CN105907659B - 一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌及其应用 - Google Patents

一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌，所述细菌分类名为Sinobaca bifengensis JH2，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015519，于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉)。本发明同时公开了该细菌在降解钻井废弃泥浆中的应用。该细菌能很好地去除钻井废弃泥浆中的COD和柴油，适应不同钻井泥浆环境能力强，可作为优良降解菌用于废弃泥浆污染生物处理。该细菌在与植物联合修复钻井废弃液的现场处理试验中，能有效降解泥浆中的污染物，处理后环境样品浸出液COD、柴油、硫化物和pH等指标都能达到国家标准。

Description

一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物菌种及其应用，具体涉及一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌Sinobaca bifengensis JH2及其应用。
背景技术
随着我国经济快速发展，对石油、天然气等化石能源需求量日益增大，而石油天然气钻探过程中所产生的钻井废弃物数量庞大，按所钻井深度(1000～7000m)的不同，可产生500～4000m3废水、300～2000m3的废弃渣泥、废弃钻屑和废弃泥浆等难降解物质。这些废弃泥浆浓缩富集了钻井废水中的所有污染物质成份，以及所有钻井作业过程中所用的30～50种不同的无机和有机泥浆处理添加剂，具有色度高、有机物污染物含量高、难降解、环境危害性大等特点。
传统的物理化学处理技术大多昂贵且会造成二次污染，目前以微生物、植物处理为代表的生物处理技术具有很大的应用潜力，在国外已得到广泛应用。例如授权公开号为CN 101798162B的中国专利文献公开了一种利用植物-微生物联合作用处理油气田然气勘探钻井作业废弃渣泥的方法，将大多有机物降解为简单的无机物，使得渣泥中的COD和油类物质被有效降解，实现钻井废弃物的无害化处理。到目前为止，已分离到能降解有机污染物的微生物共100余属，200多个种，包括细菌、放线菌、霉菌、酵母菌乃至藻类，这些微生物大多具有耐盐、降解卤代有机化合物和还原金属的能力。不同微生物利用底物的能力不同，对有机污染物的代谢机理及代谢途径存在差异，因而有必要从不同环境条件下分离出具有降解能力的菌种资源，以强化对钻井废弃泥浆中有机污染物的降解效果。
发明内容
为了促进废弃泥浆生物处理技术的发展，本发明筛选出了一株降解钻井废弃泥浆复合污染物的细菌，开发出了该细菌的应用方式。该细菌按5％接种，在中性环境(pH7.0)和碱性环境(pH9.5)条件下均能很好地去除钻井废弃泥浆中的COD和柴油，可以适应不同的钻井泥浆环境，证明该细菌可以作为优良降解菌应用于废弃泥浆污染的生物处理。在该细菌与植物联合处理钻井废弃液的现场处理试验中，处理后的土壤+泥浆混合体系浸出液COD、柴油、硫化物含量和pH等指标与自然土壤接近，联合处理体系表现出了良好的废弃泥浆污染物处理效果。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是开发出了一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌JH2，于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉，武汉大学，登记编号为CCTCC NO：M 2015519，菌株的分类名为Sinobaca bifengensis JH2。
该菌株来源于四川省雅安市碧峰镇的油气田钻井废弃泥浆，经富集培养、分离纯化得到。该菌属于厚壁菌门，芽孢杆菌科，Sinobaca属，革兰氏阳性，菌落圆形，橘黄色，光滑不透明，表面湿润，边缘整齐，不产芽孢。能在10-45℃生长，最适生长温度为28-37℃；在盐浓度为1％-20％范围内都能生长，在盐浓度为10％时生长最好；在pH6.0-11.0范围都能生长，当pH为8.0-9.0时生长最佳。
该菌的16S rRNA基因序列SEQ ID(见说明书)所示，将该细菌的16S rRNA基因序列在GenBank中比对，获得相近代表菌株l6S rDNA序列，应用MEGA6.0构建系统发育树，结果表明该菌株与Sinobaca qinghaiensis处于同一系统发育分支(图2)；应用EzTaxon server对菌株的l6S rDNA序列进行比较，相似性最高的菌株为Sinobaca qinghaiensis YIM70212T，相似度为98.9％。
将供试菌株与标准菌株Sinobaca qinghaiensis DSM 17008进行DNA-DNA杂交，杂交率为40.31％，结合生理生化实验结果，将JH2 命名为Sinobaca bifengensis JH2。
该细菌按5％接种，在中性环境(pH7.0)和碱性环境(pH9.5)条件下均能很好地去除钻井废弃泥浆中的COD和柴油，可以适应不同的钻井泥浆环境，证明菌株JH2可以作为优良的降解细菌用于废弃泥浆污染的生物处理方面。
在该细菌与植物联合处理钻井废弃液的现场处理试验中，处理后的土壤+泥浆混合体系浸出液COD、柴油、硫化物含量和pH等指标与自然土壤接近，联合处理体系表现出了良好的废弃泥浆污染物处理效果。
附图说明
图1为Sinobaca bifengensis JH2光学显微镜照片。
图2为Sinobaca bifengensis JH2基于16S rDNA的系统发育树。
图3为Sinobaca bifengensis JH2对泥浆中COD和柴油的去除率。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1菌株的分离纯化及鉴定
1.菌株分离
⑴菌株驯化
从钻井场周边环境采集农田土壤、林地腐殖质层土壤、以及钻井场附近农户农家肥堆肥共20份，充分混匀。于广口瓶中装入150ml钻井废弃泥浆，加入50g已混合均匀的样品，封好瓶口，28℃，150r/min振荡培养10天。随后，取20ml培养物转入另一瓶150ml同样的废弃物体系中，同法培养7天，如此反复驯化4次。
⑵菌株分离纯化
取10g驯化的废弃泥浆混合物，加入90ml无菌水混匀制成菌液，取1ml菌液加入9ml无菌水稀释，逐级稀释到10-5梯度，分别取10-3-10-5菌悬液1ml，倒入LB培养基混匀，28℃培养至单菌落出现，挑取单菌落在LB培养基上划线纯化，显微镜镜检无杂菌后转接于牛肉膏蛋白胨斜面培养基培养24-48h，4℃保存。
所用培养基如下：
LB培养基：10g胰化蛋白胨(Tryptone),5g酵母提取物(Yeast extract),5g NaCl，琼脂18g,调pH至7.4用去离子水定容至1L；
普戈二号培养基：(NH4)2SO4 2.64g，KH2PO4 2.38，K2HPO4 5.65g，MgSO4·7H2O1.00g，CuSO4·5H2O 0.0064g，FeSO4·7H2O 0.0011g，MnCl2·7H2O，ZnSO4·7H2O 0.0015g，琼脂18g，调pH至7.4用去离子水定容至1L。
2.菌株的鉴定
⑴形态学特征
将Sinobaca bifengensis JH2在LB平板划线培养36h，记录单菌落形态，包括菌落大小、颜色、透明度、湿润度和边缘状态。同时在LB液体培养基中培养至对数生长期，菌株进行简单染色和革兰氏染色，观察Sinobaca bifengensis JH2菌体形态及革兰氏反应。
Sinobaca bifengensis JH2在LB固体培养基平板上培养36h后，菌落形态为圆形，光滑不透明，湿润，橘黄色，边缘整齐，菌落直径1.0-1.2毫米。形态学观察表明，该菌株为球菌，革兰氏阳性，不产芽孢，菌体直径为0.8-1.0μm(图1)。
⑵生理生化特征分析
参照《常见细菌系统鉴定手册》，测定菌株的生长pH范围，生长盐浓度范围，生长温度范围，唯一碳氮源利用情况以及其它生理生化特征。
Sinobaca bifengensis JH2生长温度范围10-45℃，最适生长温度为28-37℃；在盐浓度为1％-20％范围内都能生长，在盐浓度为10％ 时生长最好；在pH6.0-11.0都能生长，在pH8.0-9.0内生长最佳。菌株能够利用棉子糖、D-甘露醇、D-甘露糖、蔗糖、D-木糖、果糖、甘露醇、麦芽糖、葡萄糖、半乳糖、L-鼠李糖作为唯一碳源生长，不能利用L-阿拉伯糖、L-山梨醇、肌醇、D-阿拉伯糖、纤维二糖、肌糖、肌酸作为唯一碳源生长；氧化酶还原反应、硝酸盐还原反应、水解淀粉、水解明胶均为阴性，不产H2S和氨气；过氧化氢酶、葡萄糖产酸、脲酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶均为阴性。
⑶16S rRNA序列测定及系统发育分析
将纯化后的菌株采用GUTC法提取细菌总DNA，采用细菌通用引物27F(5’-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3’)和1492R(5’–CTACGG CTA CCT TGT TAC GA-3’)扩增16S rDNA片段。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后送往上海生工测序。
将测得的该细菌16S rRNA基因序列应用EzTaxon server对菌株的l6S rDNA序列进行比较，相似性最高的菌株为Sinobaca qinghaiensis YIM 70212T，相似度为98.01％。在GenBank中比对，获得了相近代表菌株l6S rDNA序列，应用MEGA6.0构建系统发育树，结果表明该菌株与Sinobaca qinghaiensis YIM 70212T处于同一系统发育分支(图2)。在形态特征、生理生化特征差异较大，结合DNA同源性分析结果，本发明所分离获得的降解菌为新的种群，命名为Sinobaca bifengensis JH2。
菌株Sinobaca bifengensis JH2已于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉,武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2015519。
实例2 菌株Sinobaca bifengensis JH2利用废弃钻井液的能力
1.菌悬液制备
将纯化后的菌种Sinobaca bifengensis JH2接入10mL的LB液体 培养基，28℃，160r/min振荡培养至对数期，8000rpm离心10min收集菌体，用灭菌PBS洗菌3次后重悬，调节OD600nm＝1.0-1.2作为菌种悬液备用。
2.供试菌株利用聚磺泥浆情况
在250mL三角瓶各装入50mL普戈二号液体培养基，分别添加5g/L、10g/L、15g/L、30g/L和50g/L聚磺泥浆为唯一碳源，配制成培养液，灭菌冷却后按5％(v/v)分别接种Sinobaca bifengensis JH2菌悬液，28℃、160r/min振荡培养72h，稀释平板法测定菌株数量，分析菌株Sinobaca bifengensis JH2对聚磺泥浆利用情况。
表1不同泥浆添加量对JH2数量影响
表1结果显示，随着普戈二号培养基中聚磺泥浆添加量的增加，Sinobacabifengensis JH2菌落数量逐渐增加，随着泥浆添加量的增加，菌落数量由1.73×108cfu/mL上升至9.20×108cfu/mL；尤以添加50g聚磺体系泥浆作为碳源的处理中菌落数量最多。这表明菌株Sinobaca bifengensis JH2能够以泥浆为惟一碳源生长，而且其长势与泥浆添加量成正相关。
实例3 菌株Sinobaca bifengensis JH2对钻井废弃液降解效果实验
将供试菌株经LB液体培养基培养至对数生长期后，用0.9％生理盐水洗涤菌体，调整至浓度一致，按照5％(V/V)的接种量接种至60ml聚磺泥浆中振荡培养5d，每24h测定泥浆中COD值和柴油含量变化，重复3次。柴油含量用紫外分光光度法测定，COD值用HH-5型智能化学耗氧量测定仪测定。菌株降解率＝(空白含量-接菌后含量)/空白含量×100％。
结果表明，菌株Sinobaca bifengensis JH2能够很好去除钻井废弃泥浆中的COD和降解其中的柴油。泥浆原液COD达62111mg/L，接 种供试菌株培养5后天，泥浆COD大大降低，处理后泥浆COD为22370mg/L，COD去除率达68％(图3)。尽管泥浆原液中柴油含量较高(1279mg/L)，接种菌株Sinobaca bifengensis JH2后第5天，废弃钻井废弃液中的柴油降解率达50％(图3)；说明菌株Sinobaca bifengensis JH2在处理钻井废弃泥浆方面具有很大的应用潜力。
实例4 接种量和pH对Sinobaca bifengensis JH2降解效果的影响
1.接种量对Sinobaca bifengensis JH2钻井废弃液降解效果的影响
将活化的菌株接种于LB液体，28℃，160r/min振荡培养至对数期，同上洗涤后调整菌液OD为0.6，分别按1.0％、3.0％、5.0％接种量(V/V)接种于50ml钻井废弃液中，28℃，160r/min振荡培养，每隔24h测定混合液中柴油含量和COD值，以不接菌为对照，重复3次。
在接种量分别为1.0％、3.0％、5.0％条件下，振荡培养5d后，钻井废弃泥浆中的COD由初始的62300mg/L,降为27090mg/L、25190mg/L和18680mg/L，降解率分别为56.5％、59.6％和70.0％；同时，柴油含量由初始的1228mg/L降为820mg/L、803mg/L和675mg/L，降解率38.2％、39.5％和49.2％。可见，菌株接种量对钻井泥浆中COD去除和柴油降解影响较大，随着接种量增加，COD去除率和柴油降解率均逐渐增大。因此，实际应用中，菌株JH2的接种量以5％为宜。
2.pH对Sinobaca bifengensis JH2降解钻进废弃液效果的影响
同上法，按5％(V/V)最佳接种量，于初始pH 7.0和pH 9.5的50ml钻井废弃液中接种对数生长期Sinobaca bifengensis JH2菌株，28℃，160r/min振荡培养5d后，测定培养基中柴油含量和COD值，以不接菌为空白对照，3次重复。
在两种pH条件下，菌株Sinobaca bifengensis JH2对COD的去除率和柴油降解率无明显差异，在pH7.0和pH9.5条件下培养5d后， 钻井废弃泥浆中的COD由最初的65327mg/L降为20190mg/L和20570mg/L，降解率分别为69.1％和68.5％；对柴油的降解来看，柴油含量由最初的1295mg/L降为690mg/L和678mg/L，降解率分别为46.7％和47.6％，可见菌株能在较广泛的pH范围降解钻井废弃物。
实例5 Sinobaca bifengensis JH2降解钻井废弃液的实际应用效果
1.现场应用试验
在室内先准备好的Sinobaca bifengensis JH2菌剂，使菌体浓度达到1.0×108cfu/g，细米糠为辅料。供试地点为重庆市壁山县大兴镇的井场，参照授权公开号为CN101798162B提供的方法，开展天然气钻井废弃泥浆生物处理技术现场应用试验。
具体检测步骤为：
(1)接种降解菌：将准备好的Sinobaca bifengensis JH2菌剂按5:100的重量比加入至废弃泥浆中，混合均匀；并将自然土壤:泥浆按2:1的重量比加入至上述接种降解菌的废弃泥浆中，混合均匀；
(2)表层覆土：将步骤(1)形成的处理层表面覆盖10-15cm的自然土壤；
(3)种植植物：在表面，栽种槐树，播撒黑麦草种子，形成植物处理层。
2.降解效果检测
分别测定处理前后废弃泥浆、生物处理体系的浸提液COD值及柴油含量，其含量均较高；经过20个月处理，两个指标都得到大幅降解，COD去除率和柴油降解率均达到95％以上，检出值均已低于国家污水综合排放一级标准，硫化物含量和pH符合标准要求，井场含水率也在土壤正常含水量范围内(表2)。本实施例说明Sinobaca bifengensis JH2在室外条件下，与植物联合处理钻井废弃泥浆，效果显著，应用前景良好。
表2菌株JH2对钻井泥浆的处理效果
表2中的单位为mg/L，pH除外。
本发明中采用的Sinobaca bifengensis JH2菌种的16S rRNA基因序列SEQ ID：KP241934
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一株钻井废弃泥浆复合物降解细菌，其特征在于，所述细菌的分类名为Sinobacabifengensis JH2，GenBank序列登录号为KP241934，保藏编号为CCTCC NO：M 2015519，于2015年9月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学)。
2.如权利要求1所述的细菌在降解钻井废弃泥浆中的应用。
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