CN104817632A

CN104817632A - 拟态弧菌ta系统毒素蛋白及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN104817632A
Application number: CN201510224056.XA
Authority: CN
Inventors: 罗鹏; 何香燕; 胡超群
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2015-08-05
Anticipated expiration: 2035-05-05
Also published as: CN104817632B

Abstract

本发明公开一种拟态弧菌TA系统毒素蛋白及其编码基因和应用。本发明的拟态弧菌TA系统毒素蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明首次在拟态弧菌中发现了TA系统的存在，并证实了TA系统中关键毒素基因vmi480是一种新型的毒素基因，该基因的产物对细菌细胞具有强烈的致死作用，且毒性作用范围广泛，因此可以替代目前应用广泛但假阳性较严重的致死基因ccdB、sacB等。将vmi480应用于克隆载体和自杀载体的构建将大大提高阳性重组子的筛选效率，减少实验室的工作量。

Description

拟态弧菌TA系统毒素蛋白及其编码基因和应用

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种拟态弧菌(Vibrio mimicus)TA系统毒素蛋白及其编码基因和应用。

背景技术：

毒素-抗毒素(toxin-antitoxin,TA)系统最初发现于一些低拷贝质粒中，它们是一对密切相关的基因组合，其中一个编码稳定的毒素，另一个编码不太稳定的抗毒素(王晓蕾等，2008)。当细菌细胞分裂时，如果子代细胞丢失此质粒，不太稳定的抗毒素很快降解，而稳定的毒素则发挥毒性杀死细胞，这种效应被称作分裂后致死效应，质粒借此得以在宿主中稳定存在(Jump等，2001)。随着生物测序技术及生物信息学分析技术的发展，至2008年已经在测序的原核生物中发现671个TA系统位点，分布于126个物种中，它们隶属于7个经典的TA基因家族。(王晓蕾等，2008)。TA系统并不局限于细菌质粒中，也存在于细菌染色体的一些潜在的移动遗传元件上(Ghafourian等，2013)。

近年来，微生物学家开始在生物研究中应用细菌的TA系统作为工具，来自于TA系统的致死基因常用作载体的选择标记(Ghafourian等，2013)。其中以致死基因ccdB、sacB应用最为广泛。克隆基因片段是分子生物学最常规的操作，进行微生物的基因缺失突变是微生物分子生物学最常见的研究基因功能的手段。ccdB常用于制作克隆载体或基于基因缺失目的用于反向选择的标记(如：Bernard等，1996；Mondon等2000；Traore等,2011)；sacB则常用于构建自杀载体，便于同源重组子的反向筛选(Kaniga等，1991；Philippe等，2004；Quénée等，2005)。Invitrogen公司基于ccdB基因构建了一系列用于克隆的商业化载体，用于提高阳性克隆筛选的效率等目的(贾卉等，2009)。然而在实际应用中，我们发现含有ccdB源质粒的大肠杆菌在IPTG诱导的情况下，平板上仍然会有一些克隆长出，表明ccdB的毒性并非足够强烈到杀死所有的大肠杆菌细胞或者细菌细胞容易针对ccdB的靶位点进行自我修饰；此外还发现：当ccdB源的自杀载体发生第一次同源重组整合至弧菌基因组时，在IPTG诱导的情况下则完全不能发挥杀死弧菌细胞的作用，这表明ccdB表达产物的毒性具有宿主特异性。来源于芽孢杆菌的sacB致死基因表达后会代谢蔗糖并产生对多数革兰氏阴性菌致死的代谢产物(Gay等，1985),然而后来发现在基于sacB自杀质粒的同源重组中，一些细菌对于蔗糖代谢产物并不敏感，导致缺失突变株的筛选并不容易成功(Milton等，1996)；此外，sacB容易发生自发点突变，造成筛选时大量假阳性克隆的出现(Blomfield等，2006)。

综合上述，迫切需要发掘微生物遗传资源，筛选出新的具有广泛适用性和足够强烈毒性的致死基因，并应用于克隆载体或自杀载体，新的微生物致死基因的应用将大大提高目的片段阳性克隆的效率或筛选缺失突变体的效率。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种拟态弧菌TA系统毒素蛋白及其编码基因。

本发明的拟态弧菌TA系统毒素蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因，其特征在于，编码氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的拟态弧菌TA系统毒素蛋白。

编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因，优选，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于，含有上述编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因。

所述的表达载体，优选为严谨控制型表达载体pBAD30。长期以来缺乏既能在大肠杆菌内进行遗传操作并复制，又能在弧菌等海洋细菌中稳定保存的穿梭表达载体。本发明通过实验手段证实了pBAD30是一种穿梭能力强的表达载体，且能方便地对插入基因进行开启和关闭。

本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。

本发明的第四个目的是提供编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因在构建克隆载体和自杀载体中的应用。

本发明首先在拟态弧菌LP177的基因组survey中发现了一个具有潜在移动能力的基因岛GIVmi573，在进一步对GIVmi573进行生物信息学解析时发现一对基因vmi480/Vmi470，其疑似TA系统。为了验证其功能，本发明通过基因缺失方法验证vmi480功能，该方法主要采用λ同源重组的方式对vmi480及功能相关基因vmi470进行敲除，首先分别构建Δvmi480-470、Δvmi480、Δvmi470缺失突变株，再构建pBAD30-vmi480表达载体，将此表达载体成功电转入大肠杆菌、野生海洋细菌溶藻弧菌E001和海藻施万氏菌E114，并在其中操控表达，以此确定其对于弧菌、海藻施万氏菌以及大肠杆菌等具有强烈的致死作用。

本发明首次在拟态弧菌中发现了TA系统的存在，并通过实验手段证实了TA系统中关键毒素基因vmi480的功能，实验结果表明vmi480是一种新型的毒素基因，该基因的产物对细菌细胞具有强烈的致死作用，且毒性作用范围广泛，因此可以替代目前应用广泛但假阳性较严重的致死基因ccdB、sacB等。在实际应用中只需要将vmi480替换以往克隆载体中使用的ccdB基因(如：Invitrogen公司的系列载体)等毒素基因即可，或用于替代自杀载体中用于反向选择的毒素基因，如：sacB(如：Quénée等，2005)。将vmi480应用于克隆载体和自杀载体的构建将大大提高阳性重组子的筛选效率，减少实验室的工作量。鉴于基因克隆以及基因功能研究的广泛性，vmi480将有广阔的应用前景并产生可观的经济价值。

本发明的拟态弧菌(Vibrio mimicus)LP177为发明人所在实验室保藏，本申请人保证自申请日起20年内向公众提供该拟态弧菌(Vibrio mimicus)LP177。

附图说明：

图1是毒素基因vmi480所在操纵子结构示意图，其中P代表启动子区；

图2是与毒素基因vmi480相关的基因vmi470编码蛋白保守结构域，其中黑色三角形代表Vmi470与抗毒素蛋白HipB在保守结构域基序中共有的氨基酸残基位点；

图3是毒素基因vmi480编码蛋白的Blastx比对结果图；

图4是毒素基因vmi480在不同细菌中的严谨控制表达，其中1A，1B，1C分别代表大肠杆菌NEB5α(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生长情况；2A，2B，2C分别代表溶藻弧菌E0601(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生长情况；3A，3B，3C分别代表海藻施万氏菌E114(pBAD30-vmi480)在LB平板A，B，C生长情况。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法的均为采用本领域技术人员所熟知的常规手段。

以下实施例中所涉及的材料及来源如下：

拟态弧菌LP177为本实验室保存菌株，pBAD30、pKD46、pKD4、pCP20、pVCR94质粒及其宿主大肠杆菌NEB5α、大肠杆菌MG1655由加拿大舍布鲁克大学馈赠。EcoR I、Xba I、T4DNA连接、Thempol Taq聚合酶、pfu高保真酶、Q5高保真酶、PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自NEB公司。LB培养基购自Amersco公司。脑心浸液培养基购自BD公司。

实施例1：

1、拟态弧菌LP177基因组测序、注释及vmi480基因发现

传统酚/氯仿法提取拟态弧菌LP177基因组DNA，DNA送交华大基因(深圳)进行Illumina平台测序，测序共获得127个scaffold序列。序列递交在线RAST微生物基因组注释工具(http://rast.nmpdr.org/)进行注释。在对注释结果进行分析时，发现scaffold7序列存在一个完整的疑似可移动的小型基因岛，命名MGIVmi-1。

对MGIVmi-1详细分析发现，该小型基因岛具备左右二端相同的att位点、整合酶基因int，剪切酶基因xis，参与识别转移起始位点(oriT)的基因mobI以及在整合性结合元件(ICE)中常见的限制性修饰系统(RM)。其它多数基因功能未知，基因vmi480与vmi470紧密相邻，位于同一操纵子上(如图1所示)。

Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD＝Web&PAGE_TYPE＝BlastHome)搜索发现Vmi470属于可以与DNA结合的XRE蛋白家族成员，大肠杆菌TA系统的hipB抗毒素蛋白与Vmi470相似性非常低(小于30％)，但是二者同属XRE家族，具有相同的关键基序的残基(如图2所示)，因此推测二者具有类似的功能。Blastx搜索未得到vmi480潜在功能的任何预测结果，提示这是一个功能未知的新基因(如图3所示)。

vmi480基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示，vmi480编码氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、拟态弧菌LP177基因vmi480、vmi470缺失突变

为了研究vmi480、vmi470基因的功能，分别对vmi480、vmi470以及双基因进行敲除，目前便利的原核生物基因敲除只能在大肠杆菌中顺利实现，因此在铺助质粒pVCR94的帮助下，将包含vmi480、vmi470的基因岛MGIVmi-1通过常规的细菌接合，驱动转移至大肠杆菌MG1655中。

vmi470基因缺失突变所用PCR片段引物如下：

MGVmi 470-F:GAAAGTACAAAAAAAGGTCTCTGATGAGTAAAAGAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

MGVmi 470-R:CTTAAGATGGGTTACTAGTTGGCCATTTAAGATAGTATTCCGGGGATCCGTCGACC

划线部分为同源臂，插入marker基因扩增模板来自质粒pKD13。

vmi480基因缺失突变所用PCR片段引物如下：

MGVmi 480-F:TTTTGCATAATTTAACCCAGTATACGGATAGAACGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG

MGVmi 480-R:CTCGCCGTTAAAACGATTAACAGCTTGATAAATCATCATATGAATATCCTCCTTA

划线部分为同源臂，插入marker基因扩增模板来自质粒pKD4。

vmi480-470双基因突变则采用MGVmi 480-F与MGVmi 470-R组合，插入marker基因模板来自质粒pKD13。

PCR酶采用NEB Thempol Taq与NEB pfu高保真酶混合(10：1，V/V)。PCR反应体系为：模板1μL(50-100ng)，上下游引物各8μL(10μM/μL)，dNTP(2.5mM each)32μL，10×PCRbuffer 40μL，混合酶4μL，去离水319μL；PCR程序：94℃预变性4min；94℃变性20sec,52℃退火30sec,72℃延伸100sec,30个循环；最后72℃延伸4min。PCR产物纯化采用NEBPCR产物纯化试剂盒进行。

PCR产物参照文献方法(Datsenko et al.One-step inactivation of chromosomal genes inEscherichia coli K-12using PCR products.PNAS,2000,97(12):20163297)进行电击转化并同源重组MGIVm-1中相应基因位点。

结果获得vmi480及vmi480-470缺失突变株，不能单独获得vmi470缺失突变株，表明在vmi470缺失的情况下，vmi480产物表现出强烈的毒性，vmi480的表达对细胞是致命的，vmi470则有拮抗这种毒性的功能，结合vmi470与HipB具有类似的结构域，同属一个蛋白家族，因此推测vmi470-vmi480可能是一种新的TA系统。

3、vmi480基因严密控制表达载体构建及大肠杆菌表达

为了明确vmi480基因的功能，需要构建表达载体，鉴于vmi480基因的表达产物可能是致死的，一般的表达载体并不能适用，因此采用了一种严密控制型表达载体pBAD30。

vmi480基因表达引物如下：

MGVmi480exF:ACGTATGAATTCAGGAGGAATTCACCATGACCAAAAAACCTGAATTTTAT

MGVmi480exR:CAGCTATCTAGATTACTCATCAGAGACCTTTTTTTG

二端划线部分分别为EcoR I和Xba I酶切位点。

PCR采用NEB Q5高保真酶。PCR产物及pBAD30质粒经EcoR I和Xba I双酶切再纯化。纯化产物以3：1(摩尔比)混合，T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌NEB5α感受态细胞，42℃热激30sec，37℃恢复培养1小时后，涂布LB平板(D-葡萄糖0.3％，氨苄青霉素100ng/ml)。

挑取10个克隆进行PCR鉴定，鉴定引物同vmi480基因表达引物。阳性克隆PCR片段长度635bp，阳性PCR产物递交Invitrogen公司进行测序，测序结果表明vmi480基因正确插入了质粒pBAD30的多克隆位点，得到重组表达载体pBAD30-vmi480。

阳性克隆大肠杆菌NEB5α(pBAD30-vmi480)于LB液体中(D-葡萄糖0.3％，氨苄青霉素100ng/ml)扩大培养，10^-5倍稀释后分别涂布LB平板A(D-葡萄糖0.3％，氨苄青霉素100ng/ml)、LB平板B(氨苄青霉素100ng/ml)、LB平板C(L-阿拉伯糖0.2％，氨苄青霉素100ng/ml)。D-葡萄糖主要起封闭vmi480基因表达作用，L-阿拉伯糖主要起诱导vmi480基因表达作用，在不加入二者的情况下，位于pBAD30质粒载体中的vmi480基因则可呈现低程度的泄漏表达。

结果表明：大肠杆菌NEB5α(pBAD30-vmi480)不能在LB平板B、LB平板C上生长，仅能在LB平板A在生长(如图4所示：1B,1C,IA)，这一结果证实：vmi480是一种强烈的毒素基因，vmi480极其微量的表达对于宿主细胞来说都是致命的，vmi480产物具有强烈杀大肠杆菌细胞作用。

4、pBAD30-vmi480电转化海藻施万氏菌E114、溶藻弧菌E0601并表达vmi480

从上述步骤3的大肠杆菌NEB5α(pBAD30-vmi480)中提取质粒pBAD30-vmi480备用(pBAD30-vmi480浓度50ng/μL)。

于脑心浸液培养基(BHI)中过夜培养海藻施万氏菌E114(200ng/ml氨苄青霉素敏感)、溶藻弧菌E0601(200ng/ml氨苄青霉素敏感)，培养温度37℃。pBAD30-vmi480质粒1μL电转化海藻施万氏菌E114及溶藻弧菌E0601，电转化的方法参见发明人本人已公开专利(CN104195073A)。电击电压1.5kV，电击时间5ms。电击后细胞悬液迅速加入BHI培养基(D-葡萄糖0.3％)，37℃恢复培养3小时，培养液稀释10倍、100倍后分别取100μL涂布LB平板A，37℃过夜培养后，10倍、100倍稀释涂布平板均有菌落长出。此结果表明：在封闭vmi480表达的情况下，pBAD30-vmi480质粒能够成功在亲缘关系远的海洋野生菌株中保存并复制，pBAD30是一种良好的穿梭表达质粒。

分别挑取海藻施万氏菌E114(pBAD30-vmi480)、溶藻弧菌E0601(pBAD30-vmi480)菌落于LB液体中(D-葡萄糖0.3％，氨苄青霉素100ng/ml)扩大培养，10^-5倍稀释后分别涂布LB平板A、LB平板B、LB平板C，37℃培养。

结果发现海藻施万氏菌E114(pBAD30-vmi480)、溶藻弧菌E0601(pBAD30-vmi480)仅能在LB平板A生长，不能在LB平板B和C生长(如图4所示:2A,2B,2C,3A,3B,3C)。这一结果证实：vmi480极其微量的表达对海藻施万氏菌及溶藻弧菌都是致命的，Vmi480表现出强烈的毒性。结合上述步骤3的结果表明：Vmi480的毒性作用并不因宿主的不同而改变，提示Vmi480的毒性作用范围广泛，这为其在克隆载体和自杀载体中的应用打下了基础。

Claims

1.一种拟态弧菌TA系统毒素蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种表达载体，其特征在于，含有权利要求2或3所述的编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为严谨控制型表达载体pBAD30。

6.一种含有权利要求4或5所述的表达载体的微生物。

7.权利要求2所述的编码拟态弧菌TA系统毒素蛋白的基因在构建克隆载体和自杀载体中的应用。