CN103343148B

CN103343148B - 用改变tdcD酶调控元件的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

Info

Publication number: CN103343148B
Application number: CN201310278997.2A
Authority: CN
Inventors: 马吉银; 贾慧萍; 孟刚; 魏爱英; 马风勇; 李小刚; 杨立鹏
Original assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: NINGXIA EPPEN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2013-07-05
Filing date: 2013-07-05
Publication date: 2016-01-06
Anticipated expiration: 2033-07-05
Also published as: CN103343148A

Abstract

本发明提供了发酵生产L-色氨酸的方法，其包括改造细菌染色体上<i>tdcD</i>基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因（如，<i>tdcD</i>基因）的表达启动能力减弱但不消失；和，用改造的细菌发酵生产L-色氨酸。另外，本发明还提供了由该方法衍生的方法和应用，以及可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

Description

用改变tdcD酶调控元件的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

技术领域

本发明属于氨基酸发酵领域，具体而言，本发明涉及发酵生产l-色氨酸的方法及其衍生的方法和应用，和可以用在这些方法和应用中的多核苷酸、载体和细菌。

背景技术

通过产l-色氨酸的细菌（如，埃希氏菌属的大肠杆菌和棒杆菌属的杆状细菌）发酵来生产l-色氨酸已经得到了产业化应用。这些细菌，可以是从自然界分离的细菌，也可以是通过诱变或基因工程改造获得的细菌，或者两者兼而有之。当前的文献报道中，通过基因工程改造的注意力主要集中在mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因上（参见中国专利85101270、93117586、96111972、200580043246、200710056966、201010598350等），未见为了L-色氨酸生产而关注tdcD酶及其编码基因，更未见对tdcD酶的调控元件加以改造，事实上国际专利WO2012135389公开了生产芳香氨基酸的氧化产物，其中甚至需要额外表达异源的tdc酶。

TdcD酶由tdcD基因编码。在E.coliK12菌株及其衍生菌株（如，W3110菌株）等中，野生型的tdcD基因的核苷酸序列如Genbank登录号AP009048.1中第3263515-3262220位所示，本发明人发现其上游具有调控（尤其是启动子）功能的序列（野生型的调控元件序列）如SEQIDNo：1所示，通过Genbank提供的同源性比较工具，也能够找到其他野生型的tdcD基因的上游调控元件。

本发明人经过长期研究和实践，尤其凭借了一些运气，偶然发现tdcD基因的上游调控元件的改造能够有助于提高l-色氨酸的产量，而且本发明人发现，tdcD基因的调控元件不能简单地提高或敲除，尤其是敲除后将使得细菌生长困难，难以实际应用，因此开发了新的针对tdcD基因的调控元件的方法，以此来提高l-色氨酸的产量，而且更重要的是，该方法与现有改造的大量高产L-色氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，可以叠加提高的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产l-色氨酸。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供新的发酵生产l-色氨酸的方法及其相关的方法，包括相对于未改造细菌提高l-色氨酸的发酵生产量的方法，改造的细菌在发酵生产l-色氨酸中的应用，改造的细菌在相对于未改造细菌提高l-色氨酸的发酵生产量的应用，和/或，改造细菌的方法等。另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的多核苷酸、载体和/或细菌等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了发酵生产l-色氨酸的方法，其包括：

（1）改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产l-色氨酸。

在本文中，术语“改造”指的是是相应被改造的对象发生变化，从而达到一定的效果。改造位于染色体上的基因的手段包括但是不限于，诱变、定点突变、和/或同源重组，优选是后两者。这些技术手段广泛记载于分子生物学和微生物学文献中，有许多甚至已经商品化了。在本发明的具体实施方式中，根据同源重组的原理，采用Addgene公司商品化的pKOV质粒系统来进行改造，将未改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件，改造成能够使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失的新的调控元件。因此，在本文文中，优选改造是通过同源重组进行的改造。

在本文中，术语“下游酶基因”指的是tdcD基因的野生型的调控元件所能调控的编码酶的基因，而且该酶位于该调控元件的下游。所以，该调控原件一般是启动子。优选在本文中，下游酶基因是tdcD基因。

本发明人经过长期研究发现，使得tdcD基因的野生型的调控元件被敲除（替换成其他无关序列），将造成细菌本身生长困难，甚至无法生长/繁殖（而只是使tdcD酶的表达量消失却在一些培养基中能正常生长）。因此，本发明的“改造”要相对于未改造的细菌，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失，优选减弱20%~95%，更优选减弱50%~90%，更加优选减弱70%~85%，如减弱15%、20%、25%或30%。在本文中，该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失可以通过其下游酶基因（如，tdcD基因）所编码的酶的表达量降低但不消失来表征，优选表达量降低20%~95%，更优选降低50%~90%，更加优选降低70%~85%，如降低15%、20%、25%或30%。

相应地，本发明还提供了其他应用或方法。例如，在第二方面，本发明提供了提高l-色氨酸的发酵量的方法，其包括：

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵产生l-色氨酸。

l-色氨酸作为细菌的重要代谢产物，大多数细菌或多或少都能够发酵产生一定量的l-色氨酸。尽管低产L-色氨酸的细菌不适合有经济效益地生产l-色氨酸，但是通过本发明的方法，仍旧能提高l-色氨酸的发酵量，仍旧可以供对经济效益不敏感的地方使用。当然，在本文中，优选细菌是高产L-色氨酸的细菌。通过本发明的方法，可以进一步提高其产量。另外，在本发明的方法或应用中，除了改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件以外，可以不再进行其他改造，如甚至可以不改造细菌染色体上的野生型的tdcD基因。例如，尤其对于高产L-色氨酸的细菌来说，仅仅改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件。

又如，在第三方面，本发明提供了改造获得的细菌在发酵生产l-色氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件而获得，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失。

改造获得的细菌可以单独应用于发酵生产l-色氨酸中，也可以和其他产L-色氨酸的细菌混合发酵生产l-色氨酸，或者以其他方式应用于发酵生产l-色氨酸中。在本文中，如无特别限定（如未以“改造获得”来限定），术语“细菌”是未改造或改造前的细菌，其染色体的tdcD基因座位后的调控元件是野生型的调控元件。

还如，在第四方面，本发明提供了改造获得的细菌在提高l-色氨酸的发酵量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件而获得，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失。

在本文中，细菌优选是埃希氏菌属细菌，更优选是大肠杆菌，如大肠杆菌K-12菌株的后续菌株，包括W3110衍生的菌株。由于现有技术几乎没有在l-色氨酸生产/发酵中关注过细菌的tdcD基因及其调控元件，改造的染色体的基因大多集中于mtr、aroP、tnaA、trpB、gnd以及traB等基因位点上，甚至都不关注调控元件，因此现有技术中的细菌（尤其是埃希氏菌属细菌，如大肠杆菌）没有被报道不带有野生型的调控元件。在本发明的具体实施方式中，无论高产还是低产L-色氨酸的细菌，只要带有tdcD基因的野生型的调控元件，通过本发明的方法进行改造，就能使得L-色氨酸的发酵量得到提高。

更本质地，在第五方面，本发明提供了改造细菌的方法，其包括改造所述细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失。

本发明第五方面的方法改造而获得的细菌能够用于发酵生产或产生L-色氨酸。因此，在第六方面，本发明提供了本发明第五方面的方法改造而获得的细菌。

埃希氏菌属细菌（如，大肠杆菌）中有报道的tdcD基因的野生型的调控序列，基本上其核苷酸序列都如SEQIDNo：1所示，而且本发明的具体实施方式也证实了在多种染色体上带有如SEQIDNo：1所示的野生型的调控序列的细菌上实施本发明的改造，都能提高L-色氨酸的发酵量。所以优选在本文中，所述野生型的调控元件的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示。

经过本发明人研究和证实，更优选地，在本文中，所述改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件是改造成不具有核苷酸序列如SEQIDNo：1所示的调控元件，优选，优选替换为弱转录启动子，最优选替换成核苷酸序列如SEQIDNo：2所示的弱转录启动子。

另外，本发明还提供了可以用于上述方法中的引物等中间体物质。例如，在第七方面，本发明提供了引物，其多核苷酸选自，

5’-ACTCATAATCACCCAGCCCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3’，和

5’-GATAAATACCGCGAAACAGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3’。

又如，在第八方面，本发明提供了引物对，其包含下述多核苷酸：

5’-ACTCATAATCACCCAGCCCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3’，和

5’-GATAAATACCGCGAAACAGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3’。

本发明的有益效果在于，开辟并且实践证明了新的提高L-色氨酸的发酵量的方式，对于高产和低产L-色氨酸的细菌都适用，而且与现有改造的大量高产L-色氨酸的细菌的染色体改造位点没有冲突，观察到了可以叠加提高产量的效果，从而在实践上可用于细菌发酵生产l-色氨酸，便于推广应用。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。

另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南（第3版）》（科学出版社）、《微生物学实验（第4版）》（高等教育出版社）以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。

构建实施例用转录活性较弱的启动子替换tdcD的上游调控序列

通过对大肠杆菌中tdcD的上游序列分析，我们设计了弱转录启动子（序列如SEQIDNo：2所示)并委托中科院微生物所合成并构建入pMD-19T质粒（可购自大连宝生物公司）中，来替换菌株tdcD基因ORF上游337bp的野生型的启动子区域（序列如SEQIDNo：1所示），以减弱野生型tdcD基因的表达强度。

具体而言，以抽提的野生型大肠杆菌E.coliK12W3110基因组染色体为模板，以引物P1和P2、P3和P4分别进行PCR扩增，获得长度分别为290bp和392bp的两条DNA片段（分别命名为Up和Down片段）。以含有上述弱转录启动子的pMD-19T质粒，以P5和P6进行PCR扩增，获得长度为161bp的弱转录启动子片段（命名为P片段）。其中，PCR按如下方式进行：94℃变性30秒，52℃退火30秒，以及72℃延伸30秒（30个循环）。

将上述三条DNA片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述Up和P片段混合为模板，以P1和P6为引物，通过OverlapPCR扩增长约451bp的片段(命名为Up-P片段)。其中，PCR按如下方式进行：94℃变性30秒，52℃退火30秒，以及72℃延伸30秒（30个循环）。

将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的Up-P和Down片段混合为模板，以P1和P4为引物，通过OverlapPCR扩增长约843bp的片段(命名为Up-P-down片段)。其中，PCR按如下方式进行：94℃变性30秒，52℃退火30秒，以及72℃延伸60秒（30个循环）。

上述所用的引物序列如下：

P1:5’-CGCGGATCCGGAGTGATGGCGGTGGAATAG-3’（下划线为BamHI酶切位点）

P2:5’-GGTTTCTTAGACGTCGGATTGGGCTGGGTGATTATGAGT-3’

P3:5’-ATCAGCAGGACGCACTGACCTGTTTCGCGGTATTTATC-3’

P4:5’-ATTGCGGCCGCTTTGCCCGCTATTTTCTGG-3’（下划线为NotI酶切位点）

P5:5’-ACTCATAATCACCCAGCCCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3’

P6:5’-GATAAATACCGCGAAACAGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3’

将琼脂糖凝胶电泳分离纯化后的Up-P-down片段和pKOV质粒（可购自Addgene公司）分别用BamHI/NotI双酶切，经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后连接，获得用于导入的载体pKOV-Up-P-Down，并将载体pKOV-Up-P-Down送测序公司进行测序鉴定，表明其含有正确的弱转录启动子序列，保存备用。

将构建好的pKOV-Up-P-Down质粒分别电转化入几乎不产L-色氨酸的E.coliK12W3110菌株（可购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITEBiologicalResourceCenter,NBRC)）和高产L-色氨酸的E.coli1-1703菌株（可购自中科院微生物研究所，其为经E.coliK12W3110诱变突变得到的L-色氨酸生产工程菌，经测序保留了野生型的tdcD的上游序列），于30℃、100rpm，在LB培养基中复苏2h后，根据Addgene公司的pKOV质粒的商品指南，挑选出同源重组阳性的单克隆，经测序确认其染色体上的tdcD基因的上游启动子被替换为弱转录启动子，分别得到tdcD启动子突变的（低/高产L-色氨酸）大肠杆菌，分别记为YPT-W-101（来自E.coliK12W3110菌株）和YPT-W-111（来自E.coli1-1703）。经检测，这两个菌株的tdcD酶的等菌体量表达活性分别仅保留23%和17%，均有显著的下降。

效果实施例色氨酸发酵实验

将E.coliK12W3110菌株和E.coli1-1703以及实施例1制备的2种菌株分别接种在25mL表1所述的种子培养基中，于37℃、220rpm培养8h。然后取1mL种子培养基的培养物接种在25mL表1所述的发酵培养基中，于37℃、220rpm培养培养36h。当培养完成时，通过HPLC测定l-色氨酸的产生。

表1培养基配方

成分	种子培养基配方（g/L）	发酵培养基配方（g/L）
			葡萄糖	20	7.5
磷酸氢二钾	5.6	7.5
			七水硫酸镁	1.6	2
柠檬酸钠	1.6
			柠檬酸		2
酵母提取物	1.1	1
			硫酸铵	1.2	1.6
维生素B1	0.0013	0.0013
			生物素	0.003	0.0003
硫酸亚铁	0.028	0.075
			硫酸锰	0.012	0.0016
硫酸钠		0.05
			硫酸锌		0.003
氯化钴		0.0004
			硫酸铜		0.002

结果如表2所示，通过本发明的构建，几乎不产色氨酸的菌株，提高L-色氨酸的产量的提高非常可观，尽管绝对提高量比不过高产菌株，但是相对提高量却远远高于高产菌株。由于我们敲除该上游序列之后，菌体几乎不生长，而保留该上游序列并且敲除tdcD基因（另文详细公开），菌体生长正常并且能提高色氨酸产量，因此预计是由于一些依赖于tdcD的代谢途径代偿到产色氨酸相关的途径上，从而有助于l-色氨酸产量的提高，而且该上游序列对其他基因的调控也有必要的调控作用，因而只可以减弱不能敲除，具体对其他基因表达的影响有待于进一步研究。

表2色氨酸发酵量

菌株	发酵量（g/L）	提高比例（%）	菌株	发酵量（g/L）	提高比例（%）
						E. coli K12 W3110	0.4	-	E. coli 1-1703	11.3	-
YPT-W-101	0.7	75.0	YPT-W-111	13.0	15.0

<110>宁夏伊品生物科技股份有限公司

<120>用改变tdcD酶调控元件的细菌发酵生产L-色氨酸的方法

<130>CN

<160>2

<170>PatentInversion3.5

<210>1

<211>337

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>1

tccagcacgacccgccggggtcgaagcgtctgcaatgacgcctttattcgatgcaatttc60

cataatttctcgctcaatattttgtagggcttattatttttttccgagccgcatcaaggc120

gatatgcggtctacgtttttgcaggcgagttattagaataaagaaatgatacgcgcgagg180

tcagagaaaatcttcacaatcaagactttgaaataacggagatggataagaattttctac240

taaattaatcgcaggagaatattcattctctatttgcggcagatcacaaaaaaaaggtgc300

acatttgtgcacccaaggatgaaagctgacagcaatg337

<210>2

<211>161

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

caatccgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatc60

acgaggccctttcgtcttcacctcgagtccctatcagtgatagagatggacatccctatc120

agtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc161

Claims

1.发酵生产L-色氨酸的方法，其包括：

（1）改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失，其中，所述野生型的调控元件的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；和，所述改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件是改造成核苷酸序列如SEQIDNo：2所示的调控元件；和，

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵生产L-色氨酸。

2.权利要求1所述的方法，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。

3.权利要求2所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。

4.权利要求1所述的方法，其中，所述下游酶基因是tdcD基因。

5.提高L-色氨酸的发酵量的方法，其包括：

（2）用步骤（1）改造而得到的细菌发酵产生L-色氨酸。

6.权利要求5所述的方法，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。

7.权利要求6所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。

8.权利要求5所述的方法，其中，所述下游酶基因是tdcD基因。

9.改造获得的细菌在发酵生产L-色氨酸中的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件而获得，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失，其中，所述野生型的调控元件的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；和，所述改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件是改造成核苷酸序列如SEQIDNo：2所示的调控元件。

10.权利要求9所述的应用，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。

11.权利要求10所述的应用，其中，所述细菌是大肠杆菌。

12.权利要求9所述的应用，其中，所述下游酶基因是tdcD基因。

13.改造获得的细菌在提高L-色氨酸的发酵量的应用，其中，所述改造获得是改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件而获得，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失，其中，所述野生型的调控元件的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；和，所述改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件是改造成核苷酸序列如SEQIDNo：2所示的调控元件。

14.权利要求13所述的应用，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。

15.权利要求14所述的应用，其中，所述细菌是大肠杆菌。

16.权利要求13所述的应用，其中，所述下游酶基因是tdcD基因。

17.改造细菌的方法，其包括改造所述细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件，使改造获得的细菌的该调控元件对其下游酶基因的表达启动能力减弱但不消失，其中，所述野生型的调控元件的核苷酸序列如SEQIDNo：1所示；和，所述改造细菌染色体上tdcD基因的野生型的调控元件是改造成核苷酸序列如SEQIDNo：2所示的调控元件。

18.权利要求17所述的方法，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。

19.权利要求18所述的方法，其中，所述细菌是大肠杆菌。

20.权利要求17所述的方法，其中，所述下游酶基因是tdcD基因。

21.权利要求17-20之任一所述的方法改造而得到的细菌。

22.引物，其多核苷酸选自，

5’-ACTCATAATCACCCAGCCCAATCCGACGTCTAAGAAACC-3’，和

5’-GATAAATACCGCGAAACAGGTCAGTGCGTCCTGCTGAT-3’。