CN109913473A

CN109913473A - 一种用于改良种子大小和品质的基因及其应用

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Publication number: CN109913473A
Application number: CN201910312456.4A
Authority: CN
Inventors: 苏英华; 李英菊; 张宪省; 于洋; 姚汪劲松; 彭静
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2038-12-27
Also published as: CN109439670B; CN109439670A; CN109913473B

Abstract

本发明公开了一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用。本发明发现了能够改良种子大小和品质的基因BnaC04g36220D。本发明用包含上述基因的全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染拟南芥花序，建立了转基因拟南芥株系。发明人进一步培育后将转基因株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因株系具有叶器官变大、种子变大、千粒重增加和油脂含量增高等表型。将该基因过量表达应用于生产、改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

Description

一种用于改良种子大小和品质的基因及其应用

技术领域

本案是针对中国专利申请“一种用于改良种子大小和品质的基因的获得方法和应用”(专利申请号201811611337.0)的分案申请。本发明涉及植物基因工程和细胞生物学技术领域，具体涉及一种用于改良种子大小和品质的基因及其应用。

背景技术

植物的种子大小是标志产量最重要的特征之一(Alonso-Blanco C et al,PNAS，1999，96：4710-4717；Moles AT et al，PNAS，2005，102:10540-10544)。被子植物中，种子通常包括胚、胚乳和种皮，它们分别由受精卵、已受精的中央细胞和珠被发育而来。近十几年来，尽管人们在理解控制种子大小的分子机制方面取得一定进展，但发现的调控种子大小的关键基因并不多。未来的主要挑战是进一步挖掘调控种子大小的关键基因，并建立完善的分子调控网络，为使用现代生物技术(基因组学相关研究，基因编辑，蛋白组学，代谢组学和数学模型建立等)改良作物提供重要的基因资源。

拟南芥是一种十字花科植物，广泛应用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。MEE45(MATERNAL EFFECT EMBRYO ARREST 45)，是拟南芥中含有四个B3-domain的转录因子。现有技术中有对该基因家族其他成员的研究，但是其主要侧重于该类基因在植物体细胞胚胎的发生的研究。然而，MEE45与改良种子大小和品质有关的功能分析尚未见报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明经长期研究和探索，发现了能够改良种子大小和品质的基因MEE45和BnaC04g36220D。本发明用包含上述基因的全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将MEE45基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染拟南芥花序，建立了转基因拟南芥株系。发明人进一步培育后将转基因株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因株系具有叶器官变大、种子变大、千粒重增加和油脂含量增高等表型。将该基因过量表达应用于生产、改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

基于上述基因，本发明的第一方面，提供用于改良种子大小和品质的基因，是如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

2)其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

3)由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因；

4)由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

本发明的第二方面，提供携带上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

其中，携带MEE45基因的重组表达载体如图1所示；携带BnaC04g36220D基因的重组表达载体如图2所示。

携带上述基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在改良种子大小和品质中的应用也是本发明的保护范围。

上述应用中，所述改良种子大小和品质包括：叶器官变大、种子变大、千粒重变大和油脂含量增高。

本发明的第三方面，提供如下a)-f)中任一项所述的DNA片段在改良种子大小和品质中的应用；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价；

d)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

e)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

f)DNA片段，与d)或e)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.4所示的蛋白等价。

本发明的第四方面，提供如下1)-6)中任一项所述的蛋白在改良种子大小和品质中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.2所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

4)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

5)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

6)在SEQ ID NO.4所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第五方面，提供一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，包括用如下a)-f)任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

d)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

e)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

在农业生产中，有时需要降低植物种子中油脂含量以获得更为有利的性状，例如在用于生产蛋白粉的大豆中。基于此，本发明的第六方面，提供一种降低种子中油脂含量的方法，包括在产生所述种子并且含有如下a)-f)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

d)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

e)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

f)DNA片段，与d)或e)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.4所示的蛋白等价；

或者包括在产生所述种子并且含有由如下1)-4)中任一项所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的蛋白；

3)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

4)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白。

优选的，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者使用干扰RNA干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

本发明的第七方面，提供一种培育种子大小和品质改良的转基因植物的方法，是将如下a)-f)任一项所述的多核苷酸导入目的植物得到种子大小和品质改良的转基因植物；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的DNA片段；

d)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

e)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

上述方法中，所述种子大小和品质改良为如下1)-4)中的至少一种：

1)所述转基因植物的种子大于所述目的植物；

2)所述转基因植物的叶器官大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的种子的千粒重大于所述目的植物；

4)所述转基因植物的种子中油脂含量大于所述目的植物。

作为优选，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述单子叶植物选自水稻、小麦或玉米；所述双子叶植物选自拟南芥、大豆、油菜、花生或向日葵。

本发明的有益效果：

本发明首次提供了一种用于改良种子大小和质量的基因：拟南芥转录因子基因MEE45及其在甘蓝型油菜中的同源基因BnaC04g36220D，利用该基因所得的转基因植物具有叶器官变大、种子变大、千粒重变大和油脂含量增高等表型。将该基因应用于生产，改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

附图说明

图1：植物表达载体pMEE45::MEE45-GFP载体结构图。

图2：植物表达载体35S::BnaC04g36220D载体结构图。

图3：野生型(WT)、mee45突变体(mee45)、mee45恢复型(pMEE45::MEE45mee45)和MEE45过表达植株(pMEE45::MEE45)种子大小和粒重的比较及野生型和mee45突变体种子中油脂含量的测定。

图4：野生型、mee45突变体、mee45恢复型和MEE45过表达植株不同时期胚胎发育的比较；

图5：mee45突变体与野生型植株进行父母本的正反交实验；

图6：MEE45基因的在胚珠和胚胎表达模式和蛋白的亚细胞定位；

图7：野生型、mee45突变体和过表达35S::MEE45种子油脂含量分析；

图8：过表达甘蓝型油菜同源基因BnaC04g36220D在mee45突变体和野生型中的比较。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，现有报道的调控种子大小的关键基因并不多。未来的主要挑战是进一步挖掘调控种子大小的关键基因。

本发明人通过长期的研究和探索，发现了一种用于改良种子大小和品质的基因，该基因为拟南芥转录因子基因MEE45，该基因扩增自拟南芥基因组，该基因含有四个保守的B3结构域，属于LEC2家族，其核苷酸序列如SED ID NO.1所示，该基因编码序列全长为1587bp；氨基酸序列如SED ID NO.2所示，编码528个氨基酸。用包含该MEE45基因的全长片段的DNA序列构建过表达载体，然后将MEE45基因过表达载体导入农杆菌菌株，并用农杆菌介导法侵染拟南芥花序，建立了转基因拟南芥株系。发明人进一步培育后将转基因株系与野生型植株进行比较，发现利用该基因所得的转基因株系具有叶器官变大、种子变大、千粒重增加和油脂含量增高等表型。将该基因过量表达应用于生产、改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

通过进化树分析和同源性比较，本发明还找到了甘蓝型油菜中与MEE45亲缘关系较近的同源性达56％基因BnaC04g36220D，该基因的核苷酸序列如SED ID NO.3所示，该基因全长为1530bp，氨基酸序列如SED ID NO.4所示，编码509个氨基酸。研究发现过表达BnaC04g36220D基因转拟南芥mee45突变体，能够恢复mee45种子变小的表型；过表达BnaC04g36220D基因转拟南芥野生型，转基因植株种子变大。因此，BnaC04g36220D基因也可以用于改良种子大小和品质。

基于上述发现的MEE45基因和BnaC04g36220D基因，本发明的保护范围还包括与上述两个基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白功能等价。本文所指的“与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.2或SEQID NO.4所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白典型的生物学功能是促使植物种子增大、叶器官增大、千粒重增加和种子中油脂含量提高。通过上调SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白的表达量和/或活性，可以于改良种子大小和品质。

这些与MEE45基因和BnaC04g36220D基因同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的MEE45基因和BnaC04g36220D基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明MEE45基因和BnaC04g36220D基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.4所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul et al.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin and Altschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

在本发明的一个实施方案中，是从拟南芥Col生态型受精后三天的角果基因组中扩增获得该基因，其具体步骤如下：

(1)CTAB法提取拟南芥果实基因组；

(2)MEE45基因的克隆

以基因组DNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-TAGGATCCATGGCGCATCAACATTTCTTCT-3'，如SEQ ID NO.5所示；

下游引物:5'-TAGGTACCTCATTTGATTTCTAGCTTCACCTT-3'，如SEQ ID NO.6所示；

其中划横线部分为BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点；

PCR扩增体系为4μL上游引物(50pmol/μL)，4μL下游引物(50pmol/μL)，10μL 10×PCR buffer，4μL dNTP混合液(10mmol/L)，4μL EVO DNA聚合酶(5U)，2μL cDNA模板，加ddH₂O将总体积补充至50μL；

扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

取4μL PCR产物与pEasy-Blunt Simple Vector载体连接，操作步骤按照TransGenBiotech公司产品pEasy-Blunt Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如SEQ ID NO.1所示，表明扩增产物为MEE45基因。

现有技术中也有该基因家族其他成员的研究，但是其主要侧重于该类基因在植物体细胞胚胎的发生的研究，并未发现其具有与本发明类似的功能，发明人认为这与本发明的基因与现有基因功能具有较大的不同有关。

获得上述的目标基因后，发明人利用其构建了植物表达载体pMEE45:：MEE45-GFP，该载体为利用限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ酶切扩增得到的MEE45基因DNA片段，并将其连接在PROK2空表达载体获得；发明人进一步利用获得的该载体转化农杆菌。

最后发明人利用农杆菌介导转化拟南芥花序，并最终筛选获得了具有抗性的植株，并最终验证发现该植株具有叶器官变大、种子变大(图3所示)和油脂含量增高(图3所示)等表型。将该基因应用于生产，改良种子的大小、千粒重和油脂含量等重要农艺性状，用于提高作物的产量和品质，具有重要的经济价值和社会效益。

在本发明的另一实施方案中，研究了mee45突变体和MEE45过表达的细胞学基础，具体步骤如下：

(1)利用透明剂将植物组织透明后观察照相对mee45突变体、MEE45过表达和野生型授粉前的胚珠、授粉后的胚胎发生过程进行详细对比研究(图4所示)，研究发现mee45突变体胚珠及胚胎变小，种子变小；相反过表达植株pMEE45::MEE45胚珠及胚胎变大，种子变大。

(2)将mee45突变体与野生型植株进行父母本的正反交实验，观察杂交后代的胚珠、胚和胚乳的表型，分析MEE45是否通过母体组织或者合子组织调控种子大小发育(图5所示)，研究表明MEE45是通过母系遗传控制种子大小的。

在本发明的又一实施方案中，研究了MEE45基因的表达模式和蛋白的亚细胞定位，具体如下：

构建pMEE45::MEE45-GFP融合表达载体并转化植株，对MEE45蛋白的表达模式进行分析(图6所示)，研究表明MEE45在胚珠及胚胎中都表达，定位模式为核定位。

在本发明的又一实施方案中，对MEE45基因调控油脂含量进行了研究，具体如下：

发明人测了野生型Col、突变体mee45和过表达35S::MEE45种子中总油脂的含量，发现突变体中油脂的含量相比野生型有所减少，而过表达里油脂的含量有所上升(图7所示)。

在本发明的又一实施方案中，对MEE45的甘蓝型油菜同源基因BnaC04g36220D进行了研究，具体如下：

通过进化树分析和同源性比较，找到了甘蓝型油菜中与MEE45亲缘关系较近的同源性达56％基因BnaC04g36220D，将该基因克隆出来转拟南芥mee45突变体和野生型，观察是否影响种子大小的发育(图8所示)，研究发现过表达BnaC04g36220D基因转拟南芥mee45突变体，能够恢复mee45种子变小的表型；过表达BnaC04g36220D基因转拟南芥野生型，转基因植株种子变大。我们也正在转化该基因过表达的甘蓝型油菜，在得到转基因植株后观察种子的大小和品质的变化。其核苷酸序列如SED ID NO.3所示，该基因全长为1530bp，氨基酸序列如SED ID NO.4所示，编码510个氨基酸。

该基因从甘蓝型油菜10天的小苗幼叶cDNA中扩增获得，其具体步骤如下：

1.油菜RNA的提取和纯化

2.cDNA第一链的合成

3.BnaC04g36220D基因的克隆

以cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-TAGGATCCATGGTGAACAAACGTTTCTTCAAGC-3'，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物:5'-TAGAGCTCTCATTCGGTCTCATGCTTTACCTT-3'，如SEQ ID NO.8所示；

其中划横线部分为BamHⅠ和SacⅠ酶切位点；

取4μL PCR产物与pEasy-Blunt Simple Vector载体连接，操作步骤按照TransGenBiotech公司产品pEasy-Blunt Simple Vector说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。扩增产物经测序分析，其序列如SEQ ID NO.3所示，表明扩增产物为BnaC04g36220D基因。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1、MEE45和BnaC04g36220D基因克隆及植物表达载体构建

1.1拟南芥RNA的提取和纯化

鲜的拟南芥幼嫩角果在液氮中研磨，迅速将研磨好的样品移入15mL CTAB提取液中(2％(W/V)CTAB，2％(W/V)PVP，100mM Tris-HCl(pH8.0)，25mM EDTA，2.0M NaCl，2％(W/V)β-巯基乙醇，0.5g/L亚精胺)，立即涡旋震荡30s，65℃水浴片刻，加与CTAB提取液等体积的氯仿：异戊醇的混合物，其中氯仿：异戊醇的体积比为24:1，振荡混匀；室温下10000rpm离心15分钟，转移上清液到另一干净管中，加入与上清液等体积的氯仿：异戊醇混合物(体积比24:1)混匀静置，重复抽提一次，室温下10000rpm离心15分钟，转移水相到另一离心管中。根据溶液体积加入8M LiCl，使LiCl终浓度为2M，4℃过夜沉淀(最多16小时)。4℃离心20分钟，去掉上清液，用500μL 70％乙醇漂洗沉淀，用500μL SSTE液(1.0M NaCl，0.5％(W/V)SDS，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA(pH8.0))溶解沉淀，将溶液转移到1.5mL离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇混合物(体积比24:1)，再抽提一次。上清液中加入2倍体积的乙醇，-70℃沉淀30分钟或-20℃沉淀2小时，4℃12000rpm离心20分钟，沉淀DNA，先用400μL70％乙醇漂洗沉淀，再加入400μL 100％乙醇漂洗沉淀，干燥沉淀后，用50μL DEPC ddH₂O溶解沉淀。

为确保RNA质量达到测序要求，分别使用分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的RNA样品纯度和浓度，其中纯度和浓度标准为：RNA纯度为OD260/280和OD260/230均在1.8-2.0范围内，RNA浓度在1.0-2.0μg/μL范围内。

1.2 cDNA第一链的合成

在0.2mL DEPC处理的离心管中顺序加入1μL 50μM Oligo dT Primer和15.5μL总RNA，70℃变性6分钟，迅速冰浴10分钟。在上述离心管中顺序加入2μL dNTP Mixture(10mM)，5μL 5×Primer Script Buffer，0.5μL RNase Inhibitor(40U)，1μL PrimerScript RTase(200U)，加DEPC-H₂O至25μL。在PCR仪上运行程序为25℃，10分钟；42℃，90分钟；95℃，5分钟。程序结束后，样品于-80℃冻存待用。

1.3 MEE45和BnaC04g36220D基因的克隆

以反转录的cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

MEE45以基因组为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-TAGGATCCATGGCGCATCAACATTTCTTCT-3'，如SEQ ID NO.5所示；

下游引物:5'-TAGGTACCTCATTTGATTTCTAGCTTCACCTT-3'，如SEQ ID NO.6所示；

其中划横线部分为BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点；

扩增条件为：94℃预变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

甘蓝型油菜基因以cDNA为模板，采用以下引物对进行PCR扩增：

上游引物:5'-TAGGATCCATGGTGAACAAACGTTTCTTCAAGC-3'，如SEQ ID NO.7所示；

下游引物:5'-TAGAGCTCTCATTCGGTCTCATGCTTTACCTT-3',如SEQ ID NO.8所示；

其中划横线部分为BamHⅠ和SacⅠ酶切位点；

扩增条件为：95℃变性3min；95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，循环32次；72℃延伸7min。

1.4植物表达载体pMEE45::MEE45-GFP和35S::BnaC04g36220D基因的获得

用限制性内切酶BamH I和Kpn I切MEE45 DNA片段。用限制性内切酶BamH I和KpnI切PROKⅡ空表达载体，二者均通过电泳检测并回收目的片段。利用T4连接酶连接酶切后的片段，操作步骤按照Fermentas公司产品T4 DNA ligase说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA并进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的表达载体pMEE45::MEE45-GFP转化农杆菌GV3101并获得可供转化使用的农杆菌菌株。本发明采用的是电击法转化农杆菌。

用限制性内切酶BamH I和Sac I切BnaC04g36220D DNA片段。用限制性内切酶BamHI和Sac I切PROKⅡ空表达载体，二者均通过电泳检测并回收目的片段。利用T4连接酶连接酶切后的片段，操作步骤按照Fermentas公司产品T4 DNA ligase说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含有卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上培养过夜。挑取白色菌落，在含有壮观霉素(50mg/L)的LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA并进行酶切鉴定。将酶切鉴定正确的表达载体35S::BnaC04g36220D转化农杆菌GV3101并获得可供转化使用的农杆菌菌株。

实施例2、农杆菌介导的拟南芥花序的转化及抗性植株的获得

浸染前一天挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于含有50mg/L卡那霉素的YEP培养基中，28℃，220rpm摇菌过夜，第二天一早沉淀并用预浸染培养基中重悬。然后浸染正在开花的拟南芥花序组织，花序组织在浸染液中浸染15s，然后暗培养24h，接着16h光照8h黑暗培养生长到拟南芥花序生长到拟南芥角果成熟，最后收了所有种子，用于筛选阳性植株。因为PROKⅡ空载体带有的植株抗性为卡那抗性，所以用含有卡那抗性的GM培养基筛选种子，能够活下来的有可能为阳性植株，为了严谨起见，可以从基因上设计一端引物，从载体骨架上设计另一端引物，用这一对嵌套引物筛选基因组，能够显示出正确条带的是阳性植株。

pMEE45::MEE45-GFP和35S::BnaC04g36220D阳性植株的嵌套引物序列如下：

MEE45上游引物：5'-TAGGATCCATGGCGCATCAACATTTCTTCT-3'，如SEQ ID NO.9所示；

BnaC04g36220D上游引物：5'-TAGGATCCATGGTGAACAAACGTTTCTTCAAGC-3'，如SEQID NO.10所示；

下游引物序列：5'-CAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGG-3'，如SEQ ID NO.11所示；(两个基因可共用)。

实施例3、突变体及阳性转基因植株的表型分析

测量突变体及阳性转基因植株和野生型植株成熟的种子大小，统计千粒重和长宽(图3)；并观察胚珠和种子发育过程及测量种子中油脂的含量。由图3可以看出，mee45突变体种子相比野生型种子变小，千粒重减小；相反过表达植株pMEE45::MEE45-GFP种子变大，千粒重增大。由图4可以看出，mee45突变体胚珠和胚均变小，油脂含量降低；相反过表达pMEE45::MEE45-GFP植株的胚珠和胚均变大。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种用于改良种子大小和品质的基因及其应用

<130> 2018

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1587

<212> DNA

<213> MEE45基因

<400> 1

atggcgcatc aacatttctt caagcctctt cttcctggct tccacgcctc cttgacaatt 60

cctgtagcct tcttcttgaa gtatatagaa ggaagatatg agcagaagac ggcgaagctg 120

agatcagacg cgtcaaagag aacttgggaa gtgaagatag atggccagag actcaccgac 180

ggttggaaag agtttgctgt ctcacatgat cttcgaatcg gtgacattgt tgttttcaga 240

caagagagtg acttggcttt ccatgtaaca ctgttgggac ctagttgttg tgggattcaa 300

tatggttcgt gttcagtcga aaagaacaac ctcggtgacg agaaaaagaa agtgaaggag 360

aatccaaatg gagaagcaga gtcttcttca cgagatccct cttgttttgt ggctaatgtt 420

gcgccttcga gtctacgtta tgacttgatg agatttccaa ggggttttgt gagggataat 480

ggtgtagtcg gatctggaga gattgttctg atgaatgaaa agggcagatc atggaatttt 540

aacttgagac aaaagccatc aaacggaaca gtttatgtta gaggagggtg ggtgagtttt 600

tgtgatgcca atgggcttaa agctggagat aactacactt tcaaactgat caaaagagca 660

ggaactcttg ttctacgttt gttacccaat gagccaaaag aggaagctaa tgaagtgtct 720

cttcccgaag aaccggaaag cgatgcagag cgcaaccttg aaaagattca aaggaaggag 780

aaagtgaaga agaatgtaac aagagaggca gagtcttctt cacaagatcc ctcttgtttt 840

gtggctaatg tctccccttc gagtctacgc tatgacacac tgtatcttcc aaagcgtttt 900

atgagggaaa atggtgtaga caaaagatgt ggagagatga ttctgattaa tgaaaaggga 960

aaatcatgga ctttagattt gaaagtaaag aaatcatccg gaacttctct catcaaacga 1020

ggatggagaa gtttctgtag tgccaatgga ctaagagctg gaagtatcat aactctcaaa 1080

ctgataaaga aaagagcaac tcttgttcta cgtttgatcc ccaacgagcc agaagaagct 1140

aatgaagtag tctctctttc gacagagcaa gaaagcgatg aagagagtat ccacgacgag 1200

aaaatctcaa gaagaaagtc tttactatcc gaaaaccgat ttgtgacatt aactctaaca 1260

ccttatacaa tccaaagttc tctactgaat gagaatcttt tgtgtgaatc tatgtttcag 1320

cgtcttccgg ttcctttcac gaggatgaat ggtatcaatg aagaaactaa aatgactctg 1380

ttggataaac atggtgtgaa gtggttaacg actctgcggt tcgaggacga caaaagaaaa 1440

agactacgaa tggtaggagg atggcaagga ttcatccaag ctaacgatgt gaaggcaaac 1500

gaatccatca tgttggaact gatttgggaa gaagaaacaa gttgcgtcct taagttctgc 1560

tccaaggtga agctagaaat caaatga 1587

<210> 2

<211> 528

<212> PRT

<213> MEE45基因编码蛋白

<400> 2

Met Ala His Gln His Phe Phe Lys Pro Leu Leu Pro Gly Phe His Ala

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ile Pro Val Ala Phe Phe Leu Lys Tyr Ile Glu Gly Arg

20 25 30

Tyr Glu Gln Lys Thr Ala Lys Leu Arg Ser Asp Ala Ser Lys Arg Thr

35 40 45

Trp Glu Val Lys Ile Asp Gly Gln Arg Leu Thr Asp Gly Trp Lys Glu

50 55 60

Phe Ala Val Ser His Asp Leu Arg Ile Gly Asp Ile Val Val Phe Arg

65 70 75 80

Gln Glu Ser Asp Leu Ala Phe His Val Thr Leu Leu Gly Pro Ser Cys

85 90 95

Cys Gly Ile Gln Tyr Gly Ser Cys Ser Val Glu Lys Asn Asn Leu Gly

100 105 110

Asp Glu Lys Lys Lys Val Lys Glu Asn Pro Asn Gly Glu Ala Glu Ser

115 120 125

Ser Ser Arg Asp Pro Ser Cys Phe Val Ala Asn Val Ala Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Arg Tyr Asp Leu Met Arg Phe Pro Arg Gly Phe Val Arg Asp Asn

145 150 155 160

Gly Val Val Gly Ser Gly Glu Ile Val Leu Met Asn Glu Lys Gly Arg

165 170 175

Ser Trp Asn Phe Asn Leu Arg Gln Lys Pro Ser Asn Gly Thr Val Tyr

180 185 190

Val Arg Gly Gly Trp Val Ser Phe Cys Asp Ala Asn Gly Leu Lys Ala

195 200 205

Gly Asp Asn Tyr Thr Phe Lys Leu Ile Lys Arg Ala Gly Thr Leu Val

210 215 220

Leu Arg Leu Leu Pro Asn Glu Pro Lys Glu Glu Ala Asn Glu Val Ser

225 230 235 240

Leu Pro Glu Glu Pro Glu Ser Asp Ala Glu Arg Asn Leu Glu Lys Ile

245 250 255

Gln Arg Lys Glu Lys Val Lys Lys Asn Val Thr Arg Glu Ala Glu Ser

260 265 270

Ser Ser Gln Asp Pro Ser Cys Phe Val Ala Asn Val Ser Pro Ser Ser

275 280 285

Leu Arg Tyr Asp Thr Leu Tyr Leu Pro Lys Arg Phe Met Arg Glu Asn

290 295 300

Gly Val Asp Lys Arg Cys Gly Glu Met Ile Leu Ile Asn Glu Lys Gly

305 310 315 320

Lys Ser Trp Thr Leu Asp Leu Lys Val Lys Lys Ser Ser Gly Thr Ser

325 330 335

Leu Ile Lys Arg Gly Trp Arg Ser Phe Cys Ser Ala Asn Gly Leu Arg

340 345 350

Ala Gly Ser Ile Ile Thr Leu Lys Leu Ile Lys Lys Arg Ala Thr Leu

355 360 365

Val Leu Arg Leu Ile Pro Asn Glu Pro Glu Glu Ala Asn Glu Val Val

370 375 380

Ser Leu Ser Thr Glu Gln Glu Ser Asp Glu Glu Ser Ile His Asp Glu

385 390 395 400

Lys Ile Ser Arg Arg Lys Ser Leu Leu Ser Glu Asn Arg Phe Val Thr

405 410 415

Leu Thr Leu Thr Pro Tyr Thr Ile Gln Ser Ser Leu Leu Asn Glu Asn

420 425 430

Leu Leu Cys Glu Ser Met Phe Gln Arg Leu Pro Val Pro Phe Thr Arg

435 440 445

Met Asn Gly Ile Asn Glu Glu Thr Lys Met Thr Leu Leu Asp Lys His

450 455 460

Gly Val Lys Trp Leu Thr Thr Leu Arg Phe Glu Asp Asp Lys Arg Lys

465 470 475 480

Arg Leu Arg Met Val Gly Gly Trp Gln Gly Phe Ile Gln Ala Asn Asp

485 490 495

Val Lys Ala Asn Glu Ser Ile Met Leu Glu Leu Ile Trp Glu Glu Glu

500 505 510

Thr Ser Cys Val Leu Lys Phe Cys Ser Lys Val Lys Leu Glu Ile Lys

515 520 525

<210> 3

<211> 1530

<212> DNA

<213> BnaC04g36220D基因

<400> 3

atggtgaaca aacgtttctt caagcctctt cttcctggct tccacagcca cttgacaatt 60

cctgtagcct tcttcgtcaa gtatatagaa ggaaaaaacg agcaccatac gacgaagcta 120

agatcagacg cgtcaaagat aacctgggaa gtgaaaatag aagatggcca gaaactcact 180

gacggttgga aagagttcgc tcttgcacac gatcttcgta tcggcgacat tctcattttc 240

aagcaagaga aagacatggc tttccacgta acactcttgg gacccagtgg ctgtgagatt 300

caatatgagt cgtgttcaga agaagagaac aacttcggga atattccaaa gaagaagaat 360

tcaaaaagag aagcagagtc ttcttcacta gatccttctt gtttcttggc taatatctgg 420

ccttcgtcct tacgctatga ctcattgaac cttccaagga gttttgtgag ggcaaatggt 480

ctagagacaa gatgtggaag agagatcgtt ctgatcaatg aaaagggtaa atcatggact 540

ttggctttaa aacaaaagct atctggacct acttacatca gacgagggtg gagaagtttc 600

tgtattgcca atggtcttaa aactggaggc gtctacactt tcaaactaat caagagaggg 660

agagctccgg ttcttcgttt gtcctccaca gagtcagagt tagaagagag aaacatcgag 720

aagattcaga ggaacaaagc agagtcttcc tcactaaatc cctcttgttt tgtggctaat 780

atctcgcgtg caaccctacg ttatgacaca ctgggtcttc caatgaaatt ttcaagggaa 840

aatggtctag aggcaagatg tggagagatt gttctaatga atgaaaaggg tagatcgtgg 900

aagctaaatc tgaaacgaaa gagatcatgc ggaactatgt atatcacaca agggtggagg 960

agtttctgta gtgcaaatgg acttagagct ggaagttctt ccactttcaa actgatcaaa 1020

agaggaggaa ctctggctct acgtttgtca tctaaagaga ctgaagaaga agaagaagat 1080

tgctcattaa aagctaatga agtggagtct ctttccacag aaccagaaag cgatgaagag 1140

gggagccaag atgagaaaca aatcaagaag catagatcga catggaaagc ttcatcttca 1200

caatcccaaa accgatttgt gacacttact tttagacctt tcaatcttga aaagtattta 1260

ctgtttcttc ctttacgctt caccaggtgg cacggcatca atgaagaaac taaaatgaga 1320

ctgttggaca aaaacggtgt caagtggtct acggatctgc ggtctgggaa aactaatatt 1380

gataaaataa gattggtagg aggttggcaa gaattcttca aagctaactg tgtgaagcca 1440

ggtgaatcta tcattgtgaa gctgatatgg gatggagaca aaagttgtat cctcaagttc 1500

tgctctaagg taaagcatga gaccgaatga 1530

<210> 4

<211> 509

<212> PRT

<213> BnaC04g36220D基因编码蛋白

<400> 4

Met Val Asn Lys Arg Phe Phe Lys Pro Leu Leu Pro Gly Phe His Ser

1 5 10 15

His Leu Thr Ile Pro Val Ala Phe Phe Val Lys Tyr Ile Glu Gly Lys

20 25 30

Asn Glu His His Thr Thr Lys Leu Arg Ser Asp Ala Ser Lys Ile Thr

35 40 45

Trp Glu Val Lys Ile Glu Asp Gly Gln Lys Leu Thr Asp Gly Trp Lys

50 55 60

Glu Phe Ala Leu Ala His Asp Leu Arg Ile Gly Asp Ile Leu Ile Phe

65 70 75 80

Lys Gln Glu Lys Asp Met Ala Phe His Val Thr Leu Leu Gly Pro Ser

85 90 95

Gly Cys Glu Ile Gln Tyr Glu Ser Cys Ser Glu Glu Glu Asn Asn Phe

100 105 110

Gly Asn Ile Pro Lys Lys Lys Asn Ser Lys Arg Glu Ala Glu Ser Ser

115 120 125

Ser Leu Asp Pro Ser Cys Phe Leu Ala Asn Ile Trp Pro Ser Ser Leu

130 135 140

Arg Tyr Asp Ser Leu Asn Leu Pro Arg Ser Phe Val Arg Ala Asn Gly

145 150 155 160

Leu Glu Thr Arg Cys Gly Arg Glu Ile Val Leu Ile Asn Glu Lys Gly

165 170 175

Lys Ser Trp Thr Leu Ala Leu Lys Gln Lys Leu Ser Gly Pro Thr Tyr

180 185 190

Ile Arg Arg Gly Trp Arg Ser Phe Cys Ile Ala Asn Gly Leu Lys Thr

195 200 205

Gly Gly Val Tyr Thr Phe Lys Leu Ile Lys Arg Gly Arg Ala Pro Val

210 215 220

Leu Arg Leu Ser Ser Thr Glu Ser Glu Leu Glu Glu Arg Asn Ile Glu

225 230 235 240

Lys Ile Gln Arg Asn Lys Ala Glu Ser Ser Ser Leu Asn Pro Ser Cys

245 250 255

Phe Val Ala Asn Ile Ser Arg Ala Thr Leu Arg Tyr Asp Thr Leu Gly

260 265 270

Leu Pro Met Lys Phe Ser Arg Glu Asn Gly Leu Glu Ala Arg Cys Gly

275 280 285

Glu Ile Val Leu Met Asn Glu Lys Gly Arg Ser Trp Lys Leu Asn Leu

290 295 300

Lys Arg Lys Arg Ser Cys Gly Thr Met Tyr Ile Thr Gln Gly Trp Arg

305 310 315 320

Ser Phe Cys Ser Ala Asn Gly Leu Arg Ala Gly Ser Ser Ser Thr Phe

325 330 335

Lys Leu Ile Lys Arg Gly Gly Thr Leu Ala Leu Arg Leu Ser Ser Lys

340 345 350

Glu Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Cys Ser Leu Lys Ala Asn Glu Val

355 360 365

Glu Ser Leu Ser Thr Glu Pro Glu Ser Asp Glu Glu Gly Ser Gln Asp

370 375 380

Glu Lys Gln Ile Lys Lys His Arg Ser Thr Trp Lys Ala Ser Ser Ser

385 390 395 400

Gln Ser Gln Asn Arg Phe Val Thr Leu Thr Phe Arg Pro Phe Asn Leu

405 410 415

Glu Lys Tyr Leu Leu Phe Leu Pro Leu Arg Phe Thr Arg Trp His Gly

420 425 430

Ile Asn Glu Glu Thr Lys Met Arg Leu Leu Asp Lys Asn Gly Val Lys

435 440 445

Trp Ser Thr Asp Leu Arg Ser Gly Lys Thr Asn Ile Asp Lys Ile Arg

450 455 460

Leu Val Gly Gly Trp Gln Glu Phe Phe Lys Ala Asn Cys Val Lys Pro

465 470 475 480

Gly Glu Ser Ile Ile Val Lys Leu Ile Trp Asp Gly Asp Lys Ser Cys

485 490 495

Ile Leu Lys Phe Cys Ser Lys Val Lys His Glu Thr Glu

500 505

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taggatccat ggcgcatcaa catttcttct 30

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taggtacctc atttgatttc tagcttcacc tt 32

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taggatccat ggtgaacaaa cgtttcttca agc 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tagagctctc attcggtctc atgctttacc tt 32

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

taggatccat ggcgcatcaa catttcttct 30

<210> 10

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

taggatccat ggtgaacaaa cgtttcttca agc 33

<210> 11

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

caagagtcca ctattaaaga acgtgg 26

Claims

1.用于改良种子大小和品质的基因，其特征在于，是如下1)-2)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

2)由SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的蛋白的编码基因。

2.携带权利要求1所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌。

3.如下a)-c)中任一项所述的DNA片段在改良种子大小和品质中的应用；

a)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.4所示的蛋白等价。

4.如下1)-3)中任一项所述的蛋白在改良种子大小和品质中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.4所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

5.携带权利要求1所述的基因的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在促进植物体细胞胚发生中的应用。

6.一种促进种子增大和/或油脂合成的方法，其特征在于，包括用如下a)-c)任一项所述的多核苷酸转化植物并使所述多核苷酸在所述植物中表达的步骤；

a)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

7.一种降低种子中油脂含量的方法，其特征在于，包括在产生所述种子并且含有如下a)-c)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

c)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.4所示的蛋白等价；

或者包括在产生所述种子并且含有由如下1)-2)中任一项所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.4所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.4所示的蛋白具有相同功能的蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者使用干扰RNA干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

9.一种培育种子大小和品质改良的转基因植物的方法，其特征在于，是将如下a)-c)任一项所述的多核苷酸导入目的植物得到种子大小和品质改良的转基因植物；

a)SEQ ID NO.3所示的DNA片段；

b)编码SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述种子大小和品质改良为如下1)-4)中的至少一种：

1)所述转基因植物的种子大于所述目的植物；

2)所述转基因植物的叶器官大于所述目的植物；

3)所述转基因植物的种子的千粒重大于所述目的植物；

4)所述转基因植物的种子中油脂含量大于所述目的植物。