CN110606879B

CN110606879B - 一种蛋白及其基因在控制粒重和/或含油量中的应用

Info

Publication number: CN110606879B
Application number: CN201911032791.5A
Authority: CN
Inventors: 伍晓明; 闫贵欣; 张美丽; 胡继宏; 高桂珍; 陈碧云; 许鲲
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2022-02-25
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN110606879A

Abstract

本发明涉及一种蛋白及其基因在控制粒重和/或含油量中的应用。所述植物种子性状包括植物所结的种子的粒重和/或含油量，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

Description

一种蛋白及其基因在控制粒重和/或含油量中的应用

技术领域

本发明涉及一种蛋白及其基因在控制粒重和/或含油量中的应用。

背景技术

随着人们生活水平的提高，对油脂的需求量日益增大。

油菜是世界第二大油料作物,也是中国重要的油料作物，菜籽油占国产食用植物油的近57％。决定油菜产油量高低的两个最重要构成因子是种子含油量和单位面积种子产量，因此，提高产量和含油量是提高油菜产油量的重要途径。粒重是构成甘蓝型油菜的单株产量重要构成因子之一，发掘控制粒重、种子含油量等性状方面的基因，对提高油菜生产、满足人类的油脂需求具有重要意义。

发明内容

本发明之一提供了一种蛋白在控制植物所结的种子的粒重(可以以平均的单粒、百粒重或千粒重来计)和/或所述种子的含油量中的应用，其中所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

在一个具体实施方式中，在所述植物的生长阶段，在所述植物中存在所述蛋白时，能够提高所述种子的粒重和/或含油量，其中，这些性状的提高是相对于植物中不存在所述蛋白或所述蛋白的表达量更少的情况来讲的；在所述植物的生长阶段，在所述植物中不存在所述蛋白时，能够降低所述种子的粒重和/或含油量；其中，这些性状的降低是相对于植物中存在所述蛋白或所述蛋白的表达量更多的情况来讲的。

在一个具体实施方式中，所述植物为芸薹属(Brassica)和/或拟南芥属(Arabidopsis)中的植物中的至少一种。

在一个具体实施方式中，所述植物为白菜型油菜(Brassica rapa(campestris)L)、芥菜型油菜(Brassica juncea L.)、甘蓝型油菜(Brassica napus L.)、埃塞俄比亚芥(Brassica carinata Braun)、甘蓝(Brassica oleracea L.)、黑芥(Brassica nigraKoch)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的至少一种。

本领域的技术人员公知，一般对于蛋白来讲，其通常具有保守区域和可变区域，当改变其中的保守区域的一个或多个氨基酸时，虽然不必然导致改变蛋白的功能、使蛋白的功能减弱、使蛋白的功能增强或使蛋白的功能消失，但产生这些可能的情况的几率是非常大的；而当改变其中的可变区域的一个或多个氨基酸时，则一般不会影响该蛋白原有的功能。因此，在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列75％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列85％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

例如，相对于SEQ ID No.2氨基酸序列中的其他区域，改变或缺失SEQ ID No.2氨基酸序列的第110位的K，第119位的E，第127位的G，第195位的K，第199位的T，第229至230位的TE，第285至293位的ERQVSEPRE氨基酸一般不会影响该蛋白原有的功能。因此，在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列95％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述蛋白的氨基酸序列具有与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列99％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

本发明之二提供了一种核苷酸在控制植物所结的种子的粒重和/或含油量中的至少一种中的应用，其中所述核苷酸能够编码如本发明之一中任意一项所述的应用中的所述蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码的蛋白的氨基酸序列如SEQID No.2所示。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列75％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列85％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列95％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列95.45％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

例如，在一个具体实施方式中，所述核苷酸能够编码与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列99％以上的一致性，且与如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的蛋白。

在一个具体实施方式中，所述核苷酸如SEQ ID No.1所示。

在一个具体实施方式中，在所述植物的生长阶段，在所述植物中存在所述核苷酸且所述核苷酸能够表达出所示蛋白时，能够提高所述种子的粒重和/或含油量；

在所述植物的生长阶段，在所述植物中不存在所述核苷酸时，能够降低所述种子的粒重和/或含油量。

本发明的有益效果：

本发明首次发现了如SEQ ID No.2所示的蛋白能够提高植物(例如拟南芥或油菜)的种子的粒重、种子的含油量的效用。通过将其所对应的基因在植物中超表达，可以改善植物的上述多种性状，例如，包括可提高种子的粒重、种子的含油量。基于此，为了使籽粒更重、含油量更高，需要使植物在生长阶段有如SEQ ID No.2所示的蛋白存在，并通过现有已知的生物技术手段使如SEQ ID No.2所示的蛋白尽量多的存在，例如通过过表达(或称之为超表达)的方式使植物植株内积累更多的如SEQ ID No.2所示的蛋白。

附图说明

图1显示了如SEQ ID No.2所示的蛋白的保守结构域分析。

图2显示了蛋白序列的比对结果及其保守氨基酸位点。其中，

XP_009116965.1为白菜型油菜(B.rapa)；

XP_013670552.1为甘蓝型油菜(B.napus)；

XP_013604621.1为甘蓝(B.oleracea var.oleracea)；

XP_013604620.1为甘蓝(B.oleracea var.oleracea)；

XP_013711109.1为甘蓝型油菜(B.napus)；

XP_018488078.1为萝卜(Raphanus sativus)。

图3显示了转BnaC08g40330D基因的拟南芥株系1-12的转录水平。其中，WT为野生型对照，40330-1至40330-12依次为按照1至12的顺序编号的12株阳性苗。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

图4显示了种子的百粒重。其中，WT为野生型对照，40330-1、40330-6和40330-9依次为编号1、6和9的阳性苗单株。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

图5显示了种子的含油量。其中，WT为野生型对照，40330-1、40330-6和40330-9依次为编号1、6和9的阳性株。**表示在P<0.01水平下具有极显著差异。

具体实施方式

以下通过优选的实施案例的形式对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但其不构成对本发明的限制。

如无特别说明，本发明的实施例中的试剂均可通过商业途径购买。

MS培养基：M519(phytotechlab)4.4g、蔗糖30g，琼脂8g，用蒸馏水补至1升，pH5.8。

1.基因的克隆与过表达载体构建

(1)基因的克隆与序列分析

获得甘蓝型油菜基因组数据库Genoscope(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)中BnaC08g40330D的cDNA序列(SEQ ID No.1)，其能够编码的蛋白具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。该蛋白的分子量为33.28kDa，等电点6.15。

通过PFAM保守结构域分析，该蛋白含有锌指蛋白结构域(图1)，序列中的第1位至74位为保守结构域，其他为可变区，那么保守区占比为25％，可变区占比为75％。

将SEQ ID No.2在ncbi中进行blast，从blast结果中去掉重复，选取与SEQ IDNo.2一致性在95％以上的不同的代表物种，包括白菜型油菜、甘蓝型油菜、甘蓝和萝卜的序列，然后通过DNAMAN将SEQ ID No.2与各序列进行比对，结果见图2，结果显示这些序列的一致性为95.45％。以SEQ ID No.2的氨基酸序列顺序来讲，第1位的M，第2位的G，第4至9位的ASASLL、第11至23位的PMDTDSAIPRDRD、第25的G、第27至60位的SQFGCEHYKRRCKIRAPCCNLIFPCRHCHNDAAN、以及第62位的L、第64至85位的DPKERHDLVRQNVKQVICSVCE、第87至95位的EQEVAQVCS、第97至109位的CGVCMGEYFCNIC、第111至115位的FFDDE、第121位的F、第144至191位的GACYSMGLRDNHSCIENATKNSCPVCYEFLFDSVKAAHVMRCGHTMHM、第193至194位的CF、第196至198位的QMI、第200至224位的EQQYRCPICYKSMMDMSSSWQLLDA、第226至228位的IRA、第231至238位的MPSEYNYE、第240至241位的EI、第243至277位的CNDCNKSSKAMFHILGHKCAHCGSYNTRRISAPQD在各物种中最保守；第3位的G，第10位的H，第24位的F，第26位的R，第61位的A，第63位的P，第86位的A，第96位的N，第116至118位的TSK，第120位的Q，第122至126位的HCDDC，第128至143位的ICRVGGRDNFFHCQSC，第192位的G，第225位的E，第239位的I，第242位的L，第278至284位的PPPQGET在各物种中次保守；第110位的K，第119位的E，第127位的G，第195位的K，第199位的T，第229至230位的TE，第285至293位的ERQVSEPRE在各物种中虽然也具有一定的保守性，但相对来讲，可以适当发生变化或缺失。其中，最保守的序列在SEQ IDNo.2中的占比为234/293＝79.9％；次保守的序列在SEQ ID No.2中的占比为44/293＝15.0％；两者共计79.9％+15.0％＝94.9％(≈95％)。

根据上述cDNA序列设计扩增该基因全长的引物，并在引物部分引入酶切位点(KpnI/XbaI)和保护碱基。cDNA序列引物为40330-F(SEQ ID No.3)和40330-R(SEQ IDNo.4)。

使用TransZol试剂盒(TranGen)提取甘蓝型油菜品种Westar 2叶龄幼苗RNA，电泳检测条带完整。取500ng RNA进行反转录，以得到cDNA。然后以该cDNA为模板，以40330-F(SEQ ID No.3)/40330-R(SEQ ID No.4)为引物进行PCR，扩增获得该基因的全长cDNA序列，并克隆至克隆载体PMD-18T，转化大肠杆菌DH5α，并对转化产物进行培养，对培养出的重组子进行PCR和测序检测，获得阳性质粒，命名为PMD-40330。

(2)表达载体构建

KpnI/XbaI双酶切质粒PMD-40330和表达载体pCambia2301-KY，回收前者中的目的基因片段和后者中的载体骨架，并将两回收产物连接，转化大肠杆菌DH5α。利用载体上目的基因上游35S启动子的引物35S-F(SEQ ID No.5)和基因的下游引物40330-R(SEQ ID No.4)进行PCR鉴定，结合KpnI/XbaI双酶切检测，获得阳性质粒，命名为pCa-40330。

2.转化拟南芥和转基因植株的筛选鉴定

将pCa-40330质粒转化农杆菌GV3101，并检测阳性菌落。利用农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法，将转入农杆菌GV3101中的pCa-40330质粒转入拟南芥，然后于22℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，收取T1代种子，在含有卡那抗生素的培养基初步筛选阳性苗。将阳性苗种植到土壤中，并提取4周拟南芥叶片gDNA，用引物35S-F(SEQ ID No.5)和40330-R(SEQ ID No.4)对阳性苗进一步鉴定，结果显示，所检测的12株苗均为阳性苗。

将1至12号转基因拟南芥的T2代种子，在含有卡那霉素的MS培养基上培养并进行筛选，用不含卡那霉素的MS培养基培养野生拟南芥作为对照。提取拟南芥野生型和1至12号转基因拟南芥的RNA，逆转录得到cDNA，用引物RTf1(SEQ ID No.6)和RTr1(SEQ ID No.7)检测各个株系目标基因的转录水平，结果见图3。选取表达量较高的1、6和9号转基因拟南芥继续种植，直到获得这3个株系的T3代纯合体阳性苗，得到1、6和9号各转基因拟南芥的纯合体种子。

3.转基因拟南芥T3代植株表型鉴定

将获得的1、6和9号转基因纯合体的种子和野生型Col种子在MS培养基萌发并培养至4叶期，挑选长势一致的移栽到土壤中(营养土：蛭石为1:3)，每盆移栽3株(相同株系)，且1、6和9号转基因拟南芥和野生型每个株系移栽3盆，将其放置于温度22℃，16h光照/8h黑暗条件下培养，每次浇等量的水，尽量保证其生长环境的一致性。

收取T3代的种子烘干，用扫描仪扫描种子的形态，并用万深的自动考种分析仪软件统计其百粒重，利用气相色谱测定种子的含油量，结果见图4、图5。测量数据可以发现，目标BnaC08g40330D基因(SEQ ID No.1)过表达株系的种子百粒重和含油量都极显著或显著高于野生型。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 一种蛋白及其基因在控制粒重和/或含油量中的应用

<130> LHA1960615

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1045

<212> DNA/RNA

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 1

gctgctggtt catcgtcctg tggggttgaa cctaattcca aatcagatgg gtggtgcaag 60

tgctagtctc ctccatccaa tggatacaga ttctgcaatt cctagagaca gagactttgg 120

cagatcccaa ttcggctgtg aacactacaa gagaaggtgc aaaataagag cgccttgctg 180

caatctcatc ttcccatgcc gccactgcca caacgacgcc gcgaacgctt tacctgatcc 240

taaagaacga catgatttgg tccgacaaaa cgtcaaacag gttatctgtt cagtgtgtga 300

agctgagcaa gaggtagctc aagtctgctc gaactgcggc gtctgtatgg gagaatactt 360

ttgcaacatc tgcaaattct ttgacgacga gacctcaaaa gaacaatttc attgtgacga 420

ctgtgggatt tgtagagttg gtgggcgtga caatttcttt cattgccaaa gctgtggagc 480

ttgttattca atgggcctgc gcgataatca ctcatgcatt gagaacgcca ctaagaactc 540

ttgtcctgtc tgttatgagt ttttatttga ttccgtaaaa gctgcacatg tcatgagatg 600

tggccatact atgcatatgg gttgcttcaa acaaatgatc actgaacaac agtaccgatg 660

cccaatttgc tacaagtcaa tgatggatat gtcttcttca tggcaactat tagatgccga 720

gataagggca acagagatgc ctagtgaata taactatgag attgaaattc tttgcaatga 780

ctgcaataag agcagcaaag ctatgttcca cattctgggg cacaagtgcg cgcattgtgg 840

ttcttacaac actcgcagga tctcagctcc acaagaccca cccccgcaag gtgaaacaga 900

gcgacaagtt tctgaaccta gagaataagc aagctattct tgattggttc aaccataaga 960

gttatacggc tctgtgtttt gcttgttaca taaagtgatc cggcaggcaa accaccatta 1020

ggtttggatt gcaggtttta gtcac 1045

<210> 2

<211> 293

<212> PRT

<213> 甘蓝型油菜(Brassica napus L.)

<400> 2

Met Gly Gly Ala Ser Ala Ser Leu Leu His Pro Met Asp Thr Asp Ser

1 5 10 15

Ala Ile Pro Arg Asp Arg Asp Phe Gly Arg Ser Gln Phe Gly Cys Glu

20 25 30

His Tyr Lys Arg Arg Cys Lys Ile Arg Ala Pro Cys Cys Asn Leu Ile

35 40 45

Phe Pro Cys Arg His Cys His Asn Asp Ala Ala Asn Ala Leu Pro Asp

50 55 60

Pro Lys Glu Arg His Asp Leu Val Arg Gln Asn Val Lys Gln Val Ile

65 70 75 80

Cys Ser Val Cys Glu Ala Glu Gln Glu Val Ala Gln Val Cys Ser Asn

85 90 95

Cys Gly Val Cys Met Gly Glu Tyr Phe Cys Asn Ile Cys Lys Phe Phe

100 105 110

Asp Asp Glu Thr Ser Lys Glu Gln Phe His Cys Asp Asp Cys Gly Ile

115 120 125

Cys Arg Val Gly Gly Arg Asp Asn Phe Phe His Cys Gln Ser Cys Gly

130 135 140

Ala Cys Tyr Ser Met Gly Leu Arg Asp Asn His Ser Cys Ile Glu Asn

145 150 155 160

Ala Thr Lys Asn Ser Cys Pro Val Cys Tyr Glu Phe Leu Phe Asp Ser

165 170 175

Val Lys Ala Ala His Val Met Arg Cys Gly His Thr Met His Met Gly

180 185 190

Cys Phe Lys Gln Met Ile Thr Glu Gln Gln Tyr Arg Cys Pro Ile Cys

195 200 205

Tyr Lys Ser Met Met Asp Met Ser Ser Ser Trp Gln Leu Leu Asp Ala

210 215 220

Glu Ile Arg Ala Thr Glu Met Pro Ser Glu Tyr Asn Tyr Glu Ile Glu

225 230 235 240

Ile Leu Cys Asn Asp Cys Asn Lys Ser Ser Lys Ala Met Phe His Ile

245 250 255

Leu Gly His Lys Cys Ala His Cys Gly Ser Tyr Asn Thr Arg Arg Ile

260 265 270

Ser Ala Pro Gln Asp Pro Pro Pro Gln Gly Glu Thr Glu Arg Gln Val

275 280 285

Ser Glu Pro Arg Glu

290

<210> 3

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggggtaccgc tgctggttca tcgtcctg 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gctctagagt gactaaaacc tgcaatcc 28

<210> 5

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

gacgcacaat cccactatcc 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

atgtcatgag atgtggccat actat 25

<210> 7

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

tctctaggtt cagaaacttg tcgc 24

Claims

1.一种蛋白在控制植物所结的种子的粒重和/或含油量中的应用，其中所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，

所述植物为白菜型油菜（Brassica rapa （campestris）L）、芥菜型油菜（Brassicajuncea L.）、甘蓝型油菜（Brassica napus L.）和拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的至少一种；

在所述植物的生长阶段，在所述植物中过表达所述蛋白时，能够提高所述种子的粒重和/或含油量。

2.一种核苷酸在控制植物所结的种子的粒重和/或含油量中的应用，其中所述核苷酸能够编码如权利要求1所述的应用中的所述蛋白，

在所述植物的生长阶段，在所述植物中过表达所述核苷酸且所述核苷酸能够表达出所述蛋白时，能够提高所述种子的粒重和/或含油量。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核苷酸如SEQ ID No. 1所示。