CN110156882A

CN110156882A - 枇杷EjAP3基因及其编码的蛋白与应用

Info

Publication number: CN110156882A
Application number: CN201910327512.1A
Authority: CN
Inventors: 景丹龙; 梁国鲁; 陈薇薇; 郭启高; 夏燕; 吴頔; 王淑明; 石敏
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2019-08-23
Anticipated expiration: 2039-04-23
Also published as: CN110156882B

Abstract

本发明涉及植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷花瓣和雄蕊特征决定EjAP3基因及其编码的蛋白质和应用。该基因的cDNA序列全长如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白质的氨基酸序列，如SEQ ID No.2所示。本发明所述的EjAP3基因表达量与枇杷重瓣花的形成密切相关。通过农杆菌介导的花芽浸染法将EjAP3基因表达载体转入到拟南芥ap3‑3突变体中，结果显示EjAP3在转基因ap3‑3突变体过表达能完全恢复花瓣和雄蕊。利用枇杷EjAP3基因过表达载体获得的转基因植物花器官材料，既能恢复植物花瓣器官，又能恢复雄性生殖器官，进而完成生殖过程，即可用于被子植物的育种和观赏，具有极好的应用前景。

Description

枇杷EjAP3基因及其编码的蛋白与应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个枇杷EjAP3基因、其编码的蛋白和应用。

背景技术

枇杷(Eriobotrya japonica)是蔷薇科枇杷属亚热带常绿果树，其果实成熟于春末夏初的水果淡季，果肉鲜嫩多汁。枇杷为圆锥花芽，花色雪白，花两性；开花时，花瓣5枚；雄蕊5枚。由于枇杷花量很大，且花期很长，同时枇杷的生殖发育是一个持续的过程，其顶芽的顶端分生组织持续发育成花芽，不需要低温诱导，不受冬季休眠的干扰，每棵树上的花芽数目每年几乎保持稳定，秋季开花，花期为2个多月，因此也常作为园艺观赏植物。

APETALA3(AP3)基因是参与拟南芥花瓣和雄蕊特征决定的B类基因发育的编码MADS-box基因家簇中的MIKC^C-type转录因子。AP3同源基因存在于不同类群的被子植物中，其伴随被子植物的起源出现，首先产生的进化系为paleoAP3型，在真双子叶植物演化过程中，paleoAP3通过一次基因重复事件分化出euAP3型和TM6型2个进化系。研究表明，真双子叶植物euAP3型基因主要参与决定雄蕊和花瓣的形成和发育。

发明内容

本发明的目的是提供枇杷EjAP3蛋白及其编码的蛋白与应用。

首先，本发明提供枇杷EjAP3蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2)在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质，其中，所述的由1)衍生的蛋白质包括MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域以及C末端结构域的2个基序PI-derived基序和euAP3基序。

本发明还提供编码所述的枇杷EjAP3蛋白的基因。

优选的，所述基因的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供含有所述基因的载体，宿主细胞和工程菌。

本发明还提供所述基因在决定植物雄蕊和花瓣的形成和发育中的用途。

在本发明一个实施方案中，将所述基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，恢复植物花瓣器官和雄性生殖器官，进而完成生殖过程。

本发明还提供一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有所述基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

本发明从枇杷花芽中分离了1个枇杷花瓣和雄蕊特征决定的EjAP3基因。通过qRT-PCR证实了EjAP3基因表达量会影响花瓣和雄蕊发育，与枇杷重瓣花的形成密切相关。利用基因工程的手段构建了EjAP3基因的植物表达载体，并将其转入拟南芥ap3-3突变体中，结果显示EjAP3在转基因ap3-3突变体过表达能完全恢复花瓣和雄蕊。利用枇杷EjAP3基因过表达载体获得的转基因植物花器官材料，既能恢复植物花瓣器官，又能恢复雄性生殖器官，进而完成生殖过程，即可用于被子植物的育种和观赏，具有极好的应用前景。

附图说明

图1所示为枇杷EjAP3基因的3'-RACE和5'-RACE的电泳照片。其中，a是3'-RACE的电泳照片，M为DL2000DNA marker，1为3'RACE PCR产物；b是5'RACE的电泳照片，M为DL2000DNA marker，1为5'RACE PCR产物；c为EjAP3基因ORF的PCR电泳照片，M为DL2000DNAmarker，1为EjAP3基因ORF的PCR产物；黑色箭头代表扩增的目的基因所在位置。

图2是枇杷花瓣和雄蕊特征决定的EjAP3基因cDNA核苷酸序列图。

图3是EjAP3基因所编码蛋白质的氨基酸序列和结构域划分图。

图4是枇杷EjAP3基因在枇杷重瓣花的雄蕊、雄蕊状花瓣和花瓣中表达量。

图5EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体植株的PCR鉴定。

图6是EjAP3转基因前后的拟南芥ap3-3突变体的花器官照片。其中a是拟南芥ap3-3突变体；b，c和d是EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体。

图7EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体植株的表型与基因表达的关系。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1枇杷EjAP3基因cDNA序列的克隆

枇杷花芽总RNA的提取

采集新鲜长度约0.5cm的枇杷花芽，快速放入冻存管中，放入液氮中速冻3h后，放入-80℃超低温冰箱中备用。采用RNA提取试剂盒提取花芽的总RNA：从-80℃超低温冰箱中取出花芽材料，放入加有2mL RLT裂解液和200μL PLANTaid研钵中，在室温下，充分研磨；将上述研磨液转移至2mL的eppendorf管中，13000rpm离心15min后，吸取500μL上清液，转移至新的2mL离心管；向上清液中加入250μL无水酒精，吸打混匀；将上述液体转移至吸附柱，并将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入500μL漂洗液，13000rpm离心2min后，倒掉收集管中的废液。加入500μL漂洗液，再重复一次；将吸附柱放回空收集管中，13000rpm离心3min，尽量去除漂洗液；取出吸附柱，放回至空的RNase-free eppendorf管中，加入50μL的RNasefree water室温放置2min，13000rpm离心2min；将第一次洗脱液加入到吸附柱中，再重复一次。吸取2μL稀释后的RNA样品，用分光光度计检测RNA浓度。

枇杷花芽总RNA的3'RACE实验

采用枇杷花芽总RNA为3'RACE实验模板，以3'RACE Adaptor为引物进行逆转录反应，合成3'RACE实验的第一链cDNA；取总RNA 2.5μL，DEPC-ddH₂O 3μL，3'RACE Adaptor 1μL，混合均匀后，在70℃，变性10min；冰浴2min；反应结束后，依次加入5×M-MLV buffer 2μL，10mM dNTP 1μL，RNase inhibitor 0.25μL，M-MLV 0.25μL，混匀后，置于42℃条件下，反应60min；70℃条件下，反应10min；冰浴2min，然后置于-20℃条件下保存，待用。

根据NCBI网站公布的枇杷近缘种苹果(HM122607)和山杜鹃(AB638333)AP3同源基因序列的保守区域，直接设计3′RACE实验的上游特异性引物3REjAP3F：5′-GATTGTCTGAACGATCTGAGT-3′；以第一链3'RACE逆转录产物为模板，使用高保真EX-taq酶，上游外侧特异性引物3REjAP3F和3'RACE Outer Primer：5'-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'，进行PCR反应，反应条件为94℃5min；94℃45s，57℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测(图1a)，切下目的片段，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。将回收产物连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序。

枇杷花芽总RNA的5'RACE实验

根据3′RACE实验的测序结果，设计5′RACE实验的特异性引物5REjAP3R：5′-GGCGAATGACATCGACGGCG-3′。按照5'RACE实验操作说明书，具体步骤为：第一链合成，首先配制Buffer Mix，即依次加入2.0μL的5×First-strand Buffer，1.0μL的DTT(20mM)，1.0μL的dNTP Mix(10mM)，混匀，室温下放置。

在200μL的eppendorf管，加入1.0μL总RNA，1.0μL的5’-CDS primer A，1.75μL的H₂O，混匀，离心到管底，72℃3min，然后冷却至42℃2min，冷却后，14000g离心10s，加入1μL的SMARTER IIA oligo，4.0μL的Buffer Mix，0.25μL的RNase inhibitor(400U/μL)，1.0μL的SMARTscrube Reverse Transcriptese(100U)，总体积10μL，混合均匀，离心后，42℃反应90min，70℃变性10min，获得control 5’-RACE-Ready cDNA。

5'RACE扩增体系：34.5μL的PCR-Grade water，5.0μL的10×Advantage 2PCRBuffer，1.0μL的d NTP Mix，1.0μL的50×Advantage 2polymerase Mix，2.5μL的control5’-RACE-Ready cDNA，1.0μL的5REjAP3R引物，5.0μL的UPM(10×)。降落PCR的程序为：94℃30s，72℃3min，5个循环；94℃30s，70℃30s，5个循环；72℃3min，94℃30s，68℃30s，30个循环；72℃5min，用1％琼脂糖凝胶电泳检测RACE反应结果(图1b)。切下目的片段，按照说明书用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序。

使用DNAMAN软件对3'RACE和5'RACE实验的PCR测序结果，进行分析和拼接，得到枇杷EjAP3基因cDNA序列全长(SEQ ID No.1)，其序列图片见图2。

在枇杷EjAP3基因序列全长的设计引物FLEjAP3F:5'-GAGAGATGGCGAGGGGGAAGATCCA-3'和FLEjAP3R:5'-GAAGATTAGTGGGATGCGATTGGTTA-3'，反应条件为94℃4min；94℃45s，56℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，切下目的片段(图1c)，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。连接到pMD19-T载体后，转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取单克隆，进行测序，对EjAP3基因功能区的CDS序列进行验证。

使用primer 5软件，对枇杷EjAP3基因的cDNA序列全长，进行蛋白质序列翻译(SEQID No.2)，并根据MADS-box蛋白质特点，枇杷EjAP3蛋白质序列进行MADS结构域、I结构域、K结构域、C末端结构域以及C末端结构域的2个基序PI-derived基序和euAP3基序的划分(图3)。

实施例2枇杷EjAP3基因的表达量分析

分别提取枇杷重瓣花的雄蕊、花瓣状雄蕊和花瓣的总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA，作为模板。根据枇杷EjAP3基因的cDNA序列全长，利用oligo 6.0软件设计实时荧光定量引物qEjAP3F:5'-ACTCTTCAAGAAGGCCAACGAGC-3'和qEjAP3R:5'-ATCCCCAACTCTCTGCCTGATCT-3'。用PCR对其特异性进行检测，在确保PCR特异性扩增前提下，方可进行实时荧光定量PCR。以枇杷actin基因为内参基因，引物为qEjactinF：5'-AATGGAACTGGAATGGTCAAGGC-3'和qEjactinR：5'-TGCCAGATCTTCTCCATGTCATCCCA-3'。采用三步法进行扩增，每个反应3个生物学重复。PCR反应程序为:94℃预变性3min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，40个循环；收集溶解曲线。根据得到的Ct值，利用2^-ΔΔ^CT方法，分别计算EjAP3基因在雄蕊、雄蕊状花瓣和花瓣中的表达量(图4)。结果显示：在枇杷重瓣花发育过程中，EjAP3基因在雄蕊阶段的表达量最低，随着雄蕊状花瓣和重瓣花的最终形成，EjAP3基因的表达量逐渐升高，表明EjAP3基因的表达模式变化与枇杷重瓣花的形成密切相关。

实施例3枇杷EjAP3基因的植物转基因载体pBI121-EjAP3构建

采用PCR扩增，在枇杷EjAP3基因的CDS区两端引入酶切位点。以枇杷花芽总RNA逆转录的cDNA为模板，以EjAP3-F：5′-TCTAGAATGGCGAGGGGGAAGATC-3′(引入XbaⅠ酶切位点)和EjAP3-R：5′-CCCGGGCTACTTTGCAAATATGGGA-3′(引入SmaⅠ酶切位点)为引物，使用EX-taq酶，进行PCR扩增。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，57℃30s，72℃30s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆后，送样测序。根据测序结果，提取质粒。使用XbaⅠ和SmaⅠ限制性内切酶分别双酶切pMD19-EjAP3重组质粒和pBI121载体，通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。使用T₄DNA连接酶将双酶切后的EjAP3基因与pBI121连接后，转入大肠杆菌感受态细胞，获得植物转基因表达载体PBI121-EjAP3。将获得的表达载体送样测序，证明EjAP3基因与pBI121载体连接成功。

实施例4将转基因表达载体pBI121-EjAP3转入拟南芥ap3-3突变体

取2μg的pBI121-EjAP3质粒，加至100μL农杆菌感受态细胞，吸打混合均匀；冰浴5min，转入液氮，迅速冷冻1min，快速置于37℃，水浴4min；加入800μL的LB液体培养基，28℃、250rpm振荡5h；将菌液转移至LB(50mL LB+50μg/mL Kan+50μg/mL Rif)固体选择培养基中，均匀涂布，在28℃倒置培养1-2d。

将含有pBI121-EjAP3阳性克隆农杆菌在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上划线，28℃，倒置培养48h；选取单克隆，接种到10mL的液体LB培养基(含有10μg/mL Kan+10μg/mL Rif)中；在28℃、200rpm条件下，振荡培养过夜至OD＝0.7-0.8。取1mL的培养菌液均匀涂布在25mL固体平板培养基(含有25μg/mL Kan+25μg/mL Rif)上，28℃，倒置培养48h；使用玻璃三角棒将固体培养基上的农杆菌刮下来，将菌块重悬于含有5％蔗糖和3％Silwet L-77的1/2MS液体培养基中，使其OD＝0.2，用于拟南芥转基因。

将拟南芥种子放在湿润的滤纸上，并置于4℃，48h，接着播种至营养土(营养土：蛭石：珍珠岩＝5:4:1)，在温度22℃，湿度75％，14h黑暗/10h光照条件下，培养；在转基因的前一天，将鉴定的拟南芥ap3-3杂合体(购自拟南芥突变体库)植株浇透水；在浸染前，将待用的拟南芥植株上已有角果剪掉，将花芽浸入PBI121-EjAP3农杆菌浸染液中60s左右，用作浸染转化；罩上黑色封口膜，并保持膜内的高温和高湿环境，暗培养2d后，揭开薄膜；上述方法侵染3-4次，间隔时间为7d。

实施例5枇杷EjAP3基因的转基因拟南芥筛选和表型鉴定

收取EjAP3转基因拟南芥成熟种子，将种子处理干净。置于4℃冰箱中2周时间，进行春化处理；将种子放入收集管中，向种子中加入800μL无水乙醇，摇动5min；离心4000rpm，2min；倒掉收集管中的酒精，向收集管中加入800μL 70％乙醇，摇晃5min；离心5000rpm，2min；晾干种子；均匀铺在1/2MS培养基(pH＝5.8，含50μg/mL的Kan，3％蔗糖和0.8％琼脂)平板上。将接种后的平板放入到4℃冰箱，进行再春化处理2d；将春化后的平板置于人工气候箱中，正常培养。待其长出4片真叶后，将其移至营养土中，经过炼苗、壮苗后，按照常规的水肥管理，直至开花。

提取EjAP3转基因拟南芥DNA，取1小片拟南芥的叶片置于1.5mL的eppendorf管中，放入液氮速冻，研磨；加入600μL提取缓冲液，涡旋震荡后，置于冰上；待所有样品处理完后，置于65℃水浴中，25min；将样品从水浴中取出，放置到室温，待冷却至室温后，加入340μL乙酸钾溶液，涡旋震荡，冰浴20min；12000rpm，高速离心10min，将上清液转移至新的eppendorf管中；加等量体积的异丙醇，4℃，12000rpm，离心20min，弃上清液，用冰无水乙醇(提前2h将无水乙醇放入-20℃冰箱)漂洗；沉淀依次用70％、100％乙醇漂洗；沉淀吹干后，溶于50μL无菌水。

以未转基因拟南芥ap3-3突变体的DNA作为对照，使用载体构建的引物EjAP3-F和EjAP3-R，对转基因拟南芥的阳性植株DNA进行PCR筛选。PCR扩增程序：94℃4min；94℃45s，57℃45s，72℃45s，进行30个循环；72℃10min。反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中检测(图5)，结果显示共获得24株拟南芥植株，其中16株为含有EjAP3基因的阳性转基因拟南芥植株。

对转基因拟南芥ap3-3纯合体进行花器官表型鉴定，并在Leica体式显微镜下观察，对拟南芥的花器官表型进行拍照(图6)。结果显示：与未转基因的ap3-3突变体(没有花瓣和雄蕊，图6a)相比，有4株EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体在花器官第2轮，长出了花瓣，第3轮长出了绿色雄蕊状结构(图6b)；有5株EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体在花器官第2轮，长出了花瓣，第3轮长出了花丝较短的雄蕊(图6c)；有7株EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体在花器官第2轮，长出了正常花瓣，第3轮长出了正常雄蕊(图6d)。结果表明，EjAP3基因有替代AP3基因的功能，EjAP3基因的转基因拟南芥材料可用于植物观赏和育种。

取转基因拟南芥的花，提取总RNA，去除总RNA中微量的DNA后，逆转录成cDNA，作为模板，使用qEjactinF和qEjactinR为引物。以拟南芥actin基因为内参基因，引物为qactinF：5'-CGTATGAGCAAGGAGTACAC-3'和qactinR：5'-CACATCTGTTGGAAGGTGCT-3'，对转基因拟南芥中EjAP3基因的表达量进行检测。进一步对这些转基因拟南芥中EjAP3基因与表型进行关联分析，结果表明EjAP3基因表达量与转基因拟南芥的表型呈正相关关系，即在EjAP3转基因拟南芥ap3-3突变体中，EjAP3基因的表达量越高，恢复转基因拟南芥ap3-3突变体的花瓣和雄蕊器官特征越明显(图7)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 枇杷EjAP3基因及其编码的蛋白与应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1058

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacgcggg gattcatatt ttcagatcgg atttgaggag 60

agagagggga ggagaggaga gagagagaga gatggcgagg gggaagatcc agatcaggag 120

gatagagaac tcgaccaacc ggcaggtgac ctactccaag agaaggaacg gactcttcaa 180

gaaggccaac gagctcaccg tcctctgcga cgccgaggtc tctctcatca tggtttcgag 240

ctccggcaaa gtccacgagt acattagccc ctccaccaca acaaagcaat tgctggatca 300

gtaccggaag actcttggaa tcgatatttg gaactcccac tacgagagaa tgcaacagca 360

tttgaagaag ctgaaggagg tcaacatgaa tcttcgtagg cagatcaggc agagagttgg 420

ggattgtctg aacgatctga gtttcgatga actgcggggt ctcgagaaag aggtggaagc 480

cgccgtcgat gtcattcgcc agcgcaagca gagagttggg gattgtctga acgatctgag 540

tttcgatgaa ctgcggggtc tggagaaaga ggtggaagcc gccgtcgatg tcattcgcca 600

gcgcaaggtt cggatgatct ccaataagat tgatacaacc aagaaaaagg taaagagcca 660

agcagatatg aacatgagtc ttcacgaact ctatgcaagg gacgttggct gctcaacaaa 720

tggaggagga cctcccatat ttgcaaagta gtaaccaatc gcatcccact aatcttcact 780

gcactgctgc tggagctgca tcagattcca tcaccactgc agtaattagt taaacatttg 840

gttaattacc catgtattgt taaaatttaa actcgtttgt tgtagacttg tagtggcagt 900

attacctata acgatgtcgt tttgttatgg tgggctgcat atgtggttgg gcctaaatgt 960

ttggaccatg taacctaaca cagagcctct aaaacttctt ccacgacgac ggtccatgaa 1020

aatcatgttt gctggattaa atgcccaaaa aaaaaaaa 1058

<210> 2

<211> 219

<212> PRT

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 2

Met Ala Arg Gly Lys Ile Gln Ile Arg Arg Ile Glu Asn Ser Thr Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Tyr Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Phe Lys Lys Ala

20 25 30

Asn Glu Leu Thr Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ser Leu Ile Met Val

35 40 45

Ser Ser Ser Gly Lys Val His Glu Tyr Ile Ser Pro Ser Thr Thr Thr

50 55 60

Lys Gln Leu Leu Asp Gln Tyr Arg Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Trp

65 70 75 80

Asn Ser His Tyr Glu Arg Met Gln Gln His Leu Lys Lys Leu Lys Glu

85 90 95

Val Asn Met Asn Leu Arg Arg Gln Ile Arg Gln Arg Val Gly Asp Cys

100 105 110

Leu Asn Asp Leu Ser Phe Asp Glu Leu Arg Gly Leu Glu Lys Glu Val

115 120 125

Glu Ala Ala Val Asp Val Ile Arg Gln Arg Lys Gln Arg Val Gly Asp

130 135 140

Cys Leu Asn Asp Leu Ser Phe Asp Glu Leu Arg Gly Leu Glu Lys Glu

145 150 155 160

Val Glu Ala Ala Val Asp Val Ile Arg Gln Arg Lys Val Arg Met Ile

165 170 175

Ser Asn Lys Ile Asp Thr Thr Lys Lys Lys Val Lys Ser Gln Ala Asp

180 185 190

Met Asn Met Ser Leu His Glu Leu Tyr Ala Arg Asp Val Gly Cys Ser

195 200 205

Thr Asn Gly Gly Gly Pro Pro Ile Phe Ala Lys

210 215

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 3

gattgtctga acgatctgag t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 4

taccgtcgtt ccactagtga ttt 23

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 5

ggcgaatgac atcgacggcg 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 6

gagagatggc gagggggaag atcca 25

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 7

gaagattagt gggatgcgat tggtta 26

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 8

actcttcaag aaggccaacg agc 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 9

atccccaact ctctgcctga tct 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 10

aatggaactg gaatggtcaa ggc 23

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 11

tgccagatct tctccatgtc atccca 26

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 12

tctagaatgg cgagggggaa gatc 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 枇杷(Eriobotrya japonica)

<400> 13

cccgggctac tttgcaaata tggga 25

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 14

cgtatgagca aggagtacac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 15

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Claims

1.枇杷EjAP3蛋白，其为：

1)由SEQ ID No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或

2.编码权利要求1所述的枇杷EjAP3蛋白的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如SEQ ID No.1所示。

4.含有权利要求2或3所述基因的载体。

5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。

6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。

7.权利要求2或3所述基因在决定植物雄蕊和花瓣的形成和发育中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入植物基因组中，并在转基因植物中超量表达，恢复植物花瓣器官和雄性生殖器官，进而完成生殖过程。

9.一种转基因植株的构建方法，采用农杆菌介导的方法，将含有权利要求2或3所述基因的载体转入植物基因组中，筛选获得转基因植株。

10.如权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的转基因植株与野生型相比，其花朵的花瓣数量增加。