CN116254281A - 生产3-脱氢莽草酸的重组微生物及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及生产3‑脱氢莽草酸(DHS)的重组微生物及其构建方法与应用。具体的，本公开涉及用于DHS生产的重组微生物，其具有增强的或者降低/消失的特定酶活性和/或其编码基因的表达水平。与此同时，本公开还进一步记载了利用前述重组微生物制备DHS的用途。本公开记载的重组微生物有效地提高了DHS的产量与转化率，进而实现在简单发酵培养基的条件下缩短发酵周期，降低DHS生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及生产3-脱氢莽草酸的重组微生物及其构建方法，以及前述重组微生物在制备3-脱氢莽草酸中的应用。
背景技术
3-脱氢莽草酸(3-dehydroshikimate，DHS)是微生物及植物体内芳香族氨基酸生物合成代谢途径中的一种重要中间产物，对维系生物正常发育、完成代谢过程具有重要作用。DHS可被进一步催化形成莽草酸(Shikimate)及其芳香族氨基酸和衍生物，以及原儿茶酸(Protocatechuate)、香草醛(Vanillin)、儿茶酚(Catechol)、没食子酸(Gallate)、已二酸(Adipate)、水杨酸(Salicylic acid)等一系列重要化工产品。利用3-脱氢莽草酸合成这些化工产品可以避免有毒的苯和甲苯等原料的使用，减少对人体和环境影响。与此同时，3-脱氢莽草酸还是一种十分有效的抗氧化剂，其活性甚至优于没食子酸、没食子酸丙酯(Propyl gallate)、对苯二酚(BHQ)、丁羟甲苯(BHT)、生育酚(α-tocopherol)等一些商品化的抗氧化剂，具有重要的应用价值。此外，DHS作为一种小分子手性化合物，还可以作为药物合成中非常有潜力的合成中间体。因此，研究DHS的生产具有重要的应用前景。
目前，利用微生物生产DHS最主要报道的文献有以下3篇现有技术文献。
现有技术文献1在突变aroE的E.coli AB2834中利用质粒表达系统过表达tktA/glf/glk/aroF/aroB，5L发酵罐放大发酵DHS产量达到69g/L。前述发酵过程中的发酵培养基中包含如下组分：磷酸氢二钾7.5g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，一水柠檬酸2.1g/L，芳香族氨基酸和维生素，微量元素以及葡萄糖。其通过过表达tktA增加DHS前体E4P供给，通过PTS系统替换为glf/glk增加DHS另一个前体PEP供给，通过突变aroE阻断DHS降解(通过添加复杂培养基成分维持生长)以及通过过表达aroFfbr/aroB强化DHS合成途径。
但是，现有技术文献1的技术方案存在如下缺陷：(1)发酵培养基成分复杂(需要添加多种芳香族氨基酸以及维生素等必须成分)：由于在大肠杆菌中突变aroE(相当于敲除aroE)时，细胞因为无法合成生长必需的芳香族氨基酸导致细胞无法正常生长，需要额外添加复杂的营养物质维持细胞生长；(2)发酵过程繁琐：由于需要额外添加芳香族氨基酸以及维生素，因此需要进行过滤除菌操作；(3)遗传不稳定性以及增加细胞代谢负担：质粒系统过表达相关基因时，会导致细胞除了维持正常生长还需要承担质粒系统带来的代谢负担；(4)DHS产量与转化率不高：因为细胞内代谢网络的复杂性以及刚性，利用质粒系统过表达相关基因并不会充分扰动代谢网络偏向DHS的生物合成，进而导致碳源-葡萄糖等仅有一部分流向DHS合成途径；(5)生产成本较高：需要添加大量的芳香族氨基酸以及微量元素、DHS产量与转化率低。
现有技术文献2公开了在敲除aroE的E.coli AB2834中先后敲除tyrR/ptsG/pykA，基因组水平上过表达aroB/aroD/ppsA/galP/aroG/aroF，在7L发酵罐中发酵120小时产量达到目前文献报道的最高水平117g/L。前述发酵过程中的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖30g/L，甘油10g/L，酵母抽提物15.75g/L，胰蛋白胨21.375g/L，磷酸氢二钾5.25g/L，七水硫酸镁1g/L，柠檬酸0.8g/L，1mL/L微量元素以及200μg/L盐酸硫胺素。前述发酵过程中的发酵培养基包含如下组分：600g/L葡萄糖，100g/L酵母抽提物，20g/L七水硫酸镁，以及微量元素，转化率为0.39g/g葡萄糖。其通过PTS系统替换为glf/glk、过表达ppsA、敲除pykA增加DHS前体PEP供给，通过敲除aroE阻断DHS降解(通过添加复杂培养基成分维持生长)以及通过过表达aroF/aroG/aroB/aroD强化DHS合成途径。
但是，现有技术文献2的技术方案同样存在如下缺陷：(1)发酵培养基成分复杂(需要添加大量的酵母抽提物等复杂培养基成分)：由于在大肠杆菌中敲除aroE，细胞因为无法合成生长必需的芳香族氨基酸导致细胞无法正常生长，需要额外添加复杂的营养物质维持细胞生长；(2)发酵所需的流加培养基成分复杂：敲除aroE导致的维持细胞生长所需；(3)发酵周期过长：发酵120小时，可能是由于流加培养基每次流加时酵母抽提物含量低；(4)DHS转化率不高：在发酵过程中，除了葡萄糖以外，还存在甘油、胰蛋白胨以及酵母抽提物等可作为碳源的的营养物质，而现有技术文献2中仅报道了DHS对葡萄糖的转化率(0.39g/g)；(5)生产成本高：发酵培养基中大量的复杂培养基成分(酵母抽提物、胰蛋白胨)、发酵周期长、DHS转化率低。
现有技术文献3公开的技术方案中，包括在E.coli ATCC8739中利用杂合启动子元件(P1)表达aroE(而非敲除，避免发酵培养基中添加复杂培养基成分)，敲除tyrR/ptsI，调控aroFfbr表达(P2)过表达tktA(P3)，组合调控大肠本底基因glk/galP表达、弱化pykF/pykA/pgi表达(P1)，实现了大肠杆菌在简单无机盐发酵培养基中发酵52小时产量达到94.4g/L，转化率为32.65％M/M。其通过PTS系统替换为glf/glk、同时弱化pykA/pykF增加DHS前体PEP供给，通过基因组过表达tktA增加DHS前体E4P供给，通过弱化aroE积累DHS的同时维持细胞生长，调控aroFfbr表达强化DHS合成途径。
但是，现有技术文献3同样存在转化率不够高，以及生产成本不够低的缺陷。
总之，上述现有技术文献中所公开的技术方案虽然可以生产DHS，但其生产成本仍然较高，并且其生产DHS的转化率仍然有待提高。
现有技术文献
1.Altered Glucose Transport and Shikimate Pathway Product Yields inE.coli，Jian Yi et.al.，BIOTECHNOLOGY PROGRESS，(2003)
2.Cell Factory Design and Culture Process Optimization forDehydroshikimate Biosynthesis in Escherichia coli，Si-Sun Choi et.al.，Front.Bioeng.Biotechnol.，(2019)
3.CN 107619817 A
发明内容
发明要解决的问题
鉴于现有技术中存在的问题，本公开提供了新的能够生产3-脱氢莽草酸菌株及其构建方法与应用。本公开记载的技术方案通过系统优化DHS合成过程生成CO2的代谢反应以减少碳损失，提高DHS转化率，进而实现在简单发酵培养基的条件下缩短发酵周期，降低DHS生产成本。
用于解决问题的方案
本公开提供了如下技术方案。
(1)一种用于3-脱氢莽草酸生产的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，具有如下(a)、(b)、(c)所示的特性：
(a)增强的磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(b)增强的磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和
(c)降低或消失的乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
(2)根据(1)所述的重组微生物，其中，在野生型微生物或出发菌株中，
插入编码磷酸转酮酶的基因，以增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
在起始磷酸乙酰基转移酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；或
敲除编码乙酸激酶的基因，以降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
其中，所述调控元件P3的序列如SEQ ID NO：1所示。
(3)根据(1)-(2)任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(d)所示的特性：
(d)增强的脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，在起始脱氢奎尼酸合成酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，编码所述脱氢奎尼酸合成酶基因的核酸序列如SEQ IDNO：11所示。
(4)根据(3)所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(e)所示的特性：
(e)降低或消失的丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，将野生型微生物或出发菌株中表达丙酮酸激酶的基因敲除，以使得野生型微生物或出发菌株中丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平降低或消失。
(5)根据(4)所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(f)、(g)、(h)、(j)或(k)所示的特性：
(f)降低或消失的丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(g)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，以及在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；
(h)降低或消失的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(j)降低或消失的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，增强的NAD(P)依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，增强的葡萄糖-6-磷酸异构酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，和降低或消失的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(k)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和降低或消失的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，对于(f)，在起始丙酮酸脱氢酶E1翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为TTG，以降低或消失丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，对于(h)，在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，对于(j)，将野生型微生物或出发菌株中表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因敲除，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，以降低或消失甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和在起始葡萄糖-6-磷酸异构酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P2，或进一步将所述调控元件P2的起始密码子由ATG突变为GTG。
在一个具体的实施方式中，对于(k)，在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，所述编码Esal蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码EsaRI70V蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述PeasR-C启动子的核酸序列如SEQID NO：4所示；所述调控元件P1的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述调控元件P2的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。
(6)一种用于3-脱氢莽草酸生产的重组微生物的制备方法，其中，所述方法包含如下步骤：
(a1)相较于野生型微生物或出发菌株，增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤；和
(b1)相较于野生型微生物或出发菌株，增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤；和
(c1)相较于野生型微生物或出发菌株，降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤。
(7)根据(6)所述的重组微生物的制备方法，其中，在野生型微生物或出发菌株中，
插入编码磷酸转酮酶的基因，以增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
在起始磷酸乙酰基转移酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；或
敲除编码乙酸激酶的基因，以降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
其中，所述调控元件P3的序列如SEQ ID NO：1所示。
(8)根据(6)-(7)任一项所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法还包含如下步骤：
(d1)增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤。
在一个具体的实施方式中，在起始脱氢奎尼酸合成酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
(9)根据(8)所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法还包含如下步骤：
(e1)敲除或敲减所述重组微生物中编码丙酮酸激酶基因的步骤。
在一个具体的实施方式中，将野生型微生物或出发菌株中表达丙酮酸激酶的基因敲除，以使得野生型微生物或出发菌株中丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平降低或消失。
(10)根据(9)所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法还包含如下步骤：
(f1)敲除或敲减所述重组微生物中编码丙酮酸脱氢酶E1基因的步骤；
(g1)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，以及在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列的步骤；
(h1)敲除或敲减所述重组微生物中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的步骤；
(j1)敲除或敲减所述重组微生物中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，增强NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，和敲除或敲减所述重组微生物中编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的步骤；
(k1)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和敲除或敲减所述重组微生物中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的步骤。
在一个具体的实施方式中，对于(f1)，在起始丙酮酸脱氢酶E1翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为TTG，以降低或消失丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，对于(h1)，在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，对于(j1)，将野生型微生物或出发菌株中表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因敲除，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，以降低或消失甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和在起始葡萄糖-6-磷酸异构酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P2，或进一步将所述调控元件P2的起始密码子由ATG突变为GTG。
在一个具体的实施方式中，对于(k1)，在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
在一个具体的实施方式中，所述编码Esal蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码EsaRI70V蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述PeasR-C启动子的核酸序列如SEQID NO：4所示；所述调控元件P1的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述调控元件P2的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。
(11)菌株，其中，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.22068，CGMCC No.22069，CGMCCNo.22070或CGMCC No.24671。
(12)(1)-(5)任一项所述的重组微生物或(11)所述的菌株在生产3-脱氢莽草酸中的应用。
(13)一种生产3-脱氢莽草酸的方法，其中，包括：以葡萄糖为底物，利用(1)-(5)任一项所述的重组微生物或权利要求11所述的菌株进行发酵反应的步骤。
(14)根据(13)所述的生产3-脱氢莽草酸的方法，其中，所述方法还包括在培养基中添加酵母抽提物的步骤。
在一个具体的实施方式中，所述方法还包括在所述发酵反应结束后，从所述发酵反应液中分离3-脱氢莽草酸的步骤。
发明的效果
在一个具体的实施方式中，通过增加E4P的表达，进而减少CO2的释放，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，通过引入无碳损失、非天然的AccoA合成途径并增加E4P供给，减少了CO2的释放，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，为了解除DHS合成途径限制，通过优化aroB的表达的方式，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，在解除DHS合成途径限制，增加E4P供给的情况下，进一步增加PEP的供给(敲除pyk)，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，利用杂合组成型启动子元件P1以及优化起始密码子(ATG变为TTG)调控aceE的表达，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，利用群体感应动态调控aceE表达，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，在敲除zwf之后，调控pgi的表达，组合调控gapN以及gapA表达平衡NADPH/NADP+，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，通过弱化zwf表达，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
在一个具体的实施方式中，综合aceE的动态调控以及zwf的弱化表达，制备得到的菌株有效地提高了DHS的产量与转化率。
附图说明
图1示出了本公开采用的3-脱氢莽草酸(DHS)的生物合成途径的原理示意图。其中，图1中涉及的化合物、酶或者编码前述酶的基因的含义如下：zwf：编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)的基因(GenBank ID：946179)；Glucose：葡萄糖；G6P：葡萄糖-6-磷酸；Pgi：编码葡萄糖-6-磷酸异构酶(EC 5.3.1.9)的基因(GenBank ID：948535)；F6P：果糖-6-磷酸；E4P：赤藓糖-4-磷酸；fxpk：编码磷酸转酮酶(EC 4.1.2.9)的基因(GenBank ID：56674845)；tktA：编码转酮醇酶(EC 2.2.1.1)的基因(GenBank ID：947420)；DHS：3-脱氢莽草酸；gapA：编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.12)的基因(GenBank ID：947679)；gapN：编码NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(EC 1.2.1.9)的基因(GenBank ID：66817864)；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；ppsA：编码磷酸烯醇丙酮酸合酶(EC 2.7.9.2)的基因(GenBankID：946209)；pyk：编码丙酮酸激酶(EC 2.7.1.40)的基因(GenBank ID：946179)；Pyr：丙酮酸；aroB：编码脱氢奎尼酸合成酶(EC 4.2.3.4)的基因(GenBank ID：947927)；aroF：编码3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(EC 2.5.1.54)的基因(GenBank ID：947084)；aroE：编码3-脱氢莽草酸脱氢酶(EC 1.1.1.25)的基因(GenBank ID：947776)；aceE：编码丙酮酸脱氢酶E1(EC 1.2.4.1)的基因(GenBank ID：944834)；AccoA：乙酰辅酶A；pta：编码磷酸乙酰基转移酶(EC 2.3.1.8)的基因(GenBank ID：946778)；Acetate：乙酸；AcP：乙酰磷酸；ackA：编码乙酸激酶(EC 2.7.2.1)的基因(GenBank ID：946775)。
图2示出了通过摇瓶发酵菌株WJ060、GT10、GT12以及GT14的发酵结果。
图3示出了通过5L发酵罐放大发酵菌株GT14的发酵结果。
图4示出了通过摇瓶发酵菌株GT14、GT52以及GT58的发酵结果。
图5示出了通过5L发酵罐放大发酵菌株GT52的发酵结果；其中，图5中的a为不添加5g/L酵母抽提物的结果；图5中的b为添加5g/L酵母抽提物的结果。
图6示出了菌株GT14、GT23以及GT49的发酵结果；其中，图6中的a为前述菌株摇瓶发酵的结果；图6中的b为菌株GT49的发酵结果；图6中的c为菌株GT23的发酵结果。
图7示出了菌株GT60的发酵结果；其中，图7中的a为前述菌株摇瓶发酵的结果；图7中的b为不添加5g/L酵母抽提物的结果；图7中的c为添加5g/L酵母抽提物的结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
如本公开所使用的，尽管可以使用其他有机或无机催化剂，但术语“转化(converting)”是指主要由一种或多种的多肽(酶)催化从一个分子到另一个分子的化学转化；其也可以指期望产物的摩尔量与限量底物的摩尔量之间的比率(以％为单位)
如本公开所使用的，术语“多肽”、“酶”、“多肽或酶”、“多肽/酶”、“蛋白”具有相同的含义，其在本公开中可以互换。前述术语是指一种由和很多氨基酸通过肽键组成的聚合物，聚合物可以由任意长度的氨基酸形成，其可能含有或可能不含有如磷酸基和甲酰基的修饰。
如本公开所使用的，术语“基因表达盒”是包含目标基因，与调控目标基因表达的调控元件的重组表达元件。在一些实施方式中，目标基因是目标多肽的编码基因。在一些实施方式中，调控元件是用于起始编码基因转录的启动子元件。在一些实施方式中，调控元件还可以包含增强子、沉默子、绝缘子等元件。
如本公开所使用的，术语“表达”包括涉及RNA产生及蛋白产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
如本公开所使用的，术语“启动子”是指一种核酸分子，通常位于目标基因编码序列的上游，为RNA聚合酶提供识别位点，并位于mRNA转录起始位点的5’方向的上游。它是不被翻译的核酸序列，RNA聚合酶与这一核酸序列结合后启动目标基因的转录。在核糖核酸(RNA)的合成中，启动子可以和调控基因转录的转录因子产生相互作用，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度，包含核心启动子区域和调控区域，就像“开关”，决定基因的活动，继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。
依照控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子。强启动子包括但不限于如本公开所使用的P3启动子，以及T7启动子等现有技术中已知的强启动子。弱启动子包括但不限于如本公开所使用的P1启动子。在本公开中，P2启动子的强度位于P3启动子和P1启动子之间。
如本公开所使用的，术语“微生物”是肉眼难以观测的微小生物的总称，包括细菌、真菌等等。由于微生物的表面积与体积比很大，能够快速与外界环境进行物质交换，产生代谢产物。本公开中的微生物特指能够发酵培养，产生蛋白、糖类、脂质、氨基酸、核苷酸等代谢产物的发酵微生物。
如本公开所使用的，术语“重组微生物”是以基因工程方法进行重组，所得到的改造的微生物。实施方案包括但不限于引入重组基因，对微生物的内源基因进行敲除、敲减处理等操作。其中，术语“重组基因”是并非天然存在的基因，重组基因包括可操作地连接到表达控制序列上的蛋白质编码序列。实施方案包括但不限于引入微生物的外源基因、可操作地连接到外源启动子的内源蛋白质编码序列和具有经修改的蛋白质编码序列的基因。重组基因保存在微生物的基因组、微生物中游离的质粒或微生物中的噬菌体上。
在一些实施方式中，重组微生物内降低或消失的蛋白活性、降低或消失的蛋白编码基因的表达水平、降低或消失的酶活性、降低或消失的酶编码基因的表达水平，包括以下述基因工程的方法改造得到的重组微生物：向微生物的细胞中引入弱启动子、弱核糖体结合位点，对蛋白、酶的编码基因进行基因敲除或敲减，向蛋白、酶的编码基因中插入随机片段使蛋白、酶的活性丧失。
在一些实施方式中，重组微生物内增强的蛋白活性、增强的蛋白编码基因的表达水平、增强的酶活性、增强的酶编码基因的表达水平，包括以下述基因工程的方法改造得到的重组微生物：向微生物的细胞中引入强启动子、强核糖体结合位点，引入非整合型的蛋白、酶的重组表达载体，引入染色体整合型的蛋白、酶的重组表达载体。
如本公开所使用的，术语“出发菌株”是选择用于相对于在后的基因工程改造步骤中的在先菌株。换言之，“出发菌株”是指每一步改造前的对照菌株。示例性的，例如GT52菌株，是以GT14作为出发菌株，P1调控aceE表达构建得到的。
如本公开所使用的，术语“野生型微生物”是指未进行任何基因编辑的原始微生物。
在一个具体的实施方式中，本公开采用的WJ060菌株，其保藏号为CGMCCNo.14602，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2017年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
在一个具体的实施方式中，本公开采用的GT14菌株，其保藏号为CGMCC No.22068，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2021年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
在一个具体的实施方式中，本公开采用的GT49菌株，其保藏号为CGMCC No.24671，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2022年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
在一个具体的实施方式中，本公开采用的GT52菌株，其保藏号为CGMCC No.22069，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2021年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
在一个具体的实施方式中，本公开采用的GT60菌株，其保藏号为CGMCC No.22070，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，于2021年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)。
如本公开所使用的，术语“可操作地连接”是指如下的构造：调控序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该调控序列指导该编码序列的表达。示例性的，所述调控序列可以选自启动子和/或增强子编码的序列。
如本公开所使用的，术语“内源的”指在生物体或细胞内自然表达或产生的多核苷酸、多肽或其他化合物。也就是说，内源性多核苷酸、多肽或其他化合物不是外源的。例如，当细胞最初从自然界分离时，细胞中存在一种“内源性”多核苷酸或多肽。
如本公开所使用的，术语“外源的”指在需要表达的特定细胞或有机体中天然发现或表达的任何多核苷酸或多肽。外源多核苷酸、多肽或其他化合物不是内源性的。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一个具体的实施方式中，术语“突变”是指“取代”。
在一个实施方式中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”。在本公开中，术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的，术语“保守置换”涉及用具有类似侧链的氨基酸残基替换氨基酸残基。本领域已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，并且包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸和谷氨酸)、不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、和半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)、β-支链(例如苏氨酸、缬氨酸和异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸)。如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的，术语“载体”指的是DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的DNA序列，从而在合适的宿主中表达目的基因。“重组表达载体”指用于表达例如编码所需多肽的多核苷酸的DNA结构。重组表达载体可包括，例如包含i)对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；ii)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及iii)适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。重组表达载体以任何合适的方式构建。载体的性质并不重要，并可以使用任何载体，包括质粒、病毒、噬菌体和转座子。用于本公开的可能载体包括但不限于染色体、非染色体和合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒以及从质粒和噬菌体DNA的组合中衍生的载体，来自如牛痘、腺病毒、鸡痘、杆状病毒、SV40和伪狂犬病等病毒的DNA。
如本公开所使用的，术语“转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙(CaPO4)沉淀法、氯化钙(CaCl2)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。
本公开的重组微生物的培养可以根据本领域的常规方法进行，包括但不限于孔板培养、摇瓶培养、批次培养、连续培养和分批补料培养等，并可以根据实际情况适当地调整各种培养条件如温度、时间和培养基的pH值等。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
在本公开中，相关元件的序列如下：
P3元件的核酸序列如下所示：
TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCGTATTGTTAGCATGTACGTTTAAACCAGGAAACAGCT(SEQ ID NO：1)
EsaI元件的核酸序列如下所示：
ATGCTGGAACTGTTTGATGTTTCATACGAAGAACTGCAGACCACCCGTAGCGAAGAACTGTATAAACTGCGTAAAAAGACCTTTTCCGATCGTCTGGGTTGGGAAGTGATTTGTTCACAGGGTATGGAAAGCGATGAATTTGATGGTCCGGGTACC(SEQ ID NO：2)
EsaRI70V元件的核酸序列如下所示：
ATGTTTAGCTTTTTTCTGGAAAACCAGACCATTACCGATACCCTGCAGACCTATATTCAGCGCAAACTGAGCCCGCTGGGTAGCCCGGATTATGCATATACCGTTGTTAGCAAAAAGAATCCGTCAAATGTTCTGATTATCAGCAGCTATCCAGATG(SEQ ID NO：3)
PeasR-C元件的核酸序列如下所示：
GCCTGTACTATAGTGCAGGTTAAGTCCACGTTAAGTAAAAGAAGCAGC(SEQ ID NO：4)
P1元件的核酸序列如下所示：
TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCCTTTTGGTGCGTCAGTCAGTTTAAACCAGGAAACAGCT(SEQ ID NO：5)
P2元件的核酸序列如下所示：
TTATCTCTGGCGGTGTTGACAAGAGATAACAACGTTGATATAATTGAGCCACTGGCTCGTAATTTATTGTTTAAACCAGGAAACAGCT(SEQ ID NO：6)
fxpk-磷酸转酮酶的核酸序列如下所示：
ATGACCACCGATTATAGCAGCCCGGCATATCTGCAGAAAGTTGATAAATATTGGCGTGCAGCCAACTATCTGAGCGTTGGTCAGCTGTATCTGAAAGATTATCCGCTGCTGCAGCAGCCGCTGAAAGCAAGCGATGTTAAAGTTCACCCTATTTGCCATTGGGGAACCATCGCAGGACAGAACAGCATTTATGCGCATCTGAATCGTGTTATTAATAAATATGGCCTGAAAATGTTCTATGTGGAAGGTCCGGGTCATGGTGGTCAGGTTATGGTTAGTAATTCATATCTGGATGGTACCTATACAGATATTTATCCTGAAATTACCCAGGATGTGGAAGGTATGCAGAAACTGTTTAAACAGTTTAGCTTTCCGGGTGGTGTTGCAAGCCATGCAGCACCGGAAACCCCGGGTAGCATTCACGAAGGCGGTGAACTGGGTTATAGTATTAGTCATGGTGTTGGTGCGATTCTGGATAATCCGGATGAGATTGCGGCGGTTGTTGTTGGTGATGGTGAAAGTGAGACTGGTCCGCTGGCGACGAGTTGGCAGAGCACAAAATTTATTAATCCGATTAACGATGGCGCGGTTCTGCCAATTCTGAATCTGAATGGTTTTAAAATCAGCAATCCGACAATTTTTGGTCGTACCTCAGATGCAAAAATTAAAGAATATTTCGAGTCCATGTCCTGGGAACCGATTTTTGTTGAAGGTGATGATCCGGAAAAAGTACATCCGGTTCTGGCCAAAGCAATGGATGAAGCAGTTGAAAAAATTAAAGCAATTCAGAAACATGCACGTGAAAATGATGATGCAACCCTGCCGGTTTGGCCGATGATTGTTTTTCGTGCACCGAAAGGTTGGACCGGTCCGAAAAGCTGGGATGGTGATAAAATTGAAGGTAGCTTTCGTGCACATCAGATTCCGATTCCGGTTGATCAGAATGATATGGAACATGCAGATGCACTGGTTGATTGGCTGGAAAGCTATCAGCCGAAAGAACTGTTTAATGAAGATGGTAGCCTGAAAGATGATATTAAAGAAATTATTCCGACCGGTGATAGCCGTATGGCAGCAAATCCGATTACCAATGGTGGTGTTGATCCGAAAGCACTGAATCTGCCGAATTTTCGTGATTATGCAGTTGATACCAGCAAAGAAGGTGCAAATGTTAAACAGGATATGCTGGTTTGGAGCGATTATCTGCGTGATGTTATTAAAAAAAATCCGGATAATTTTCGTCTGTTTGGTCCGGATGAAACCATGAGCAATCGTCTGTATGGTGTTTTTGAAACCACCAATCGTCAGTGGATGGAAGATATTCATCCGGATAGCGATCAGTATGAAGCAGCAGCAGGTCGTGTTCTGGATGCACAGCTGAGCGAACATCAGGCAGAAGGTTGGCTGGAAGGTTATGTTCTGACCGGTCGTCATGGTCTGTTTGCAAGCTATGAAGCATTTCTGCGTGTTGTTGATAGCATGCTGACCCAGCATTTTAAATGGCTGCGTAAAGCAAATGAACTGGATTGGCGTAAAAAATATCCGAGCCTGAATATTATTGCAGCAAGCACCGTTTTTCAGCAGGATCATAATGGTTATACCCATCAGGATCCGGGTGCACTGACCCATCTGGCAGAAAAAAAACCGGAATATATTCGTGAATATCTGCCGGCAGATGCAAATACCCTGCTGGCAGTTGGTGATGTTATTTTTCGTAGCCAGGAAAAAATTAATTATGTTGTTACCAGCAAACATCCGCGTCAGCAGTGGTTTAGCATTGAAGAAGCAAAACAGCTGGTTGATAATGGTCTGGGTATTATTGATTGGGCAAGCACCGATCAGGGTAGCGAACCGGATATTGTTTTTGCAGCAGCAGGTACCGAACCGACCCTGGAAACCCTGGCAGCAATTCAGCTGCTGCATGATAGCTTTCCGGAAATGAAAATTCGTTTTGTTAATGTTGTTGATATTCTGAAACTGCGTAGCCCGGAAAAAGATCCGCGTGGTCTGAGCGATGCAGAATTTGATCATTATTTTACCAAAGATAAACCGGTTGTTTTTGCATTTCATGGTTATGAAGATCTGGTTCGTGATATTTTTTTTGATCGTCATAATCATAATCTGTATGTTCATGGTTATCGTGAAAATGGTGATATTACCACCCCGTTTGATGTTCGTGTTATGAATCAGATGGATCGTTTTGATCTGGCAAAAACCGCAATTGCAGCACAGCCGGCAATGGAAAATACCGGTGCAGCATTTGTTCAGAGCATGGATAATATGCTGGCAAAACATAATGCATATATTCGTGATGCAGGTACCGATCTGCCGGAAGTTAATGATTGGCAGTGGAAAGGTCTAA(SEQ ID NO：7)
实施例1：大肠杆菌重组菌株Fxpk1、GT02、GT10、GT12、GT14的制备方法
在WJ060的基因组adhE(编码醇脱氢酶EC 1.1.1.1，GenBank ID：945837)位点上利用λ-red同源重组的方式插入利用杂合组成型启动子元件P3表达源于青春双歧杆菌的磷酸转酮酶fxpk，利用杂合组成型启动子元件P3表达大肠杆菌本底pta，并敲除ackA，进一步利用杂合组成型启动子元件P3表达密码子优化的大肠杆菌本底aroB，进一步敲除pyk，成功构建GT14菌株。
大肠杆菌重组菌株Fxpk1的制备方法：
以含氯霉素抗性基因cat和果聚糖蔗糖转移酶基因sacB(cat-sacB盒，其核酸序列如SEQ ID NO：10所示)的质粒pEASY-cat-sacB为模板，使用引物对1(adhE1-up/adhE1-down)扩增第一步同源重组的片段adhE1。引物对1的序列为：
adhE1-up(正向引物)：ATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：13)
adhE1-down(反向引物)：
CAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGAACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ ID NO：14)
cat-sacB盒的具体序列如下(SEQ ID NO：10)：
tggtgtccctgttgataccgggaagccctgggccaacttttggcgaaaatgagacgttgatcggcacgtaagaggttccaactttcaccataatgaaataagatcactaccgggcgtattttttgagttatcgagattttcaggagctaaggaagctaaaatggagaaaaaaatcactggatataccaccgttgatatatcccaatggcatcgtaaagaacattttgaggcatttcagtcagttgctcaatgtacctataaccagaccgttcagctggatattacggcctttttaaagaccgtaaagaaaaataagcacaagttttatccggcctttattcacattcttgcccgcctgatgaatgctcatccggaattccgtatggcaatgaaagacggtgagctggtgatatgggatagtgttcacccttgttacaccgttttccatgagcaaactgaaacgttttcatcgctctggagtgaataccacgacgatttccggcagtttctacacatatattcgcaagatgtggcgtgttacggtgaaaacctggcctatttccctaaagggtttattgagaatatgtttttcgtctcagccaatccctgggtgagtttcaccagttttgatttaaacgtggccaatatggacaacttcttcgcccccgttttcaccatgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatcatgccgtttgtgatggcttccatgtcggcagaatgcttaatgaattacaacagtactgcgatgagtggcagggcggggcgtaatttttttaaggcagttattggtgcccttaaacgcctggtgctacgcctgaataagtgataataagcggatgaatggcagaaattcgaaagcaaattcgacccggtcgtcggttcagggcagggtcgttaaatagccgctagatctaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaaaaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgcaactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttcccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatcaagttcctgaattcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgtttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctaccacatcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgttctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaaagacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtcaggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccggtaaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacagctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaacgtatcaaaatgtacagcagttcatcgatgaaggcaactacagctcaggcgacaaccatacgctgagagatcctcactacgtagaagataaaggccacaaatacttagtatttgaagcaaacactggaactgaagatggctaccaaggcgaagaatctttatttaacaaagcatactatggcaaaagcacatcattcttccgtcaagaaagtcaaaaacttctgcaaagcgataaaaaacgcacggctgagttagcaaacggcgctctcggtatgattgagctaaacgatgattacacactgaaaaaagtgatgaaaccgctgattgcatctaacacagtaacagatgaaattgaacgcgcgaacgtctttaaaatgaacggcaaatggtacctgttcactgactcccgcggatcaaaaatgacgattgacggcattacgtctaacgatatttacatgcttggttatgtttctaattctttaactggcccatacaagccgctgaacaaaactggccttgtgttaaaaatggatcttgatcctaacgatgtaacctttacttactcacacttcgctgtacctcaagcgaaaggaaacaatgtcgtgattacaagctatatgacaaacagaggattctacgcagacaaacaatcaacgtttgcgccaagcttcctgctgaacatcaaaggcaagaaaacatctgttgtcaaagacagcatccttgaacaaggacaattaacagttaacaaataaaaacgcaaaagaaaatgccgatattgactaccggaagcagtgtgaccgtgtgcttctcaaatgcctgattcaggctgtctatgtgtgactgttgagctgtaacaagttgtctcaggtgttcaatttcatgttctagttgctttgttttactggtttcacctgttctattaggtgttacatgctgttcatctgttacattgtcgatctgttcatggtgaacagctttaaatgcaccaaaaactcgtaaaagctctgatgt
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的adhE1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是adhE起始密码子上游40个碱基序列和adhE终止密码子下游的40个碱基序列。
将获得的adhE1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌WJ060后进行同源重组，实现在adhE的CDS区替换为cat-sacB盒。具体过程如下：其中大肠杆菌WJ060和质粒pKD46为本所实验室保存(大肠杆菌WJ060(CGMCC NO.14602)；pKD46质粒可参阅非专利文献Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.Proc Natl Acad Sci U S A.2000,97(12)：6640-6645)。
将adhE1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌WJ060。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌WJ060的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ngadhE1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对2为：
adhE-up(正向引物)：CCGCTGTCTGATAACTGG(SEQ ID NO：15)
adhE-down-a(反向引物)：GTGCCAGTCATCCTTCAG(SEQ ID NO：16)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Fxpk1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT02的制备方法：
设计引物3，以大肠杆菌WJ060作为模板进行PCR扩增，得到扩增片段adhE2，包括adhE起始密码子上游500个碱基序列的同源臂片段；设计引物4，以人工合成的调控元件P3DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物adhE3,包含合成调控元件P3以及两端分别是adhE起始密码子上游40个碱基序列和磷酸转酮酶fxpk起始密码子开始的40个碱基序列；设计引物5，以公司(北京擎科生物科技有限公司)合成的fxpk片段为模板进行PCR扩增，得到扩增片段adhE4，包含fxpk以及adhE终止密码子下游40个碱基序列；设计引物6，以大肠杆菌WJ060作为模板进行PCR扩增，得到扩增片段adhE5，包括adhE终止密码子下游500个碱基序列的同源臂片段；利用引物3中的正向引物序列和引物6中的反向引物序列，以adhE2、adhE3、adhE4以及adhE5作为模板，PCR扩增得到片段adhE6，包含利用杂合组成型启动子元件P3表达的fxpk两端分别是adhE起始密码子上游500个碱基序列和adhE终止密码子下游500个碱基序列。引物对3-6序列分别为：
引物对3的序列为：
AdhE-up-s(正向引物)：GGTCTGAATCACGGTTAG(SEQ ID NO：17)
AdhE-up-a(反向引物)：AATGCTCTCCTGATAATG(SEQ ID NO：18)
引物对4的序列为：
AdhE40-w-p-s(正向引物)：
ATGATTTACTAAAAAAGTTTAACATTATCAGGAGAGCATTTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：19)
BaFxpk40-w-p-a(反向引物)：
CAGTTTTTTCCACGGGGTACCGATAACCGGAGAGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ IDNO：20)
引物对5的序列为：
Bafxpk-s(正向引物)：ATGACCTCTCCGGTTATCGG(SEQ ID NO：21)
AdhE40-Bafxpk-a(反向引物)：CAGAAGGGGCCGTTTATGTTGCCAGACAGCGCTACTGATCATTCGTTGTCACCCGC(SEQ ID NO：22)
引物对6的序列为：
adhEdown-s(正向引物)：TCTGAAATAATCAGTAGCGCTGTCTGGC(SEQ ID NO：23)
AdhE-down-a(反向引物)：GTGCCAGTCATCCTTCAG(SEQ ID NO：24)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的adhE6片段包含利用杂合组成型启动子元件P3表达的fxpk两端分别是adhE起始密码子上游500个碱基序列和adhE终止密码子下游500个碱基序列。
获得的adhE6这个扩增产物导入大肠杆菌Fxpk1后进行第二步同源重组，实现在adhE的CDS区替换为杂合组成型启动子元件P3表达的fxpk。
第二步同源重组是将adhE6片段电转至大肠杆菌Fxpk1。电转条件为：首先准备大肠杆菌Fxpk1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng adhE6片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株Fxpk2。
取300μL重组菌株Fxpk2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对2。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT02，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT10的制备方法：
简单来说，以GT02菌株作为出发菌株，然后利用杂合组成型启动子元件P3(SEQ IDNO：1)过表达pta同时敲除ackA，进而得到GT10。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物7ackA1-up/ackA1-down扩增第一步同源重组的片段ackA1。
引物对7的序列为：
ackA1-up(正向引物)：CTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：25)
ackA1-down(反向引物)：
GCTGGTTCCGGTAGGGATCAGCATAATAATACGGGACACACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ ID NO：26)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的ackA1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是ackA起始密码子上游40个碱基序列和ackA终止密码子下游的40个碱基序列。
将获得的ackA1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT02后进行同源重组，实现在ackA的CDS区替换为cat-sacB盒。具体过程如下：
将ackA1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT02。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT02的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ackA1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对8为：
AckA-up(正向引物)：CGTTGACATGCTTCACCTC(SEQ ID NO：27)
AckA-down(反向引物)：CAGACCTTCAACGTAGCTC(SEQ ID NO：28)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌AckA1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对9，以人工合成的调控元件P3 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物ackA2,包含合成调控元件P3以及两端分别是ackA起始密码子上游40个碱基序列和pta起始密码子开始的40个碱基序列。引物对9序列为：
AckA40-w-p-s(正向引物)：CTGACGTTTTTTTAGCCACGTATCAATTATAGGTACTTCCTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：29)
Pta40-w-p-a(反向引物)：GCTGGTTCCGGTAGGGATCAGCATAATAATACGGGACACAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ ID NO：30)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的ackA2片段包含杂合组成型启动子元件P3两端分别是ackA起始密码子上游40个碱基序列和pta起始密码子开始的40个碱基序列。
获得的ackA2这个扩增产物导入大肠杆菌AckA1后进行第二步同源重组，实现在ackA的CDS区替换为杂合组成型启动子元件P3。
第二步同源重组是将ackA2片段电转至大肠杆菌AckA1。电转条件为：首先准备大肠杆菌AckA1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ackA2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株ackA2。
取300μL重组菌株AckA2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物8。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT10，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT12的制备方法：
菌株GT12：以GT10为起始菌株，利用杂合组成型启动子元件P3过表达aroBopt，进而得到GT12。
其中，aroBopt的核酸序列如下：
ATGGAGCGTATTGTCgttactctcggggaacgtagttacccaattaccatcgcatctggtttgtttaatgaaccagcttcattcttaccgctgaaatcgggcgagcaggtcatgttggtcaccaacgaaaccctggctcctctgtatctcgataaggtccgcggcgtacttgaacaggcgggtgttaacgtcgatagc(SEQ ID NO：11)
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物10aroB1-up/aroB1-down扩增第一步同源重组的片段aroB1。
引物对10的序列为：
aroB1-up(正向引物)：ACTCGTCTGCGGGTACAGTAATTAAGGTGGATGTCGCGTTTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：31)
aroB1-down(反向引物)：
GTAGCTACGTTCGCCCAGAGTAACGACAATACGCTCCATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ ID NO：32)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroB1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是aroB起始密码子上游40个碱基序列和aroB起始密码子优化(SEQ ID NO：11)的40个碱基序列。
将获得的aroB1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT10后进行同源重组，实现在aroB起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将aroB1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT10。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT10的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroB1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对11为：
AroB-up(正向引物)：TGAGGTTTCAGTTCATGTCC(SEQ ID NO：33)
AroB-down(反向引物)：CAACGCATCCAGATTCTC(SEQ ID NO：34)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌AroB1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对12，以人工合成的调控元件P3 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aroB2,包含合成调控元件P3以及两端分别是aroB起始密码子上游40个碱基序列和aroB起始密码子优化后开始的40个碱基序列。引物对12序列为：
AroB40-w-p-s(正向引物)：ACTCGTCTGCGGGTACAGTAATTAAGGTGGATGTCGCGTTTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：35)
AroB40-w-p-a(反向引物)：GTAGCTACGTTCGCCCAGAGTAACGACAATACGCTCCATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ ID NO：36)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aroB2片段包含杂合组成型启动子元件P3两端分别是aroB起始密码子上游40个碱基序列和aroB起始密码子优化后开始的40个碱基序列。
获得的aroB2这个扩增产物导入大肠杆菌AroB1后进行第二步同源重组，实现在aroB的起始密码子前插入杂合组成型启动子元件P3并将aroB起始密码子前15个碱基进行优化。
第二步同源重组是将aroB2片段电转至大肠杆菌AroB1。电转条件为：首先准备大肠杆菌AroB1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aroB2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株AroB2。
取300μL重组菌株AroB2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对11。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT12，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT14的制备方法：
以GT12菌株作为出发菌株，敲除pyk，进而得到GT14。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物13pyk1-up/pyk1-down扩增第一步同源重组的片段pyk1。引物对13的序列为：
pyk1-up(正向引物)：GTGCGCCCAGAAAGCAAGTTTCTCCCATCCTTCTCAACTTTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：37)
pyk1-down(反向引物)：
CAGGGCGCTTCGATATACAAATTAATTCACAAAAGCAATAACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：38)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的pyk1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是pyk起始密码子上游40个碱基序列和pyk终止密码子下游40个碱基序列。
将获得的pyk1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT12后进行同源重组，实现在pyk的CDS区替换为cat-sacB盒。具体过程如下：
将pyk1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT12。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT12的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pyk1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对14为：
pyk-up(正向引物)：CCAGCACAACTTTACCGAC(SEQ ID NO：39)
pyk-down(反向引物)：GCAGAATGGTGAACCAGAG(SEQ ID NO：40)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Pyk1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对15和16，以大肠杆菌GT12为模板进行PCR扩增，分别得到扩增产物pyk2和pyk3,分别包含pyk起始密码子上游500个碱基序列和pyk终止密码子下游500个碱基序列；利用引物15正向引物和引物16反向引物，以pyk2和pyk3作为模板进行PCR扩增，得到扩增产物pyk4，包含pyk起始密码子上游500个碱基序列和pyk终止密码子下游500个碱基序列。引物对15和16序列分别为：
引物对15序列为：
Pyk-up-s(正向引物)：ATCATGCCAACTATCAGC(SEQ ID NO：41)
Pyk36-up-a(反向引物)：CGATATACAAATTAATTCACAAAAGCAATAAAGTTGAGAAGGATGGGAG(SEQ ID NO：42)
引物对16序列为：
Pyk36-down-s(正向引物)：CTCCCATCCTTCTCAACTTTATTGCTTTTGTGAATTAATTTGTATATCG(SEQ ID NO：43)
Pyk-down-a(反向引物)：GTTAGCACGAGCTGCGTC(SEQ ID NO：44)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的pyk4片段包含pyk起始密码子上游500个碱基序列和pyk终止密码子下游500个碱基序列。
获得的pyk4这个扩增产物导入大肠杆菌Pyk1后进行第二步同源重组，实现删除pyk的CDS区。
第二步同源重组是将pyk4片段电转至大肠杆菌Pyk1。电转条件为：首先准备大肠杆菌Pyk1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pyk4片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株Pyk2。
取300μL重组菌株Pyk2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对14。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT14，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
实施例2：大肠杆菌重组菌株GT52/GT54/GT56/GT58/GT20/GT29/GT38/GT49/GT23/GT60的制备方法
大肠杆菌重组菌株GT52的制备方法：
以实施例1中得到的GT14作为出发菌株，利用杂合组成型启动子元件P1(SEQ IDNO：5)以及将前述P1的起始密码子优化为TTG表达aceE，进而得到GT52。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对17(aceE1-up/aceE1-down)扩增第一步同源重组的片段aceE1。引物对17的序列为：
aceE1-up(正向引物)：ATGGGACAGGTTCCAGAAAACTCAACGTTATTAGATAGATTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：45)
aceE1-down(反向引物)：
GTTTCGATCGGATCCACGTCATTTGGGAAACGTTCTGACATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：46)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aceE1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是aceE起始密码子上游40个碱基序列和aceE起始密码子开始的40个碱基序列。
将获得的aceE1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT14后进行同源重组，实现在aceE起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将aceE1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT14。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT14的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aceE1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对18为：
AceE-up(正向引物)：GATGTTGGCCCAGAATGTCC(SEQ ID NO：47)
AceE-down(反向引物)：TTCCAGCGGATAGCTGAACG(SEQ ID NO：48)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌AceE1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对19，以人工合成的调控元件P3 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物aceE2,包含合成调控元件P1以及两端分别是aceE起始密码子上游40个碱基序列和aceE起始密码子优化后(ATG变更为TTG)开始的40个碱基序列。引物对19序列为：
AceE40-w-p-s(正向引物)：ATGGGACAGGTTCCAGAAAACTCAACGTTATTAGATAGATTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：49)
AceE40-w-p-a(反向引物)：GTTTCGATCGGATCCACGTCATTTGGGAAACGTTCTGACATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ ID NO：50)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aceE2片段包含杂合组成型启动子元件P1两端分别是aceE起始密码子上游40个碱基序列和aceE起始密码子优化后(ATG变更为TTG)开始的40个碱基序列。
获得的aceE2这个扩增产物导入大肠杆菌AceE1后进行第二步同源重组，实现在aceE的起始密码子前插入杂合组成型启动子元件P1并将aceE起始密码子由ATG变更为TTG。
第二步同源重组是将aceE2片段电转至大肠杆菌AceE1。电转条件为：首先准备大肠杆菌AceE1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aceE2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株AceE2。
取300μL重组菌株AceE2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物18。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT52，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT54的制备方法：
菌株GT54：以实施例1中得到的GT14为起始菌株，在ldhA(编码D-乳酸脱氢酶EC1.1.1.28，GenBank ID：946315)位点插入apFAB65+apFAB700表达的EsaI(GenBank ID：AAA82096.1)蛋白，进而得到GT54；
其中，apFAB65+apFAB700表达EsaI蛋白的核酸序列如下：
TTGACATCAGGAAAATTTTTCTGTATAATGTGTGGAGGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCCTAGGAAGTTTTCTA(SEQ ID NO：8)
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对20ldhA1-up/ldhA1-down扩增第一步同源重组的片段ldhA1。引物对20的序列为：
ldhA1-up(正向引物)：TAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGTGACGGAAGATCACTTC(SEQ ID NO：51)
ldhA1-down(反向引物)：
ATCTGAATCAGCTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGAATCAAAGGGAAAACTGTCC(SEQ IDNO：52)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的ldhA1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是ldhA起始密码子上游40个碱基序列和ldhA终止密码子下游的40个碱基序列。
将获得的ldhA1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT14后进行同源重组，实现在ldhA的CDS区替代为cat-sacB盒。具体过程如下：
将ldhA1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT14。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT14的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ldhA1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对21为：
ldhA-up(正向引物)：CGCCAGACAAGCAGAATC(SEQ ID NO：53)
ldhA-down(反向引物)：GATTGGGATGTGTGCATTAC(SEQ ID NO：54)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌LdhA1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对22，以公司(北京擎科生物科技有限公司)合成的apFAB65+apFAB700表达EsaI的质粒为模板进行PCR扩增，得到扩增产物ldhA2,包含apFAB65+apFAB700表达EsaI以及两端分别是ldhA起始密码子上游40个碱基序列和ldhA终止密码子下游的40个碱基序列。引物对22序列为：
LdhA40-abFAB-s(正向引物)：TAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTCATATGTTGACATCAGGAA(SEQ ID NO：55)
LdhA40-EsaI-a(反向引物)：GAATCAGCTCCCCTGGGTTGCAGGGGAGCGGCAAGATTACACAGGCAGGGTCAGCG(SEQ ID NO：56)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的ldhA2片段包含apFAB65+apFAB700表达EsaI以及两端分别是ldhA起始密码子上游40个碱基序列和ldhA终止密码子下游的40个碱基序列。
获得的ldhA2这个扩增产物导入大肠杆菌LdhA1后进行第二步同源重组，实现在ldhA的CDS区替换为apFAB65+apFAB700表达的EsaI。
第二步同源重组是将ldhA2片段电转至大肠杆菌LdhA1。电转条件为：首先准备大肠杆菌LdhA1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ldhA2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株LdhA2。
取300μL重组菌株LdhA2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对21。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT54，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT56的制备方法：
以GT54菌株为出发菌株，将apFAB104表达的EsaRI70V替换基因组的pflB的编码区，进而得到了GT56。
apFAB104表达EsaR蛋白的核酸序列如下：
TCGACATAAAGTCTAACCTATAGGATACTTACAGCCAT(SEQ ID NO：9)
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对23pflB1-up/pflB1-down扩增第一步同源重组的片段pflB1。引物对23的序列为：
pflB1-up(正向引物)：CGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：57)
pflB1-down(反向引物)：
TATTGTACGCTTTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAAACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：58)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的pflB1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是pflB起始密码子上游40个碱基序列和pflB终止密码子下游的40个碱基序列。
将获得的pflB1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT54后进行同源重组，实现在pflB的CDS区替代为cat-sacB盒。具体过程如下：
将pflB1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT54。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT54的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pflB1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对24为：
pflB-up(正向引物)：GCCAGCGGTTTTGAGCACAG(SEQ ID NO：59)
pflB-down(反向引物)：CATTGCGGTGTTTCTCCAGATG(SEQ ID NO：60)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌PflB1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对25，以公司(北京擎科生物科技有限公司)合成的apFAB104表达EsaRI70V的质粒为模板进行PCR扩增，得到扩增产物pflB2,包含apFAB104表达EsaRI70V以及两端分别是pflB起始密码子上游40个碱基序列和pflB终止密码子下游的40个碱基序列。引物对25序列为：
PflB40-abFAB-s(正向引物)：
CGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACTTCGACATAAAGTCTAACC(SEQ IDNO：61)
PflB40-EsaR-a(反向引物)：TATTGTACGCTTTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAATTAACGTGCTGCGCTTGC(SEQ ID NO：62)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的pflB2片段包含apFAB104表达EsaRI70V以及两端分别是pflB起始密码子上游40个碱基序列和pflB终止密码子下游的40个碱基序列。
获得的pflB2这个扩增产物导入大肠杆菌LdhA1后进行第二步同源重组，实现在pflB的CDS区替换为apFAB104表达的EsaRI70V。
第二步同源重组是将pflB2片段电转至大肠杆菌PflB1。电转条件为：首先准备大肠杆菌PflB1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pflB2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株PflB2。
取300μL重组菌株PflB2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物24。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT56，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT58的制备方法：
以GT56菌株为出发菌株，利用诱导型启动子PesaR-C替换aceE本底启动子，进而得到GT58。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对17aceE1-up/aceE1-down扩增第一步同源重组的片段aceE1。引物对17的序列为：
aceE1-up(正向引物)：ATGGGACAGGTTCCAGAAAACTCAACGTTATTAGATAGATTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：45)
aceE1-down(反向引物)：
GTTTCGATCGGATCCACGTCATTTGGGAAACGTTCTGACATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：46)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aceE1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是aceE起始密码子上游40个碱基序列和aceE起始密码子开始的40个碱基序列。
将获得的aceE1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT56后进行同源重组，实现在aceE起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将aceE1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT56。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT56的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aceE1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对18为：
AceE-up(正向引物)：GATGTTGGCCCAGAATGTCC(SEQ ID NO：47)
AceE-down(反向引物)：TTCCAGCGGATAGCTGAACG(SEQ ID NO：48)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌AceE3(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对26，引物退火直接扩增得到产物aceE3,包含诱导型启动子PesaR-C以及两端分别是aceE起始密码子上游40个碱基序列和aceE起始密码子开始的40个碱基序列。引物对26序列为：
AceE40-esaR-C-s(正向引物)：ATGGGACAGGTTCCAGAAAACTCAACGTTATTAGATAGATATGTTTAGCTTTTTTCTGG(SEQ ID NO：63)
AceE40-esaR-C-a(反向引物)：GTTTCGATCGGATCCACGTCATTTGGGAAACGTTCTGACATGCTGCTTCTTTTTCTTAACG(SEQ ID NO：64)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的aceE3片段包含诱导型启动子PesaR-C以及两端分别是aceE起始密码子上游40个碱基序列和aceE起始密码子开始的40个碱基序列。
获得的aceE3这个扩增产物导入大肠杆菌AceE3后进行第二步同源重组，实现在aceE的起始密码子前插入诱导型启动子PesaR-C。
第二步同源重组是将aceE3片段电转至大肠杆菌AceE3。电转条件为：首先准备大肠杆菌AceE3的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng aceE3片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株AceE4。
取300μL重组菌株AceE4菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物18。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT58，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌菌株重组GT20的制备方法：
以GT14菌株为出发菌株，敲除zwf，进而得到菌株GT20。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对27zwf1-up/zwf1-down扩增第一步同源重组的片段zwf1。引物对27的序列为：
zwf1-up(正向引物)：CTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：65)
zwf1-down(反向引物)：
CATGTTACCGGTAAAATAACCATAAAGGATAAGCGCAGATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：66)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的zwf1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf终止密码子下游40个碱基序列。
将获得的zwf1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT14后进行同源重组，实现在zwf的CDS区替换为cat-sacB盒。具体过程如下：
将zwf1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT14。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT14的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng zwf1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对28为：
zwf-up(正向引物)：GTCGGTTCGCTAACATTG(SEQ ID NO：67)
zwf-down(反向引物)：GCTTGCCATCGGTCCAGAC(SEQ ID NO：68)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Zwf1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对29和30，以大肠杆菌GT14为模板进行PCR扩增，分别得到扩增产物zwf2和zwf3,分别包含zwf起始密码子上游500个碱基序列和pyk终止密码子下游500个碱基序列；利用引物29正向引物和引物30反向引物，以zwf2和zwf3作为模板进行PCR扩增，得到扩增产物zwf4，包含zwf起始密码子上游500个碱基序列和pyk终止密码子下游500个碱基序列。引物对29和30序列分别为：
引物对29序列为：
Zwf-up-s(正向引物)：ACTCGAATGGATCGCGTTATC(SEQ ID NO：69)
Zwf36-up-a(反向引物)：CATAAAGGATAAGCGCAGATAGTCATTCTCCTTAAGTTAAC(SEQ IDNO：70)
引物对30序列为：
Zwf36-down-s(正向引物)：TAACTTAAGGAGAATGACTATCTGCGCTTATCCTTTATG(SEQ IDNO：71)
Zwf-down-a(反向引物)：CTGGCAGGCAGCGAAACC(SEQ ID NO：72)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNAPolymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸1分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的zwf4片段包含zwf起始密码子上游500个碱基序列和zwf终止密码子下游500个碱基序列。
获得的zwf4这个扩增产物导入大肠杆菌Zwf1后进行第二步同源重组，实现删除zwf的CDS区。
第二步同源重组是将zwf4片段电转至大肠杆菌Zwf1。电转条件为：首先准备大肠杆菌Zwf1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng zwf4片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株Zwf2。
取300μL重组菌株Zwf2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对28。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT20，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT29的制备方法：
以GT20菌株为出发菌株，利用将杂合组成型启动子元件P2(SEQ ID NO：6)的起始密码子由ATG突变为GTG后的启动子元件表达pgi，进而得到GT29菌株。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对31pgi1-up/pgi1-down扩增第一步同源重组的片段pgi1。
引物对31的序列为：
pgi1-up(正向引物)：ACTGGCGCTACAATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCGTGACGGAAGATCACTTC(SEQ ID NO：73)
pgi1-down(反向引物)：
GCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTTGGATTGATGTTTTTCAATCAAAGGGAAAACTGTCC(SEQ IDNO：74)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的pgi1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基序列和pgi起始密码子开始的40个碱基序列。
将获得的pgi1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT20后进行同源重组，实现在pgi起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将pgi1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT20。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT20的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pgi1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对32为：
pgi-up(正向引物)：CGCTACAATCTTCCAAAGTCAC(SEQ ID NO：75)
pgi-down(反向引物)：CGGCATCAGGCATGAACGATG(SEQ ID NO：76)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Pgi1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对33，以人工合成的调控元件P2 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物pgi2,包含合成调控元件P2以及两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基序列和pgi起始密码子优化后(ATG变更为GTG)开始的40个碱基序列。引物对33序列为：
pgi40-w-p-s(正向引物)：ACTGGCGCTACAATCTTCCAAAGTCACAATTCTCAAAATCTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：77)
pgi40-w-p-a(反向引物)：GCCTGCCAGGCAGCGGTCTGCGTTGGATTGATGTTTTTCAGAGCTGTTTCCTGGTTTAA(SEQ ID NO：78)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的pgi2片段包含杂合组成型启动子元件P2两端分别是pgi起始密码子上游40个碱基序列和pgi起始密码子优化后(ATG变更为GTG)开始的40个碱基序列。
获得的pgi2这个扩增产物导入大肠杆菌Pgi1后进行第二步同源重组，实现在pgi的起始密码子前插入杂合组成型启动子元件P2并将pgi起始密码子由ATG变更为GTG。
第二步同源重组是将pgi2片段电转至大肠杆菌Pgi1。电转条件为：首先准备大肠杆菌Pgi1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng pgi2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株Pgi2。
取300μL重组菌株Pgi2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物32。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT29，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT38的制备方法：
以GT29菌株为出发菌株，利用杂合组成型启动子元件P3(SEQ ID NO：1)表达gapN，进而得到菌株GT38。
其中，gapN的核酸序列如下：
ATGACCAAACAGTATAAAAACTATGTGAACGGTGAATGGAAACTGAGCGAAAACGAAATCAAAATCTATGAACCGGCCAGCGGTGCCGAACTGGGTAGCGTGCCGGCCATGAGCACCGAAGAAGTGGATTATGTTTATGCAAGCGCAAAAAAAGCACAGCCGGCATGGCGTAGCCTGAGCTATATTGAACGTGCAGCATATCTGCATAAAGTTGCAGATATTCTGATGCGTGATAAAGAAAAAATTGGTGCAGTTCTGAGCAAAGAAGTTGCAAAAGGTTATAAAAGCGCAGTTAGCGAAGTTGTTCGTACCGCAGAAATTATTAATTATGCAGCAGAAGAAGGTCTGCGTATGGAAGGTGAAGTTCTGGAAGGTGGTAGCTTTGAAGCAGCAAGCAAAAAAAAAATTGCAGTTGTTCGTCGTGAACCGGTTGGTCTGGTTCTGGCAATTAGCCCGTTTAATTATCCGGTTAATCTGGCAGGTAGCAAAATTGCACCGGCACTGATTGCAGGTAATGTTATTGCATTTAAACCGCCGACCCAGGGTAGCATTAGCGGTCTGCTGCTGGCAGAAGCATTTGCAGAAGCAGGTCTGCCGGCAGGTGTTTTTAATACCATTACCGGTCGTGGTAGCGAAATTGGTGATTATATTGTTGAACATCAGGCAGTTAATTTTATTAATTTTACCGGTAGCACCGGTATTGGTGAACGTATTGGTAAAATGGCAGGTATGCGTCCGATTATGCTGGAACTGGGTGGTAAAGATAGCGCAATTGTTCTGGAAGATGCAGATCTGGAACTGACCGCAAAAAATATTATTGCAGGTGCATTTGGTTATAGCGGTCAGCGTTGTACCGCAGTTAAACGTGTTCTGGTTATGGAAAGCGTTGCAGATGAACTGGTTGAAAAAATTCGTGAAAAAGTTCTGGCACTGACCATTGGTAATCCGGAAGATGATGCAGATATTACCCCGCTGATTGATACCAAAAGCGCAGATTATGTTGAAGGTCTGATTAATGATGCAAATGATAAAGGTGCAGCAGCACTGACCGAAATTAAACGTGAAGGTAATCTGATTTGTCCGATTCTGTTTGATAAAGTTACCACCGATATGCGTCTGGCATGGGAAGAACCGTTTGGTCCGGTTCTGCCGATTATTCGTGTTACCAGCGTTGAAGAAGCAATTGAAATTAGCAATAAAAGCGAATATGGTCTGCAGGCAAGCATTTTTACCAATGATTTTCCGCGTGCATTTGGTATTGCAGAACAGCTGGAAGTTGGTACCGTTCATATTAATAATAAAACCCAGCGTGGTACCGATAATTTTCCGTTTCTGGGTGCAAAAAAAAGCGGTGCAGGTATTCAGGGTGTTAAATATAGCATTGAAGCAATGACCACCGTTAAAAGCGTTGTTTTTGATATTAAATAA(SEQ IDNO：12)
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对20ldhA1-up/ldhA1-down扩增第一步同源重组的片段ldhA1。引物对20的序列为：
ldhA1-up(正向引物)：TAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTGTGACGGAAGATCACTTC(SEQ ID NO：51)
ldhA1-down(反向引物)：
ATCTGAATCAGCTCCCCTGGAATGCAGGGGAGCGGCAAGAATCAAAGGGAAAACTGTCC(SEQ IDNO：52)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的ldhA1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是ldhA起始密码子上游40个碱基序列和ldhA终止密码子下游的40个碱基序列。
将获得的ldhA1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT29后进行同源重组，实现在ldhA的CDS区替代为cat-sacB盒。具体过程如下：
将ldhA1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT29。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT29的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ldhA1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对21为：
ldhA-up(正向引物)：CGCCAGACAAGCAGAATC(SEQ ID NO：53)
ldhA-down(反向引物)：GATTGGGATGTGTGCATTAC(SEQ ID NO：54)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌LdhA3(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对34，以大肠杆菌GT29作为模板进行PCR扩增，得到扩增片段ldhA3，包括ldhA起始密码子上游500个碱基序列的同源臂片段；设计引物35，以人工合成的调控元件P3DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物ldhA4,包含合成调控元件P3以及两端分别是ldhA起始密码子上游40个碱基序列和gapN起始密码子开始的40个碱基序列；设计引物36，以公司(北京擎科生物科技有限公司)合成的gapN片段为模板进行PCR扩增，得到扩增片段ldhA5，包含完整的gapN编码区；设计引物37，以大肠杆菌GT29作为模板进行PCR扩增，得到扩增片段ldhA6，包括ldhA终止密码子下游500个碱基序列的同源臂片段以及5’端包含ldhA终止密码子下游40个碱基序列；利用引物34中的正向引物序列和引物37中的反向引物序列，以ldhA3、ldhA4、ldhA5以及ldhA6作为模板，PCR扩增得到片段ldhA7，包含利用杂合组成型启动子元件P3表达的gapN两端分别是ldhA起始密码子上游500个碱基序列和ldhA终止密码子下游500个碱基序列。引物对34-37序列分别为：
引物对34的序列为：
LdhA-up-s(正向引物)：CGCCAGACAAGCAGAATC(SEQ ID NO：79)
LdhA-up-a(反向引物)：AGTGATGTTGAATCACA(SEQ ID NO：80)
引物对35的序列为：
LdhA40-w-p-s(正向引物)：
TAAAATATTTTTAGTAGCTTAAATGTGATTCAACATCACTTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：81)
GapN-w-p-a(反向引物)：
TTCACCGTTCACATAGTTTTTATACTGTTTGGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ ID NO：82)
引物对36的序列为：
GapN-s(正向引物)：ATGACCAAACAGTATAAAAAC(SEQ ID NO：83)
GapN-a(反向引物)：TTATTTAATATCAAAAACAACGC(SEQ ID NO：84)
引物对37的序列为：
GapN-ldhA-down-s(正向引物)：ACCACCGTTAAAAGCGTTGTTTTTGATATTAAATAATCTTGCCGCTCCCCTGCAAC(SEQ ID NO：85)
LdhA-down-a(反向引物)：GATTGGGATGTGTGCATTAC(SEQ ID NO：86)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNAPolymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的ldhA7片段包含利用杂合组成型启动子元件P3表达的ldhA两端分别是ldhA起始密码子上游500个碱基序列和ldhA终止密码子下游500个碱基序列。
获得的ldhA7这个扩增产物导入大肠杆菌LdhA3后进行第二步同源重组，实现在ldhA的CDS区替换为杂合组成型启动子元件P3表达的gapN。
第二步同源重组是将ldhA7片段电转至大肠杆菌LdhA3。电转条件为：首先准备大肠杆菌LdhA3的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng ldhA7片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株LdhA4。
取300μL重组菌株LdhA4菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对21。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT38，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT49的制备方法：
以GT38菌株为出发菌株，利用杂合组成型启动子元件P1(SEQ ID NO：5)表达gapA，进而得到GT49；
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对38gapA1-up/gapA1-down扩增第一步同源重组的片段gapA1。引物对38的序列为：
gapA1-up(正向引物)：TTGTAATTTTACAGGCAACCTTTTATTCACTAACAAATAGGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：87)
gapA1-down(反向引物)：
TTGTAATTTTACAGGCAACCTTTTATTCACTAACAAATAGGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：88)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的gapA1产物包含cat-sacB盒以及两端分别是gapA起始密码子上游40个碱基序列和gapA起始密码子开始的40个碱基序列。
将获得的gapA1这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT38后进行同源重组，实现在gapA起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将gapA1片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT38。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT38的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng gapA1片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对39为：
GapA-up(正向引物)：ATCATACTTGGTTTCGGAATG(SEQ ID NO：89)
GapA-down(反向引物)：CTAACAGCGTAAAGTCGTGC(SEQ ID NO：90)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GapA1(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对40，以人工合成的调控元件P1 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物gapA2,包含合成调控元件P1以及两端分别是gapA起始密码子上游40个碱基序列和gapA起始密码子开始的40个碱基序列。引物对40序列为：
GapA40-w-p-s(正向引物)：TTGTAATTTTACAGGCAACCTTTTATTCACTAACAAATAGTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：91)
GapA40-w-p-a(反向引物)：GATACGGCCAAAACCGTTGATACCTACTTTGATAGTCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ ID NO：92)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的gapA2片段包含杂合组成型启动子元件P1两端分别是gapA起始密码子上游40个碱基序列和gapA起始密码子开始的40个碱基序列。
获得的gapA2这个扩增产物导入大肠杆菌GapA1后进行第二步同源重组，实现在gapA的起始密码子前插入杂合组成型启动子元件P1。
第二步同源重组是将gapA2片段电转至大肠杆菌GapA1。电转条件为：首先准备大肠杆菌GapA1的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng gapA2片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株GapA2。
取300μL重组菌株GapA2菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对39。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT49，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT23的制备方法：
以实施例一中得到的GT14菌株为出发菌株，利用将杂合组成型启动子元件P1(SEQID NO：5)的起始密码子由ATG突变为GTG后的启动子元件表达zwf，进而得到菌株GT23；
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对41zwf1-up/zwf2-down扩增第一步同源重组的片段zwf3。引物对41的序列为：
Zwf1-up(正向引物)：CTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：93)
Zwf2-down(反向引物)：
TGACCAGGTCACAGGCCTGGGCTGTTTGCGTTACCGCCATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：94)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的zwf3产物包含cat-sacB盒以及两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf起始密码子开始的40个碱基序列。
将获得的zwf3这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT14后进行同源重组，实现在zwf起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将zwf3片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT14。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT14的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng zwf3片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对42为：
zwf-up-s(正向引物)：ACTCGAATGGATCGCGTTATC(SEQ ID NO：95)
zwf-iner-a(反向引物)：CCTGCGAGGTCGCCAGCGAC(SEQ ID NO：96)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Zwf3(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对43，以人工合成的调控元件P1 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物zwf4,包含合成调控元件P1以及两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf起始密码子优化后(ATG变更为GTG)开始的40个碱基序列。引物对43序列为：
zwf40-w-p-s(正向引物)：CTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：97)
zwf40-w-p-a(反向引物)：
TGACCAGGTCACAGGCCTGGGCTGTTTGCGTTACCGCCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ IDNO：98)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNAPolymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的zwf4片段包含杂合组成型启动子元件P1两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf起始密码子优化后(ATG变更为GTG)开始的40个碱基序列。
获得的zwf4这个扩增产物导入大肠杆菌Zwf3后进行第二步同源重组，实现在zwf的起始密码子前插入杂合组成型启动子元件P1并将zwf起始密码子由ATG变更为GTG。
第二步同源重组是将zwf4片段电转至大肠杆菌Zwf3。电转条件为：首先准备大肠杆菌Zwf3的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng zwf4片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株Zwf4。
取300μL重组菌株Zwf4菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对42。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT23，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
大肠杆菌重组菌株GT60的制备方法：
以GT58菌株为出发菌株，利用将杂合组成型启动子元件P1(SEQ ID NO：5)的起始密码子由ATG突变为GTG后的启动子元件表达zwf，进而得到GT60。
以大肠杆菌adhE1为模板，使用引物对41zwf1-up/zwf2-down扩增第一步同源重组的片段zwf3。引物对41的序列为：
Zwf1-up(正向引物)：CTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACTGGTGTCCCTGTTGATACC(SEQ ID NO：93)
Zwf2-down(反向引物)：
TGACCAGGTCACAGGCCTGGGCTGTTTGCGTTACCGCCATACATCAGAGCTTTTACGAG(SEQ IDNO：94)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、菌液模板1μL、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO 1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为：94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸3分钟(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的zwf3产物包含cat-sacB盒以及两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf起始密码子开始的40个碱基序列。
将获得的zwf3这个扩增产物通过电转化法导入含有pKD46的大肠杆菌GT58后进行同源重组，实现在zwf起始密码子前插入cat-sacB盒。具体过程如下：
将zwf3片段电转至含有pKD46的大肠杆菌GT58。电转条件为：首先准备含有pKD46的大肠杆菌GT58的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng zwf3片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、100rpm转速的摇床中孵育2小时。取200μL孵育后菌液涂布于含氯霉素和氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃培养至长出肉眼可见明显单菌落，挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物对42为：
zwf-up-s(正向引物)：ACTCGAATGGATCGCGTTATC(SEQ ID NO：95)
zwf-iner-a(反向引物)：CCTGCGAGGTCGCCAGCGAC(SEQ ID NO：96)
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌Zwf5(含有pKD46)，作为下一轮同源重组的出发菌。
设计引物对43，以人工合成的调控元件P1 DNA为模板进行PCR扩增，得到扩增产物zwf4,包含合成调控元件P1以及两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf起始密码子优化后(ATG变更为GTG)开始的40个碱基序列。引物对43序列为：
zwf40-w-p-s(正向引物)：CTGGCTTAAGTACCGGGTTAGTTAACTTAAGGAGAATGACTTATCTCTGGCGGTGTTG(SEQ ID NO：97)
zwf40-w-p-a(反向引物)：
TGACCAGGTCACAGGCCTGGGCTGTTTGCGTTACCGCCATAGCTGTTTCCTGGTTTAAAC(SEQ IDNO：98)
扩增体系：5×TransStartTM FastPfu Buffer 10μL、dNTPs(2.5mmol/L每个dNTP)4μL、DNA模板1μL(20-50ng)、正向引物(10μmol/L)2μL、反向引物(10μmol/L)2μL、100％DMSO1μL、TransStartTM FastPfu DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL、去离子水29μL，总体积50μL。
扩增条件为94℃预变性5分钟(1个循环)；95℃变性20秒、55℃退火30秒、72℃延伸30秒(30个循环)；72℃延伸5分钟(1个循环)。扩增后的zwf4片段包含杂合组成型启动子元件P1两端分别是zwf起始密码子上游40个碱基序列和zwf起始密码子优化后(ATG变更为GTG)开始的40个碱基序列。
获得的zwf4这个扩增产物导入大肠杆菌Zwf5后进行第二步同源重组，实现在zwf的起始密码子前插入杂合组成型启动子元件P1并将zwf起始密码子由ATG变更为GTG。
第二步同源重组是将zwf4片段电转至大肠杆菌Zwf5。电转条件为：首先准备大肠杆菌Zwf3的电转化感受态细胞；将50μL感受态细胞置于冰上，加入50-100ng zwf4片段，冰上放在2分钟，转移至0.2em的Bio-Rad电转杯。使用MicroPulser(Bio-Rad公司)电穿孔仪，电击参数为电压2.5kv。电击后迅速将1mL LB液体培养基转移至电转杯中，用移液器混合5次左右后转移至15mL试管中，放置在30℃、250rpm转速的摇床中孵育2小时，得到大肠杆菌重组菌株Zwf6。
取300μL重组菌株Zwf6菌液(含pKD46质粒)转接到含有氨苄抗生素的30mL含10％蔗糖、没有氯化钠的LB液体培养基中30℃，250rpm过夜培养，后划线于含氨苄抗生素的10％蔗糖、没有氯化钠的LB平板，30℃培养长出菌落。挑取单菌落进行菌落PCR扩增及DNA测序验证。PCR扩增及DNA测序引物42。
挑选一个正确的单菌落，将其命名为大肠杆菌GT60，用于3-脱氢莽草酸生产测试或下一轮菌种制备的出发菌。
实施例3：大肠杆菌重组菌株WJ060，GT10，GT12，GT14摇瓶发酵的方法及结果
种子培养基为含0.5％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：
葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
摇瓶发酵培养基为NBS培养基，由以下成分组成：
葡萄糖20g/L，KH2PO4 3.5g/L，K2HPO4·3H2O 6.5g/L，(NH4)2HPO4 3.5g/L，MgSO40.120g/L，CaCl2 11mg/L，Thiamine HCl(盐酸硫胺素)5mg/L，碳酸钙10g/L，FeCl3·6H2O0.16mg/L，CoCl2·6H2O 0.2mg/L，CuSO4·5H2O 0.015mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.02mg/L，ZnCl20.02mg/L，H3BO3 0.005mg/L。
大肠杆菌重组菌株WJ060，GT10，GT12，GT14发酵生产3-脱氢莽草酸，包括如下步骤：
(1)种子培养：15mL试管中种子培养基为3mL，121℃灭菌15分钟。冷却后分别将WJ060，GT10，GT12，GT14单菌落接种到3mL种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于发酵培养基接种。
(2)发酵培养：取200μL上述种子菌液，接种于发酵培养基中，37℃，250rpm摇床培养24小时，得到发酵液。
分析方法：使用安捷伦(Agilent-1200)高效液相色谱仪对发酵液中的组分进行分析测定。发酵液中的葡萄糖和有机酸浓度测定采用伯乐(Bio-Rad)公司的Aminex HPX-87H有机酸分析柱(300mm×7.8mm，9μm)；流动相为5mM硫酸，流速0.6mL/min，柱温63℃，检测波长210nm。3-脱氢莽草酸标准品购自Sigma-Aldrich公司，产品目录号为05616-100MG。
结果：菌株WJ060，GT10，GT12，GT14摇瓶发酵48小时的结果如图2所示。
具体来说，对于菌株GT10，在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率(转化率＝DHS产量*发酵体积*葡萄糖摩尔分子量/(消耗葡萄糖总量*DHS摩尔分子量))分别达到了7.58g/L，24.5％M/M，较对照菌株WJ060(5.67g/L，19.5％M/M)分别提高了33.7％和25.6％。以上结果表明，增加E4P，减少CO2的释放有效地提高了DHS的产量与转化率。
对于菌株GT12，在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率分别为10.5g/L，33.2％M/M，较对照GT10分别提高了38.5％以及35.5％，结果表明aroB是限制DHS合成的关键限速步骤。
在解除DHS合成途径限制，增加E4P供给的情况下，进一步增加PEP的供给(敲除pyk)，以获得菌株GT14。在摇瓶发酵水平上，菌株GT14的DHS产量与转化率分别为10.61g/L，35.8％M/M，相较于菌株GT12略有提高，但较对照WJ060分别提高了87.1％以及83.6％。
实施例4：大肠杆菌重组菌株GT14放大发酵的方法及结果
一级种子培养基为含0.5％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：
葡萄糖5g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
二级种子培养基为含2％葡萄糖的LB培养基，由以下成分组成：
葡萄糖20g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠(NaCl)10g/L。
初始发酵罐培养基为无机盐发酵培养基，其由以下成分组成：
大量元素：起始葡萄糖20g/L、柠檬酸2g/L、KH2PO4 7.5g/L、(NH4)2SO4 1.6g/L、MgSO4·7H2O 2g/L；和
微量元素：FeSO4·7H2O 75mg/L、MnSO4·H2O 4.5mg/L、Na2SO4 20mg/L、ZnSO4 6mg/L、CoCl2·6H2O 4mg/L、CuSO4·5H2O 0.6mg/L。
大肠杆菌重组菌株WJ060扩大发酵生产3-脱氢莽草酸，包括如下步骤：
(1)一级种子培养：15mL试管中一级种子培养基为3mL，121℃灭菌15分钟。冷却后将基因工程大肠杆菌WJ060单菌落接种到3mL种子培养基，在30℃，250rpm摇床过夜培养16小时，用于二级种子培养基接种。
(2)二级种子培养：1L摇瓶中二级种子培养基为200mL，121℃灭菌15分钟。冷却后将2mL一级种子培养液接种到200mL二级种子培养基，在37℃，250rpm摇床培养24小时，用于发酵罐培养基接种。
(3)发酵罐补料发酵生产：取200mL上述二级种子菌液，接种于装有2L初始发酵罐培养基的5L Biotech-5BG发酵罐中(上海保兴生物设备工程有限公司)，在37℃，pH6.5(通过浓氨水调控pH)，溶氧20％的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/L。定时取样分析发酵生产情况。
大肠杆菌重组菌株GT14的放大发酵结果如图3所示。
具体来说，在5L发酵罐放大发酵50小时，对于菌株GT14，菌株OD，DHS产量与转化率分别为120.4，103.15g/L，37.1％M/M，较对照菌株WJ060(131.4，94.4g/L，32.65％M/M)分别变化了-8.3％，9.3％以及13.63％。
实施例5：大肠杆菌重组菌株GT10/GT12的放大发酵和GT52/GT58/GT23/GT49/GT60的摇瓶发酵和放大发酵的方法及结果
除了将实施例3-4中的大肠杆菌重组菌株GT14替换为GT10/GT12/GT52/GT58/GT23/GT49/GT60以外，采用和实施例3-4中相同的方法步骤，并且保持其它条件不变，检测大肠杆菌重组菌株GT10/GT12/GT52/GT58/GT23/GT49/GT60摇瓶发酵和放大发酵的结果。
前述重组菌株的具体的实验结果如图4-7所示。
具体来说，菌株GT52在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率分别为13.7g/L，41.4％M/M，较菌株GT14分别提高了29.1％以及15.6％。与此同时，在无机盐发酵培养基进行5L发酵罐放大发酵时，菌株OD以及DHS产量为56g/L以及67.2g/L，其仅为菌株GT14(OD 120.4，103.15g/L)的46.5％以及65.1％，表明aceE的弱化表达显著影响了菌株的生长进而影响了DHS的产量。进一步的，通过添加5g/L酵母抽提物，5L发酵罐发酵52小时，菌株GT52的OD、DHS产量以及转化率分别为109.4，118.2g/L以及39.3％M/M，较菌株GT14分别变化了-9％，14.6％以及6％，并且较菌株WJ060分别变化了-16.5％，25.2％以及20.4％。结果表明静态调控弱化aceE的表达会显著的提高DHS转化率。
菌株GT58在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率分别为14.03g/L，41.7％M/M，较菌株GT14分别提高了32.2％以及16.5％。与此同时，在无机盐发酵培养基进行5L发酵罐放大发酵52小时，菌株OD，DHS产量与转化率分别为90.1，104.4g/L以及42.9％M/M，较菌株GT14分别变化了-16.7％，1.2％以及14％。(较菌株WJ060分别变化了-31.4％，10.6％以及31.4％。)结果表明动态调控aceE的表达会显著的提高DHS转化率。
菌株GT49在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率分别为14.82g/L，42.2％M/M，较菌株GT14分别提高了39.7％以及17.9％。与此同时，在无机盐发酵培养基进行5L发酵罐放大发酵52小时，菌株OD，DHS产量与转化率分别为91.2，93.8g/L，43％M/M，较菌株GT14分别变化了-24.2％，-9％以及15.9％。(较菌株WJ060分别变化了-30.6％，-1％以及31.7％。)结果表明敲除zwf并精细调控pgi表达以及精细调控gapN和gapA表达会显著的提高DHS转化率。
菌株GT23在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率分别为11.34g/L，37％M/M，较菌株GT14分别提高了6.9％以及3.3％。与此同时，在无机盐发酵培养基进行5L发酵罐放大发酵55小时，菌株OD，DHS产量与转化率分别为94，106.12g/L、40.7％M/M，较菌株GT14分别变化了-21.9％，2.9％以及9.7％。(较菌株WJ060分别变化了-28.5％，12.4％以及24.7％。)结果表明静态弱化zwf的表达有效的提升了DHS的转化率。
菌株GT60在摇瓶发酵水平上，DHS产量与转化率分别为15.58g/L，40.8％M/M，较菌株WJ060分别提高了175％以及109％。与此同时，在无机盐发酵培养基进行5L发酵罐放大发酵60小时，菌株OD，DHS产量以及转化率分别为41.1，68.3g/L以及46.3％M/M。表明组合弱化aceE以及zwf时，菌株的生长更加缓慢。进一步的，通过添加5g/L酵母抽提物，在5L发酵罐放大发酵46小时，菌株OD，DHS产量以及转化率分别为77.4，107.4g/L以及46.73％M/M，较菌株WJ060分别变化了-41.1％，13.8％以及43.1％。
本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。
此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。
Claims (14)
1.一种用于3-脱氢莽草酸生产的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，具有如下(a)、(b)、(c)所示的特性：
(a)增强的磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(b)增强的磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和
(c)降低或消失的乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，在野生型微生物或出发菌株中，
插入编码磷酸转酮酶的基因，以增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
在起始磷酸乙酰基转移酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；或
敲除编码乙酸激酶的基因，以降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
其中，所述调控元件P3的序列如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(d)所示的特性：
(d)增强的脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
可选的，在起始脱氢奎尼酸合成酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
优选的，编码所述脱氢奎尼酸合成酶基因的核酸序列如SEQ ID NO：11所示。
4.根据权利要求3所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(e)所示的特性：
(e)降低或消失的丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
可选的，将野生型微生物或出发菌株中表达丙酮酸激酶的基因敲除，以使得野生型微生物或出发菌株中丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平降低或消失。
5.根据权利要求4所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(f)、(g)、(h)、(j)或(k)所示的特性：
(f)降低或消失的丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(g)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，以及在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；
(h)降低或消失的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(j)降低或消失的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，增强的NAD(P)依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，增强的葡萄糖-6-磷酸异构酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，和降低或消失的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
(k)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和降低或消失的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
可选的，
对于(f)，在起始丙酮酸脱氢酶E1翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为TTG，以降低或消失丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
对于(h)，在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
对于(j)，将野生型微生物或出发菌株中表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因敲除，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，以降低或消失甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和在起始葡萄糖-6-磷酸异构酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P2，或进一步将所述调控元件P2的起始密码子由ATG突变为GTG；
对于(k)，在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
其中，所述编码Esal蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码EsaRI70V蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述PeasR-C启动子的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述调控元件P1的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述调控元件P2的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。
6.一种用于3-脱氢莽草酸生产的重组微生物的制备方法，其中，所述方法包含如下步骤：
(a1)相较于野生型微生物或出发菌株，增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤；和
(b1)相较于野生型微生物或出发菌株，增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤；和
(c1)相较于野生型微生物或出发菌株，降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤。
7.根据权利要求6所述的重组微生物的制备方法，其中，在野生型微生物或出发菌株中，
插入编码磷酸转酮酶的基因，以增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
在起始磷酸乙酰基转移酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；或
敲除编码乙酸激酶的基因，以降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
其中，所述调控元件P3的序列如SEQ ID NO：1所示。
8.根据权利要求6-7任一项所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法还包含如下步骤：
(d1)增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤；
可选的，在起始脱氢奎尼酸合成酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。
9.根据权利要求8所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法还包含如下步骤：
(e1)敲除或敲减所述重组微生物中编码丙酮酸激酶基因的步骤；
可选的，将野生型微生物或出发菌株中表达丙酮酸激酶的基因敲除，以使得野生型微生物或出发菌株中丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平降低或消失。
10.根据权利要求9所述的重组微生物的制备方法，其中，所述方法还包含如下步骤：
(f1)敲除或敲减所述重组微生物中编码丙酮酸脱氢酶E1基因的步骤；
(g1)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，以及在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列的步骤；
(h1)敲除或敲减所述重组微生物中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的步骤；
(j1)敲除或敲减所述重组微生物中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因，增强NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，和敲除或敲减所述重组微生物中编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的步骤；
(k1)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和敲除或敲减所述重组微生物中编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因的步骤；
可选的，
对于(f1)，在起始丙酮酸脱氢酶E1翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为TTG，以降低或消失丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
对于(h1)，在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
对于(j1)，将野生型微生物或出发菌株中表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的基因敲除，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强NAD(P)H依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始甘油醛-3-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，以降低或消失甘油醛-3-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和在起始葡萄糖-6-磷酸异构酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P2，或进一步将所述调控元件P2的起始密码子由ATG突变为GTG；
对于(k1)，在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaRI70V蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR-C启动子的核酸序列；和在起始葡萄糖-6-磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；
其中，所述编码Esal蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码EsaRI70V蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述PeasR-C启动子的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述调控元件P1的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述调控元件P2的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。
11.菌株，其中，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.22068，CGMCC No.22069，CGMCCNo.22070或CGMCC No.24671。
12.权利要求1-5任一项所述的重组微生物或权利要求11所述的菌株在生产3-脱氢莽草酸中的应用。
13.一种生产3-脱氢莽草酸的方法，其中，包括：以葡萄糖为底物，利用权利要求1-5任一项所述的重组微生物或权利要求11所述的菌株进行发酵反应的步骤。
14.根据权利要求13所述的生产3-脱氢莽草酸的方法，其中，所述方法还包括在培养基中添加酵母抽提物的步骤；优选的，所述方法还包括在所述发酵反应结束后，从所述发酵反应液中分离3-脱氢莽草酸的步骤。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BO XIONG等: "Flux redistribution of central carbon metabolism for efficient production of L‐tryptophan in Escherichia coli", BIOTECHNO BIOENG, vol. 118, no. 3, 13 January 2021 (2021-01-13), pages 1393 - 1404 * |
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