CN113846114B - 烟粉虱致死基因及应用和rna干扰剂及干扰剂的制备方法和应用 - Google Patents

烟粉虱致死基因及应用和rna干扰剂及干扰剂的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应用,烟粉虱致死基因为天门冬氨基氨酸转移酶的编码基因。烟粉虱致死基因与天门冬氨基氨酸转移酶的基因表达量和活性相关，能够催化转氨基反应，将氨基从天门冬氨酸转移到α‑酮戊二酸，通过破坏该基因可应用于杀灭烟粉虱。RNA干扰剂根据烟粉虱致死基因合成的dsRNA，其制备方法为：合成cDNA第一条链，RT‑PCR扩增；合成dsRNA。本发明的RNA干扰剂，能够降低AST相对基因表达量，从而降低烟粉虱代谢所吸收的氨基酸的能力，影响烟粉虱对氨基酸的消化和吸收，影响烟粉虱的生长发育，从而有效控制烟粉虱种群增长，进而减少对番茄褪绿病毒病的传播。

Description

烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应。
背景技术
近年来，番茄褪绿病毒的危害并没有明显减少，而烟粉虱的防治依旧困难。物理防控主要有加强田间管理、及时清理田间杂草和带毒苗、设置防虫网以防止烟粉虱侵入、悬挂粘虫板以诱杀烟粉虱等。化学防控主要是喷洒5％噻嗪酮（扑虱灵）可湿性粉剂、10％吡虫啉可湿性粉剂、25％噻虫嗪水（阿克泰）分散剂等杀虫剂。尽管已有烟粉虱防治措施有很多，但是RNAi（RNA interference）技术在防治中应用仍然稀缺，尤其是关于烟粉虱的靶标太少，所以寻找既能控制烟粉虱同时又能控制病毒病的靶标迫在眉睫。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi主要通过在转录后水平阻断基因表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。 这是一种针对烟粉虱的特异性杀虫剂，对其他的昆虫、哺乳动物等没有危害，特异性高，见效快，致死率高，对环境无污染，属于一种新型绿色的杀虫方法。这为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种烟粉虱致死基因和RNA干扰剂以及RNA干扰剂的制备方法和应用。本发明的烟粉虱致死基因与天门冬氨酸氨基转移酶的基因表达量和活性相关，在携带ToCV病毒的烟粉虱中，其天门冬氨酸氨基转移酶的相对表达量和酶活均高于健康烟粉虱。根据烟粉虱天门冬氨酸氨基转移酶基因设计的RNA干扰剂可抑制天门冬氨酸氨基转移酶的相对基因表达量，从而降低烟粉虱代谢所吸收的氨基酸的能力，影响烟粉虱对氨基酸的消化和吸收，从而影响烟粉虱的生长发育，甚至可能导致烟粉虱死亡，从而有效控制烟粉虱种群增长，进而减少对病毒病的传播。而利用RNAi的技术减少病虫害的传播，具有绿色环保，抗虫性稳定，降低抗药性等优势。
为了实现上述目的，本发明提供了一种烟粉虱致死基因，所述烟粉虱致死基因为天门冬氨酸氨基转移酶的编码基因，所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的烟粉虱致死基因在杀灭烟粉虱中的应用。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种RNA干扰剂，所述RNA干扰剂根据上述的烟粉虱致死基因合成的dsRNA，所述dsRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的RNA干扰剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、根据天门冬氨酸氨基转移酶的编码基因序列合成引物对，提取烟粉虱RNA，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链，
S2、以烟粉虱的cDNA第一条链为模板，进行RT-PCR得到扩增产物；
S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到目标DNA片段；
S4、将所述目标DNA片段用PROMEGA dsRNA合成试剂盒合成dsRNA，即为RNA干扰剂。
上述的制备方法，进一步的，所述S1中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
基于一种总的技术构思，本发明还提供了一种上述的RNA干扰剂在降低烟粉虱基因表达中的应用。
上述的应用，进一步的，所述应用的方法为：
（1）将15 %的蔗糖溶液与不同体积的AST dsRNA混匀得到饲喂营养液；
（2）将饲喂营养液置于饲喂管中，与烟粉虱一起培养48 h；
（3）计算饲喂RNA干扰剂后烟粉虱的死亡率，同时采用RT-qPCR的方法检测饲喂后的烟粉虱体内AST的相对分子表达量。
上述的应用，进一步的，所述（2）中所述培养的条件为：光照比为14︰10，湿度80%。
上述的应用，进一步的，所述（3）中所述RT-qPCR采用的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ IDNO.6所示。
基于一种总的技术构思，本发明还提供了一种上述的RNA干扰剂在降低烟粉虱获毒和传毒中的应用。
上述的应用，进一步的，所述应用方法包括以下步骤：
（1）将饲喂了含AST dsRNA营养液的烟粉虱置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株中培养48 h，考察烟粉虱获取病毒率和获取病毒数量；
（2）取食带毒苗48 h后，将烟粉虱通过虫传的方法进行传毒，观察饲喂RNA干扰剂后30 d内烟粉虱传播到番茄的病毒率和病毒数量。
现有技术相比，本发明的优点在于：
（1）本发明提供了一种烟粉虱氨基酸代谢基因，烟粉虱致死基因为Aspartateaminotransferase（AST），Aspartate aminotransferase基因编码天门冬氨酸氨基转移酶，天门冬氨酸氨基转移酶，也称谷草转氨酶，是一种磷酸吡哆醛蛋白质，能够催化转氨基反应，将氨基从天门冬氨酸转移到α-酮戊二酸。烟粉虱代谢基因与天门冬氨酸氨基转移酶的基因表达量和活性相关，在携带ToCV病毒的烟粉虱中，其天门冬氨酸氨基转移酶的相对表达量和酶活均高于健康烟粉虱。同时当降低烟粉虱体内天门冬氨酸氨基转移酶基因表达量时，也降低了烟粉虱对番茄褪绿病毒的获毒率和传播率，从而降低病毒病的发生。因此，基于天门冬氨酸氨基转移酶的特性，本发明可以设计阻断该基因表达的物质，从而达到杀灭烟粉虱的目的。
（2）本发明提供了一种RNA干扰剂，该RNA干扰剂是基于烟粉虱的天门冬氨酸氨基转移酶特异基因进行设计，合成AST dsRNA，该dsRNA可以诱发同源mRNA高效特异性降解，通过在转录后水平阻断天门冬氨酸氨基转移酶基因表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。从而能降低烟粉虱代谢所吸收的氨基酸的能力，影响烟粉虱对氨基酸的消化和吸收，从而影响烟粉虱的生长发育，甚至可能导致烟粉虱死亡。从而有效控制烟粉虱种群增长，进而减少对番茄褪绿病毒病的传播。而利用RNAi的技术减少病虫害的传播，具有绿色环保，抗虫性稳定，降低抗药性等优势。
（3）本发明提供了一种RNA干扰剂，该RNA干扰剂是基于Aspartateaminotransferase设计的dsRNA，这是一种针对烟粉虱的特异性杀虫剂，对其他的昆虫、哺乳动物等没有危害，特异性高，见效快，致死率高，对环境无污染，属于一种新型绿色的杀虫方法。这为利用RNA干扰技术控制害虫提供了新途径。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中携带ToCV烟粉虱（绿色）和健康烟粉虱（黄色）体内天门冬氨酸氨基转移酶的相对表达量。
图2为本发明实施例1中携带ToCV烟粉虱（绿色）和健康烟粉虱（黄色）体内天门冬氨酸氨基转移酶酶活。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种烟粉虱致死基因，具体为天门冬氨酸氨基转移酶的编码基因Aspartateaminotransferase，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：
ATGACCTCTTCGGTTTTCTCCTCCATTGAGCCTGGAATACTGAACGAAATATGCGCATTGCACGAGGAATTTTGCAGCGATCCTTACAGGAAGAAGGTGGATCTTGTTAAAGGAGCTTATCCGACGGACGAAGGAAAACCATGGGTTTTGCCTGTGGTCAGGAAAACTGAAATCATTCTGGCAAACGATGAAAATACCTTTCATGAGTCTGAACATTTTCTGAGCTCCAGCGAGTTTACTGATGCAGCCACTTCCTCACTACTGGGCGAAAAATCCATCGCCGTTCAAGACAAGAGGAAGAGTTTGGGACGCTCACACTTTTACTTATCTGACCCCCATTGGAACGCCTACGAAGTCATAATCATGCAAGCAGGTTTCGAGAAAAGCTCTCGTTACCGATATTGGAATGCGGAGAAACAATGCATTGACATGGATGGACTTTTGGAGGATTTGTCAAAGGCAGAGCCAACTTCGGTCGTTTTACTCCAAGCGTGTGCGCATAACCCGACTGGGTGTGATCCTACCCCCGAACAGTGGGCAAAAATAGCTTCTCTCATGAAGAAAAATAGATTGTTCCCATTCTTCGACATAGCTTATCAAGGTTTGGCGTCTGGTGATATGGACGAAGATGCAGAGGCTGTTCGCTATTTCGTTGACCAGGGTTTCGAGTTACTGTGCGCGCAATCTTTTTCTAAGAACTTTGGTCTTTACGGTGAACGAGTAGGAAGCCTCACTATTGTCTCAAATTGTGCCCATACAATGCCTCATATAGTATCCAAGATGATTAACATCGCTGAGGGCAATTATCTGGTGCCACCCCTCCATGGAACTGCTCAAATTGAGTACTTGAGGAAAAAGCACCATGTCTATACATTGGAAAATGGGAGGATGAACGTCGCAGCGCTGACACCCTTAAACTTGGACCACGTCGCCTGGAGTATTCATGATACTTCTGAACAGCCCGCCGGAAAATGTTGA。
实验一：检测烟粉虱致死基因的相对表达量
烟粉虱致死基因的相对表达量的检测方法包括以下步骤：
（1）健康烟粉虱饥饿处理2 h后，置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株和健康的番茄植株中，分别在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h时收集30头烟粉虱。
（2）采用TRIzol Reagent提取烟粉虱总RNA，使用NanoDrop 2000测定其RNA浓度。
（3）将RNA浓度定量500 ng，合成cDNA第一条链。
（4）根据Aspartate aminotransferase的DNA序列，用primer premier 5设计引物。
上游引物F2的DNA序列如SEQ ID NO .5所示，具体为：GACCTCTTCGGTTTTCTCCT。
下游引物R2的DNA序列如SEQ ID NO .6所示，具体为：GGTATTTTCATCGTTTGCCA。
（5）以步骤（3）cDNA为模板，以步骤（4）设计的引物为上下游引物，进行RT-qPCR扩增，扩增体系为：
ddH2O8.2 μL
2×Ace Q qPCR SYBR Green Master Mix10 μL
cDNA模板1 μL
上游引物F2 (10 μM)0.4 μL
下游引物R2 (10 μM)0.4 μL
RT-qPCR的反应程序为：
95℃预变性5 min；
95℃ 10 sec，
53℃ 30 sec，循环反应40次
95℃ 15 sec，
60℃ 60 sec，
95℃ 15 sec。
（6）采用RT-qPCR的方法检测不同时间内携带ToCV病毒烟粉虱和健康烟粉虱体内AST的相对分子表达量，结果参考图1。
从图1中可以看出，在携带ToCV病毒的烟粉虱中，其天门冬氨酸氨基转移酶的相对表达量均高于健康烟粉虱。
实验二：检测天门冬氨酸氨基转移酶的酶活
天门冬氨酸氨基转移酶的酶活的检测方法包括以下步骤：
（1）健康烟粉虱饥饿处理2 h后，置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株和健康的番茄植株中，分别在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h时收集30头烟粉虱。
（2）采用BCA法测定烟粉虱蛋白浓度。
（3）按照索莱宝生物公司天门冬氨酸氨基转移酶活性检测试剂盒说明书进行天门冬氨酸氨基转移酶酶活性检测，结果参考图2。
从图2中可以看出，在携带ToCV病毒的烟粉虱中，其天门冬氨酸氨基转移酶的酶活均高于健康烟粉虱。
实施例2：
一种本发明的RNA干扰剂，由实施例1的Aspartate aminotransferase基因片段合成dsRNA，RNA干扰剂的序列如SEQ ID NO.4所示，是将实施例1的目标DNA片段用PROMEGAdsRNA合成试剂盒进行dsRNA的合成得到含有烟粉虱致死基因片段Aspartateaminotransferase的dsRNA，具体为：
CGAGUUUACUGAUGCAGCCACUUCCUCACUACUGGGCGAAAAAUCCAUCGCCGUUCAAGACAAGAGGAAGAGUUUGGGACGCUCACACUUUUACUUAUCUGACCCCCAUUGGAACGCCUACGAAGUCAUAAUCAUGCAAGCAGGUUUCGAGAAAAGCUCUCGUUACCGAUAUUGGAAUGCGGAGAAACAAUGCAUUGACAUGGAUGGACUUUUGGAGGAUUUGUCAAAGGCAGAGCCAACUUCGGUCGUUUUACUCCAAGCGUGUGCGCAUAACCCGACUGGGUGUGAUCCUACCCCCGAACAGUGGGCAAAAAUAGCUUCUCUCAUGAAGAAAAAUAGAUUGUUCCCAUUCUUCGACAUAGCUUAUCAAGGUUUGGCGUCUGGUGAUAUGGACGAAGAUGCAGAGGCUGUUCGCUAU。
其制备方法包括以下步骤：
（1）收集烟粉虱50～60头，采用TRIzol Reagent提取烟粉虱总RNA，合成cDNA第一条链。
（2）根据Aspartate aminotransferase的DNA序列，用primer premier 5设计引物。
上游引物F1的DNA序列如SEQ ID NO .2所示，具体为：ATTCTCTAGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGCGAGTTTACTGATGCAGCCA。
下游引物R1的DNA序列如SEQ ID NO .3所示，具体为：ATTCTCTAGAAGCTTAATACGACTCACTATAGGGATAGCGAACAGCCTCTGCAT。
（3）以步骤（1）的cDNA为模板，以步骤（2）设计的引物为上下游引物，进行RT-PCR扩增，扩增体系为：
ddH2O20 μL，
2×Phanta Max Buffer25 μL
dNTP (10 mM each)1 μL
cDNA模板1 μL
上游引物F2 (10 μM)1 μL
下游引物R2 (10 μM)1 μL
Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase1 μL
RT-PCR的反应程序为：
95℃预变性3 min，
95℃变性15 sec，
53℃退火30 sec，循环变性、退火、延伸35次，
72℃延伸30 sec，
72℃彻底延伸5 min。
（4）将经过RT-PCR获得扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，得到目标DNA片段。
（5）将所得目标DNA片段用T1连接酶连接至pEASY-T1载体中获得重组子，使重组子转化到大肠杆菌T1中获得转化子。
（6）将转化子培养并均匀涂于含有氨苄青霉素的LB培养基，37℃过夜培养，得到克隆质粒。
（7）挑取LB培养基中白色单菌落，筛选阳性重组子。用含氨苄青霉素的LB培养液将阳性重组子进行RT-PCR扩增，得到Aspartate aminotransferase基因片段。
将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检查，得到Aspartate aminotransferase基因片段。扩增产物纯化回收送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析，结果显示扩增产物的DNA序列为SEQ ID NO .1所示的Aspartate aminotransferase基因片段。
实施例3
一种实施例2的RNA干扰剂在降低烟粉虱基因表达应用，其应用方法包括以下步骤：
（1）配制15 %的庶糖溶液（以水为溶剂），充分溶解后，采用0.22 μm的细菌滤器进行过滤，然后与不同体积的AST dsRNA混匀得到400 ng/μL饲喂营养液。
（2）将饲喂营养液加入至封口膜上，再用封口膜覆盖在液滴上，尽量排除气泡，形成含有饲喂营养液的小袋。将烟粉虱放置于玻璃管中，含有饲喂营养液的小袋朝向光源一端。
（3）塞上黑色棉塞，包上能够覆盖上玻璃管的遮光管套，放置在培养箱中，所需培养条件光照比为14︰10，湿度80%。
（4）饲喂48 h后，计算饲喂RNA干扰剂后烟粉虱的死亡率（结果参考表1）。
表1：饲喂dsRNA 48 h后死亡率
由表1可以得出，饲喂实施例2的AST dsRNA 48 h后，烟粉虱的死亡率显著高于饲喂GFP dsRNA 48 h后烟粉虱的死亡率 (P<0.01)。
实施例4
一种实施例2的RNA干扰剂在降低烟粉虱基因表达应用，其应用方法包括以下步骤：
（1）收集存活的烟粉虱，提取烟粉虱总RNA，使用NanoDrop 2000测定其RNA浓度。
（2）将RNA浓度定量500 ng，合成cDNA第一条链。
（3）根据Aspartate aminotransferase的DNA序列，用primer premier 5设计引物。
上游引物F2的DNA序列如SEQ ID NO .5所示，具体为：GACCTCTTCGGTTTTCTCCT。
下游引物R2的DNA序列如SEQ ID NO .6所示，具体为：GGTATTTTCATCGTTTGCCA。
（4）以步骤（2）的cDNA为模板，以步骤（3）设计的引物为上下游引物，进行RT-qPCR扩增，扩增体系为：
ddH2O8.2 μL
2×Ace Q qPCR SYBR Green Master Mix10 μL
cDNA模板1 μL
上游引物F2 (10 μM)0.4 μL
下游引物R2 (10 μM)0.4 μL
RT-qPCR的反应程序为：
95℃预变性5 min；
95℃ 10 sec，
53℃ 30 sec，循环反应40次
95℃ 15 sec，
60℃ 60 sec，
95℃ 15 sec。
（5）采用RT-qPCR的方法检测饲喂后的烟粉虱体内AST的相对分子表达量。
表2：饲喂dsRNA 48 h后AST相对表达量
由表2可以得出，饲喂实施例2的AST dsRNA 48 h后，烟粉虱的AST相对表达量显著低于饲喂GFP dsRNA 48 h后烟粉虱的AST相对表达量 (P<0.01)。
实施例5
一种实施例2的RNA干扰剂在降低烟粉虱获取病毒中的应用，其应用方法与实施例3相同，分别将饲喂了含AST dsRNA营养液的烟粉虱和饲喂了含GFP dsRNA营养液的烟粉虱置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株中，观察饲喂带毒苗后6 h、12 h、18 h、24 h、48 h内烟粉虱获取病毒率（结果参考表3）和获取病毒数量（结果参考表4）。
表3：干扰后烟粉虱在不同时间下的获毒率
由表3可以得出，不论是饲喂了AST dsRNA还是GFP dsRNA，随着烟粉虱获取的病毒时间的增长，获毒率均会增加。在6 h和12 h 时，饲喂AST dsRNA与GFP dsRNA的烟粉虱获毒率无显著差异，但是在18 h时饲喂AST dsRNA的烟粉虱获毒率显著低于饲喂GFP dsRNA的烟粉虱获毒率 (P<0.05)，同时在24 h和48 h时饲喂AST dsRNA的烟粉虱获毒率极显著低于饲喂GFP dsRNA的烟粉虱获毒率 (P<0.001)。证明本申请实施例2的AST dsRNA能够降低烟粉虱获毒率。
表4：干扰后烟粉虱在不同时间下的获毒量
由表4可以得出，不论是饲喂了AST dsRNA还是GFP dsRNA，随着烟粉虱获取的病毒时间的增长，获毒量均会增加。在6 h和12 h 时，饲喂AST dsRNA与GFP dsRNA的烟粉虱获毒量无显著差异，但是在18 h、24 h和48 h时饲喂AST dsRNA的烟粉虱获毒率显著低于饲喂GFP dsRNA的烟粉虱获毒量 (P<0.05)。证明本申请实施例2的AST dsRNA能降低烟粉虱对番茄褪绿病毒的获毒效率，从而降低病毒病的发生。
实施例6
一种实施例2的RNA干扰剂在降低烟粉虱传播病毒中的应用，其应用方法与实施例3相同，将饲喂了含AST dsRNA营养液的烟粉虱（处理组）和饲喂了含GFP dsRNA营养液的烟粉虱（对照组）置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株中，取食带毒苗48 h后，将处理组和对照组的烟粉虱通过虫传的方法进行传毒，观察饲喂RNA干扰剂后30 d内烟粉虱传播到番茄的病毒率（结果参考表5）和病毒数量（结果参考表6）。
表5：干扰后烟粉虱的传毒率
表6：干扰后烟粉虱的传毒量
由表5、6可以得出，烟粉虱在喂食实施例2的AST dsRNA后，传毒率、传毒量显著降低于饲喂了GFP dsRNA的烟粉虱 (P<0.01)，证明本申请实施例2的AST dsRNA可以有效控制烟粉虱对番茄褪绿病毒病的传播，减少了植物病毒病的发生。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南省植物保护研究所
<120> 烟粉虱致死基因及应用和RNA干扰剂及干扰剂的制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 978
<212> DNA
<213> 烟粉虱(Bemisia tabaci)
<400> 1
atgacctctt cggttttctc ctccattgag cctggaatac tgaacgaaat atgcgcattg 60
cacgaggaat tttgcagcga tccttacagg aagaaggtgg atcttgttaa aggagcttat 120
ccgacggacg aaggaaaacc atgggttttg cctgtggtca ggaaaactga aatcattctg 180
gcaaacgatg aaaatacctt tcatgagtct gaacattttc tgagctccag cgagtttact 240
gatgcagcca cttcctcact actgggcgaa aaatccatcg ccgttcaaga caagaggaag 300
agtttgggac gctcacactt ttacttatct gacccccatt ggaacgccta cgaagtcata 360
atcatgcaag caggtttcga gaaaagctct cgttaccgat attggaatgc ggagaaacaa 420
tgcattgaca tggatggact tttggaggat ttgtcaaagg cagagccaac ttcggtcgtt 480
ttactccaag cgtgtgcgca taacccgact gggtgtgatc ctacccccga acagtgggca 540
aaaatagctt ctctcatgaa gaaaaataga ttgttcccat tcttcgacat agcttatcaa 600
ggtttggcgt ctggtgatat ggacgaagat gcagaggctg ttcgctattt cgttgaccag 660
ggtttcgagt tactgtgcgc gcaatctttt tctaagaact ttggtcttta cggtgaacga 720
gtaggaagcc tcactattgt ctcaaattgt gcccatacaa tgcctcatat agtatccaag 780
atgattaaca tcgctgaggg caattatctg gtgccacccc tccatggaac tgctcaaatt 840
gagtacttga ggaaaaagca ccatgtctat acattggaaa atgggaggat gaacgtcgca 900
gcgctgacac ccttaaactt ggaccacgtc gcctggagta ttcatgatac ttctgaacag 960
cccgccggaa aatgttga 978
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 2
attctctaga agcttaatac gactcactat agggcgagtt tactgatgca gcca 54
<210> 3
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 3
attctctaga agcttaatac gactcactat agggatagcg aacagcctct gcat 54
<210> 4
<211> 418
<212> RNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<400> 4
cgaguuuacu gaugcagcca cuuccucacu acugggcgaa aaauccaucg ccguucaaga 60
caagaggaag aguuugggac gcucacacuu uuacuuaucu gacccccauu ggaacgccua 120
cgaagucaua aucaugcaag cagguuucga gaaaagcucu cguuaccgau auuggaaugc 180
ggagaaacaa ugcauugaca uggauggacu uuuggaggau uugucaaagg cagagccaac 240
uucggucguu uuacuccaag cgugugcgca uaacccgacu gggugugauc cuacccccga 300
acagugggca aaaauagcuu cucucaugaa gaaaaauaga uuguucccau ucuucgacau 360
agcuuaucaa gguuuggcgu cuggugauau ggacgaagau gcagaggcug uucgcuau 418
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gacctcttcg gttttctcct 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtattttca tcgtttgcca 20

Claims (9)

1.一种烟粉虱致死基因，其特征在于，所述烟粉虱致死基因为天门冬氨酸氨基转移酶的编码基因，所述编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种RNA干扰剂，其特征在于，所述RNA干扰剂是根据权利要求1所述的烟粉虱致死基因，进行合成得到的dsRNA，所述dsRNA的序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种权利要求2所述的RNA干扰剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、根据天门冬氨酸氨基转移酶的编码基因序列合成引物对，提取烟粉虱RNA，以提取的总RNA为模板，合成cDNA第一条链，所述天门冬氨酸氨基转移酶的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；
S2、以烟粉虱的cDNA第一条链为模板，进行RT-PCR得到扩增产物；
S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到目标DNA片段；
S4、将所述目标DNA片段用PROMEGA dsRNA合成试剂盒合成dsRNA，即为RNA干扰剂。
4. 根据权利要求3所述的RNA干扰剂的制备方法，其特征在于，所述S1中所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示。
5. 一种权利要求2中所述的RNA干扰剂在降低如SEQ ID NO.1所示的烟粉虱基因表达中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为：
（1）将蔗糖溶液与不同体积的RNA干扰剂混匀得到饲喂营养液；
（2）将所述饲喂营养液置于饲喂管中，与烟粉虱一起培养；
（3）计算饲喂RNA干扰剂后烟粉虱的死亡率，同时采用RT-qPCR的方法检测饲喂后的烟粉虱体内天门冬氨酸氨基转移酶的相对分子表达量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述（2）中所述培养的条件为：光照比为14︰10，湿度80%；
和/或，所述（3）中所述RT-qPCR采用的引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.5所示，所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
8.一种权利要求2中所述的RNA干扰剂在降低烟粉虱获毒和传毒中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用方法包括以下步骤：
（1）将饲喂了含RNA干扰剂的烟粉虱置于携带番茄褪绿病毒的番茄植株中培养，考察烟粉虱获取病毒率和获取病毒数量；
（2）将食带毒苗后烟粉虱通过虫传的方法进行传毒，观察饲喂RNA干扰剂后烟粉虱传播到番茄的病毒率和病毒数量。
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