CN109328232A

CN109328232A - 用于产生表达生物合成通路的合成染色体的方法及其用途

Info

Publication number: CN109328232A
Application number: CN201780036557.2A
Authority: CN
Inventors: 爱德华·珀金斯; 艾米·格林
Original assignee: Simplod Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Simplod Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-04-12
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2019-02-12
Also published as: JP2022070950A; WO2017180665A3; US11692196B2; WO2017180665A2; CA3024161A1; JP2019511235A; EP3442598A4; EP3442598A2; JP7497139B2; AU2017249321B2; AU2017249321A1; RU2018139464A; AU2024206914A1; US20210403930A1

Abstract

本发明涵盖允许人们经由合成染色体将来自生物合成通路的多于一个基因递送到受体细胞中并在受体细胞中表达的组合物和方法。

Description

用于产生表达生物合成通路的合成染色体的方法及其用途

相关申请的交叉引用

本国际PCT申请要求于2016年4月12日提交的美国临时专利申请第62/321,716号的优先权。

关于政府支持的声明

本发明根据由DARPA授予的合同D15PC00008在美国政府支持下进行。美国政府在本发明中具有一定权利。

发明领域

本发明的领域涵盖允许人们工程化合成染色体以将来自生物合成通路的多于一个(multiple)基因递送至受体细胞的方法。

发明背景

在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些文章和方法。本文所包含的任何内容不得被解释为现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当的情况下证明本文引用的文章和方法根据可应用的法定条文无法构成现有技术的权利。

目前用于工程化细胞以掺入并表达例如赋予细胞产生细胞代谢物诸如氨基酸、核酸、糖蛋白等的能力的多于一个基因的方法依赖于基于病毒或基于质粒的核酸递送技术。然而，细胞产生这样的代谢物的能力通常需要构成用于代谢物合成的生物化学通路的多于一个基因产物的表达和功能编排。例如，许多哺乳动物细胞缺乏制造必需氨基酸所需的必需酶。为了允许细胞制造这些氨基酸，必须对细胞进行工程化，以表达在真菌或细菌中发现的异源基因；然而，由于病毒和质粒核酸载体递送系统的有限的有效负载(payload)能力，为了在受体细胞中生成完整的生物化学或生物合成通路，需要转染或转导事件的多于一次迭代。

生成全功能哺乳动物合成染色体的能力代表了用于基于细胞的遗传紊乱矫正和生物通路的产生的强大系统。全功能哺乳动物合成染色体提供了超过基于细菌的和基于病毒的递送系统的几个优势，包括增加的有效负载尺寸、染色体外维持的事实避免了潜在的宿主细胞破坏、引入的基因的转录沉默和可能的免疫学并发症的避免以及哺乳动物合成染色体可以源自合成染色体待被插入到其中的物种并针对该物种进行定制。在本领域中对于允许人们将来自生物合成通路的多于一个基因递送到细胞中并在细胞表达的组合物和方法存在需求。本发明提供了解决该需求的方法和组合物。

发明概述

提供该概述是为了以简化的形式介绍概念的选择，所述概念在下文的详述中进一步描述。该概述既不意图确定所要求保护的主题的关键或基本特征，也不意图用于限制所要求保护的主题的范围。所要求保护的主题的其他特征、细节、效用和优势从以下撰写的详述包括附图中阐释的和所附的权利要求中限定的那些方面将是明显的。

本发明涵盖用于经由合成染色体将来自一条或更多条生物合成通路的多于一个基因递送到受体细胞中并在受体细胞中表达的组合物和方法。通路可以包括1)已知产生特定最终产物的那些通路；2)通过以新的组合掺入现有基因和/或在新的细胞类型中表达现有基因以产生对在其中产生最终产物的细胞类型可以是新的特定最终产物而产生的新的通路；或者3)通过将新的基因单独地或与现有基因组合掺入以产生新的最终产物而产生的新的通路。

因此，在一个实施方案中，本发明的方法提供了一种用于在受体细胞中构建生物合成通路的方法，所述方法包括：用合成染色体产生组分转染受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；用包含能够实现生物合成通路的多于一个基因的递送载体转染受体细胞系，其中所述递送载体包含至少一个位点特异性重组位点；激活合成的平台染色体与递送载体之间的位点特异性重组，其中能够实现生物合成通路的多于一个基因被装载到合成的平台染色体上以产生表达生物合成通路的合成染色体；以及分离包含表达生物合成通路的合成染色体的受体细胞。

在该实施方案的一些方面，能够实现生物合成通路的多于一个基因包括色氨酸生物合成所必需的基因，并且在一些方面，色氨酸生物合成所必需的基因包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的色氨酸合成所必需的五个基因。

在该实施方案的一些方面，除了递送能够实现生物合成通路的多于一个基因之外，递送载体还包含一个或更多个以下基因：a)干扰或阻断肿瘤细胞抑制免疫细胞周期进展的能力的一个或更多个基因，b)编码增强免疫细胞活化和生长的因子的一个或更多个基因，或c)增加免疫细胞对发展中肿瘤的特异性的一个或更多个基因。

又在该实施方案的其他方面，该方法还包括以下步骤：分离表达生物合成通路的合成染色体；并将合成染色体转移至第二受体细胞。在一些方面，第二受体细胞选自通用供体T细胞或患者自体T细胞。本发明的其他方面提供了合成染色体，所述合成染色体表达生物合成通路，并且又其他方面提供了第二受体细胞。

在本发明的一些方面，允许位点特异性整合的核酸序列包括attP、attB、attL和attR或突变形式的attP、attB、attL和attR。

本发明的其他实施方案还包括以下步骤：用包含能够实现第二生物合成通路的多于一个基因的第二递送载体转染受体细胞系，其中所述第二递送载体包含至少一个位点特异性重组位点；激活合成的平台染色体与第二递送载体之间的位点特异性重组，其中能够实现第二生物合成通路的多于一个基因被装载到合成的平台染色体上以产生表达第二生物合成通路的合成染色体；以及分离包含表达第二生物合成通路的合成染色体的受体细胞。在该实施方案的一些方面，还包括以下步骤：分离表达第二生物合成通路的合成染色体；并将表达第二生物合成通路的合成染色体转移至第二受体细胞。

本发明的这些及其他方面和用途将在详述中描述。

附图简述

图1是本发明的方法的一个实施方案的简化示意图，其中细胞生理学通过由合成染色体产生生物合成通路代谢物来加强。

发明详述

除非另外指示，本文描述的方法可以采用分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和细胞工程化技术的常规技术和描述，这些都在本领域的技术人员的技术内。这样的常规技术包括寡核苷酸合成、寡核苷酸杂交和连接、细胞转化和转导、重组系统的工程化、转基因动物和植物的产生以及人类基因疗法。合适的技术的具体的说明可以通过参考本文的实例获得。然而，当然也可使用等同的常规程序。这样的常规技术和描述可以在标准实验室手册中找到，诸如Genome Analysis:A Laboratory Manual Series(第I-IV卷)(Green等人编著，1999)；Genetic Variation:A Laboratory Manual(Weiner等人编著，2007)；Sambrook和Russell,Condensed Protocols from Molecular Cloning:ALaboratory Manual(2006)；以及Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(2002)(全部来自Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Protein Methods(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner等人编著，Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift&Loewy编著，Academic Press1995)；Immunology Methods Manual(Lefkovits编著，Academic Press 1997)；GeneTherapy Techniques,Applications and Regulations From Laboratory to Clinic(Meager编著，John Wiley&Sons 1999)；M.Giacca,Gene Therapy(Springer 2010)；GeneTherapy Protocols(LeDoux编著；Springer 2008)；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths编著；John Wiley&Sons1998)；Mammalian Chromosome Engineering-Methods and Protocols(G.Hadlaczky编著，Humana Press 2011)；Essential Stem Cell Methods,(Lanza和Klimanskaya编著，Academic Press 2011)；Stem Cell Therapies:Opportunities for Ensuring theQuality and Safety of Clinical Offerings:Summary of a Joint Workshop(Board onHealth Sciences Policy,National Academies Press 2014)；Essentials of Stem CellBiology，第三版，(Lanza和Atala编著，Academic Press 2013)；以及Handbook of StemCells,(Atala和Lanza编著，Academic Press 2012)，其全部用于所有目的通过引用以其整体并入本文。在描述本发明的组合物、研究工具和方法之前，应当理解本发明不局限于描述的特定的方法、组合物、目标和用途，因为这些当然可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，而不意图限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限制。

应当注意，除非上下文另有明确指示，如本说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“组合物”指一种组合物或更多种组合物的混合物，并且提及“测定”包括提及本领域技术人员已知的等同步骤和方法，等等。

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内的普通技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有出版物通过引用并入本文，用于描述和公开在出版物中描述并且可与本文描述的发明关联使用的装置、制剂和方法的目的。

在提供值的范围的情况下，应当理解，在该范围的上限与下限之间的每一个居间值以及在该规定的范围中的任何其他规定的值或居间值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，受制于规定的范围中的任何特异性排除的限制。在规定的范围包括上限和下限两者的情况下，排除那些包括的限值的仅一个的范围也被包括在本发明内。

在以下的描述中，阐述许多具体细节，以便提供对本发明的更彻底的理解。然而，对于本领域普通技术人员在阅读本说明书后将明显的是，本发明可以在没有一个或更多个这些具体细节的情况下被实践。在其他情况下，为了避免使本发明含混不清，没有描述本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序。

定义

除非明确规定，本文使用的术语意图具有如由本领域普通技术人员所理解的一般且普通的含义。以下定义意图帮助读者理解本发明，但并不意图改变或以其他方式限制此类术语的含义，除非特别地指示。

如本文使用的“结合”(例如，提及多肽的核酸结合结构域)指多肽与核酸之间的非共价相互作用。当处于非共价相互作用的状态中时，多肽和核酸被认为是“缔合的”、“相互作用”或“结合”。结合相互作用通常通过小于10^-6M至小于10^-15M的解离常数(Kd)来表征。“亲和力”指结合强度，增加的结合亲和力与较低的Kd相关。

“结合结构域”意指能够非共价结合另一分子的多肽或蛋白结构域。结合结构域可以结合，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。

“着丝粒”为赋予染色体通过细胞分裂分离至子细胞的能力的任何核酸序列。着丝粒可以通过有丝分裂和减数分裂赋予核酸序列(包括包含着丝粒的合成染色体)的稳定分离。着丝粒不必然需要源自与其被引入的细胞相同的物种，但优选地，着丝粒具有在该物种的细胞中促进DNA分离的能力。“双着丝粒(dicentric)”染色体为包含两个着丝粒的染色体。“前双着丝粒染色体(formerly dicentric chromosome)”为当双着丝粒染色体片段化时产生的染色体。“染色体”为在细胞分裂时能够在细胞中复制和分离的核酸分子和缔合的蛋白。通常，染色体包含着丝粒区域、复制起点、端粒区域及着丝粒区域与端粒区域之间的核酸区域。“近端着丝粒染色体(acrocentric chromosome)”指具有不等长度的臂的染色体。

“编码序列”或“编码”肽的序列为当被置于适当的控制序列的控制下时体内转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)为多肽的核酸分子。编码序列的边界通常由在5’(氨基)端处的起始密码子和在3’(羧基)端处的翻译终止密码子确定。

术语DNA“控制序列”共同地指启动子序列、聚腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调控结构域、复制起点、内部核糖体进入位点、增强子等，它们共同地提供受体细胞中的编码序列的复制、转录和翻译。只要选择的编码序列能够在适当的宿主细胞中被复制、转录和翻译，则并非所有这些类型的控制序列都需要存在。

术语“实现(effectuating)”生物合成通路指重现已知的生物合成通路以及产生和执行新的生物合成通路。

“内源染色体”指在生成或引入合成染色体之前在细胞中发现的染色体。

如本文使用的，“常染色质”指弥散地(diffusely)染色并通常包含基因的染色质，且“异染色质”指保持异常凝聚并被认为是转录不活跃的染色质。高度重复的DNA序列(卫星DNA)通常位于着丝粒周围的异染色质区域。

术语“异源DNA”或“外来(foreign)DNA”(或“异源RNA”或“外来RNA”)可互换使用，并且指不作为它存在于其中的基因组的一部分天然地存在的DNA或RNA，或者在不同于它在自然界中存在的位置的一个位置或更多个位置(a location or locations)和/或以不同于它在自然界中存在的量的量在基因组或细胞中发现的DNA或RNA。异源DNA的实例包括，但不限于，编码感兴趣的一种基因产物或更多种基因产物(a gene product or geneproduct(s))的DNA。异源DNA的其他实例包括，但不限于，编码可跟踪标志物蛋白的DNA以及调控DNA序列。

如本文使用的，术语“代谢物”指天然代谢物(诸如例如胆固醇)、异源代谢物(诸如例如在人类中的色氨酸)、工程化代谢物(即新的人造代谢物，诸如嵌合蛋白或工程化RNA干扰分子)或通过例如增强或抑制生物合成通路而赋予细胞改变的功能的任何其他代谢物。

“可操作地连接”指其中如此描述的组分被配置以进行它们的通常功能的元件的排布。因此，可操作地连接至编码序列的控制序列能够影响该编码序列的表达。控制序列不必与编码序列邻接，只要它们起作用以指导编码序列的表达即可。因此，例如，居间的非翻译但转录的序列可以存在于启动子序列与编码序列之间，且启动子序列仍可以被认为是“可操作地连接”至编码序列。事实上，这样的序列不必位于同一连续DNA分子(即染色体)上，并且仍可以具有导致改变的调控的相互作用。

“启动子”或“启动子序列”为能够结合细胞中的RNA聚合酶并启动多核苷酸或多肽编码序列(诸如信使RNA、核糖体RNA、核仁小核RNA(small nuclear of nucleolar RNA)或由任何类别的任何RNA聚合酶I、II或III转录的任何种类的RNA)的转录的DNA调控区域。

受体细胞是用于产生合成染色体、合成的平台染色体或被生物工程化以包含给定的DNA元件的合成的平台染色体的组分所进入的细胞。受体细胞的类型可以包括但不限于：干细胞、间充质干细胞、成体来源的干细胞、T细胞、免疫细胞、诱导多能(pluripotent)干细胞、成纤维细胞、内皮细胞，中胚层、外胚层和内胚层的细胞。还将包括肿瘤细胞细胞培养物系、原代细胞和生殖细胞。然后可以将细胞例如培养、准备用于移植、用于产生完整的转基因动物等。

“识别序列”为蛋白、DNA或RNA分子或其组合(诸如，但不限于，限制性内切核酸酶、修饰甲基化酶或重组酶)识别并结合的特定核苷酸序列。例如，Cre重组酶的识别序列为包含位于8个碱基对核心侧翼的两个13个碱基对反向重复序列(作为重组酶结合位点)的34个碱基对序列并被指定为loxP(参见，例如，Sauer,Current Opinion in Biotechnology,5:521-527(1994))。识别序列的其他实例包括，但不限于，由重组酶噬菌体λ整合酶识别的attB和attP、attR和attL等等。指定为attB的重组位点为包含两个9个碱基对核心型Int结合位点和7个碱基对重叠区域的约33个碱基对序列；attP为包含核心型Int结合位点和臂型Int结合位点以及用于辅助蛋白IHF、FIS和Xis的位点的约240个碱基对序列(参见，例如，Landy,Current Opinion in Biotechnology,3:699-7071(1993))。

“重组酶”为催化DNA区段在特定重组位点处交换的酶。整合酶指通常源自病毒或转座子以及可能的古老病毒的重组酶。“重组蛋白”包括使用一个或更多个重组位点参与重组反应的切除蛋白(excisive protein)、整合蛋白、酶、辅因子和相关蛋白(参见，Landy,Current Opinion in Biotechnology,3:699-707(1993))。本文方法中使用的重组蛋白可以经由在适当的载体诸如质粒等上的表达盒递送至细胞。在其他实施方案中，重组蛋白可以以在用于递送期望核酸的同一反应混合物中的蛋白形式递送至细胞。又在其他实施方案中，重组酶也可以在细胞中编码并且使用严格控制的诱导型启动子根据需要进行表达。

“核糖体RNA”(rRNA)为形成核糖体结构的部分并参与蛋白合成的专门RNA。核糖体RNA由基因的转录产生，所述基因在真核细胞中以多于一个拷贝存在。在人类细胞中，约250个拷贝的rRNA基因(即，编码rRNA的基因)/单倍体基因组以簇的形式分散在至少五个不同染色体(染色体13、14、15、21和22)上。在人类细胞中，多于一个拷贝的高度保守的rRNA基因位于串联排列的rDNA单元系列中，所述串联排列的rDNA单元系列通常长度为约40-45kb，并且包含转录区域和称为间隔区(即，基因间的间隔区)DNA的非转录区域，所述间隔区(即，基因间的间隔区)DNA的长度和序列可以变化。

如本文使用的，术语“可选择标志物(selectable marker)”指引入到细胞，特别地在本发明的上下文中，引入到培养物中的细胞中的、赋予适于人工选择的性状的基因。一般使用的可选择标志物为本领域普通技术人员熟知的。在优选的实施方案中，用于在人类合成染色体系统中使用的可选择标志物在人类中应该是非免疫原性的，并且包括，但不限于：人类神经生长因子受体(用MAb检测，诸如美国专利第6,365,373号中描述的)；截短的人类生长因子受体(用MAb检测)；突变体人类二氢叶酸还原酶(DHFR；荧光MTX底物可用)；分泌型碱性磷酸酶(SEAP；荧光底物可用)；人类胸苷酸合酶(TS；赋予对抗癌剂氟脱氧尿苷的耐受性)；人类谷胱甘肽S-转移酶α(GSTA1；将谷胱甘肽与干细胞选择性烷化剂(alkylator)白消安缀合；CD34⁺细胞中的化学保护性可选择标志物)；造血干细胞中的CD24细胞表面抗原；赋予对N-膦酰基乙酰基-L-天冬氨酸(N-phosphonacetyl-L-aspartate；PALA)的耐受性的人类CAD基因；人类多药耐受性1(MDR-1；通过增加的药物耐受性可选择或通过FACS富集的P-糖蛋白表面蛋白)；人类CD25(IL-2α；通过Mab-FITC可检测)；甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT；通过卡莫司汀可选择)；和胞苷脱氨酶(CD；通过Ara-C可选择)。还可以采用药物可选择标志物诸如嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟素、G418、四环素。另外，使用FAC分选，如化学发光标志物(例如Halo标签)等可用于阳性选择一样，任何荧光标志物基因可以用于阳性选择。

“位点特异性重组”指在单个核酸分子上的两个特定位点之间或在两个不同分子之间的需要外源蛋白诸如整合酶或重组酶存在而实现的位点特异性重组。某些位点特异性重组系统可以用于特异性缺失、倒位或插入DNA，其中精确事件由特异性位点的取向、特异性系统和辅助蛋白或因子的存在控制。另外，DNA区段可以在染色体之间交换(染色体臂交换)。

“合成染色体”(也称为“人工染色体”)为具有适应和表达异源基因的能力并且在细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离的核酸分子，通常是DNA分子。“哺乳动物合成染色体”指具有活性哺乳动物着丝粒的染色体。“人类合成染色体”指包含在人类细胞中起作用的着丝粒并且优选地在人类细胞中产生的染色体。对于示例性人工染色体，参见，例如，美国专利第8,389,802号；第7,521,240号；第6,025,155号；第6,077,697号；第5,891,691号；第5,869,294号；第5,721,118号；第5,712,134号；第5,695,967号；和第5,288,625号以及公布的国际PCT申请第WO 97/40183号和第WO98/08964号。

术语“受试者”、“个体”或“患者”可以在本文中可互换使用，并且指哺乳动物，并且在一些实施方案中指人类。

“载体”为可以附接另一个DNA区段的复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒构建体、粘粒、细菌人工染色体、P-1来源的人工染色体或酵母人工染色体。在一些情况下，载体可以为染色体，诸如在从被工程化为包含重组位点的一个内源染色体臂交换至合成染色体的情况下。载体用于在细胞中转导和表达DNA区段。

本发明

本发明涵盖允许人们将来自生物合成通路的多于一个基因递送到细胞中并在细胞中表达以产生代谢物的组合物和方法。合成染色体由于其大携带能力可以携带和表达多于一个基因产物—特别是来自一条或更多条生物合成通路的多于一个基因—从而规避了基于病毒和基于质粒的核酸递送的限制。本发明提供了允许产生代谢物(或多于一种代谢物)从而增加和增强受体细胞的细胞生理学的方法和组合物，所述代谢物的合成需要生物化学通路中多于一个基因的协调的表达和功能。通路可以包括1)已知产生特定最终产物的那些通路；2)通过以新的组合掺入现有基因和/或在新的细胞类型中表达现有基因以产生对在其中产生最终产物的细胞类型可以是新的特定最终产物而产生的新的通路；或者3)通过将新的基因单独地或与现有基因组合掺入以产生新的最终产物而产生的新通路。因此，本发明的方法和组合物允许细胞的工程化以合成在细胞中不存在或以次优水平合成的代谢物，并且适用于合成染色体产生的所有方法，包括“自上而下”方法(“top down”approach)、“自下而上”方法(“bottom up”approach)、天然存在的微型染色体的工程化以及通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体生成(所有这些都在下文中更详细地讨论)。

图1是本发明的方法用于功能性增强细胞生物合成能力的一个实施方案的简化示意图。图1示出了位于细胞中的合成的平台染色体。携带生物合成通路的基因的递送载体被递送至细胞，并且来自生物合成通路的基因被“装载到”合成的平台染色体上(下文中更详细地描述)。然后，已经装载到合成染色体上的基因在细胞中表达。然后，由来自合成染色体的基因的转录和翻译表达的蛋白协同作用，以通过生物合成复合物(即一系列酶促反应物)产生一种或更多种代谢产物。

采用合成的平台染色体用于细胞功能增强的效用的一个实例是将免疫系统细胞工程化以合成必需氨基酸色氨酸。在肿瘤生长期间，肿瘤细胞从局部肿瘤环境中输入大量色氨酸，导致抑制肿瘤细胞生长的免疫细胞饥饿并随后停滞，使得饥饿的免疫细胞不能抑制生长的肿瘤细胞。色氨酸是必需氨基酸——即，人类不能从头合成的氨基酸——并且饮食摄入色氨酸不能减轻由肿瘤细胞诱导的色氨酸饥饿。然而，包含表达产生色氨酸生物合成的异源基因的合成染色体的免疫细胞具有选择性优势，并在与肿瘤细胞相互作用期间或在肿瘤细胞环境中避开“无色氨酸(tryptophan-less)”死亡。例如，酵母酿酒酵母表达合成色氨酸所必需的五个基因(TRP1-5)。这些基因中的每一个都可以被分离并由哺乳动物启动子(组成型表达的或由可调型启动子表达的)控制，并被置于可以携带大量DNA的细菌载体，诸如被工程化为将多于一个基因递送或“装载”到合成的平台染色体上(如下文所描述)的细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome)(BAC)上。然后包含色氨酸生物合成基因的合成染色体可以被随后导入到免疫细胞(例如，通用供体T细胞或患者自体T细胞)中，用于基于免疫肿瘤学细胞的疗法。

除了赋予对“无色氨酸”死亡的耐受性之外，合成染色体的大携带能力另外允许工程化阻断肿瘤细胞抑制的其他生物合成通路的基因，包括但不限于1)表达干扰或阻断肿瘤细胞抑制免疫细胞周期进程的能力的基因，例如抗PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)或抗CTLA-4(中央T细胞活化和抑制4)分子；2)增强免疫细胞活化和生长的因子(例如，白细胞介素-2或其他这样的细胞因子)；和/或3)增加工程化免疫细胞对发展中肿瘤的特异性的因子，例如，增加免疫细胞对肿瘤归巢(homing to tumors)或免疫细胞与特定肿瘤标志物结合的因子的增加。因此，色氨酸生物化学通路以及另外的通路和/或因子的工程化界定了用于基于免疫细胞的抗癌疗法的合成的平台染色体(即“免疫/肿瘤学(immuno/onc)合成染色体或免疫/肿瘤学SynC”)。

合成染色体产生

在培养的细胞中产生合成染色体。在一些实施方案中，待被工程化和/或产生合成染色体的细胞可以是天然存在于受试者(人类患者、动物或植物)中的细胞，其中来自合成染色体的基因或调控序列将最终被表达。这样的细胞可以是出于对个体特异性的合成染色体产生的目的而建立的原代培养物细胞系。在其他实施方案中，待被工程化和/或产生合成染色体的细胞来自已建立的细胞系。用于组织培养的多种细胞系为本领域中已知的。细胞系的实例包括但不限于人类细胞系诸如293-T(胚胎肾)、721(黑素瘤)、A2780(卵巢)、A172(成胶质细胞瘤)、A253(癌)、A431(上皮细胞)、A549(癌)、BCP-1(淋巴瘤)、BEAS-2B(肺)、BR293(乳腺)、BxPC3(胰腺癌)、Cal-27(舌)、COR-L23(肺)、COV-434(卵巢)、CML T1(白血病)、DUI45(前列腺)、DuCaP(前列腺)、FM3(淋巴结)、H1299(肺)、H69(肺)、HCA2(成纤维细胞)、HEK0293(胚胎肾)、HeLa(子宫颈)、HL-60(原粒细胞)、HMEC(上皮细胞)、HT-29(结肠)、HUVEC(脐静脉上皮细胞)、Jurkat(T细胞白血病)、JY(类淋巴母细胞)、K562(类淋巴母细胞)、KBM-7(类淋巴母细胞)、Ku812(类淋巴母细胞)、KCL22(类淋巴母细胞)、KGI(类淋巴母细胞)、KYO1(类淋巴母细胞)、LNCap(前列腺)、Ma-Mel(黑素瘤)、MCF-7(乳腺)、MDF-10A(乳腺)、MDA-MB-231、MDA-MB-468和MDA-MB-435(乳腺)、MG63(骨肉瘤)、MOR/0.2R(肺)、MONO-MAC6(白血细胞)、MRC5(肺)、NCI-H69(肺)、NALM-1(外周血)、NW-145(黑素瘤)、OPCN/OPCT(前列腺)、Peer(白血病)、Raji(B淋巴瘤)、Saos-2(骨肉瘤)、Sf21(卵巢)、Sf9(卵巢)、SiHa(子宫颈癌)、SKBR3(乳腺癌)、SKOV-2(卵巢癌)、T-47D(乳腺)、T84(肺)、U373(成胶质细胞瘤)、U87(成胶质细胞瘤)、U937(淋巴瘤)、VCaP(前列腺)、WM39(皮肤)、WT-49(类淋巴母细胞)、YAR(B细胞)、胚胎细胞系、多能细胞系、成体来源的干细胞、重编程细胞系、任何物种或广泛的胚胎或重编程细胞的通用动物细胞系、患者自体细胞系，并且，在一些优选实施方案中，利用了HT1080人类细胞系。这些细胞系和其他细胞系从本领域技术人员已知的多种来源可得(参见，例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,Va.))。

在生物化学或生物合成通路中表达多于一个基因的合成染色体的工程化适用于本领域中使用的所有“自上而下”、“自下而上”、微型染色体工程化和诱导的从头染色体生成方法。合成染色体形成的“自下而上”方法依赖于用克隆的α-卫星序列转染允许细胞系后细胞介导的从头染色体形成，所述克隆的α-卫星序列包括典型的宿主细胞适合的着丝粒和可选择标志物基因，具有或不具有端粒和基因组DNA。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Harrington等人，Nat.Genet.,15:345-55(1997)；Ikeno等人，Nat.Biotechnol.,16:431-39(1998)；Masumoto等人，Chromosoma,107:406-16(1998)；Ebersole等人，Hum.Mol.Gene.,9:1623-31(2000)；Henning等人，PNAS USA,96:592-97(1999)；Grimes等人，EMBO Rep.2:910-14(2001)；Mejia等人，Genomics,79:297-304(2002)；以及Grimes等人，Mol.Ther.,5:798-805(2002).)。被克隆到酵母人工染色体、细菌人工染色体或P1来源的人工染色体载体中的合成和天然存在的α-卫星阵列两者在本领域中已用于从头合成的染色体形成。自下而上组装的产物可以是线性的或圆形的，包括具有基于α-卫星DNA的着丝粒的简化和/或多联体化的输入DNA，并且通常尺寸范围在1Mb与10Mb之间。自下而上来源的合成染色体也被工程化以掺入允许将靶DNA序列位点特异性整合到合成染色体上的核酸序列。

产生合成染色体的“自上而下”方法包括顺序轮次的预先存在的染色体臂的随机和/或靶向截断，以产生包括着丝粒、端粒和DNA复制起点的简练(pared down)的合成染色体。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Heller等人，PNAS USA,93:7125-30(1996)；Saffery等人，PNAS USA,98:5705-10(2001)；Choo,Trends Mol.Med.,7:235-37(2001)；Barnett等人，Nuc.Ac.Res.,21:27-36(1993)；Farr等人，PNAS USA,88:7006-10(1991)；以及Katoh等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.,321:280-90(2004).)。“自上而下”合成染色体被最佳构建为不含天然存在的表达的基因，并被工程化为包含这样的DNA序列，所述DNA序列允许由例如位点特异性DNA整合酶介导的靶DNA序列位点特异性整合到截短的染色体上。

本领域已知的产生合成染色体的第三种方法为天然存在的微型染色体的工程化。该产生方法通常包括照射诱导的染色体片段化，该染色体包含功能性的，例如人类新着丝粒，其具有着丝粒功能但缺乏α-卫星DNA序列并被工程化为不含非必需DNA。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Auriche等人，EMBO Rep.2:102-07(2001)；Moralli等人，Cytogenet.Cell Genet.,94:113-20(2001)；以及Carine等人，Somat.Cell Mol.Genet.,15:445-460(1989).)。与生成合成染色体的其他方法一样，工程化微型染色体可以被工程化为包含允许靶DNA序列的位点特异性整合的DNA序列。

用于产生合成染色体的第四种并且优选的方法包括通过特定染色体区段的靶向扩增的诱导的从头染色体生成。该方法包括位于近端着丝粒染色体上的近着丝粒区(pericentromeric)/核糖体DNA区域的大规模扩增。通过对染色体的臂间区域(诸如核糖体RNA)特异性的过量DNA以及允许靶DNA序列的位点特异性整合的DNA序列(诸如attP、attB、attL、attR等)以及任选地整合到染色体的臂间区域的所有的可选择标志物的共转染触发扩增。(关于这些方法的方案和详细描述，参见，例如，Csonka等人，J.Cell Sci 113:3207-16(2002)；Hadlaczky等人，Curr.Opini.Mol.Ther.,3:125-32(2001)；以及Lindenbaum和Perkins等人，Nuc.Ac.Res.,32(21):el72(2004).)。在该过程中，通过共转染的DNA靶向近端着丝粒染色体的臂间区域诱导大规模染色体DNA扩增、着丝粒序列的复制/激活、以及随后的双着丝粒染色体的裂开和分离，产生包含多于一个位点特异性整合位点的基于“断裂(break-off)”的卫星DNA的合成染色体。

合成的平台染色体技术的一个组成部分是位点特异性重组系统，其允许将选择的基因“装载”或放置到合成染色体上。在本发明的优选实施方案中，合成的平台染色体包含多于一个位点特异性重组位点，在所述多于一个位点特异性重组位点的每一个中可以插入一个或几个感兴趣的基因。可以使用任何已知的重组系统，包括使用来自大肠杆菌(E.coli)噬菌体P1的CRE重组酶的Cre/lox重组系统(参见，例如，Sauer,Methods inEnzymology,225:890-900(1993)和美国专利第5,658,772号)；使用来自酿酒酵母的2μ附加体的FLP重组酶的酵母FLP/FRT系统(参见，例如，Cox,PNAS U.S.A.,80:4223(1983)和美国专利第5,744,336号)；解离酶，包括噬菌体Mu的Gin重组酶(Maeser等人，Mol Gen Genet.,230:170-176(1991))、Cin、Hin、αδ、Tn3；大肠杆菌的Pin重组酶(参见，例如，Enomoto等人，JBacterid.,6:663-668(1983))；鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)的pSRl质粒的R/RS系统(参见，例如，Araki等人，J.Mol.Biol.,225:25-37(1992))；来自Kluyveromycesdrosophilarium(参见，例如，Chen等人，Nucleic Acids Res.,314:4471-4481(1986))以及克鲁雄酵母菌(Kluyveromyces waltii)(参见，例如，Chen等人，J.Gen.Microbiol.,138:337-345(1992))的位点特异性重组酶；以及本领域技术人员已知的其他系统；然而，不需要另外因子—或者凭借突变而不需要另外因子操作的重组系统—是优选的。在一个示例性实施方案中，提供了一种用于使用细菌噬菌体λ整合酶的重组酶活性经由序列特异性重组将核酸插入到合成的平台染色体的方法。

λ噬菌体编码的整合酶(命名为“Int”)是整合酶家族的原型成员。经由命名为attB/attP和attL/attR的成对附接位点之间的重组，Int实现噬菌体进入和离开大肠杆菌基因组的整合和切除。每个att位点包含两个反向的9个碱基对核心Int结合位点和7个碱基对重叠区域，这与在野生型att位点中是相同的。像Cre重组酶和Flp-FRT重组酶系统一样，Int在整合重组和切除重组期间执行有序的序列对的链交换。Int、attB和attP或attL和attR的天然靶序列对位于相同或不同的DNA分子上，分别导致分子内或分子间重组。例如，分子内重组分别发生在反向取向的attB与attP之间，或者在attL与attR序列之间，导致居间DNA区段的倒位。尽管野生型Int需要另外的蛋白因子用于整合重组和切除重组以及负超螺旋化用于整合重组，但是突变体Int蛋白在人类细胞中的共转染测定中不需要辅助蛋白来进行分子内整合重组和切除重组(参见Lorbach等人，J Mol.Biol.,25 296:1175-1181(2000))并且对于本发明的方法是优选的。

在生物合成通路中递送多于一个基因的递送载体

待被用于将生物合成通路中的多于一个基因递送或“装载”到合成的平台染色体上的递送载体的选择将取决于多种因素，诸如期望在其中繁殖的细胞的类型。适当的递送载体的选择在本领域技术人员的技术范围内，并且许多载体商购可得。为了制备递送载体，通常通过将基因序列连接到载体中的裂解的限制性酶位点处而将多于一个基因插入到载体中。可选地，可以通过同源重组或位点特异性重组插入所期望的核苷酸序列。通常，通过在所期望的核苷酸序列的侧翼附接与载体同源的区域(例如cre-lox、att位点等)来实现同源重组。包含这样的序列的核酸可以通过例如寡核苷酸的连接，或通过使用包含同源性区域和所期望的核苷酸序列的一部分两者的引物的聚合酶链式反应来添加。可以使用的示例性递送载体包括但不限于源自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的那些。例如，可以使用质粒载体诸如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列载体。噬菌体载体可以包括λgt10、λgt11、λgtl8-23、λZΑΡ/R和EMBL系列的噬菌体载体。可以利用的粘粒载体包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9(charomid 9)系列载体。另外的载体包括基于功能性致育质粒(fertilityplasmid)(F-质粒)的细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和P1来源的人工染色体、源自P1噬菌体的DNA的DNA构建体(PACS)。可选地且优选地，重组病毒载体可以被工程化，包括但不限于源自病毒诸如疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、痘病毒、腺病毒、慢病毒、腺相关病毒或牛乳头状瘤病毒的那些重组病毒载体。BAC载体由于它们携带大量核酸，即多于一个基因的能力，是本发明的优选的递送载体。可选地，可以使用多于一个递送载体经由顺序装载将多于一个基因装载到合成的平台染色体上；即，可以经由第一递送载体将第一基因装载到合成的平台染色体上，可以经由第二递送载体将第二基因装载到合成的平台染色体上，如此类推。Perkins和Greene于2016年4月12日提交的USSN 62/321,711中描述了在回收单个可选择标志物时顺序装载多于一个递送载体。

来自生物合成通路的基因中的每一个都可以被分离并由哺乳动物启动子控制，该哺乳动物启动子组成型表达或由可调型启动子表达。可以任选地存在在表达宿主中起作用的可选择标志物，以便于选择包含递送载体的细胞。另外，递送载体可以包括另外的元件；例如，递送载体可以具有一种或两种复制系统；因此允许其在生物体中，例如在用于表达的哺乳动物细胞中和在用于克隆和扩增的原核宿主中被维持。

使用λ整合酶介导的位点特异性重组—或任何其他重组酶介导的位点特异性重组—将靶基因从递送载体引入或“装载”到合成的平台染色体上。因为合成的平台染色体包含多于一个位点特异性重组位点，所以多于一个基因被装载到单个合成的平台染色体上。介导位点特异性重组的重组酶可以通过在递送载体上编码重组酶的基因被递送至细胞，或者纯化的或包封的重组酶蛋白可以使用标准技术被递送至受体细胞。多于一个靶基因的每一个都可能处于其自身启动子的控制下；可选地，多于一个靶基因的表达可以经由基于病毒的或人类内部核糖体进入位点(IRES)元件来协同调控(参见，例如，Jackson等人，TrendsBiochem Sci.15:477-83(1990)；以及Oumard等人，Mol.Cell.Biol.20:2755-2759(2000))。另外，使用与靶基因下游的荧光标志物—例如绿色、红色或蓝色荧光蛋白(GFP、RFP、BFP)—连接的IRES类型元件允许鉴定表达整合的靶基因的合成的平台染色体。可选地或者另外，合成染色体上的位点特异性重组事件可以通过设计引物以通过PCR检测整合来快速筛选。

组分递送到合成染色体产生细胞

适用于合成染色体产生的组分和递送载体可以通过本领域已知的任何方法递送至受体细胞。术语转染和转化指外源核酸例如表达载体被宿主细胞接受，无论其事实上是否表达了任何编码序列。许多转染方法为本领域普通技术人员已知的，例如，通过农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、原生质体转化(包括聚乙二醇(PEG)介导的转化、电穿孔、原生质体融合和微细胞融合))、脂质介导的递送、脂质体、电穿孔、声致穿孔、显微注射，粒子轰击和碳化硅晶须介导的转化及其组合(参见，例如，Paszkowski等人，EMBO J.,3:2717-2722(1984)；Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.,199:169-177(1985)；Reich等人，Biotechnology,4:1001-1004(1986)；Klein等人，Nature,327:70-73(1987)；美国专利第6,143,949号；Paszkowski等人，于Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants中，第6卷，Molecular Biology of Plant Nuclear Genes，(Schell和Vasil，编著，Academic Publishers 1989)；以及Frame等人，Plant J.,6:941-948(1994))；使用磷酸钙的直接摄取(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,76:1373-1376(1979))；聚乙二醇(PEG)介导的DNA摄取；脂质体转染(参见，例如，Strauss,Meth.Mol.Biol.,54:307-327(1996))；微细胞融合(Lambert,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:5907-5911(1991)；美国专利第5,396,767号；Sawford等人，Somatic Cell Mol.Genet.,13:279-284(1987)；Dhar等人，Somatic Cell Mol.Genet.,10:547-559(1984)；以及McNeill-Killary等人，Meth.EnzymoL.,254:133-152(1995))；脂质介导的运载体(carrier)系统(参见，例如，Teifel等人，Biotechniques,19:79-80(1995)；Albrecht等人，Ann.Hematol.,72:73-79(1996)；Holmen等人，In Vitro Cell Dev.Biol.Anim.,31:347-351(1995)；Remy等人，Bioconjug.Chem.,5:647-654(1994)；Le Bolch等人，Tetrahedron Lett.,36:6681-6684(1995)；以及Loeffler等人，Meth.Enzymol.,217:599-618(1993))；或其他合适的方法。用于递送合成染色体的方法也被描述于美国申请系列第09/815,979号中。成功转染通常通过检测转染的细胞内异源核酸的存在，诸如例如宿主细胞内异源核酸的任何可视化、可选择标志物的表达或合成的平台染色体或递送载体的运行的任何迹象来确认。可用于实践本发明的递送方法的描述参见美国专利第5,011,776号；美国专利第5,747,308号；美国专利第4,966,843号；美国专利第5,627,059号；美国专利第5,681,713号；Kim和Eberwine,Anal.Bioanal.Chem.397(8):3173-3178(2010)。

可视化、分离以及转移至受体免疫细胞

本发明的合成的平台染色体的产生和装载可以通过多种方法来监控。Lindenbaum和Perkins等人,Nucleic Acid Research,32(21):el72(2004)描述了使用现有技术中的技术产生基于哺乳动物卫星DNA的人工染色体表达(ACE)系统。在该现有技术的系统中，使用PCR生成的探针或切口平移的探针进行常规的单色和双色FISH分析和高分辨率FISH。为了检测端粒序列，使有丝分裂涂布物(spreads)与商购获得的肽核酸探针杂交。使用荧光显微术进行显微术。可选地，Perkins和Greene于2016年2月9日提交的PCT/US16/17179，描述了允许人们使用两种标记的标签经由标准化荧光技术实时监测合成染色体形成的组合物和方法：一种标记的标签对用于产生合成的平台染色体的细胞系内的内源染色体是特异性的，且另一种不同地标记的标签对待产生的合成染色体上的序列是特异性的。

合成染色体的分离和转移通常包括利用微细胞介导的细胞转移(MMCT)技术或染料依赖性染色体染色及随后的基于流式细胞术的分选。在MMCT技术中，供体细胞被化学诱导使得其染色体多核化，随后包装到微细胞中，并且最终融合到受体细胞中。合成染色体已经被转移至受体细胞的建立通过药物选择和通过FISH确认的转移的染色体的完整递送来进行。可选地，可以使用基于流式细胞术的转移。对于基于流式细胞术的转移，将有丝分裂停滞的染色体分离并用DNA特异性染料染色，并且基于尺寸和差异染料染色进行流式分选。然后经由标准DNA转染技术将流式分选的染色体递送到受体细胞中，并且完整染色体的递送通过FISH来确定。又在另一个选择中，除了在Perkins和Greene于2016年2月9日提交的PCT/US16/17179中描述的合成染色体产生的可视化和监测之外，合成染色体标签还可以用于经由流式细胞术从合成染色体产生细胞中分离合成染色体，以及监测合成染色体到受体细胞(即免疫细胞)的转移。

实施例

实施例1：基于卫星DNA的人工染色体的从头生成

对于合成染色体的从头生成，将外源DNA序列引入到HT1080合成染色体产生细胞系中，并且在整合到近端着丝粒染色体的臂间异染色质区域后，触发近端着丝粒染色体的短臂(rDNA/着丝粒区域)的大规模扩增。在扩增事件期间，着丝粒被复制，产生具有两个活性着丝粒的双着丝粒染色体。随后的有丝分裂事件导致双着丝粒染色体的裂解和分离，产生尺寸约20-120Mb的断裂物，其主要包含卫星重复序列，所述卫星重复序列具有共扩增的转染的转基因的亚结构域，该亚结构域也可包含扩增的rDNA拷贝。新生成的合成染色体通过经由被工程化到HT1080合成染色体产生细胞系中的内源染色体标签和合成染色体标签观察荧光染色体涂染(或FISH)进行验证。

在转染之前一天，将HT1080合成染色体产生细胞系的细胞以约2.0至8.0×10⁴个贴壁细胞的密度分到24孔组织培养皿中，并将包含外源DNA的载体纯化(例如，使用QiagenEndoFree Plasmid Maxi试剂盒)、线性化，并确定用于转染的载体的浓度。喂养经培养的HT1080细胞3-5小时，然后转染。将225ng pSTV28HurDNA载体和12.5ngp15A72481acEF1attPPuro载体/24孔半汇合组织培养皿用于使用标准转染试剂(例如，ThermoFisher Lipofectamine LTX、Promega的Viafect或Invitrogen的磷酸钙转染试剂盒)来转染HT1080细胞。pSTV28HurDNA载体包含核糖体DNA序列。p15A7248lacEF1attPPuro载体包含用于位点特异性重组系统的组分、LacO重复序列和氨苄青霉素和嘌呤霉素耐受性基因。将细胞在转染后维持1-3天，在该时间点将它们胰蛋白酶化并重新平铺在10cm培养皿上。在平铺时或在平铺后1-3天，将选择培养基添加至10cm培养皿。选择条件被维持10-21天，每2-3天更换培养基。当集落直径达到2-3mm时挑取抗生素耐受克隆。良好分离的集落是优选的。通过使用克隆柱(cloning cylinder)和胰蛋白酶取出细胞，并转移至24孔板中以用于扩增。

实施例2：产生酿酒酵母色氨酸通路递送载体

使用BLoVeL-TTS载体作为骨架递送载体，以将来自酿酒酵母色氨酸通路的五个基因(Trp1-Trp5)插入到合成染色体上。该五个色氨酸基因被编码2A肽或IRES元件的DNA序列分开，以形成包含该五个基因的单个转录物，从而产生几乎相等的表达水平的色氨酸合成所需蛋白。可以采用的2A自裂解肽包括但不限于：猪捷申病毒(porcine teschovirus)-12A(P2A)、明脉扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2A(T2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)2A(F2A)、质型多角体病毒2A(BmCPV 2A)和软化病病毒(flacherie Virus2A)(BmIFV2A)(参见下文)。数据表明，在自裂解肽的N末端添加一个短的3个氨基酸肽(甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)可以改进自裂解。因此，该实施例还涵盖改进2A自裂解肽活性的效率的轻微修饰。

表1

(参见Kim等人，PLoS ONE,6(4),e18556.http://doi.org/10.1371/journal.pone.0018556)可以采用的内部核糖体进入位点(IRES)元件包括但不限于病毒和细胞IRES元件。病毒IRES元件分为四种类型。类型I包括肠道病毒(EV、PV、HRV)，类型II，心脏病毒(EMCV)和口蹄病毒(aphthovirus)(口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)，FMDV)，类型III用于甲型肝炎病毒(HAV)，并且丙型肝炎病毒(HCV)样的IRES符合IV组。(参见Pacheco和Martinez-Salas,J Biomed Biotechnol.Feb2；2010:458927.doi:10.1155/2010/458927.PMID:20150968；以及Hellen和Sarnow,Genes Dev.,15(13):1593-612(2001))。

将BLoVeL-TTS用Eco53KI消化，以使递送载体骨架线性化。将该五个Trp基因合成或使用这样的引物从酿酒酵母s288c基因组DNA中PCR扩增，所述引物被设计用于将该5个基因和选择的启动子IN-Fusion克隆(Takara)到线性化的BLoVeL-TTS载体中。

表2

启动子可以选自自然界中发现的那些启动子或人工组装的启动子。期望的表达控制决定组成型启动子或诱导型启动子对于特定通路和应用是否是优选的。例如，人们可以利用这样的启动子，所述启动子将提供反馈机制以根据细胞中特定代谢物的水平诱导或抑制转录。

酿酒酵母生物合成通路中的五个Trp基因通过以下修饰合成：1)合成不具有终止密码子的Trp1、Trp2、Trp3、Trp4基因；2)P2A间隔区在Trp2基因的上游被编码，并且甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸间隔区加上15bp的T2A间隔区在最后一个Trp2氨基酸密码子的下游被编码；3)T2A间隔区在Trp3基因的上游被编码，并且甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸间隔区加上15bp的E2A间隔区在最后一个Trp3氨基酸密码子的下游被编码；4)E2A间隔区在Trp4基因的上游被编码，并且甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸间隔区加上15bp的F2A间隔区在最后一个Trp4氨基酸密码子的下游被编码；以及5)F2A间隔区在Trp5基因的上游被编码，并且多聚腺苷酸化信号在Trp5基因的下游被编码。

PCR引物被设计为PCR扩增五个合成的DNA元件以及人类EF1α启动子(从pEF1hrGFP扩增)，用于N-Fusion克隆到线性化的BLoVeL-TTS载体骨架中。所得构建体BLoVeL-TTS_TrpPath示于图2中。(在BLoVeL-TTS_TrpPath中，存在以下元件：sopA、sopB和sopC＝质粒分配蛋白(plasmid partitioning protein)；SV40pAn＝SV40聚A；TTS＝转录终止信号；attB＝位点特异性重组位点；lox＝位点特异性重组位点；eGFP＝荧光蛋白；Bsr＝杀稻瘟素耐受性基因；repE＝复制起始位点；Ori2＝复制起点；CmR＝氯霉素耐受性基因；poly An＝聚A；EF1alphaPr＝启动子；TRP1、TRP2、TRP3、TRP4和TRP5＝色氨酸基因1-5；P2A、T2A、E2A和F2A＝自裂解肽。)。在构建了BLoVeL-TTS_TrpPath递送载体后，将它转染到包含合成染色体的细胞中。

实施例3：将酿酒酵母色氨酸通路基因装载到合成染色体上

使用BLoVeL-TTS载体作为递送载体，以将来自酿酒酵母色氨酸通路的五个基因(Trp1-Trp5)插入到合成染色体上。在第0天，将包含合成染色体(hSynC)的受体细胞系(例如HT1080)以～4E4细胞/24孔培养皿的孔接种，使得孔在第1天～70％汇合。将细胞在37℃、5％CO₂在适当的培养基(例如，对于HT1080，DMEM+10％FC3)中孵育过夜。在第1天，按照制造商的说明(Fisher Scientific，具有Plus试剂的Lipofectamine LTX)，将递送载体(例如BLoVeL-TTS_TrpPath)和编码重组蛋白的质粒(例如pCXLamIntR)两者转染到HT1080细胞中。转染以一式两份进行，以便可以进行药物选择和直接细胞分选的比较。在Opti-MEM培养基中稀释Lipofectamine LTX(Gibco；1.5ul LTX/50ul Opti-MEM用于待转染的24孔培养皿的每个孔)并且将250ng DNA添加至50ul在Opti-MEM中稀释的LTX(例如，125ng BLoVeL-TTS_TrpPath质粒和125ng pCXLamIntR/孔)。将0.25ul PLUS试剂添加至每个～50ul DNA-LTX-Opti_MEM样品中，并且将每个样品在室温孵育5分钟。然后将培养基从第0天铺板的细胞中去除，并且在5分钟孵育期间使用新鲜培养基替换培养基。将DNA-脂质复合物添加至细胞，并且在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育。

在第2-24天，进行药物选择。将来自一式两份24孔的孔中一个孔的细胞胰蛋白酶化并转移至10cm的培养皿中，该培养皿具有包含药物选择(例如，在5ug/ml的嘌呤霉素或在3ug/ml的杀稻瘟素)的新鲜培养基。然后将细胞在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育，并且监测集落形成。约每72小时替换一次培养基。当形成明显的集落时(约10天)，将每个集落通过玻璃柱分离、胰蛋白酶化并转移至24孔培养皿的孔中。然后将这些“克隆”在培养物中扩增，直到有足够的细胞可用于将克隆置于冷藏中并分离基因组DNA(约2周；PromegaWizard SV Genomic DNA Purification)，用于PCR分析。

可选地，可以将一式两份孔中的细胞胰蛋白酶化，并且置于具有缺乏药物选择的新鲜培养基的6cm培养皿中，并且在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育。在第3天或第4天，将在6cm培养皿中的细胞胰蛋白酶化并应用于细胞分选仪，以对已经整合了载体并在递送载体(例如GFP；BLoVeL-TTS_TrpPath)上表达荧光蛋白的荧光细胞进行单细胞分选。注意分选仪鉴定整合之后的符合读框的GFP阳性重组体，这是本发明方法的独特方面之一。包含感兴趣的基因/DNA元件的递送载体的整合通过使用适当的PCR引物生产跨越合成染色体与递送载体(BLoVeL-TTS_TrpPath)之间重组位点的独特PCR产物来鉴定。水和宿主基因组DNA(例如HT1080)的阴性对照PCR反应与测试基因组DNA样品一起进行。用来从BLoVeL-TTS_TrpPath载体整合中扩增接点(junction)PCR产物的PCR引物是：接点1-预期产物尺寸392bp(ACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTC[SEQ ID No.5]和ctcgccgcagccgtgtaa[SEQ ID No.6])；接点2-预期产物尺寸401bp(gcgctaatgctctgttacaggt[SEQ ID No.7]和GGAAAGCTGCCAGTGCCTTG[SEQ ID No.8])。

在鉴定具有正确接点PCR产物尺寸的候选克隆后，进行进一步的PCR反应以确认原始装载到递送载体并且现在位于合成染色体上的感兴趣的DNA元件(例如，TRP1、TRP2、TRP3、TRP4和TRP5)的存在。另外，进行了色氨酸的产生的测试，并且这可以以多种方式确定。首先，与在包含色氨酸的细胞培养基中生长的细胞相比，随着这些细胞的生长，可以测试细胞在缺乏氨基酸色氨酸的细胞培养基中生长的能力。用于色氨酸合成的可选的测试可以是用Bridge-it L-色氨酸荧光测定试剂盒(Mediomics，LLC)测定裂解的细胞沉淀物(pellet)中的色氨酸水平。色氨酸水平在携带TRP1、TRP2、TRP3、TRP4和TRP5基因的独立培养物上以一式三份测量，并且与不具有包含BLoVeL-TTS_TrpPath的合成染色体的细胞培养物进行比较。

实施例4：向色氨酸通路添加芳香族氨基酸通路

来自酵母的色氨酸通路可能也需要ARO通路以在人类细胞中为色氨酸生物合成通路提供前体。进入色氨酸生物合成通路的前体分子是分支酸(chorsimate)，其由芳香族氨基酸通路(也称为shikamate通路)产生。在酿酒酵母(S.cerevisiae)中，四个基因负责将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸(E4P)转化为分支酸：

表3

基因	NCBI参考序列	尺寸(bp)
			ARO1	NC_001136.10/基因ID：851705	4767
ARO2	NC_001139.9/基因ID：852729	1131
			ARO3	NC_001136.10/基因ID：851605	1113
ARO4	NC_001134.8/基因ID：852551	1113

(参见Braus，Microbiological Reviews，55(3)，349-370(1991))

在鉴定包含TRP1、TRP2、TRP3、TRP4和TRP5基因的细胞后，使用CRE-Lox重组将可选择标志物盒(eGFP-BSR)去除。

用CRE表达质粒转染包含合成染色体的细胞系。在第0天，将细胞以2E5个细胞/6cm细胞培养皿接种，并且在37℃以5％CO₂孵育过夜。在第1天，按照制造商的方案，将CRE表达质粒(例如PSF-CMV-CRE-CRE重组酶表达载体；Sigma Aldrich)用Lipofectamine LTX转染到细胞系中(包含TRP1、TRP2、TRP3、Trp4和TRP5基因)。将Lipofectamine LTX在Opti-MEM培养基中稀释(Gibco；7.25ul LTX/500ul Opti-MEM用于待转染的每个6cm培养皿)，并且将1.25ug DNA添加至500ul在Opti-MEM中稀释的LTX中(例如，PSF-CMV-CRE-CRE重组酶表达载体/6cm培养皿)。然后将1.25ul PLUS试剂添加至每个～500ul DNA-LTX-Opti_MEM样品中，并且在室温孵育5分钟。然后将培养基从在第0天平铺的细胞中去除，并且在5分钟孵育期间用新鲜培养基替换。将DNA-脂质复合物添加至细胞，并且在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育。在第2天，将来自6cm培养皿的CRE转染的细胞通过胰蛋白酶化来收获，并且门控以收集非荧光细胞。非荧光细胞已经经历CRE-lox重组，导致eGFP-BSR盒的去除。非荧光细胞已经经历CRE-lox重组，导致eGFP-BSR盒的去除。可以将非荧光细胞单细胞分选到96孔培养皿中和/或批量(bulk)分选到管中，然后平铺至细胞培养皿(例如6cm培养皿)中。然后当细胞以培养物扩增时，监测细胞的荧光。将未显示荧光的那些单细胞克隆以培养物扩增，用于冷藏和基因组DNA分离。使用以下基于BLoVeL-TTS载体的引物确定适当的CRE-lox重组事件的PCR确认：Lox盒正向：

(AGCCGTGTAACCGAGCATAGtgaagcctgcttttttatactaacttgagcgaa[SEQ ID No.9])

Lox盒反向：

(CTGTTTCCTTCAGCCTGCATGGCCTTGACTAGAGGGTCGACGG[SEQ ID No.10])

显示462bp产物的那些候选物指示eGFP-BSR盒的适当切除，而1,819bp产物指示未发生切除。将具有正确PCR产物的候选物通过PCR进一步测试，以确认感兴趣的DNA元件的存在。

酿酒酵母生物合成通路中的四个ARO基因通过以下修饰合成：1)合成不具有终止密码子的ARO1、ARO2、ARO3基因；2)P2A间隔区在ARO2基因的上游被编码，并且甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸间隔区加上15bp的T2A间隔区在最后一个ARO2氨基酸密码子的下游被编码；3)T2A间隔区在ARO3基因的上游被编码，并且甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸间隔区加上15bp的E2A间隔区在最后一个ARO3氨基酸密码子的下游被编码；以及4)E2A间隔区在ARO4基因的上游被编码，并且多聚腺苷酸化信号在ARO4基因的下游被编码。新的合成聚腺苷酸化位点从pGLuc-Basic_2(NEB)中拷贝。PCR引物被设计为PCR扩增这四个合成的DNA元件以及EF1α启动子(从pEF1hrGFP扩增)，用于N-Fusion克隆到线性化的BLoVeL-TTS递送载体骨架中。所得构建体BLoVeL-TTS_AroPath示于图3中。(在BLoVeL-TTS_AroPath中，存在以下元件：sopA、sopB和sopC＝质粒分配蛋白；SV40pAn＝SV40聚A；TTS＝转录终止信号；attB＝位点特异性重组位点；lox＝位点特异性重组位点；eGFP＝荧光蛋白；Bsr＝杀稻瘟素耐受性基因；repE＝复制起始位点；Ori2＝复制起点；CmR＝氯霉素耐受性基因；poly An＝聚A；EF1alphaPr＝启动子；ARO1、ARO2、ARO3和ARO4＝芳香族氨基酸基因1-4；P2A、T2A和E2A＝自裂解肽。)。将BLoVeL-TTS_AroPath载体转染到包含已经装载了TRP1、TRP2、TRP3、Trp4和TRP5基因的合成染色体的细胞中。

在第0天，将包含合成染色体(hSynC)的受体细胞系(例如HT1080)以～4E4个细胞/24孔培养皿的孔接种，使得孔在第1天～70％汇合，并且在37℃、5％CO₂在适当的培养基(例如，对于HT1080，DMEM+10％FC3)中孵育过夜。在第1天，按照制造商的说明(FisherScientific，具有Plus试剂的Lipofectamine LTX)，将递送载体(例如BLoVeL-TTS_AroPath)和编码重组蛋白的质粒(例如pCXLamIntR)两者转染到HT1080细胞中。转染通常以一式两份进行，以便可以进行药物选择和直接细胞分选的比较。将Lipofectamine LTX在Opti-MEM培养基中稀释(Gibco；1.5ul LTX/50ul Opti-MEM用于待转染的24孔培养皿的每个孔)，并且将250ng DNA添加至50ul在Opti-MEM中稀释的LTX中(例如，125ng BLoVeL-TTS质粒和125ng pCXLamIntR/孔)。将0.25ul PLUS试剂添加至每个～50ul DNA-LTX-Opti_MEM样品中，并且将每个样品在室温孵育5分钟。然后将培养基从第0天铺板的细胞中去除，并且在5分钟孵育期间使用新鲜培养基替换。将DNA-脂质复合物添加至细胞，并且在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育。

在第2-24天，进行药物选择。将来自一式两份24孔的孔的一个孔的细胞胰蛋白酶化并转移至10cm的培养皿中，该培养皿中具有包含药物选择(例如，在5ug/ml的嘌呤霉素或在3ug/ml的杀稻瘟素)的新鲜培养基。然后将细胞在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育，并且监测集落形成。约每72小时替换一次培养基。当形成明显的集落时(约10天)，将每个集落通过玻璃柱分离、胰蛋白酶化并转移至24孔培养皿的孔中。然后将这些“克隆”在培养物中扩增，直到有足够的细胞可用于将克隆置于冷藏中并分离基因组DNA(约2周；PromegaWizard SV Genomic DNA Purification)，用于PCR分析。

可选地，可以将一式两份孔中的细胞胰蛋白酶化，并且置于具有缺乏药物选择的新鲜培养基的6cm培养皿中，并且在37℃、5％CO₂在适当的培养基中孵育。在第3天或第4天，将在6cm培养皿中的细胞胰蛋白酶化并应用于细胞分选仪，以对已经整合了载体并在靶向载体(GFP；BLoVeL-TTS_AroPath)上表达荧光蛋白的荧光细胞进行单细胞分选。包含感兴趣的基因/DNA元件的递送载体的整合通过使用适当的PCR引物产生跨越合成染色体与递送载体(BLoVeL-TTS_AroPath)之间重组位点的独特PCR产物来鉴定。水和宿主基因组DNA(例如HT1080)的阴性对照PCR反应与测试基因组DNA样品一起进行。用来从BLoVeL-TTS_AroPath递送载体整合中扩增独特接点PCR产物的PCR引物是：接点1-预期产物尺寸40 1bp(gcgctaatgctctgttacaggt[SEQ ID No.7]和GGAAAGCTGCCAGTGCCTTG[SEQ ID No.8])。在鉴定具有正确接点PCR产物尺寸的候选克隆后，进行进一步的PCR反应以确认原始装载到递送载体(TRP1、TRP2、TRP3、Trp4和TRP5基因)以及现在位于合成染色体上的感兴趣的DNA元件(例如，ARO1、ARO2、ARO3和ARO4)的存在。注意，伴随着到合成染色体上的第二次装载，第二接点PCR不再是独特的：由BLoVeL-TTS_AroPath和BLoVeL-TTS_TrpPath靶向整合事件两者共有的接点-预期产物尺寸392bp(accgagctgcaagaactcttcctc[SEQ ID No.5]和ctcgccgcagccgtgtaa[SEQ ID No.6])。另外，进行了分支酸的产生的测试。这可以以多种方式确定。例如，可以测试细胞在缺乏氨基酸色氨酸的细胞培养基中生长的能力和与在包含色氨酸的细胞培养基中生长的细胞相比的生长。这些细胞现在具有色氨酸和芳香族氨基酸生物合成通路两者。后一种通路应该产生分支酸底物，用于通过前一种通路产生色氨酸。色氨酸合成的可选的测试可以是用Bridge-it L-色氨酸荧光测定试剂盒(Mediomics，LLC)测定裂解的细胞沉淀物中的色氨酸水平。色氨酸水平在携带色氨酸的独立培养物上以一式三份测量，并且与不具有包含合成染色体的BLoVeL-TTS_AroPath的细胞培养物以及缺乏BLoVeL-TTS-AroPath和BLoVeL-TTS-TrpPath整合事件两者的培养物进行比较。

前述仅仅阐释了本发明的原理。将理解的是，本领域技术人员将能够设计出多种排布形式，尽管本文未明确描述或显示，这些排布形式体现本发明的原理并且被包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域发展而贡献的概念，并且应被解释为不限于此类具体列举的实例和条件。此外，本文中列举本发明的原理、方面和实施方案及其具体实例的所有陈述预期包括其结构和功能等同物两者。另外，预期这样的等同物既包括当前已知的等同物又包括未来开发的等同物，即开发执行相同的功能而不管结构如何的任何元件。因此，本发明的范围并不意图被限制为本文示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。在以下的权利要求书中，除非使用术语“方法(means)”，否则本文列举的特征或要素都不应该被解释为根据35U.S.C.§112,16的方法加功能的限定。

序列表

<110> 爱德华·珀金斯

<120> 用于产生表达生物合成通路的合成染色体的方法及其用途

<130> SYN004PCT

<140> 与本文一起提交的

<141> 2017-04-12

<150> 62/321,711

<151> 2016-04-12

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 自裂解序列

<400> 1

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 2

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 自裂解序列

<400> 2

gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg acct 54

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 自裂解序列

<400> 3

cagtgtacta attatgctct cttgaaattg gctggagatg ttgagagcaa ccctggacct 60

<210> 4

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 自裂解序列

<400> 4

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccct 60

ggacct 66

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 连接接点

<400> 5

accgagctgc aagaactctt cctc 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 连接接点

<400> 6

ctcgccgcag ccgtgtaa 18

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 连接接点

<400> 7

gcgctaatgc tctgttacag gt 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 连接接点

<400> 8

ggaaagctgc cagtgccttg 20

<210> 9

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lox盒

<400> 9

agccgtgtaa ccgagcatag tgaagcctgc ttttttatac taacttgagc gaa 53

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> lox盒

<400> 10

ctgtttcctt cagcctgcat ggccttgact agagggtcga cgg 43

Claims

1.一种用于在受体细胞中构建生物合成通路的方法，所述方法包括：

用合成染色体产生组分转染受体细胞系，所述合成染色体产生组分包括允许靶核酸序列位点特异性整合的核酸序列；

产生具有多于一个位点特异性重组位点的合成的平台染色体；用包含能够实现生物合成通路的多于一个基因的递送载体转染所述受体细胞系，其中所述递送载体包含至少一个位点特异性重组位点；

激活所述合成的平台染色体与所述递送载体之间的位点特异性重组，其中能够实现生物合成通路的所述多于一个基因被装载到所述合成的平台染色体上以产生表达所述生物合成通路的合成染色体；以及

分离包含表达所述生物合成通路的所述合成染色体的受体细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中能够实现生物合成通路的所述多于一个基因包括色氨酸生物合成所必需的基因。

3.如权利要求2所述的方法，其中色氨酸生物合成所必需的基因包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的色氨酸合成所必需的五个基因。

4.如权利要求2所述的方法，其中所述递送载体还包含a)干扰或阻断肿瘤细胞抑制免疫细胞周期进展的能力的一个或更多个基因，b)编码增强免疫细胞活化和生长的因子的一个或更多个基因，或c)增加免疫细胞对发展中肿瘤的特异性的一个或更多个基因。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述递送载体包含a)、b)或c)中的至少两个。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述递送载体包含a)、b)和c)中的所有三个。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

分离表达所述生物合成通路的所述合成染色体；以及

将所述合成染色体转移至第二受体细胞。

8.如权利要求7所述的第二受体细胞。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述第二受体细胞选自通用供体T细胞或患者自体T细胞。

10.如权利要求9所述的第二受体细胞。

11.如权利要求1所述的方法，其中允许位点特异性整合的所述核酸序列包括attP、attB、attL和attR或突变形式的attP、attB、attL和attR。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述递送载体是BAC。

13.合成染色体，所述合成染色体表达权利要求1所述的生物合成通路。

14.受体细胞，所述受体细胞包含表达权利要求1所述的生物合成通路的合成染色体。

15.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

用包含能够实现第二生物合成通路的多于一个基因的第二递送载体转染所述受体细胞系，其中所述第二递送载体包含至少一个位点特异性重组位点；

激活所述合成的平台染色体与所述第二递送载体之间的位点特异性重组，其中能够实现第二生物合成通路的所述多于一个基因被装载到所述合成的平台染色体上以产生表达所述第二生物合成通路的合成染色体；以及

分离包含表达所述第二生物合成通路的所述合成染色体的受体细胞。

16.合成染色体，所述合成染色体表达权利要求15所述的第二生物合成通路。

17.如权利要求15所述的方法，所述方法还包括以下步骤：

分离表达所述第二生物合成通路的合成染色体；和

将表达所述第二生物合成通路的所述合成染色体转移至第二受体细胞。

18.如权利要求15所述的第二受体细胞。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述第二受体细胞选自通用供体T细胞或患者自体T细胞。

20.如权利要求19所述的第二受体细胞。

21.一种用于在受体免疫细胞中构建生物合成通路的方法，所述方法包括：

激活所述合成的平台染色体与所述递送载体之间的位点特异性重组，其中能够实现生物合成通路的多于一个基因被装载到所述合成的平台染色体上以产生表达所述生物合成通路的合成染色体；

分离包含表达所述生物合成通路的所述合成染色体的受体细胞；

分离表达所述生物合成通路的所述合成染色体；以及

将所述合成染色体转移至第二受体细胞。