the tumor size. Note that no significant side effects were observed in all cases of the DSF group. From these results, it was revealed that DSF has weak antitumor activity and strong metastasis inhibitory activity.
  • Example 10 Confirmation of antitumor activity and metastasis inhibitory activity of Pyt, Hr, Gra, Lyc
  • Antitumor activity and metastasis inhibitory activity were confirmed for Pyt, Hr, Gra, and Lyc by the same protocol as in Example 9.
  • the experiment was performed in two steps. In Experiment 1, three groups of a Pyt group, an Hr group, and a solvent group were provided. In Experiment 2, three groups of a Gra group, a Lyc group, and a solvent group were provided. The dose of the test compound was set to two amounts considered appropriate based on the literature (see Tables 3 and 4).
  • FIG. 16 shows whole body and lung bioluminescence images of representative individuals in the solvent group, the Gra group, and the Lyc group.
  • FIG. 17A shows the relative tumor size and relative lung metastasis of the Pyt group and the Hr group with respect to the solvent group
  • FIG. 17B shows the lung metastasis and tumor size distribution of each individual of the Pyt group, the Hr group, and the solvent group.
  • FIG. 17C shows the relative tumor size and relative lung metastasis of the Gra, Lyc and solvent groups with respect to the solvent group
  • FIG. 17D shows the distribution of lung metastasis and tumor size of each individual of the Gra group, Lyc group and solvent group. Respectively.
  • the natural lung metastasis model using RM72 cells can reliably produce results in a small number of animals for a short period of time. Furthermore, this natural lung metastasis model is also excellent in that metastasis can be determined without dissection. In treatment experiments that require daily administration, it is critically important that results be obtained in a short period of time, and this is considered to be a useful experimental system that opens a new breakthrough in preclinical studies.
  • the compound screening method using the Reck promoter has both an approach that uses biological activity such as induction of normal recovery as an index and a molecular target approach that searches for an activator of RECK that is a tumor suppressor molecule. .
  • the compound screening method using the Reck promoter can detect conventional anticancer agents very efficiently, and can simultaneously detect new types of compounds that have low toxicity, such as DSF, and have metastasis-inhibiting activity. It became clear.

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Abstract

　ＲＭ７２細胞（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１０）由来の腫瘍を有する自然転移モデル動物は、腫瘍形成とがん自然転移を同時に評価することができる。この自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法により、抗がん活性および／またはがん転移抑制活性を有する物質を取得することができる。また、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質選択するスクリーニング方法により、抗がん剤の有効成分となり得る物質を取得することができる。

Description

抗がん剤のスクリーニング方法
　本発明は、抗がん剤のスクリーニング方法に関するものであり、より詳細には、がん自然転移モデル動物を用いる抗がん剤のスクリーニング方法、当該スクリーニング方法に用いるがん自然転移モデル動物および当該モデル動物の作製に用いるがん細胞株、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を選択する抗がん剤のスクリーニング方法および当該スクリーニング方法に用いる哺乳動物細胞、ならびにこれらのスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分とする抗がん剤に関するものである。
　旧来の抗がん剤探索は、がん細胞に対する傷害活性や移植腫瘍の退縮を指標として実施されてきたが、これらの方法で選ばれた薬剤は一般に副作用が強く、許容投与量の幅が狭いという問題点を持つ。一方、最近、脚光を浴びている分子標的薬は、当該遺伝子に変異を持つ腫瘍にしか適用できない場合が多く、２次変異による耐性細胞の出現も見られる。このため、副作用が少なく、抗がん活性の強い薬剤の探索は急務である。
　本発明者らは、これまでに独自の悪性転換抑制遺伝子スクリーニング系を樹立し、これを用いて新規がん関連遺伝子を見出してきた。本発明者らが見出した新規がん関連遺伝子のなかで、ＲＥＣＫ（reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs）は膜アンカー型メタロプロテアーゼ制御因子をコードし、大腸、肺、胃、乳、膵、前立腺など多くのがんにおいて高頻度の発現低下が見られること、腫瘍組織におけるＲＥＣＫの発現量が患者の生存率と正の相関性を示すことなどが明らかとなった。また、ＲＥＣＫを強制発現させたがん細胞株をヌードマウスに移植すると、親株に比べ、腫瘍増殖、血管新生、浸潤、転移などの抑制が観察された。これらの知見から、ＲＥＣＫは予後マーカーとして有用であるのみならず、がん治療の標的作用分子（エフェクター）としても有望であることが示唆された（非特許文献１、２、３）。
　他方、がんの転移実験では、メラノーマ細胞をマウスの尾静脈に接種し、２～８週間後に解剖して肺に生じたコロニーを計数するという方法（tail vein assay）が最も良く用いられる（非特許文献４、５）。これは「実験転移」とも呼ばれ、血行性転移の後半部分を再現したものとみなされている。ある組織中に接種した腫瘍細胞の遠隔組織への転移は実際の患者で起こる転移により近く、「自然転移」（spontaneous metastasis assay）と呼ばれる。自然転移のプロトコールとしては、マウスの手の平に腫瘍を接種し、腫瘍が一定の大きさに達した時点で手を切断して原発巣を除き、４０～１００日後に解剖して肺転移を観察する方法が知られている（非特許文献６）。しかし、判定までに長時間を要するという問題があり、短期間で自然転移を判定できる実験系の確立が望まれている。
Oh J, Takahashi R, Kondo S, Mizoguchi A, Adachi E, Sasahara RM, Nishimura S, Imamura Y, Kitayama H, Alexander DB, Ide C, Horan TP, Arakawa T, Yoshida H, Nishikawa S, Itoh Y, Seiki M, Itohara S, Takahashi C, Noda M. The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis. Cell 107, 789-800 (2001). Noda M, Oh J, Takahashi R, Kondo S, Kitayama H, Takahashi C. RECK: a novel suppressor of malignancy linking oncogenic signaling to extracellular matrix remodeling. Cancer Metastasis Rev 22, 167-175 (2003). Noda M, Takahashi C. Recklessness as a hallmark of aggressive cancer. Cancer Sci 98, 1659-1665 (2007). Fidler IJ. Selection of successive tumour lines for metastasis. Nat New Biol 242, 148-149 (1973). Fidler IJ. The relationship of embolic homogeneity, number, size and viability to the incidence of experimental metastasis. Eur J Cancer 9, 223-227 (1973). Fitzer-Attas CJ, Do MS, Feigelson S, Vadai E, Feldman M, Eisenbach L. Modification of PDGFalpha receptor expression or function alters the metastatic phenotype of 3LL cells. Oncogene 15, 1545-1554 (1997).
　本発明は、短期間で自然転移を判定するために使用するがん細胞株、当該がん細胞株を用いたがん自然転移モデル動物およびその作製方法、当該がん自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法および当該スクリーニング方法で得られる抗がん剤またはがん転移抑制剤を提供することを目的とする。さらに本発明は、がん細胞のＲＥＣＫ発現を増加させる物質を選択するスクリーニング方法、当該スクリーニング方法に用いる哺乳動物細胞および当該スクリーニング方法で得られた抗がん剤を提供することを目的とする。
　本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ＲＭ７２細胞（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１０）。
［２］前記［１］に記載の細胞由来の腫瘍を有することを特徴とするがん自然転移モデル動物。
［３］げっ歯類である前記［２］に記載のがん自然転移モデル動物。
［４］マウスである前記［３］に記載のがん自然転移モデル動物。
［５］前記［１］に記載の細胞を実験動物に接種することを特徴とするがん自然転移モデル動物の作製方法。
［６］前記［１］に記載の細胞を実験動物の皮下に接種し、腫瘍を形成させることを特徴とする前記［５］に記載のがん自然転移モデル動物の作製方法。
［７］抗がん活性および／またはがん転移抑制活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、前記［２］～［４］のいずれかに記載のがん自然転移モデル動物に、被験物質を投与する工程と、被験物質の投与開始後に、細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを評価する工程と、被験物質を投与した動物と被験物質を投与していない動物の細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを比較する工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
［８］抗がん活性および／またはがん転移抑制活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、前記［２］～［４］のいずれかに記載のがん自然転移モデル動物に、被験物質を投与する工程と、被験物質の投与開始後に、動物にルシフェリンを投与する工程と、ルシフェリン投与後に、動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像を記録する工程と、被験物質を投与した動物と被験物質を投与していない動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像を比較する工程とを含むことを特徴とするスクリーニング方法。
［９］がん細胞のＲＥＣＫ（reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs）の発現を増加させる物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法。
［１０］がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質が、がん細胞のＲｅｃｋ遺伝子プロモーター活性を高める物質であることを特徴とする前記［９］に記載のスクリーニング方法。
［１１］Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えた細胞を用いることを特徴とする前記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えた細胞が、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を有するＣＲＥＦ細胞株由来の細胞であり、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域の断片を有し、レポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子を有し、さらにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を有する細胞であることを特徴とする前記［１１］に記載のスクリーニング方法。
［１３］Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えることを特徴とする哺乳動物細胞。
［１４］Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えたＣＲＥＦ細胞株由来の細胞であって、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域の断片、レポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を有する前記［１３］に記載の哺乳動物細胞。
［１５］前記［９］～［１２］のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｅ（ｓ,＋）、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃｅｐｈａｅｌｉｎｅ、ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ、ｅｍｅｔｉｎｅ、ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ、ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ、ｈａｌｏｐｒｏｇｉｎ、ｌｙｃｏｒｉｎｅ、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｍｅｎａｄｉｏｎｅ、ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ、ｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ、ｔｒｉｍｅｐｒａｚｉｎｅ、ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ、ｔｒｉａｍｔｅｒｅｎｅ、ｔｒｉｆｌｕｐｒｏｍａｚｉｎｅ、ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ、ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ、ｈｙｃａｎｔｈｏｎｅ、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅおよびｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
［１６］前記［９］～［１２］のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるＲＥＣＫの発現を増加させる物質を、被験物質として用いることを特徴とする前記［７］または［８］に記載のスクリーニング方法。
［１７］前記［７］、［８］または［１６］に記載のスクリーニング方法により得られた、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
［１８］前記［７］、［８］または［１６］に記載のスクリーニング方法により得られた、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするがん転移抑制剤。
　本発明により、短期間で自然転移を判定するために使用するがん細胞株を提供することができる。当該細胞株を実験動物に接種することにより、がん自然転移モデル動物を作製することができ、当該がん自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法により、抗がん剤またはがん転移抑制剤の有効成分となり得る物質を取得することができる。また、本発明により、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質選択するスクリーニング方法および当該スクリーニング方法に好適に用いることができる哺乳動物細胞を提供することができる。当該ＲＥＣＫの発現を増加させる物質選択するスクリーニング方法により抗がん剤の有効成分となり得る物質を取得することができる。また、当該ＲＥＣＫの発現を増加させる物質選択するスクリーニング方法は、上記がん自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法の一次スクリーニングの方法として有用である。
ＹＭ３細胞に含まれる外来遺伝子を示す図である。 ＹＭ３細胞の性質を示す図である。 分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイの流れを示す図である。 ８８０種のケミカルライブラリーについてＳＥＡＰアッセイを行い、陽性対照のＨＰＭよりも高いＲｅｃｋ遺伝子プロモーター活性を示した化合物の一部の結果を示した図である。 Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーター誘導活性が強いｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ（ＤＳＦ）、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（ＤＸＲ）、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ（Ｇｒａ）、およびｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（Ｐｙｔ）の４種について、ＹＭ３細胞に対する濃度依存的活性を確認した結果を示す図である。 ｐＧＬ３－４１１０を安定導入したＨＴ１０８０細胞に対して、ＤＳＦ、Ｐｙｔ、ＤＸＲまたはアンモニウム ピロリジン ジチオカーボメート（ｐＤＴＣ）を作用させ、ルシフェラーゼ活性によりＲｅｃｋ遺伝子プロモーター誘導活性を測定した結果を示す図である。 ＨＴ１０８０細胞にＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔを作用させ内在性ＲＥＣＫタンパク質発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 ＲＺｍｅｔ３細胞にＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔを作用させ内在性ＲＥＣＫタンパク質発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 Ａ５４９細胞にＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔを作用させ内在性ＲＥＣＫタンパク質発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 ＳＷ４８０細胞にＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔを作用させ内在性ＲＥＣＫタンパク質発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 ＲＭ７２細胞にＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔを作用させ内在性ＲＥＣＫタンパク質発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 ＲＭ７２細胞にｌｙｃｏｒｉｎｅ（Ｌｙｃ）、ｈａｒｍｉｎｅ（Ｈｒ）を作用させ内在性ＲＥＣＫ ｍＲＮＡ発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 ＲＭ７２細胞にＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔを作用させ内在性ＲＥＣＫタンパク質発現誘導活性を確認した結果を示す図である。 ＤＳＦの存在下または非存在下で２４時間培養したＲＺｍｅｔ３細胞の微分干渉コントラスト画像である。 ＤＳＦの存在下または非存在下で２４時間培養したＲＺｍｅｔ３細胞の広がりを比較した結果を示す図である。 ＤＳＦの存在下または非存在下で２４時間培養したＲＺｍｅｔ３細胞のランダムな遊走の相対速度を比較した結果を示す図である。 ＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔで処理したＲＭ７２細胞の培養上清を用いたゼラチンザイモグラフィーの結果を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＤＳＦの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群およびＤＳＦ群における全身および肺のバイオルミネッセンス像を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＤＳＦの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群とＤＳＦ群の各個体の肺転移と腫瘍サイズの分布を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＤＳＦの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群とＤＳＦ群の腫瘍サイズを比較した図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＤＳＦの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群とＤＳＦ群の肺転移を比較した図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＤＳＦの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群とＤＳＦ群の肺転移の程度を腫瘍サイズで標準化して対比した図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＧｒａおよびＬｙｃの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群、Ｇｒａ群およびＬｙｃ群における全身および肺のバイオルミネッセンス像を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＰｙｔおよびＨｒの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群に対するＰｙｔ群およびＨｒ群の相対腫瘍サイズおよび相対肺転移を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＰｙｔおよびＨｒの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群、Ｐｙｔ群およびＨｒ群の各個体の肺転移と腫瘍サイズの分布を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＧｒａおよびＬｙｃの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群に対するＧｒａ群およびＬｙｃ群の相対腫瘍サイズおよび相対肺転移を示す図である。 ＲＭ７２細胞を接種した自然肺転移モデルマウスを用いてＧｒａおよびＬｙｃの抗腫瘍活性および転移抑制活性を評価した結果であり、溶媒群、Ｇｒａ群およびＬｙｃ群の各個体の肺転移と腫瘍サイズの分布を示す図である。
〔ＲＭ７２細胞〕
　本発明は、ＲＭ７２細胞（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１０として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８、郵便番号２９２－０８１８）に国際寄託済み。受託日：２０１１年６月２２日）を提供する。ＲＭ７２細胞は、ヒト線維肉腫由来細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ－１２１）由来の細胞であり、ＨＴ１０８０細胞に選択マーカーとしてｎｅｏ（大腸菌由来カナマイシン耐性遺伝子）およびＨｙｇｒｏ（大腸菌由来ハイグロマイシンＢ耐性遺伝子）、ならびにＬｕｃ（ホタル由来ルシフェラーゼ遺伝子）を発現するプラスミドを導入した細胞である（実施例１（２）参照）。ＲＭ７２細胞をヌードマウスの皮下に接種すると腫瘍を形成するとともに、接種後２週間以内に肺への自然転移が見られる。
　ＲＭ７２細胞は、例えば１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を用いて、５％ＣＯ２、３７℃で培養することができる。培地にはペニシリン（例えば約100U/ml）、ストレプトマイシン（例えば約100μg/ml）、ハイグロマイシンＢ（例えば約400U/ml）およびＧ４１８（例えば約100mg/ml）が添加されていることが好ましい。
〔がん自然転移モデル動物およびその作製方法〕
　本発明のがん自然転移モデル動物は、ＲＭ７２細胞由来の腫瘍を有するものであればよい。本発明のがん自然転移モデル動物は、腫瘍形成とがん自然転移を同時に評価することができる点で非常に有用である。さらに、がん自然転移は、細胞の皮下接種後約２週間という短時間で評価することが可能であり、従来法（非特許文献６）のように判定までに長時間（４０～１００日）を要しない点で非常に優れている。さらに、ＲＭ７２細胞にはルシフェラーゼ発現ベクターが導入されているため、動物にルシフェリンを投与して全身の化学発光像を記録することにより原発巣および転移巣の位置と体積を映像化することができる。つまり、動物を解剖することなく腫瘍形成とがん自然転移を評価できる点で、画期的ながん自然転移モデル動物である。
　本発明のがん自然転移モデル動物は、ＲＭ７２細胞を実験動物に接種することにより作製することができる。実験動物は特に限定されないが、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルなどの哺乳動物が挙げられる。好ましくはマウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類であり、より好ましくはマウスである。さらに、動物は免疫不全動物であることが好ましい。免疫不全動物としては、例えば、ヌードマウス、ヌードラット、ＳＣＩＤマウスなどが挙げられる。
　ＲＭ７２細胞を接種する部位は、ＲＭ７２細胞が腫瘍を形成しやすい部位であれば特に限定されない。接種が容易であり、かつ腫瘍を形成しやすい点で、動物の皮下に接種することが好ましい。具体的には、背部皮下や腹部皮下が好適である。接種するＲＭ７２細胞の細胞数は、動物の種類や大きさ、接種部位等に応じて適宜選択すすることができる。ヌードマウスに皮下接種する場合は、例えば約１～５×１０６個の細胞を約１００μｌ程度のＰＢＳに懸濁して、注射器を用いて接種すればよい。接種後約５～７日で腫瘍形成の有無を確認することができる。通常、接種後約５～７日で直径が約３ｍｍ程度の腫瘍が形成される。腫瘍の形成が確認できた動物を、がん自然転移モデル動物として用いることができる。
〔がん自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法〕
　本発明のスクリーニング方法は、以下の工程（１）～（３）を含むものであればよい。本発明のスクリーニング方法により、抗がん活性（例えば、腫瘍増殖抑制、腫瘍退縮、腫瘍消滅など）を有する物質、がん転移抑制活性を有する物質、および両方の活性を有する物質を取得することができる。
（１）上記本発明のがん自然転移モデル動物に被験物質を投与する工程
（２）被験物質の投与開始後に、細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを評価する工程
（３）被験物質を投与した動物と被験物質を投与していない動物の細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを比較する工程
　上記工程（１）において、被験物質は限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよく、被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
　被験物質の用量は特に限定されず、公知文献や予備試験等に基づいて適宜設定すればよい。投与経路は被験物質に応じて選択すればよく、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与等の公知の投与経路から適宜選択することができる。投与期間、投与間隔、評価時期、評価回数等も特に限定されない。本発明のスクリーニング方法は、動物へのＲＭ７２細胞接種から約２週間経過すれば評価が可能であり、動物を解剖することなく細胞接種部位の腫瘍と転移巣の評価を行うことができるという利点を有しているので、このような特徴を踏まえ、用いる被験物質に応じて投与期間、投与間隔、評価時期、評価回数を適宜設定すればよい。被験物質投与群の他に陰性対照群（例えば溶媒を投与）を設けることが好ましい。また、既知の抗がん物質を投与する陽性対照群を設けてもよい。
　上記工程（２）において、評価を行う時期は被験物質の投与開始後であればいつでもよい。被験物質の投与期間中でもよく、投与期間終了時でもよく、投与期間終了から任意の期間経過後でもよい。後述のように、ＲＭ７２細胞の化学発光により評価を行えば、動物を解剖することなく複数回の評価を行うことができる。細胞接種部位の腫瘍の大きさを評価する方法は特に限定されない。例えば、腫瘍の長さ、幅、高さをノギス等で測定して、腫瘍体積を算出する方法、腫瘍を摘出してその重量を測定する方法等が挙げられる。また、標的臓器における転移巣の数または大きさを評価する方法も特に限定されない。例えば、動物を解剖して標的臓器を採取し、肉眼または顕微鏡下で転移巣の数または大きさを測定する方法等が挙げられる。標的臓器は、細胞接種部位に生じた腫瘍から転移し得る臓器であればいずれの臓器でもよい。例えば、肺、リンパ節、肝臓、骨、脳などが挙げられる。なかでも、細胞接種から２週間以内に転移することが確認されている肺を標的臓器とすることが好ましい。
　ＲＭ７２細胞にはルシフェラーゼ発現ベクターが導入されているため、上記工程（２）において、動物にルシフェリンを投与し、その後細胞接種部位および標的臓器の化学発光像を記録することにより、動物を解剖することなく細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを評価することができる。すなわち、この場合、上記工程（２）は、以下の工程（２－１）および（２－２）を含むことが好ましい。
（２－１）被験物質の投与開始後に、動物にルシフェリンを投与する工程
（２－２）ルシフェリン投与後に、動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像を記録する工程
　動物に投与するルシフェリンは、市販のｄ－ルシフェリンを好適に用いることができる。ルシフェリン溶液は、例えば、ＰＢＳや生理食塩液等にルシフェリンを溶解して調製することができる。ルシフェリンが動物内のＲＭ７２細胞の存在部位に到達できるように投与方法および投与経路を選択すればよい。したがって、腹腔内投与、静脈内投与等の全身性投与が好ましい。投与用量は特に限定されないが、全身性投与の場合、例えば約４０～８０ｍｇ／ｋｇの範囲から適宜選択すればよい。
　ルシフェリン投与後に動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像を記録する。化学発光像の記録は、動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像が記録できる方法であればどのような方法でもよいが、麻酔下で動物の全身化学発光像を記録することが好ましい。ルシフェリン投与後、化学発光像を記録するまでの時間は特に限定されないが、例えば腹腔内投与の場合、クリアランスタイムが約３０分と考えられるので、ルシフェリン投与後３０分以内に記録することが好ましい。より好ましくは、ルシフェリン投与後０分～約２０分以内である。全身化学発光の記録は、市販のｉｎ ｖｉｖｏ発光イメージングシステム（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製ＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍなど）を用いて記録することができる。得られた画像は、市販の画像解析ソフト（例えば、Ｘｅｎｏｇｅｎ社製Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅなど）を用いて分析することができる。
　上記工程（３）において、被験物質を投与した動物と被験物質を投与していない動物の細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを比較する。被験物質を投与していない動物は、通常陰性対照群（例えば、溶媒投与群）が該当する。
　被験物質を投与していない動物の腫瘍の大きさと比較して、被験物質を投与した動物の腫瘍のほうが小さければ、当該被験物質は抗がん活性（例えば、腫瘍増殖抑制、腫瘍退縮、腫瘍消滅など）を有していると判定できる。好ましくは腫瘍の大きさを５０％以下に低下させる被験物質、より好ましくは１０％以下に低下させる被験物質を抗がん物質と判定する。
　被験物質を投与していない動物の標的臓器における転移巣の数と比較して、被験物質を投与した動物の転移巣の数が減少していれば、当該被験物質はがん転移抑制活性を有していると判定できる。また、被験物質を投与していない動物の標的臓器における転移巣の大きさと比較して、被験物質を投与した動物の転移巣の大きさが小さければ、当該被験物質はがん転移抑制活性を有していると判定できる。好ましくは転移巣の数または大きさを２０％以下に減少させる被験物質、より好ましくは５％以下に減少させる被験物質をがん転移抑制物質と判定する。
〔がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を選択するスクリーニング方法〕
　本発明は、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法を提供する。ＲＥＣＫに関する本発明者らの過去の知見から（非特許文献１、２、３等）、ＲＥＣＫは予後マーカーとして有用であり、がん治療の標的分子としても有望であると考えられる。したがって、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質は抗がん剤の有効成分として有用であると考えられる。
　本発明のがん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法は、例えば、培養がん細胞に被験物質を接触させ、当該細胞におけるＲＥＣＫのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を測定し、被験物質依存的なＲＥＣＫのタンパク質量またはｍＲＮＡ量の変化を分析する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。
　被験物質は限定されず、例えば、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等が挙げられる。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよく、被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が用いられる。
　ＲＥＣＫタンパク質量は、公知の方法で細胞からタンパク質を抽出し、公知のタンパク質量測定方法を用いて定量することができる。公知のタンパク質量測定方法としては、例えば、ウエスタンブロット法、ＥＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、タンパク質測定試薬を用いる方法などが挙げられる。ＲＥＣＫｍＲＮＡ量は、公知の方法で細胞からＲＮＡを抽出し、公知のｍＲＮＡ量測定方法を用いて定量することができる。公知のｍＲＮＡ量測定方法としては、ノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ法、定量ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイなどが挙げられる。
　被験物質依存的なＲＥＣＫのタンパク質またはｍＲＮＡ量の変化を分析する方法は特に限定されず、例えば、被験物質を接触させない対照群におけるＲＥＣＫのタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して、被験物質を接触させた場合にＲＥＣＫのタンパク質量またはｍＲＮＡ量が増加していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。被験物質がＲＥＣＫのタンパク質量またはｍＲＮＡ量を増加させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させていない細胞のタンパク質量またはｍＲＮＡ量と比較して１５０％以上にさせる被験物質が好ましく、１７５％以上にさせる被験物質がより好ましい。
　本発明者らは、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を効率よくスクリーニングするために好適な細胞株を樹立した。この細胞は、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えた細胞である。この細胞は、テトラサイクリンの有無により、がん細胞の形態および正常細胞の形態を示すので、がん細胞と正常細胞におけるＲＥＣＫの発現誘導の対比を容易に行うことができる点で、本スクリーニング方法に用いる細胞として好適である。
　このＲｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えた細胞を用いる場合、がん細胞の形態において被験物質を接触させない場合と比較してレポーター遺伝子の発現量が増加していれば、当該被験物質を目的物質として選択すれることができる。同一の被験物質をテトラサイクリンの有無によりがん形態の細胞と正常形態の細胞に接触させた場合において、両細胞のレポーター遺伝子の発現量は同程度でもよいが、がん形態の細胞のレポーター遺伝子の発現量のほうが高いことが好ましい。がん形態の細胞のレポーター遺伝子の発現量が、正常形態の細胞のレポーター遺伝子の発現量より１．５倍以上高いことがより好ましく、２倍以上高いことがさらに好ましい。
　本発明者らが樹立した細胞は、具体的には、ＣＲＥＦ細胞株（ラット線維芽細胞株、参考文献 Fisher PB, Babiss LE, Weinstein IB, Ginsberg HS. Analysis of type 5 adenovirus transformation with a cloned rat embryo cell line (CREF). Proc Natl Acad Sci U S A 1982; 79: 3527-3531.）由来の細胞であり、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域の断片、レポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を有している。この細胞は、実施例１（１）に記載の方法で作製することができる。本発明者らは、実施例１（１）に記載の方法で作製した細胞のなかで、テトラサイクリン系抗生物質であるドキシサイクリン処理後のＳＥＡＰの発現上昇の程度が最も高い１つのクローンを選択し、この細胞株をＹＭ３と命名して当該スクリーニング方法に用いている。したがって、がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を効率よくスクリーニングするために特に好適な細胞株は、ＹＭ３細胞株である。
　本発明者らは、レポーター遺伝子に分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子を用いているが、これに限定されない。一般に用いられているレポーター遺伝子であれば、いずれも好適に用いることができる。レポーター遺伝子は、安定かつ活性の定量が容易なものが好ましい。例えば、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等をコードする遺伝子が挙げられる。
　本発明者らは、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域（Gene ID: 53614、Chromosome 4 - NC_000070.5　43884251 - 43888453）を用いているが、これに限定されない。他の哺乳動物のＲｅｃｋ遺伝子プロモーターも好適に用いることができる。他の哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、ラット、モルモットなどが挙げられ、好ましくはヒトである。各種動物のＲｅｃｋ遺伝子プロモーター領域の塩基配列は公知のデータベース（ＤＤＢＪ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ等）から取得することができる。例えば、ヒトＲＥＣＫ遺伝子プロモーター領域は、Gene ID: 8434、Chromosome 9 - NC_000009.11　36,032,644 - 36,036,971である。
　本発明者らは、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を用いているが、Ｔｅｔ－ｏｎシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を用いてもよい。また、テトラサイクリン以外の薬剤による発現誘導システムを用いてもよい。このような発現誘導システムとしては、ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ－ＭＭＴＶプロモーター系、Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ組換え系を用いた方法などが挙げられる。
　本発明者らは、選択マーカーにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を用いているが、これらに限定されない。哺乳動物細胞に使用可能な公知の選択マーカーは、いずれも好適に用いることができる。具体的には、例えば、ピューロマイシン、ハイグロマイシンＢ、ゼオシンなどが挙げられる。
　本発明には、上記がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を効率よくスクリーニングするために好適な細胞が含まれる。つまり、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えることを特徴とする哺乳動物細胞も、本発明に含まれる。より好ましくは、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えたＣＲＥＦ細胞株由来の細胞であって、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域の断片、レポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を有する哺乳動物細胞である。
　本発明のがん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質を選択するスクリーニング方法は、上記がん自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法に供する被験物質のプレスクリーニングに、好適に用いることができる。
〔本発明のスクリーニング方法により得られた化合物を有効成分とする医薬〕
　上記本発明のスクリーニング方法により選択されるＲＥＣＫの発現を増加させる物質は、Ｒｅｃｋ活性化剤、抗がん剤、がん転移抑制剤の有効成分、有効成分候補、またはリード化合物として有用である。本発明者らは、８８０種のケミカルライブラリーを上記本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングし、濃度依存的にＲｅｃｋ遺伝子プロモーターを活性化させる３４種の化合物を選択した。具体的には、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｅ（ｓ,＋）、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃｅｐｈａｅｌｉｎｅ、ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ、ｅｍｅｔｉｎｅ、ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ、ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ、ｈａｌｏｐｒｏｇｉｎ、ｌｙｃｏｒｉｎｅ、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｍｅｎａｄｉｏｎｅ、ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ、ｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ、ｔｒｉｍｅｐｒａｚｉｎｅ、ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ、ｔｒｉａｍｔｅｒｅｎｅ、ｔｒｉｆｌｕｐｒｏｍａｚｉｎｅ、ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ、ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ、ｈｙｃａｎｔｈｏｎｅ、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅおよびｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ、またはこれらの薬学的に許容される塩である（実施例２の表１，２参照）。これらの化合物は、Ｒｅｃｋ活性化剤、抗がん剤またはがん転移抑制剤の有効成分として有用であると考えられる。したがって、本発明は、上記３４種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするＲｅｃｋ活性化剤、抗がん剤またはがん転移抑制剤を提供する。
　上記３４種の化合物のうち、少なくともｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅの５種については、上記本発明のがん自然転移モデル動物を用いるスクリーニング方法により抗がん活性（例えば、腫瘍増殖抑制、腫瘍退縮、腫瘍消滅など）およびがん転移抑制活性を有することが確認されている。したがって、本発明は、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤を提供し、また、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするがん転移抑制剤を提供する。
　「薬学的に許容される塩」とは、例えば、アルカリ金属（例えば、カリウム、ナトリウム、リチウム等）の塩、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）の塩、アンモニウム塩（例えば、テトラメチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等）、有機アミン（例えば、トリエチルアミン、メチルアミン、ジメチルアミン、シクロペンチルアミン、ベンジルアミン、フェネチルアミン、ピペリジン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、リジン、アルギニン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン等）の塩、酸付加物塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩等の無機酸塩；例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、トルエンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、グルクロン酸塩、グルコン酸塩等の有機酸塩）などが挙げられる。
　上記３４種の化合物はいずれも公知の化合物であり、それぞれ公知の方法で製造することができ、市販品を購入することができる。また、上記３４種の化合物のうち光学異性体、立体異性体、位置異性体、回転異性体等の異性体を有する化合物は、いずれか一方の異性体でもよく混合物でもよい。また、上記３４種の化合物は水和物または溶媒和物であってもよく、同位元素等で標識されていてもよい。
　本発明のスクリーニング方法により得られた上記化合物を有効成分とする医薬は、上記３４種もしくは上記５種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とし、薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
　錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート８０ＴＭ、ＨＣＯ－５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。
　このようにして得られる製剤は、例えばヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。投与量、投与回数、投与間隔等は、投与対象動物の状態、対象癌種、症状、投与方法などに応じて適宜設定すればよい。
　なお、本発明には、以下の発明が含まれる。
（ａ）哺乳動物に対して、上記３４種もしくは上記５種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩またはこれらの薬学的に許容される塩のいずれかの有効量を投与することを特徴とするがん治療方法。
（ｂ）抗がん剤を製造するための、上記３４種もしくは上記５種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩の使用。
（ｃ）癌の治療に使用するための、上記３４種もしくは上記５種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩。
（ｄ）哺乳動物に対して、上記５種の化合物またはこれらの薬学的に許容される塩のいずれかの有効量を投与することを特徴とするがん転移抑制方法。
（ｅ）がん転移抑制剤を製造するための、上記５種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩の使用。
（ｆ）がん転移抑制に使用するための、上記５種の化合物からなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：細胞株の樹立〕
（１）Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターレポーターシステムを備えた細胞の樹立
　マウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域（Gene ID: 53614、Chromosome 4 - NC_000070.5　43884251 - 43888453）をｐＳＥＡＰ２－Ｂａｓｉｃベクター（Clontech）に挿入し、ｐＳＥＡＰ２－ＲＰ４．１プラスミドを構築した。一方、本発明者らは、以前に、ラット線維芽細胞株ＣＲＥＦ（Fisher PB, Babiss LE, Weinstein IB, Ginsberg HS. Analysis of type 5 adenovirus transformation with a cloned rat embryo cell line (CREF). Proc Natl Acad Sci U S A 1982; 79: 3527-3531.）にテトラサイクリン感受性トランスアクチベーター（Ｔｅｔ－ｏｆｆ）システムによってＨＲＡＳ１２Ｖ遺伝子の発現を制御できるようにするためのプラスミド２種（trans-repressor 発現ベクターと標的ベクター）を安定導入し、通常培養液中ではＨＲＡＳ１２Ｖが発現して悪性形質を示し、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ；２μｇ／ｍｌ）存在下ではＨＲＡＳ１２Ｖ発現が抑制されて正常細胞の形態を示す細胞株ＴＦ３２３－Ｃ３（Ｇ４１８耐性）を樹立した（Sasahara RM, Takahashi C, Noda M. Involvement of the Sp1 site in ras-mediated downregulation of the RECK metastasis suppressor gene. Biochem Biophys Res Commun 1999; 264: 668-675.）。このＴＦ３２３－Ｃ３細胞に、ｐＳＥＡＰ－ＲＰ４．１とｐＵＣＳＶ－ＢＳＤとを４：１（ｗ/ｗ）の比で共導入した後、ブラスチシジンＳを８μｇ／ｍｌ含有する増殖培地で選択した（Ｇ４１８／ブラスチシジンＳの２重耐性）。Ｄｏｘ処理後のＳＥＡＰの発現上昇の程度が最も高い１つのクローンを選択し（ＹＭ３と命名）目的の細胞株を樹立した（図１、２参照）。ＹＭ３細胞のＳＥＡＰは、ｖ－Ｋ－ｒａｓ－形質転換細胞において平坦な形態の復帰体を誘導するＭＥＫ阻害剤であるＨｙｐｏｔｈｅｍｙｃｉｎ（１μｇ／ｍｌ）による処理の後も上昇していた。なお、ＴＦ３２３－Ｃ３細胞は、本発明者の野田亮から分与可能である。
（２）自然転移系細胞株の樹立
　ヒト線維肉腫由来細胞株ＨＴ１０８０（ＡＴＣＣ ＃ＣＣＬ－１２１）にｎｅｏマーカーを含むプラスミドを安定導入した株をヌードマウス皮下に移植し、約１か月後に腋下リンパ節に生じた腫瘤をＧ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）を含む培養液中で分散培養し、生じたコロニーを分離してＲＺｍｅｔ３株を得た。ＲＺｍｅｔ３細胞は、皮下移植すると２週間程度で腋下リンパ節への転移が見られる。次に、ＲＺｍｅｔ３細胞に２種のプラスミドｐＧＬ４（Photinus pyralis 由来のルシフェラーゼ遺伝子を含む、Promega社製）およびｐｃＤＮＡ３．１（－）－Ｈｙｇｒｏ（hygromycin B phosphotransferase 遺伝子（耐性遺伝子）を含む、Invitrogen社製）を安定導入し、Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）とハイグロマイシンＢ（４００Ｕ／ｍｌ）を含む培養液中でクローニングを繰り返し、高いルシフェラーゼ活性を示すクローンを分離した。この中から、ゼラチナーゼ活性の高いクローン数種を選び、それぞれをヌードマウス皮下に移植したところ、２週間で肺転移を示す１株が見つかったため、これをＲＭ７２と命名した。
〔実施例２：ＳＥＡＰアッセイ〕
（１）実験方法
　９６ウェルプレートにＹＭ３細胞を１×１０４個／１００μｌ／ウェルで播種し、５時間インキュベートして細胞を定着させた後、化合物溶液（５００μＭ、１μｌ）を培地に添加した。被験化合物として、８８０種の構造的に異なった既知の生物活性化合物からなるケミカルライブラリーＰｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ（Prestwick Chemical, Illkirch, France）をナノピュアーｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ（ＤＭＳＯ、和光純薬）で溶解したものを使用した。これらの異なる化合物の生物学的メカニズムまたは薬理学的効果は実験的に検証されており、８５％以上の化合物は、広範囲の治療分野における医薬やサプリメントとして米国または欧州で市販されている。陰性対照として溶媒（ＤＭＳＯ、１μｌ）のみ、陽性対照としてＨｙｐｏｔｈｅｍｙｃｉｎ（ＨＰＭ、１ｍｇ／ｍｌ）をプレート毎に２ウェルずつ添加した。すべてのサンプルについて２プレートを用いた（２連サンプル）。
　４８時間培養後、培養上清の一部（１０μｌ）をサンプリングし、６５℃で３０分間インキュベート（熱処理）した後、Ｇｒｅａｔ ＥｓｃＡＰｅＴＭ ＳＥＡＰ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いるＳＥＡＰアッセイに供した。残りの培地と細胞は、ＳＦ試薬を用いた細胞計数アッセイに供した。すなわち、ＳＦ試薬（ナカライ）を培地に添加し（１０μｌ／ウェル）、ＣＯ２インキュベーター内で３時間培養後、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）を測定することによって相対的な細胞数を求めた。ＳＥＡＰ活性のデータは、「ＳＥＡＰ測定値／Ａ４５０」を「細胞当たりＳＥＡＰ活性」とし、各化合物の「細胞当たりＳＥＡＰ活性」をネガティブコントロールの「細胞当たりＳＥＡＰ活性」で割った値を「相対的ＳＥＡＰ活性」と定義し、２連サンプル間の「相対的ＳＥＡＰ活性」の平均値および誤差を求めた。細胞数のデータは、各化合物のＳＦ測定値をネガティブコントロールのＳＦ測定値で割った値を「相対的細胞数」と定義し、２連サンプル間の平均値と誤差を求めた。誤差が大きなものについては、再実験を行った。実験は、通常培養液およびＤｏｘ（２μｇ／ｍｌ）を含む培養液のそれぞれにおいて２連サンプルを用意し、合計４つの値（Ｒａｓ－ＯＮの時の相対的細胞数と相対的ＳＥＡＰ活性、Ｒａｓ－ＯＦＦの時の相対的細胞数と相対的ＳＥＡＰ活性）の平均値を得た（図３参照）。
（２）結果
　８８０種の既知生理活性低分子化合物からなるケミカルライブラリーにおいて、陽性対照のＨＰＭよりも高い活性を示す化合物１５１種類が検出された。陽性対照のＨＰＭはＭＥＫを阻害することによって、通常約２倍ＳＥＡＰ活性を上昇させる薬剤である。図４に示すように、ほとんどのケースで、ＳＥＡＰ上昇の程度は、非形質転換細胞より形質転換細胞のほうが高かったが、３０番目のクロルヘキシジンのように例外もあった。
　次に、これら１５１種類の化合物について濃度依存的な活性を調べる２次スクリーニングを行ったところ、表１に記載の３４種の化合物が陽性サンプルとして選ばれた。このうち４種類はテトラサイクリン類縁物質（表１のＣｌａｓｓ欄の¶印）であり、活性の強さ（２．５～２．６倍）もＤｏｘ（１．９６倍）と大差がなく、Ｄｏｘ存在下では活性を示さないことからＹＭ３細胞に組み込まれたＴｅｔ－ｏｆｆ－ＨＲＡＳ１２Ｖ遺伝子の発現を抑制することによってＲｅｃｋプロモーターを活性化している可能性が高いと考えられた。他の３０化合物を用途別に分類すると、７種類と「その他」に分けることができ（表２参照）、抗がん剤に分類される化合物が１０種と最多であることが分かった（比率１０／３４＝２９％）。元のライブラリーには抗がん剤が１８種類含まれている（比率１８／８８０＝２％）ことから、本スクリーニングによって約１５倍の濃縮がかかったことになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔実施例３：濃度依存的活性の確認〕
　Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーター誘導活性が強く適用分野の異なる化合物として、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ（以下「ＤＳＦ」；抗アルコール剤）、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ（以下「ＤＸＲ」；抗がん剤）、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ（以下「Ｇｒａ」；抗菌剤）、およびｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ（以下「Ｐｙｔ」；抗カビ薬）の４種を選択した。これらについて、再度ＹＭ３細胞に対する濃度依存的活性を確認した。
　結果を図５に示した。グラフの下の表に、各化合物の濃度を示した。陰性対照（Ｖ、１％ＤＭＳＯ）および陽性対照（ＨＰＭ、１μｇ／ｍｌ）のデータも示した。活性値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。
〔実施例４：ＨＴ１０８０細胞のＲｅｃｋ－ルシフェラーゼプロモーター活性の確認〕
　ｐＧＬ３－４１１０を安定導入したＨＴ１０８０細胞に対して、ＤＳＦ、Ｐｙｔ、ＤＸＲまたはａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｅ ｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ（以下、「ｐＤＴＣ」）を図６に記載の用量で４８時間曝露した。具体的には、ｐＧＬ３－４１１０を安定導入したＨＴ１０８０細胞を９６ウェルプレートに播種し（５×１０４個／１００μｌ／ウェル）、２４時間培養した後、１μｌの化合物溶液または溶媒（ＤＭＳＯ）をウェルごとに添加した。４８時間培養後、細胞を溶解し、Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞溶解液におけるホタルルシフェラーゼ活性を測定し、細胞ごとに標準化した。
　結果を図６に示した。無処理対称（ＮＴ）、陰性対照（Ｖ、１％ＤＭＳＯ）および陽性対照（ＨＰＭ、１μｇ／ｍｌ）のデータも示した。活性値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示した。溶媒（Ｖ）に対してＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ－ｔｅｓｔを行った。＊はＰ＜０．０５、＊＊はＰ＜０．０１を表す。
〔実施例５：内在性ＲＥＣＫ発現誘導活性の確認（その１）〕
　５種のヒト悪性腫瘍由来細胞株（ＨＴ１０８０，ＲＺｍｅｔ３、Ａ５４９（ヒト肺腺癌細胞）またはＳＷ４８０（ヒト結腸腺癌細胞）、ＲＭ７２に、ＤＳＦ、ＤＸＲ、ＧｒａおよびＰｙｔをそれぞれのＩＣ５０で作用させ（ＲＺｍｅｔ３およびＲＭ７２にはｐＤＴＣも用いた）、４８時間あるいは７２時間後に細胞を溶解し、免疫ブロット法にて内在性ＲＥＣＫタンパク質の発現量を検討した。具体的には、予め細胞（６０ｍｍディッシュあたりの細胞密度：ＨＴ１０８０およびＡ５４９は５×１０４個、ＲＺｍｅｔ３は１×１０５個、ＳＷ４８０は１．５×１０５個）播種しておき、コロニーフォーメーションアッセイで決定したＩＣ５０で各化合物を作用させた。また、陽性対処としてＨＰＭ（１μｇ／ｍｌ）、陰性対照として１％ＤＭＳＯ（溶媒）を用いた。作用時間は、ＨＴ１０８０、ＲＺｍｅｔ３およびＲＭ７２は４８時間、Ａ５４９およびＳＷ４８０は７２時間とした。培養終了後細胞溶解液を調製し、抗ＲＥＣＫ抗体（５Ｂ１１Ｄ１２）を用いた免疫ブロットアッセイに供し、分析した。続いて、ストリッピングし、抗ＧＡＰＤＨ抗体（６Ｃ５、Ａｍｂｉｏｎ）でリプロービングした。可視化するために、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、二次抗体としてＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を用いた。画像はＬＡＳ－３０００およびＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ）を用いて記録し、分析した。相対的なバンドの濃さは、ＧＡＰＤＨに基づいて標準化した後、溶媒処理した細胞の標準化後の値で割り算して求めた。
　結果を図７（Ａ）～（Ｅ）に示した。（Ａ）はＨＴ１０８０細胞の結果、（Ｂ）はＲＺｍｅｔ３細胞の結果、（Ｃ）はＡ５４９細胞の結果、（Ｄ）はＳＷ４８０細胞の結果、（Ｅ）はＲＭ７２細胞の結果である。図７（Ａ）～（Ｅ）から明らかなように、いずれの化合物もヒト悪性腫瘍由来細胞株の内在性ＲＥＣＫの発現を増強した。
〔実施例６：内在性ＲＥＣＫ発現誘導活性の確認（その２）〕
　２次スクリーニングで選択された３４種の化合物の中から、ｌｙｃｏｒｉｎｅ（以下「Ｌｙｃ」、催嘔吐性アルカロイド）およびｈａｒｍｉｎｅ（以下「Ｈｒ」、モノアミンオキシダーゼＡ）をについて、ＲＭ７２細胞に対する内在性ＲＥＣＫ発現誘導活性を確認した。具体的には、培養下のＲＭ７２細胞にＩＣ３０に相当するＬｙｃ（１．３μＭ）またはＨｒ（１１μＭ）を４８時間作用させ、ＲＥＣＫ ｍＲＮＡ（ＲＴ－ＰＣＲ法）およびＲＥＣＫタンパク質（免疫ブロット法）を調べた。相対的なバンドの濃さは、ｍＲＮＡについてはＨＰＲＴ１、タンパク質についてはＧＡＰＤＨに基づいて標準化した後、溶媒処理した細胞の標準化後の値で割り算して求めた。
　結果を図８（Ａ）、（Ｂ）に示した。（Ａ）はＲＥＣＫ ｍＲＮＡの結果、（Ｂ）はＲＥＣＫタンパク質の結果である。図８（Ａ）、（Ｂ）から明らかなように、ｍＲＮＡレベルではＬｙｃ、Ｈｒ共にＲＥＣＫの発現を上昇させたが、タンパク質レベルではＨｒのみが発現を亢進し、Ｌｙｃは発現を低下させた。
〔実施例７：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞に対するＤＳＦの効果の確認〕
　ＤＳＦの存在下または非存在下におけるＲＺｍｅｔ３細胞の形態と挙動を、ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅビデオ顕微鏡を用いて調べた。具知的には、ＲＺｍｅｔ３細胞（２×１０４個）を３５ｍｍのガラスディッシュ（ＩＷＡＫＩ）に播種し、２４時間培養し、１％ＤＭＳＯ（溶媒）または１０μＭのＤＳＦを含む増殖培地に交換した。さらに２４時間培養後、培地を１０％ウシ胎児血清と、１％ＤＭＳＯまたは１０μＭのＤＳＦとを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ－１５（ＧＩＢＣＯ）に交換した。文献（Morioka Y, Monypenny J, Matsuzaki T, Shi S, Alexander DB, Kitayama H, Noda M. The membrane-anchored metalloproteinase regulator RECK stabilizes focal adhesions and anterior-posterior polarity in fibroblasts. Oncogene 2009; 28: 1454-1464.）の記載に準じて、細胞の運動性をｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ顕微鏡を用いて３時間（３分間隔）記録した。移動スピードはＤｕｎｎの式（Dunn GA. Characterising a kinesis response: time averaged measures of cell speed and directional persistence. Agents Actions Suppl 1983; 12: 14-33.）を用いて、時間の一連の座標（参照位置；核の中心）から計算した。統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ－ｔｅｓｔにより評価した。
　結果を図９（Ａ）～（Ｃ）に示した。（Ａ）はＤＳＦの存在下または非存在下で２４時間培養後のＲＺｍｅｔ３細胞の微分干渉コントラスト画像、（Ｂ）は細胞の広がりをコントロールに対する比率で表した結果（平均値±ＳＥＭＩ、ｎ＝１００）、（Ｃ）はランダムな遊走の相対速度の結果（平均値±ＳＥＭＩ、ｎ＝１０）である。図９（Ａ）～（Ｃ）から明らかなように、ＤＳＦはＲＺｍｅｔ３細胞の平坦化と拡散化を誘導し、ランダムな遊走速度を抑制した。この結果は、ＲＥＣＫ発現ベクターを形質転換細胞に導入した結果と一致するものであった。
〔実施例８：ゼラチンザイモグラフィー〕
　ＤＳＦ、ＤＸＲ、Ｇｒａ、Ｐｙｔ、ｐＤＴＣ、ＨＰＭ、ＤＭＳＯ（溶媒）で処理したＲＭ７２細胞の培養上清を用いたゼラチンザイモグラフィーを行った。具体的には、ＲＭ７２細胞を９６ウェルプレートに播種（２×１０４個／ウェル）して２４時間培養し、上記化合物を含む培地（ＤＳＦ：１６μＭ、ＤＸＲ：２１０ｎＭ、Ｇｒａ：３２ｎＭ、Ｐｙｔ：５μＭ、ＨＰＭ：１μｇ／ｍｌ、ｐＤＴＣ：２０μＭ）に交換して４８時間培養した。その後、０．１％ＦＢＳを含む１００μｌＤＭＥＭに培地交換し、さらに１２時間培養した。培養上清を集め、遠心分離で固形物を除き、文献（Takahashi C, Sheng Z, Horan TP, Kitayama H, Maki M, Hitomi K, Kitaura Y, Takai S, Sasahara RM, Horimoto A, Ikawa Y, Ratzkin BJ, Arakawa T, Noda M. Regulation of matrix metalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK. Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95: 13221-13226.）に記載の方法に準じてゼラチンザイモグラフィーで分析した。バンドの濃さはＳＦアッセイで測定した細胞数で標準化した。
　結果を図１０に示した。ＤＳＦ、ＤＸＲ、ＧｒａおよびＰｙｔの４化合物は、培養上清中のプロＭＭＰ－９のレベルを低下させた。さらに、ＤＳＦは、プロＭＭＰ－２および成熟途中／成熟ＭＭＰ－２のレベルも低下させた。
〔実施例９：ＤＳＦの抗腫瘍活性および転移抑制活性の確認〕
（１）実験方法
　０．１ｍｌのＰＢＳに懸濁したＲＭ７２細胞（３×１０６個）を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（６週齢、雄、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）の右後部脇腹の皮下に注射した。注射５日後に小腫瘍（直径約３ｍｍ）が生じたマウスを無作為に２群に分け（ｎ＝５／群）オリーブオイルに溶解したＤＳＦ（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）またはオリーブオイルのみ（溶媒）を２４ゲージの針を用いて腹腔内注射した。１４日間の治療後、マウスに麻酔をかけ、下記の方法でバイオルミネッセンスを記録した。全身のバイオルミネッセンスを記録後、肺を切除してＰＢＳ（－）で洗浄し、バイオルミネッセンス記録に供した。腫瘍サイズ（長さ×幅×高さ）の測定は、週に１回行った。統計的有意性は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ Ｔ－ｔｅｓｔにより評価した。
（２）バイオルミネッセンスの記録方法
　ＰＢＳ（－）に溶解したｄ－ルシフェリンを７５ｍｇ／ｋｇの用量で、麻酔下のマウスに腹腔内注射した。バイオルミネッセンス画像は、注射５分後にＩＶＩＳ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）で取得した（Wang S, El-Deiry WS. Requirement of p53 targets in chemosensitization of colonic carcinoma to death ligand therapy. Proc Natl Acad Sci U S A 2003; 100: 15095-15100. 、Minn AJ, Kang Y, Serganova I, Gupta GP, Giri DD, Doubrovin M, Ponomarev V, Gerald WL, Blasberg R, Massague J. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest 2005; 115: 44-55.）。全身または単離した臓器から放出される光子を６０秒間集め、積分した。画像はＬｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて分析した。
（３）結果
　全身および肺のバイオルミネッセンス像を図１１に示した。各個体の肺転移と腫瘍サイズの分布を図１２に示した。溶媒群とＤＳＦ群の腫瘍サイズの比較を図１３に示した。溶媒群とＤＳＦ群の肺転移の比較を図１４に示した。肺転移の程度を腫瘍サイズで標準化して対比した結果を図１５に示した。なお、ＤＳＦ群の全例に顕著な副作用は認められなかった。これらの結果から、ＤＳＦは弱い抗腫瘍活性と、強い転移抑制活性を有することが明らかとなった。
〔実施例１０：Ｐｙｔ、Ｈｒ、Ｇｒａ、Ｌｙｃの抗腫瘍活性および転移抑制活性の確認〕
　実施例９と同様のプロトコールでＰｙｔ、Ｈｒ、Ｇｒａ、Ｌｙｃについて抗腫瘍活性および転移抑制活性を確認した。実験は２回に分けて行い、実験１はＰｙｔ群、Ｈｒ群および溶媒群の３群を設け、実験２ではＧｒａ群、Ｌｙｃ群および溶媒群の３群を設けた。被験化合物の投与量は、文献に基づいて適当と考えられた２つの量を設定した（表３、４参照）。
　溶媒群、Ｇｒａ群およびＬｙｃ群における代表的な個体の全身および肺のバイオルミネッセンス像を図１６に示した。Ｐｙｔ群およびＨｒ群の溶媒群に対する相対腫瘍サイズおよび相対肺転移を図１７（Ａ）に、Ｐｙｔ群、Ｈｒ群および溶媒群の各個体の肺転移と腫瘍サイズの分布を図１７（Ｂ）に、Ｇｒａ群およびＬｙｃ群の溶媒群に対する相対腫瘍サイズおよび相対肺転移を図１７（Ｃ）に、Ｇｒａ群、Ｌｙｃ群および溶媒群の各個体の肺転移と腫瘍サイズの分布を図１７（Ｄ）に、それぞれ示した。実験１（Ｐｙｔ群、Ｈｒ群、溶媒群）の結果を表３にまとめ、実験２（Ｇｒａ群、Ｌｙｃ群、溶媒群）の結果を表４にまとめた。
　これらの結果から、以下の知見が得られた。なお、いずれの群においても顕著な副作用は認められなかった。
(i) Ｐｙｔは低い投与量において強い抗腫瘍活性と強い転移抑制活性を有し、高い投与量においては弱い抗腫瘍活性と強い転移抑制活性を有すること。
(ii) Ｈｒはいずれの投与量においても強い抗腫瘍活性と強い転移抑制活性を有すること。
(iii) Ｇｒａはいずれの投与量においても弱い抗腫瘍活性と強い転移抑制活性を有すること。
(iv) Ｌｙｃはいずれの投与量においても強い抗腫瘍活性を有し、高い投与量においては強い転移抑制活性を有し、低い投与量においては弱い転移抑制活性を有すること。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上の研究成果から、ＲＭ７２細胞を用いた自然肺転移モデルは、短期間、少数の動物で確実に結果を出すことがでることが確認された。さらに、この自然肺転移モデルは、解剖することなく転移が判定できる点でも大変優れている。連日投与を必要とする治療実験では短期間で結果が出ることは決定的に重要であり、前臨床試験に新たな突破口を開く有用な実験系と考えられる。
　また、Ｒｅｃｋプロモーターを用いる化合物スクリーニング方法は、正常復帰誘導という生物活性を指標とするアプローチと、がん抑制分子であるＲＥＣＫの活性化因子を探すという分子標的的なアプローチとの両方を兼ね備えている。Ｒｅｃｋプロモーターを用いる化合物スクリーニング方法により、従来型の抗がん剤がきわめて効率良く検出できると共に、ＤＳＦに代表される毒性が弱く、転移抑制活性を持つような新たなタイプの化合物も同時に検出できることが明らかとなった。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
微生物の表示
　識別の表示：ＲＭ７２
　受託番号：ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１０
受託日
　２０１１年６月２２日
国際受託当局
　名称：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
　住所：〒２９２－０８１８　日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８

Claims (18)

  1. 　ＲＭ７２細胞（受託番号ＮＩＴＥ　ＢＰ－１１１０）。
  2. 　請求項１に記載の細胞由来の腫瘍を有することを特徴とするがん自然転移モデル動物。
  3. 　げっ歯類である請求項２に記載のがん自然転移モデル動物。
  4. 　マウスである請求項３に記載のがん自然転移モデル動物。
  5. 　請求項１に記載の細胞を実験動物に接種することを特徴とするがん自然転移モデル動物の作製方法。
  6. 　請求項１に記載の細胞を実験動物の皮下に接種し、腫瘍を形成させることを特徴とする請求項５に記載のがん自然転移モデル動物の作製方法。
  7. 　抗がん活性および／またはがん転移抑制活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、
    　請求項２～４のいずれかに記載のがん自然転移モデル動物に、被験物質を投与する工程と、
    　被験物質の投与開始後に、細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを評価する工程と、
    　被験物質を投与した動物と被験物質を投与していない動物の細胞接種部位の腫瘍の大きさ、ならびに標的臓器における転移巣の数および／または大きさを比較する工程と
    を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
  8. 　抗がん活性および／またはがん転移抑制活性を有する物質をスクリーニングする方法であって、
    　請求項２～４のいずれかに記載のがん自然転移モデル動物に、被験物質を投与する工程と、
    　被験物質の投与開始後に、動物にルシフェリンを投与する工程と、
    　ルシフェリン投与後に、動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像を記録する工程と、
    　被験物質を投与した動物と被験物質を投与していない動物の細胞接種部位および／または標的臓器の化学発光像を比較する工程と
    を含むことを特徴とするスクリーニング方法。
  9. 　がん細胞のＲＥＣＫ（reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs）の発現を増加させる物質を選択することを特徴とする抗がん物質のスクリーニング方法。
  10. 　がん細胞のＲＥＣＫの発現を増加させる物質が、がん細胞のＲｅｃｋ遺伝子プロモーター活性を高める物質であることを特徴とする請求項９に記載のスクリーニング方法。
  11. 　Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えた細胞を用いることを特徴とする請求項１０に記載のスクリーニング方法。
  12. 　Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えた細胞が、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を有するＣＲＥＦ細胞株由来の細胞であり、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域の断片を有し、レポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子を有し、さらにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を有する細胞であることを特徴とする請求項１１に記載のスクリーニング方法。
  13. 　Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えることを特徴とする哺乳動物細胞。
  14. 　Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとレポーター遺伝子を含むレポーターシステムおよびテトラサイクリン発現誘導システムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子を備えたＣＲＥＦ細胞株由来の細胞であって、Ｔｅｔ－ｏｆｆシステムで制御されるＨＲＡＳ１２Ｖがん遺伝子、Ｒｅｃｋ遺伝子プロモーターとしてマウスＲｅｃｋ遺伝子の上流４．１ｋｂ領域の断片、レポーター遺伝子として分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子、ならびにネオマイシン耐性遺伝子およびブラスチシジンＳ耐性遺伝子を有する請求項１３に記載の哺乳動物細胞。
  15. 　請求項９～１２のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られた、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ、ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｅ（ｓ,＋）、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ、ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ、ｃｅｐｈａｅｌｉｎｅ、ｍｅｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎｅ、ｅｍｅｔｉｎｅ、ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ、ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ、ｈａｌｏｐｒｏｇｉｎ、ｌｙｃｏｒｉｎｅ、ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ、ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ、ｍｅｎａｄｉｏｎｅ、ａｌｂｅｎｄａｚｏｌｅ、ｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｄｅｍｅｃｌｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ、ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｍｅｔｈａｍｉｎｅ、ｔｒｉｍｅｐｒａｚｉｎｅ、ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ、ｐｅｒｈｅｘｉｌｉｎｅ、ｔｒｉａｍｔｅｒｅｎｅ、ｔｒｉｆｌｕｐｒｏｍａｚｉｎｅ、ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ、ｐｉｐｅｒｌｏｎｇｕｍｉｎｅ、ｈｙｃａｎｔｈｏｎｅ、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅおよびｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
  16. 　請求項９～１２のいずれかに記載のスクリーニング方法により得られるＲＥＣＫの発現を増加させる物質を被験物質として用いることを特徴とする請求項７または８に記載のスクリーニング方法。
  17. 　請求項７、８または１６に記載のスクリーニング方法により得られた、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とする抗がん剤。
  18. 　請求項７、８または１６に記載のスクリーニング方法により得られた、ｄｉｓｕｌｆｉｒａｍ、ｈａｒｍｉｎｅ、ｐｙｒｉｔｈｉｏｎｅ、ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎおよびｌｙｃｏｒｉｎｅからなる群より選ばれる１種、またはその薬学的に許容される塩を有効成分とするがん転移抑制剤。
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