MX2010014541A - Produccion y almacenamiento mejorados de proteinas en plantas. - Google Patents

Abstract

Se describe una planta dicotiledónea transgénica que tiene una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento de semilla vegetal, que tiene además una construcción de polinucleótido transgénica que comprende un marco de lectura abierto enlazado operablemente a un promotor de proteína de almacenamiento y una secuencia de señal ER. La construcción de polinucleótido codifica para un producto de proteína que puede acumularse a altos niveles en la semilla. Se proporcionan también métodos para producir una proteína heteróloga en una semilla vegetal.

Description

PRODUCCION Y ALMACENAMIENTO MEJORADOS DE PROTEINAS EN PLANTAS Campo de la Invención La presente invención se refiere al campo de genética vegetal. Más específicamente, la presente invención se refiere a construcciones y métodos genéticos para usar las construcciones para modificar semillas vegetales y producir una cantidad incrementada de una proteína de interés.

Antecedentes de la Invención Las semillas proporcionan una fuente importante de proteína dietaria para humanos y ganado. Ciertos tipos de semillas, tales como soya, son capaces de acumular un nivel relativamente alto de proteína endógena, haciendo la soya una buena opción para modificación genética para producir proteínas introducidas. A pesar de la disponibilidad de muchas herramientas moleculares, sin embargo, la modificación genética de semillas comúnmente es restringida por una acumulación insuficiente de la proteína manipulada. Muchos procesos intracelulares pueden impactar la acumulación de proteínas total, incluyendo transcripción, traducción, ensamble y doblez de proteínas, metilación, fosforilación, transporte y proteólisis. La intervención en uno o más de estos procesos puede incrementar la cantidad de proteína producida en semillas genéticamente manipuladas.

La introducción de un gen puede causar efectos Ref.:216592 dañinos en el crecimiento y desarrollo de las plantas. Bajo tales circunstancias, la expresión del gen puede tener que ser limitada al tejido objetivo deseado. Por ejemplo, podría ser necesario expresar un gen de desregulación de aminoácidos de una manera específica de semilla para evitar un fenotipo no deseado que pudiera afectar el rendimiento u otros rasgos agronómicos .

Las semillas de soya contienen de 35% a 43% de proteína sobre una base de peso seco; la mayoría de esta proteína es proteína de almacenamiento. Hay dos proteínas de almacenamiento de semilla de soya principales: glicinina (también conocida como las globulinas 11S) y beta-conglicinina (conocidas también como las globulinas 7S) . Juntas, comprenden 70 a 80% de la proteína total de la semilla, o 25 a 35% del peso en seco de la semilla.

La glicinina es una proteína grande con un peso molecular de aproximadamente 360 kDa. Es un hexámero compuesto de las diferentes combinaciones de cinco subunidades mayores identificadas como Gl, G2 , G3 , G4 y G5.

La beta-conglicinina es una glicoproteína heterogénea con un peso molecular que varía de 150 y 240 kDa. Está compuesta de combinaciones variables de tres subunidades altamente cargadas negativamente identificadas como alfa, alfa' y beta.

Kinney y Hermán ( "Cosuppression of the a Subunits of beta-conglycinin in Transgenic Soybean Seeds Induces the Formation of Endoplasmic Reticulum-Derived Protein Bodies" Plant Cell 13:1165-1178 (2001)) reportan que la transformación con una construcción que contiene una región que puede transcribirse a una secuencia líder no traducida 5' de beta-conglicinina se traduce en una reducción de las subunidades alfa y alfa' de la proteína beta-conglicinina. Kinney y Hermán hacen notar que " [e] 1 incremento en la proteína beta-conglicinina fue aparentemente compensado por una acumulación incrementada de glicinina y otras proteínas vacuolares en el ER" llevándoles a especular que "[t]al vez al co-expresar otras proteínas, posiblemente como una proteína de fusión de glicinina con un separador escindible, puede ser posible configurar soyas para expresar y acumular a altos niveles proteínas extrañan que requieran de eventos de doblez y procesamiento mediados por ER" . Kinney y Hermán no enseñan reducir la expresión de beta-conglicinina en una semilla de soya mientras se expresa bajo el control del promotor de glicinina, una proteína extraña fusionada a un péptido de señal ER.

Oulmassov et al. (solicitud de patente de E.U.A. 2005/0079494) describe la expresión de glicinina mutada bajo el control de un promotor, tal como un promotor de glicinina. Oulmassov et al . describen además la supresión mediada antisentido de secuencias que contienen un bajo contenido de aminoácidos esenciales, pero que son expresadas a niveles relativamente altos en tejidos particulares, tales como beta-conglicinina y glicinina. Oulmassov et al. no enseñan ninguna consecuencia posible de reducir la expresión con beta-conglicinina con respecto a la expresión y acumulación de proteínas que son expresadas bajo el control de un promotor de glicinina ni tampoco enseñan alguna consecuencia posible de suprimir la expresión de beta-conglicinina en una semilla de soya mientras se expresa bajo el control del promotor de glicinina, una proteína extraña fusionada a un péptido de señal ER.

Wu (solicitud de patente de E.U.A. 2007/0067871) describe proporcionar una soya con un contenido de beta-conglicinina en semilla incrementado, que comprende mutaciones no transgénicas que proporcionan un fenotipo nulo de al menos dos de las subunidades de glicinina. Uno enseña reducir la expresión de beta-conglicinina o glicinina, o la expresión de una proteína exógena.

Lo que se requiere en la técnica es un método para usar soya para producir altos niveles de una proteína de interés, tal como para alimento, combustible, pienso, enzimas industriales, enzimas de bioprocesamiento, vacunas, proteínas terapéuticas, anticuerpos o similares.

Breve Descripción de la Invención Se proporcionan en la presente métodos para producir cantidades incrementadas de una proteína heteróloga de interés en una semilla. En una modalidad, suprimir genéticamente la producción de una proteína de semilla causa que la semilla reequilibre su composición proteínica al incrementar la producción de otras proteínas para mantener un contenido de proteína de semilla normal. Este efecto puede ser combinado con el uso de un "mímico de alelo" de los genes que sean subregulados para reequilibrar el contenido proteínico y de esta manera conducir la expresión de la proteína heteróloga.

En una modalidad, se proporciona en la presente una dicotiledónea transgénica que tiene una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento vegetal y un polinucleótido heterólogo que tiene un marco de lectura abierto enlazado operablemente a un promotor de proteína de almacenamiento y una secuencia de señal ER. Opcionalmente , el polinucleótido heterólogo comprende además un dominio potenciador de traducción 5' (TED) y/o un 3' TED . Opcionalmente, el polinucleótido heterólogo comprende además una secuencia de retención de ER para inducir la acreción del polinucleótido heterólogo en el lúmen del ER o una vesícula derivada del ER.

En otra modalidad, se proporciona una planta dicotiledónea transgénica que tiene una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento de semilla, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en proteína de almacenamiento de semilla endógena en comparación con aquella de una planta tipo silvestre, y un polinucleótido heterólogo que tiene un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura abierto que tiene una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una señal de retención de ER, en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al promotor de proteína de almacenamiento de semilla, y en donde la semilla de la planta transgénica es capaz de producir una proteína heterologa a un nivel que sea más alto que el 5% del peso en seco total de la semilla. El polinucleótido heterólogo también puede tener un dominio potenciador de traducción 5' y/o un dominio potenciador de traducción 3'. La secuencia de retención ER puede inducir la acreción de la proteína heterologa en el lumen de ER o una vesícula derivada del ER. La dicotiledónea puede ser, por ejemplo, un miembro de la familia de las Fabáceas, y opcionalmente del orden Fabales, y opcionalmente del género soya. La dicotiledónea puede ser un miembro del género glicina, tal como una soya. El promotor puede derivarse, por ejemplo, del inhibidor de tripsina Kunitz, lectina de soya, alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 30k, proteína de unión a glucosa, proteína de maduración de semilla, glicinina o conglicinina . El dominio potenciador de traducción puede ser derivado de inhibidor de tripsina Kunitz, lectina de soya, alérgeno de soya inmimodominante P34 o Gly m Bd 30k, proteína de unión a glucosa, proteína de maduración de semilla, glicinina o conglicinina . La deficiencia en proteína de almacenamiento puede ser, por ejemplo, uno o más de inhibidor de tripsina Kunitz, lectina de soya, alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 30k, proteína de unión a glucosa, proteína de maduración de semilla, glicinina o conglicinina. En una modalidad, la deficiencia puede deberse a, por ejemplo, la presencia de un ARNi, un fragmento de antisentido o sentido de un ácido nucleico que codifique para una proteína de almacenamiento de semilla .

La semilla dicotiledónea provista en la presente puede tener, por ejemplo, una deficiencia de más del 75% de las proteínas de almacenamiento endógenas de la semilla. La proteína heteróloga puede acumularse en una semilla de la dicotiledónea hasta un nivel que sea mayor que aproximadamente 2% o mayor de aproximadamente 4% o mayor de aproximadamente 5% del peso en seco total de la semilla. En otra modalidad, se proporciona una semilla transgénica, o una proteína obtenida de la semilla. La proteína heteróloga puede ser purificada.

En una modalidad, la secuencia de codificación de proteína codifica para una enzima o fragmento de la misma. La enzima puede ser una enzima celulolítica, tal como una ß- glucosidasa, una exoglucanasa I, una exoglucanasa II, una endoglucanasa, una xilanasa, una hemicelulasa, una ligninasa, una ligina peroxidasa o una manganeso peroxidasa. En una modalidad, se proporciona una composición enzimática comercialmente útil.

En una modalidad, se proporciona en la presente una planta dicotiledónea transgénica, que tiene una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento vegetal endógenas, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en el nivel de la proteína de almacenamiento vegetal endógena en comparación con una planta tipo silvestre, y un polinucleótido heterólogo que tiene una región reguladora génica de una proteína compensadora enlazada operablemente a un marco de lectura abierto que codifica para una secuencia que tiene una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una secuencia de retención ER, en donde la semilla de la planta dicotiledónea transgénica es capaz de producir la proteína heteróloga a un nivel que sea mayor que el 5% del peso en seco total de la semilla.

En otra modalidad, se proporciona en la presente un método para almacenar establemente una enzima antes de usar, al almacenar la enzima en una semilla proveniente de una planta dicotiledónea transgénica que tiene una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento vegetal, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en la proteína de semilla endógena, y un polinucleótido heterólogo que tiene un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura de abierto que tiene un ácido nucleico que codifica para una secuencia de señal ER, una enzima de interés y una señal de retención ER, en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al promotor de proteína de almacenamiento de semilla, y en donde la semilla de la planta transgénica es capaz de producir la enzima a un nivel que es mayor que 5% del peso en seco total de la semilla, y almacenar la enzima en la semilla de la dicotiledónea transgénica.

En otra modalidad más., se proporciona en la presente un método para producir una cantidad incrementada de una proteína heteróloga en una planta dicotiledónea, que incluye transformar establemente una célula vegetal con un polinucleótido que tenga un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura abierto que tenga una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una secuencia de retención ER, en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al promotor de proteína de almacenamiento de semilla, obtener una línea vegetal homocigótica de la célula vegetal transformada establemente, introducir la línea vegetal transformada establemente en una planta que tenga una deficiencia en una proteína de almacenamiento de semilla endógena, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en la proteína de almacenamiento de semilla endógena en comparación con aquella de una planta tipo silvestre, cultivar las semillas de la planta transgénica introducida, y obtener la proteína heterologa de las semillas de la planta transgénica introducida, en donde la semilla de la planta transgénica introducida es capaz de producir una proteína heterologa a un nivel que es más alto que el 5% del peso en seco total de la semilla. La deficiencia en una proteína de almacenamiento de semilla endógena puede ser debida a, por ejemplo, la presencia de un ARNi, un fragmento de antisentido o de sentido de un ácido nucleico que codifique para una proteína de almacenamiento de semilla.

En otra modalidad más, se proporciona un método para producir una cantidad incrementada de una proteína heterologa en una planta dicotiledónea, al transformar establemente una célula vegetal con un polinucleótido que tenga un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura abierto que comprenda una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una señal de retención ER; en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al promotor de proteína de almacenamiento de semilla; en donde el polinucleótido contiene también una secuencia de ARNi que es capaz de la subregulación de una proteína de almacenamiento de semilla endógena, obtener una línea vegetal homocigótica y cultivar las semillas de la planta, para obtener una proteína heteróloga .

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un modelo de las diferentes vías de ubicación subcelular del retículo endoplásmico (ER) a una vacuola de almacenamiento de proteínas o un cuerpo proteínico (PB) .

La figura 2 es un diagrama esquemático que muestra una construcción de ARNi diseñado para suprimir glicinina. Los segmentos para el gen de glicinina como para el gen fad2 (ácido graso desaturasa) fueron incluidos en la construcción de ARNi . El segmento fad2 fue añadido como una característica opcional de la construcción, proporcionando un marcador para tamizado adicional.

Las figuras 3A y 3B son micrografías electrónicas que muestran que células de plantas "SP-" de línea deficiente en proteína de semilla forman vacuolas de almacenamiento de proteínas (PSVs) (Figura 3A) que son notoriamente similares en tamaño y apariencia a las PSVs formadas en células de semillas T (Figura 3B) . PSV: vacuola de almacenamiento de proteína; OB : cuerpo óleo; AV: vacuola autofágica; ER: retículo endoplásmico; Nucí: núcleo; G: aparato de golgi . La barra es igual a 1 µp?.

Las figuras 4A, 4B y 4C son fotografías de una comparación por enfoque isoeléctrico bidimensional/electroforesis en dodecilsulfato de sodio-gel de poliacrilamida (IEF/SDS-PAGE) entre el proteoma de semillas tipo silvestre (WT) variedad "Jack" y SP- .

La figura 5 es una gráfica de dispersión de un ensayo de transcritoma a gran escala de la variedad SP- en comparación con la variedad "Jack" WT usando un ensayo de plataforma de disposición de ADN Affymetrix.

La figura 6 esa gráfica de tarta que demuestra los cambios en la composición de proteínas de semilla en semillas de líneas de soya WT ("Jack") vs SP- . La composición porcentual de las diferentes proteínas de semilla se muestra.

La figura 7 es un diagrama esquemático que muestra los detalles de la construcción GFP-kdel. El promotor de glicinina, glicinina 5' UTR ("TED"), secuencia de señal ER, secuencia de codificación GFP, la secuencia de señal de retención de ER kdel y la glicinina 3' UTR ("TED") son indicados. El sitio de inicio de transcripción, el sitio de inicio de traducción y el sitio de detención de traducción son indicados.

Las figuras 8A, 8B, 8C y 8D son un panel de fotografías que muestran imágenes de luz blanca (Figura 8A) y azul (Figura 8B) de semillas de soya enteras de las dos líneas progenitoras homocigóticas y la progenie homocigótica de la cruza. Las semillas mostradas han sido fragmentadas para exponer el tejido cotiledóneo (Figuras 8A y 8B) . Las Figuras 8C y 8D son imágenes GFP pseudocoloreadas de células de parénquima de almacenamiento de GFP-kdel (proteína GFP con un marcador de retención ER KDEL C-terminal añadido) en un fondo T (Figura 8C) y semillas GFP-kdel x CS . La barra es igual a 10 im.

Las figuras 9A, 9B, 9C y 9D son un panel de fotografías de la separación 2D IEF-PAGE del lisado de proteínas de semilla CS (suprimida en ß-conglicinina Figura 9A) , semilla GFP-kdel (Figura 9B) y semilla GFP-dkel x CS (Figura 9C) , e inmunoblot de un gel de lisado replicado (9 Figura 9D) sondeado para GFP. Los puntos de proteína de control GFP-kdel (Figuras 9A y 9B) o GFP son encerrados en los cuadros como se marca. La introducción del rasgo GFP-kdel en la línea CS se tradujo en la acumulación incrementada de la GFP-kdel. La identidad de los puntos de GFP se determinó mediante inmunorreactividad en blots usando una sonda de anticuerpos monoclonales comercial (Figura 9D) .

Las figuras 10A, 10B y 10C muestran microscopías de fluorescencia (Figura 10A) , ID PAGE (Figura 10B) , e inmunoblot de ß-conglicinina (Figura 10C) ya sea para ß??, GFP-kdel en WT, o GFP-kdel x CS .

La figura 11 es una gráfica de barras de un análisis fluorométrico de abundancia de GFP-kdel en lisados de semilla preparados de semillas ya sea ß??, GFP-kdel en T, o GFP-kdel x CS, y ensayados usando GFP comercial como un parámetro de control .

La figura 12 es una fotografía de un PAGE unidimensional de proteínas de semilla fraccionadas que muestra el procesamiento de glicina en WT ("Jack"), CS y GFP-kdel x PCS . El gel teñido resultante fue escaneado y la distribución relativa de la fracción de proglicinina de la proglicinina sumada, glicinina A , subunidad ácida de glicinina y subunidad básica de glicinina. Los resultados muestran una reducción de más de tres veces de la fracción de proglicinina de la población de proteínas de glicinina. Marcadores de peso molecular e isoformas de proteína de almacenamiento son indicados .

Las figuras 13A, 13B y 13C son fotografías de un análisis en gel bidimensional de la producción de proteínas en una planta SP- (Figura 13A) , GFP-kdel transformada en un fondo WT (Figura 13B) y una planta SP- introducida con GFP-kdel (Figura 13C) .

La figura 14 es una gráfica de barras de un análisis fluorométrico de la abundancia de GFP-kdel en lisados de semilla preparados a partir de semillas de una planta SP-, una planta WT transformada con GFP-kdel y una cruza GFP-kdel x SP- . GFP comercial se usó como una norma de control .

Las figuras 15A y 15B es una micrografía electrónica que demuestra la abundancia de cuerpos de proteínas en el citoplasma de células de semilla de maduración tardía de plantas BCS x GFP-kdel. Figura 315A: Los cuerpos de proteína contienen una matriz dispersa y están unidos por una membrana ER. Figura 15B: imagen que demuestra el origen ER de los cuerpos de proteína. PSV; vacuola de almacenamiento de proteína; OB = cuerpo óleo. La barra es igual a 1 µp\.

Descripción Detallada de la Invención Se proporciona en la presente una planta dicotiledónea modificada genéticamente que tiene una semilla que produce una alta cantidad de una proteína heteróloga de interés. En ciertas modalidades, la semilla es deficiente en al menos una proteína de almacenamiento de semilla endógena, permitiendo que se produzca en la misma una cantidad incrementada de una proteína extraña. La secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína heteróloga puede ser enlazada operablemente a una región reguladora de una proteína de semilla. En algunas modalidades, esta región reguladora se deriva de una proteína de semilla que es sobrerregulada naturalmente en respuesta a la deficiencia de la proteína de semilla endógena.

En ciertas modalidades, la programación genética en dicotiledóneas puede utilizarse exitosamente para producir una proteína de interés, por ejemplo, una proteína cualitativa y cuantitativamente superior (por ejemplo, proteína recombinante) .

En ciertas modalidades, el antecedente genético de la planta es modificado de tal manera que haya una deficiencia en la cantidad de una o más proteínas de almacenamiento (por ejemplo, en peso) . Al usar uno o más promotores de proteína de almacenamiento para conducir la transcripción de la proteína objetivo, los mecanismos de reequilibrio de la planta pueden traducirse en niveles especialmente altos de una producción de proteína heteróloga.

En esta modalidad, y sin desear ser limitados por teoría, en respuesta a una deficiencia genética que causa la pérdida de una proteína de almacenamiento de semilla mayor, la semilla se "reequilibra" al incrementar la producción de otras proteínas de almacenamiento de semilla. Al enlazar un gen heterólogo de interés a elementos reguladores génicos de una proteína de semilla endógena que es sobre-regulada para reequilibrar la cantidad total de la proteína en la semilla, se puede producir un alto nivel de proteína heteróloga en la semilla. Gracias a este alto nivel de acumulación de la proteína extraña, este método "mímico de alelo" es útil para producir proteínas, particularmente proteínas comercialmente valiosas, en soya u otras semillas dicotiledóneas.

Además, la dirección opcional de la proteína heterologa al ER le permite acumularse establemente a niveles todavía más altos en la semilla. Pueden diseñarse señales en la proteína heterologa que puedan traducirse en el secuestro de la proteína objetivo en vesículas derivadas del ER, no obstante de si la planta produce naturalmente cuerpos proteicos fisiológicamente. Estas vesículas derivadas del ER están sorprendentemente libres de otras proteínas, tales como proteasas, glucosidasas , etc., produciendo acumulación de niveles más altos de proteína en una forma menos degradada o degradable. Según se usa en la presente, aplican las siguientes abreviaturas y definiciones.

El término "glicinina" , se refiere a una proteína de almacenamiento de semilla mayor, conocida también como IIS globulina, que está presente en semillas de soya.

El término "ß-conglicinina" se refiere a una proteína de almacenamiento de semilla mayor, también conocida como 7S globulina que está presente en semillas de soya.

El término "GBP" se refiere a proteína de unión a glucosa .

El término "KTI" se refiere a inhibidor de tripsina Kunitz .

El término "LE" se refiere a lectina de soya.

El término "P34" se refiere al alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 3.

La abreviatura "fad2" se refiere a una secuencia que codifica para una porción de un gen de "ácido graso desatúrasa" .

Según se usa en la presente, el término "vegetal" incluye células vegetales, protoplastos vegetales, callos vegetales, grupos vegetales y células vegetales que están intactas en plantas o partes de plantas, tales como polen, flores, embriones, semillas, vainas, hojas, tallos y similares.

El término "PB" se refiere a un cuerpo proteínico. Estas vesículas de una sola membrana son capaces de almacenar proteínas, y se derivan directamente del retículo endoplásmico (en contraste con las PSVs descritas abajo) .

El término "PSVs" se refiere a vacuolas de almacenamiento de proteínas. En semillas, estas vesículas se forman típicamente a partir de una división de la vacuola durante el proceso de maduración y secado de la semilla. Así, las enzimas degradadoras de proteínas normalmente presentes en la vacuola también pueden estar presentes en la PSV. En semillas de soya normales, la mayoría de las proteínas acumuladas se ubican en estos organelos.

El término "SMP" se refiere a una proteína de maduración de semilla.

El término "proteína de almacenamiento" se refiere a una proteína que se acumula específicamente en una planta, por ejemplo, en semillas.

La abreviatura "BBI" se refiere a "inhibidor bowman birk" , que es un inhibidor de serina proteasa.

El término "ß??" se refiere a una planta que es deficiente en la proteína de almacenamiento ß-conglicinina únicamente .

El término "SP-" se refiere a supresión de proteína de almacenamiento, es decir, una planta que es deficiente tanto en glicinina como en ß-conglicinina .

El término "semilla" incluye generalmente el núcleo de la semilla, la cápside de la semilla y/o la cáscara de la semilla, o cualquier porción de la misma.

"Maduración de semilla" se refiere al periodo que inicia con la fertilización en la cual las reservas metabolizables , por ejemplo, almidón, azúcares, oligosacáridos , fenólicos, aminoácidos y proteínas, se depositan en varios tejidos en la semilla, llevando a agrandamiento de la semilla, relleno de la semilla y concluyendo con la desecación de la semilla.

El término " T" se refiere a tipo silvestre y se refiere a un antecedente de origen natural de una planta, o, como es aparente del contexto de uso, WT puede referirse a una planta que tenga un antecedente genético de origen natural excepto para la manipulación genética de la presente invención .

El término "ORF" se refiere a un marco de lectura abierto; es decir, una secuencia que codifica para un péptido (por ejemplo, la "proteína objetivo"). En general, esta secuencia es ininterrumpida por intrones entre los codones de inicio y terminación que codifica para una secuencia de aminoácidos .

El término "polinucleótido heterólogo" se refiere generalmente a un polinucleótido que no existe en forma idéntica en la planta anfitriona excepto como resultado de un evento de transformación. Los términos "ADN heterólogo", "gen heterólogo" o "ADN extraño" se refieren a ADN, y típicamente a una secuencia de codificación de ADN ("secuencia de codificación heteróloga" ) , que ha sido introducida en células vegetales de otra fuente, es decir, una fuente no vegetal o de otra especie de planta, o una secuencia de codificación de la misma especie que es puesta bajo el control de un promotor vegetal que controla normalmente otra secuencia de codificación.

El término gen "endógeno" se refiere a un gen nativo encontrado normalmente en su ubicación natural en el genoma y no está aislado. Un gen "extraño" se refiere a un gen que no se encuentra normalmente en el organismo anfitrión pero que es introducido mediante transferencia génica.

El término "secuencia de codificación" o "región de codificación" se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una proteína específica.

Un "gen quimérico" o "cásete de expresión" en el contexto de la presente invención, se refiere a una secuencia promotora enlazada operablemente a una secuencia de ADN que codifica para un producto génico deseado, y de preferencia una secuencia terminadora de transcripción. En una modalidad preferida, el gen quimérico contiene también una región de codificación de péptidos de señal enlazado operablemente entre el promotor y la secuencia de codificación de producto génico en cuadro de producción con la secuencia de codificación de producto génico. Esta secuencia de señal ayuda ubicar la proteína en el ER. La secuencia puede contener además elementos reguladores de transcripción, tales como las señales de terminación de transcripción mencionadas arriba, así como señales reguladoras de traducción, tales como codones de terminación.

"Enlazado operablemente" se refiere a componentes de un cásete de expresión, que están enlazados de tal manera que funcionen como una unidad para expresar una proteína heteróloga. Por ejemplo, un promotor enlazado operablemente a un ADN heterólogo, el cual codifica para una proteína, promueve la producción de ARNm funcional que corresponde al ADN heterólogo.

"Transcrito de ARN" se refiere al producto que resulta de una transcripción catalizada por ARN polimerasa de una secuencia de ADN.

El término "ARN mensajero (ARNm)" se refiere generalmente al ARN que puede ser traducido en proteína por la célula.

El término ARN de "sentido" se refiere generalmente a un transcrito de ARN que incluye el ARNm. El término "ARN de antisentido" se refiere a un transcrito de ARN que es complementario a todo o parte de un transcrito primario objetivo o ARN y que puede inhibir la expresión de un gen objetivo. La complementariedad de un ARN de antisentido puede ser con cualquier parte del transcrito génico específico, es decir, en la secuencia de no codificación 5', secuencia de no codificación 3', intrones o la secuencia de codificación. El término "inhibición de antisentido" se refiere a la producción de transcritos de ARN de antisentido capaces de impedir la expresión de la proteína objetivo.

El término "ARNi" o "interferencia de ARN" se refiere generalmente a métodos de inhibición de expresión de una proteína de introducir un fragmento de ARN en la célula. El ARN puede ser codificado por un fragmento de ADN que sea integrado en el genoma . El ARNi también puede prepararse mediante cualquier otro medio conocido en la técnica. El fragmento de ARNi puede ser de cualquier longitud adecuada, y puede ser de una sola o de doble hebra.

En general, "secuencias reguladoras" son secuencias de nucleótidos ya sea en genes endógenos o heterólogos (quiméricos) que se ubican hacia el extremo 5' (5'), dentro, o hacia el extremo 3' hacia la región de codificación de la proteína. Estas secuencias reguladoras o "regiones reguladoras" pueden regular la transcripción y/o traducción.

Una "región reguladora de transcripción" o "promotor" se refiere a secuencias de ácido nucleico que influencian y/o promueven el inicio de transcripción. Los promotores se consideran típicamente que incluyen regiones reguladoras, tales como elementos potenciadores o inductores.

El término "regiones reguladoras hacia el extremo 5'" se refieren generalmente a una región 5' del codón de inicio de traducción de proteína. Así, las "regiones reguladoras hacia el extremo 5'" pueden abarcar, por ejemplo, un promotor, o pueden abarcar un promotor y una 5' UTR. La región reguladora hacia el extremo 5' también se puede referir a regiones más allá del extremo 5' de la secuencia promotora típica, tales como "elementos potenciadores" .

El término "TED" se refiere a un dominio potenciadof de traducción.

El 5' TED (o región no traducida 5' (UTR)) se refiere generalmente a la región que codifica para un ARNm que es 5' (hacia el extremo 5') hacia el sitio de inicio de traducción. De esta manera, la región está entre el sitio de inicio de transcripción y el sitio de inicio de traducción. El 5' TED puede ser una parte de la "región reguladora hacia el extremo 5 ' " .

La 3' TED (o región no traducida 3' (UTR) ) se refiere generalmente a la región en el ARNm que está hacia el extremo 3' del codón de paro de la secuencia de codificación de proteína. Esta región puede contener, por ejemplo, una señal de poliadenilación y/o cualquier otra señal reguladora capaz de afectar procesamiento de ARNm o expresión génica.

"Codón de inicio" y "codón de terminación" se refieren a una unidad de tres nucleótidos adyacentes en una secuencia de codificación que especifica el inicio y terminación de cadena, respectivamente, de una secuencia de proteínas .

El alcance de la presente invención se ilustra abajo con varios ejemplos, características técnicas opcionales y enseñanzas genéricas.

Proteínas de almacenamiento Las semillas de muchas especies de plantas contienen proteínas de almacenamiento. Estas proteínas han sido clasificadas sobre la base de su tamaño y solubilidad (Higgins, T. J. (1984) Ann. Rev. Plant Physiol. 35:191-221). Aunque no todas las clases se encuentran en cada especie, las semillas de la mayoría de las especies de plantas contienen proteínas de más de una clase. Las proteínas dentro de una clase de solubilidad o tamaño particular generalmente están más estructuralmente emparentadas a miembros de la misma clase en otras especies que con miembros de una clase diferente dentro de la misma especie. En muchas especies, las proteínas de semilla de una clase dada son codificadas comúnmente por familias de varios genes, algunas veces de tal complejidad que las familias pueden dividirse en subclases con base en la homología de secuencia.

Las semillas de soya poseen un contenido de proteína relativamente alto, que consiste ampliamente en dos proteínas de almacenamiento, ß-conglicinina y glicinina. En semillas tipo silvestre, la ß-conglicinina comprende alrededor de 15-20% de la proteína de soya total. Ambas de estas proteínas están constituidas de varias isoformas derivadas de familias génicas.

Las proteínas de almacenamiento pivotal han sido identificadas en la presente como estando implicadas en el desarrollo programado de una planta. Sin embargo, la persona normalmente capacitada puede identificar ahora fácilmente otras proteínas de almacenamiento en otras plantas objetivo mediante homologías funcional, estructural o de secuencia. Habiendo identificado estas proteínas de almacenamiento, experimentos de supresión como los descritos aquí pueden identificar otras proteínas de almacenamiento que estén implicadas en el reequilibrio de la proteína. Los elementos reguladores (por ejemplo, promotor, TEDs, etc.) pueden usarse para producir altos niveles de una proteína deseada de acuerdo con la presente invención. De esta manera, los diferentes ejemplos demostrados en la presente pueden ser aplicados ahora a otras plantas de importancia potencial para el comercio o humanidad.

Deficiencias genéticas Una planta de la presente invención comprende una deficiencia, tal como por ejemplo, una deficiencia genética, dando como resultado una reducción de una porción sustáncial del contenido de proteína de almacenamiento de semilla endógeno de la planta. Por ejemplo, en varias modalidades específicas, las semillas de la planta pueden comprender menos de aproximadamente 75%, 70% o menos del 60% o menos de alrededor de 50% o menos de aproximadamente 40% o menos de alrededor de 25% o menos de 15% de la cantidad de proteína soluble total en la semilla.

En otras modalidades específicas, la deficiencia genética se traduce en una cantidad de una proteína de almacenamiento de semilla específica que es menor de 1%, aproximadamente 2%, alrededor de 5%, aproximadamente 10%, alrededor de 25%, aproximadamente 50%, alrededor de 75%, o aproximadamente 85% de la cantidad de la proteína de almacenamiento de semilla endógena que normalmente está presente en una semilla de soya T.

A manera de ejemplo, una planta de la presente invención puede ser deficiente en una o dos o tres o cuatro o más de glicinina, conglicinina, KTI, LE, P34, GBP y SMP, u otras proteínas de almacenamiento de semilla.

En una modalidad, la manipulación genética para crear una deficiencia de una proteína de almacenamiento de semilla se puede obtener mediante métodos tales como co-supresión, antisentido, ARNi u otros métodos. La patente de E.U.A. No. 5,190,931 describe métodos ejemplares del uso de una construcción de antisentido para subregular un gen. La patente de E.U.A. No. 5,231,020 describe métodos ejemplares del uso de una construcción de ácido nucleico de sentido para subregular un gen. La inhibición genética de la expresión de un producto génico mediante el uso de ARNm de doble hebra se describe en la patente de E.U.A. No. 6,506,559.

En otras modalidades, una deficiencia de una proteína de almacenamiento de semilla particular, o proteínas de almacenamiento de semilla en el agregado, también se puede lograr mediante métodos de reproducción convencionales seguidos por el análisis para un bajo nivel de una o más proteínas de semilla. Una deficiencia de una proteína de almacenamiento de semilla también puede lograrse mediante mutaciones naturales o mutaciones inducidas, seguida por métodos de tamizado para identificar las plantas que tengan un bajo nivel de una o más proteínas de almacenamiento de semilla. En otra modalidad, una planta que tenga una deficiencia de una proteína de almacenamiento de semilla puede obtenerse, por ejemplo, a partir de un banco o depósito de semillas disponible públicamente.

Una deficiencia genética de una proteína en la semilla lleva a compensación (reequilibrio) por otras proteínas de semilla Como se describe en la presente, la supresión de una proteína de semilla puede llevar a una compensación por un incremento en la producción de otras proteínas de semilla, llamada "compensación" o "reequilibrio" . Este reequilibrio es demostrado en la presente con líneas vegetales que tienen una deficiencia tanto en glicinina como en ß-conglicinina ("SP-"; ejemplo 1) -como en plantas que tienen una deficiencia nada más en ß-conglicinina (ejemplo 11) .

La supresión de la proteína de semilla ß-conglicinina mediante silenciamiento génico mediado por secuencia fue compensada por una abundancia incrementada de glicinina (ejemplo 11) . La supresión de ß-conglicinina a/a' también se logró usando tecnología de ARNi, como también se describe en el ejemplo 11. Este método dio como resultado el silenciamiento completo de a/a' ß-conglicinina. Una fracción de la producción incrementada de glicinina fue conservada en forma de su precursor, proglicinina, y fue secuestrada en PBs. La acumulación de proteínas en un cuerpo de proteína, en lugar de la PSV, demuestra dos puntos importantes: 1) que PBs derivados del ER pueden ser inducidas y acumular proteínas en semillas de soya y 2) que la supresión de una proteína de almacenamiento endógena se traduce en la acumulación incrementada de otra proteína de almacenamiento para compensar la pérdida de masa. Este fenómeno mantiene el contenido proteico total de la semilla de soya en menos de 40% y es llamado "reequilibrio".

Las líneas vegetales que tienen una deficiencia tanto en ß-conglicinina como en glicinina ( "SP- " ) fueron preparadas, como se describe en el ejemplo 1. En estas semillas que fueron genéticamente deficientes tanto en ß-conglicinina como en glicinina, la pérdida de proteína fue compensada por la producción de otras proteínas. Los cambios de la producción de proteína pueden verse en las figuras 4A a 4C, la cual es un IEF-PAGE de extractos de proteína de semilla de la línea WT ("Jack") en comparación con la SP- . La figura 5 muestra las diferencias en el transcriptoma entre las dos líneas. La figura 6 es un diagrama de tarta que muestra el porcentaje de varias proteínas de almacenamiento mayores presentes en semilla de soya de WT ("Jack") contra la lina SP- . La remoción de las proteínas de semilla ß-congicinina y glicinina en la línea SP- claramente se traduce en compensación por otras proteínas.

El fenómeno de reequilibrio puede usarse para producir grandes cantidades de proteínas extrañas en semillas En la presente se proporcionan semillas que poseen una biología intrínseca que pueden ser explotadas como los cimientos de una plataforma de producción de proteínas al hacer que una proteína extraña tenga una participación en el proceso de reequilibrio y al acumular la proteína extraña en una población estable de PBs . Esto junto sienta las bases para desarrollar semillas dicotiledóneas como una plataforma de producción de proteínas.

Así, en algunas modalidades, una (o más) proteínas de almacenamiento de semilla se reducen como se describió arriba, y una proteína heteróloga deseada se produce en la semilla. En una modalidad, cualquier promotor adecuado es enlazado operablemente a la secuencia que codifica para la proteína heteróloga. En otra modalidad, la secuencia que codifica para la proteína heteróloga es un promotor específico de semilla. El promotor puede ser, por ejemplo, seleccionado de los promotores de KTI, LE, P34, GBP o SMP .

En una modalidad preferida, la expresión incrementada de la proteína heteróloga puede ocurrir cuando su secuencia génica sea enlazada operablemente a un promotor del gen que codifique para una proteína que sea sobrerregulada en respuesta a la deficiencia genética descrita arriba en una semilla de soya. Por cada proteína específica que sea removida en una semilla, se puede producir otra proteína (o proteínas) en su lugar. Mediante el uso de la región reguladora génica (tal como la región promotora, terminadora y opcionalmente otras regiones) de esta proteína "compensadora" para conducir la expresión del gen heterólogo de interés, puede obtenerse un nivel todavía más alto de producción de proteína en la semilla.

En consecuencia, en una modalidad, la proteína de semilla- que es suprimida es ß-conglicinina, mientras que la expresión de la proteína heteróloga es controlada por al menos una porción de la región reguladora de glicinina. En una modalidad, esta región reguladora está hacia el extremo 5' de la secuencia heteróloga. En otra modalidad, la región reguladora está hacia el extremo 3' de la secuencia heteróloga. En una modalidad la región reguladora comprende el promotor de glicinina. En una modalidad la región reguladora es la región reguladora hacia el extremo 5' de glicinina, la cual puede incluir, por ejemplo, el promotor y/o la 5' UTR. En otra modalidad, la región reguladora de glicinina también incluye la región reguladora de glicinina 3' .

En otra modalidad, la proteína de semilla que es suprimida es tanto ß-conglicinina como glicinina, mientras que la proteína heteróloga es controlada por al menos una porción de las regiones reguladoras (5', 3' o ambas) de una de KTI, LE, P34, GBP o SMP .

El marco conceptual del reequilibrio de proteína y secuestro de proteína en PBs fue probado al construir un transgen con la proteína reportera GFP, flanqueada por la secuencia de señal de transido ER y secuencia de señal de retención (KDEL). , bajo el control regulador de elementos de glicinina (ejemplo 9) . Al poner la construcción GFP-kdel bajo elementos genéticos de glicinina, la expresión del transcrito GFP-kdel imitará aquella de la expresión en regulación génica y de esta manera probablemente participará en la asignación de nutrientes que incluye la sobrerregulación de genes de glicinina. Las soyas que expresan este transgen acumularon 1.6% de GFP-kdel en la semilla. Sin embargo, cuando las plantas GFP-kdel fueron genéticamente cruzadas con las plantas CS, el nivel de expresión de GFP-kdel fue incrementado casi 4 veces hasta aproximadamente 7% en las semillas (ejemplo 12) . Así, el incremento en la acumulación de GFP-kdel en las semillas PCS demuestra que imitar el alelo del gen que participa en reequilibrio de proteínas puede traducirse en un grave incremento en la acumulación de la proteína heteróloga de interés.

Así, en una modalidad, una gran cantidad de una proteína de interés puede producirse en la semilla. Por ejemplo, la proteína heteróloga puede ser expresada de aproximadamente 1%, 2%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70% o más de la proteína soluble total en la semilla.

Además, en una modalidad, el peso en seco de la proteína heterologa puede expresarse de alrededor de 0.5%, 1%, 2%, 4%, 5%, 7%, 10%, 12%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% o más del peso en seco total de la semilla. La proteína heterologa puede producirse, por ejemplo, a una cantidad de alrededor de 50, 100, 150, 200, 250 o más mg de proteína por semilla.

En una modalidad, la cantidad de proteína heterologa producida puede medirse sobre una base por planta. La proteína heterologa puede producirse, por ejemplo, en una cantidad de alrededor de 3 g, 6 g, 8 g, 10 g, 15 g o 20 g o más de proteína heterologa por planta.

La proteína heterologa puede producirse, por ejemplo, a una cantidad de alrededor de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 850, 1,000, 1,500, 2,000 o más libras por acre por temporada. El rendimiento real puede depender de muchos parámetros tales como plantas por acre, variedad vegetal, calidad en suelo, prácticas de cultivo, estrés vegetal y también el nivel de pureza de la proteína heterologa que será producida.

Promotores En una modalidad, el polinucleótido heterólogo provisto en la presente comprende un promotor obtenido de, o derivado de, un gen de proteína de almacenamiento vegetal. En varias modalidades, el promotor se deriva de la planta del mismo orden, familia, género o especie de la planta transformada por una construcción de la presente invención.

Puede usarse cualquier promotor adecuado. En una modalidad, el promotor es un promotor específico de semilla. En otra modalidad, el promotor es un promotor específico de semilla temprano. En otra modalidad más, el promotor es un promotor específico de semilla tardío. En otra modalidad, el promotor es de un gen que compensa la deficiencia genética de la proteína de semilla.

Las secuencias promotoras pueden concluir en o cerca del codón de inicio e incluir nucleótidos contiguos hacia el extremo 5' (5') . Las secuencias promotoras pueden ser de al menos aproximadamente 500 nucleótidos o por lo menos alrededor de 1,000 nucleótidos o al menos aproximadamente 1,500 nucleótidos. Aunque la longitud exacta no es crítica para la invención, un experto en la técnica puede determinar y optimizar fácilmente la longitud del promotor (por ejemplo, al medir y comparar los niveles de transcripción) .

-En una modalidad, la secuencia reguladora hacia el extremo 5' o la secuencia promotora puede tener una identidad de ácido nucleico de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99.5% o más con por lo menos una porción de una de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO : 8.

En una modalidad específica, la región reguladora hacia el extremo 5', que comprende el promotor y 5' UTR como se describe abajo, se selecciona de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO : 1 y 2 se derivan de glicinina, en tanto que SEQ ID NO: 3-8 representan regiones reguladoras hacia el extremo 5' de conglicinina, KTI , LE, P34, GBP y SMP, respectivamente .

Dominios potenciadores de traducción UTR Un polinucleótido heterólogo de la presente invención comprende opcionalmente un dominio potenciador de traducción (TED) de una proteína de almacenamiento vegetal. En algunas modalidades, esta es la región no traducida del transcrito de ARNm. Estas regiones no traducidas pueden estar en la región 5' o 3' del gen. La secuencia del TED o UTR también se puede derivar de otro organismo, o puede ser una secuencia completamente sintética. 5 ' UTR (o "5 ' TED" ) : Una construcción de la presente invención puede comprender una 5' TED de la región 5' de un ARNm que codifique para una proteína de almacenamiento vegetal tal como glicinina, conglicinina, KTI, LE, P34, GBP o SMP. Un 5' TED puede identificarse generalmente del promotor y el codón de inicio de una proteína de almacenamiento vegetal. Un 5' TED puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 25, 30, 35, 40 o más nucleótidos o al menos alrededor de 50 nucleótidos o por lo menos aproximadamente 100 nucleótidos, o al menos alrededor de 150 nucleótidos. Aunque la longitud exacta no es crítica para la invención, un experto en la técnica puede determinar y optimizar fácilmente la longitud del terminador (por ejemplo, al medir y comparar los niveles de traducción) . En modalidades específicas, una porción del extremo 3' de las secuencias reguladoras hacia el extremo 5' descritas en SEQ ID NO: 1 (glicinina) , SEQ ID NO: 2 (una secuencia de glicinina alternativa), SEQ ID NO: 3 (conglicinina) , SEQ ID NO: 4 (KTI), SEQ ID NO: 5 (LE), SEQ ID NO: 6 (P34) , SEQ ID NO: 7 (GBP) y SEQ ID NO : 8 (SMP) comprenden, respectivamente, secuencias 5' UTR. 3' UTR (o "3' TED" o "terminador"): Una TED puede derivarse, por ejemplo, de la región 3' de un ARNm que codifique para una proteína de almacenamiento vegetal tal como glicinina, conglicinina, KTI, LE, P34, GBP o SMP. Este 3' TED puede iniciar en o cerca del codón de paro e incluir nucleótidos contiguos hacia el extremo 3' . El 3' TED puede tener aproximadamente alrededor de 10, 25, 40, 50, 75, 100, 150 nucleótidos o al menos aproximadamente 250 nucleótidos o al menos aproximadamente 500 nucleótidos. Aunque la longitud exacta no es crítica para la invención, un experto en la técnica puede determinar y optimizar fácilmente la longitud del terminador (por ejemplo, al medir y comparar niveles de producción) .

En una modalidad, la secuencia terminadora se selecciona de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 y SEQ ID NO: 21. Estas secuencias representan las secuencias 3' TED - para glicinina, una secuencia terminadora de glicinina alternativa, ß-conglicinina, una secuencia terminadora de ß-conglicinina alternativa, KTI, LE, P34, GBP y SMP, respectivamente.

En una modalidad, la secuencia terminadora puede tener una identidad de ácido nucleico de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99.5% o más con una de SEQ ID NOS: 13-21.

En modalidades adicionales, las construcciones quiméricas también pueden comprender secuencias reguladoras génicas que estén más allá del extremo 5' o más allá del extremo 3' del gen de interés, tales como secuencias potenciadoras . Por ejemplo, las regiones "potenciadoras" de transcripción pueden estar presentes más allá del extremo 5' 0 extremo 3' de un gen de interés. Por ejemplo, una región potenciadora puede estar 1,000 -2,000 nucleótidos o incluidos 1 o más kb hacia el extremo 5' de una secuencia, o también puede estar presente en una ubicación de 1,000-2,000 nucleótidos o incluso 1 o más kb hacia el extremo 3' de la región transcrita de un gen. Así, en algunas modalidades, estas secuencias potenciadoras más distantes de una proteína de almacenamiento vegetal, tal como KTI, LE, P34 , GBP y SMP también están presentes en la secuencia quimérica. En ciertas modalidades, la presencia de estas secuencias potenciadoras incrementa la cantidad de la proteína heteróloga que se produce en la semilla.

El retículo endoplásmico El retículo endoplásmico (ER) de plantas es una parte del sistema de endomembrana , un sistema altamente conservado en eucariontes. Dirigir proteínas al ER es de considerable interés toda vez que las proteínas producidas en el ER son traficadas a otros organelos y también permanecen asociadas con el propio ER. Los compartimientos derivados de ER tienen diversas funciones, tales como almacenamiento de proteínas, aceites y enzimas hidrolíticas usadas en respuesta a ataques de patógenos. Incrementar el conocimiento de los mecanismos de tráfico de proteínas de almacenamiento al ER ha llevado a mejoras en el uso de plantas como biofábricas de proteínas. Las plantas pueden almacenar proteínas exógenas dentro del ER además de otros compartimientos de la endomembrana .

Vesículas derivadas de ER - cuerpos de proteínas contra vacuola de almacenamiento de proteínas La figura 1 muestra un diagrama esquemático de las diferentes vías de tráfico de proteínas subcelulares que llevan a la ubicación de una proteína en un cuerpo de proteína o una vacuola de almacenamiento de proteína en una semilla de soya. En muchas especies vegetales, pero no en soya, las PBs derivadas del ER permiten la acumulación estable de proteína no glicosilada, ya que las proteínas no siguen una vía de endomembrana típica del ER al aparato de Golgi y de ahí en adelante a la prevacuola.

En plantas de soya T, la mayoría de las proteínas de semilla se acumulan en la vacuola de almacenamiento de proteínas (PSV) , en su lugar. Las proteínas que son dirigidas a la vacuola de almacenamiento de proteínas (PSV) o a la prevacuola (la cual se dirige después al PSV) de semilla de soya es probable que sean degradadas rápidamente, sin embargo, ya que la vacuola típicamente contiene muchas enzimas líticas.

En contraste, como se describe en la presente con respecto a semillas de soya transgénicas , el tiempo de residencia en el ER de proteínas que usan una secuencia de dirección al ER C-terminal (KDEL) induce el tráfico de grandes cantidades de proteína extraña a las PBs producidas de novo. Así, las proteínas pueden ser secuestradas en PBs derivadas del ER en semillas de soya. Los cuerpos de proteína resultante son una población estable de organelos que persisten a través de la maduración de la semilla y permanecen en la semilla madura seca. Esto se demuestra en la presente con la proteína fluorescente verde de proteína reportera (GFP-kdel) de 27 kDa, como la mostrada en el ejemplo 9.

En una modalidad opcional de la presente invención, la secuencia heteróloga comprende además una secuencia de retención ER para inducir la acreción del polipéptido heterologo en el lumen del ER o una vesícula derivada del ER. Este ER o vesículas derivadas del ER incluyen las ER, PBs, PSVs, vesículas de transporte, etc. Estas vesículas pueden identificarse estructuralmente como comprendiendo una membrana (por ejemplo, membrana de bicapa de lípidos) , un lumen, en donde la proteína objetivo es un componente soluble o insoluble que reside al menos parcialmente en el lumen. Sin desear ser limitados por teoría, se cree que el ER o la ubicación de vesícula derivada de ER de la proteína de interés es, en parte, responsable de los altos niveles de proteína heteróloga producidos en plantas de acuerdo con la presente invención. En una modalidad, el polipéptido heterologo se acumula en el aparato de Golgi o vesículas de Golgi.

Secuencia de señal ER En algunas modalidades, el polinucleótido heterologo comprende una secuencia de señal ER. Una secuencia de señal ER es cualquier secuencia de polinucleótidos que codifica para una secuencia de aminoácidos que permite el reconocimiento de la proteína por la partícula de reconocimiento de señal en el retículo endoplásmico dando como resultado la translocación de la proteína dentro del lumen del ER. Esta secuencia está presente típicamente en la región N-terminal de la proteína.

En algunas modalidades, la secuencia de señal ER puede añadirse a proteínas que no tengan naturalmente una secuencia de dirección al ER. La proteína heteróloga puede ya tener una secuencia de señal ER, sin embargo. Si se desea, esta secuencia de señal puede reemplazarse con otra secuencia de señal ER, tal como aquellas mostradas abajo en la tabla 1. Como alternativa, se puede usar la secuencia de señal original de la proteína. También puede usarse una secuencia de señal completamente sintética. Ejemplos de secuencias de señal que dirigen a proteínas recién sintetizadas al retículo endoplásmico en células vegetales incluyen secuencias de lectina de cebada (Dombrowski et al., 1993, Plant Cell 5:587-596), aleuraína de cebada (Holwerda et al., 1992, Plant Cell 4:307-318), esporamina de boniato (Matsuoka et al., 1991, proc . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 88:834-838), patatina (Sonnewald et al., 1991, Plant J. 1:95-106), proteínas de almacenamiento vegetal de soya (Masón et al., 1988, Plant Mol. Biol. 11:845-856), y beta- fructosidasa (Faye et al. 1989, Plant Physiol. 89:845-851).

Aunque la persona capacitada puede determinar fácilmente secuencias de señal ER útiles, otros ejemplos se muestran en la tabla 1.

- Tabla 1 Otros ejemplos de secuencias de señal ER se describen por Emanuelsson eü al. {J. Mol. Biol . 300,1005-1016 (2000) ) .

Secuencia de retención ER Opcionalmente, el polinucleótido heterologo comprende además una secuencia de retención ER. Se ha descubierto que cuando esta secuencia se añade a un polinucleótido heterologo que también contiene una secuencia de señal ER, el producto de proteína será retenido en las vesículas derivadas del ER cuando el producto sea secuestrado a partir de cierta acción de procesamiento tal como degradación proteolítica . Sorprendentemente, las presentes construcciones dirigen el producto de proteína de polinucleótido heterologo a vesículas derivadas del ER llamadas "cuerpos de protéína" no obstante de si la planta anfitriona produce naturalmente cuerpos de proteínas. Así, es ahora posible estabilizar el producto de péptido heterólogo y acumularlo a más altos niveles .

Una secuencia de retención ER es cualquier secuencia de polinucleótidos que codifiquen para una secuencia de aminoácidos que se sepa se traduzca en la retención de una proteína dada en o asociada con el retículo endoplásmico tales como las secuencias que codifican para los aminoácidos (representados por el código de aminoácido de una sola letra) KDEL (SEQ ID NO: 23), KHDEL (SEQ ID NO: 25), HDEL (SEQ ID NO: 26), KEEL (SEQ ID NO: 27) SEKDEL (SEQ ID NO: 28) y SEHDEL (SEQ ID NO: 29) . Los ácidos nucleicos ejemplares que codifican para el KDEL o KHDEL, respectivamente, se muestran en SEQ ID NO: 22 y 24. Típicamente, estas secuencias son C-terminales en proteínas vesiculares y están generalmente 3' en el ORF.

Como alternativa, una secuencia de retención ER opcional se deriva de la región C-terminal de una proteína vacuolar (en donde estas secuencias juegan un papel en suministrar proteínas vacuolares a vacuola vegetal) . Ejemplos no limitativos de estas secuencias vacuolares se muestran en la patente de E.U.A. No. 6,054,637 incorporada en la presente a manera de referencia. Otras secuencias pueden ser fácilmente identificadas por la persona experta mediante el uso de un ensayo funcional .

Marco de lectura abierto del polinucleótido heterólogo que será expresado Un polinucleótido heterólogo, de acuerdo con la presente invención comprende un marco de lectura abierto (ORF) . El ORF, que codifica para una proteína de interés que será expresada en la semilla, puede ser cualquier ORF. Típicamente, un ORF de la presente invención puede codificar para una porción o una proteína de almacenamiento de semilla completa, enzima de la vía de ácido graso, enzima biosintética de tocoferol, enzimas degradadoras celulósicas, una vacuna, un péptido terapéutico, una proteína o péptido usado en cosméticos, enzima biosintética de aminoácidos o una enzima de ramificación de almidón. Típicamente, el ORF incluye, por ejemplo, el ácido nucleico que codifica para una proteína de interés objetivo, junto con una secuencia de señal ER de flanqueo en la región N-terminal, y una secuencia de señal de retención ER en la secuencia carboxi-terminal .

Opcionalmente , el ORF es optimizado en codones vegetales para un patrón de uso de codones preferido. La modificación de un ORF para uso de codones óptimo en plantas se describe en la patente de E.U.A. No. 5,689,052.

Elección de la proteína que será expresada La proteína de interés que será codificada para la construcción quimérica puede ser cualquier proteína deseada. La proteína puede ser una proteína de longitud completa, o puede ser un fragmento de una proteína de longitud completa. La secuencia puede derivarse, por ejemplo, de una fuente vegetal, una fuente animal, una fuente fúngica, una fuente viral, una fuente bacteriana o puede ser una secuencia completa o parcialmente sintética.

Cualquier proteína deseada puede manipularse usando el sistema descrito en la presente, no obstante de su especie de origen o su ubicación celular normal. Los tipos ejemplares de proteínas que pueden producirse en el sistema descrito en la presente incluyen pero no están limitados a una cinasa, una proteína estructural, una proteasa, una enzima, una amilasa, una enzima celulolítica, un inhibidor, una proteína de valor nutricional incrementado, una proteína farmacéutica, una proteína o fragmento de proteína usado en cosméticos, una proteína útil para bioprocesamiento, una proteína comercialmente útil, un anticuerpo o fragmento del mismo, una proteína de membrana, una proteína nuclear, una proteína de transporte, una pr.oteína de señalización, proteína de almacenamiento, una proteína receptora, un precursor de hormona, una hormona, un péptido y una secuencia de proteínas, polipéptidos o péptidos completamente sintética .

Los genes sintéticos que codifican para proteínas de interés que incluyen pero no están limitadas a enzimas industriales, enzimas y proteínas terapéuticas, vacunas y anticuerpos pueden insertarse en el cásete de expresión génica específico de semilla de soya descrito en la presente que contiene los elementos reguladores 5' y 3' de glicinina, KTI, P34, SBP, SMP o LE.

En una modalidad, para sacar ventaja del mecanismo de compensación de proteína para lograr expresión de proteína incrementada, los elementos de regulación de glicinina pueden usarse para conducir la expresión de proteínas en un antecedente fiCS . En una modalidad, los elementos reguladores de KTI, P34, SBP, SMP o LE se pueden usar para conducir la expresión de proteínas en un antecedente SP- . Las construcciones descritas en la presente pueden inducir a las proteínas a participar en el proceso del equilibrio de proteína que resulta de la supresión de conglicinina y/o glicinina incrementando la síntesis y acumulación de proteínas .

En algunas modalidades, el ORF tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de señal de dirección al ER del gen básico de quitinasa de Arabidopsis fusionado 5' y una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de retención KDEL ER carboxi-terminal fusionada 3 ' al gen. Algunas de las proteínas que serán expresadas poseen sus propias secuencias de señal ER intrínsecas; si así es, estas secuencias pueden ser reemplazadas, si se desea, con las secuencias de señal ER descritas en la presente.

Los plásmidos también pueden contener un marcador de resistencia a higromicina bajo el promotor constitutivo fuerte derivado del gen de ubiquitina 3 de papa para selección de transformantes. La transformación y producción de líneas homocigóticas que contienen los genes de interés puede producirse como se describe en la presente. Las plantas transgénicas pueden ser introducidas ya sea en la SP-, CS u otra línea deficiente en proteínas de almacenamiento en semilla.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una enzima celulolítica que es útil en la industria de biocombustibles . La industria de los biocombustibles está madurando rápidamente. Sin embargo, los costos de obtener muchas de las enzimas necesarias para varios procesos de producción de biocombustible pueden ser prohibitivos. Obtener las enzimas de una soya u otro cultivo de dicotiledónea, en su lugar, puede traducirse en costos más bajos asociados con la producción de biocombustibles, y también puede ser más ambientalmente amigable que los métodos tradicionales para obtener estas enzimas.

Como un ejemplo, las plantas de soya transgénicas descritas en la presente pueden usarse para crear una "biofábrica" para producir numerosas proteínas implicadas en la producción de etanol celulósico. Así, en una modalidad, la proteína que será expresada es una enzima celulósica. Ejemplos de estas enzimas incluyen pero no están limitadas a ß-glucosiada, exoglucanasa 1, exoglucanasa II, endoglucanasa, xilanasa, hemicelulasa, y ligninasa (tales como ligina peroxidasa o manganeso peroxidasa) , y similares. La proteína que será expresada también puede ser cualquier otra enzima útil en la industria de biocombustibles .

En una modalidad, la proteína que será expresada es una ß-glucosidasa . Una secuencia de ácido ..nucleico o una secuencia de aminoácidos de una ß-glucosidasa de cualquier especie puede ser usada. Las ß-glucosidasas ejemplares pertenecen a la familia de proteínas EC=3.21.21. La secuencia para esta enzima puede derivarse de cualquier especie adecuada, tal como de una especie de Aspergillus, por ejemplo, Aspergillus niger. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de ß-glucosidasa ejemplares se muestran en SEQ ID NOS: 35-42.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una ß-glucosidasa de Aspergillus kawachii , tal como la mostrada en SEQ ID NO: 36, o una forma modificada de ß-glucosidasa de Aspergillus kawachii , tal como la mostrada en SEQ ID NOS: 37, 38 y 39. En otra modalidad, la proteína que será expresada es una ß-glucosidasa de Aspergillus niger (SEQ ID NO: 40) . En otra modalidad más, la proteína que será expresada es una ß-glucosidasa de Aspergillus terreus (por ejemplo, XM_00121222 ; SEQ ID NO : 42).

En una modalidad, la proteína que será expresada es exoglucanasa 1, tal como en la familia de proteínas EC=3.2.1.91, también conocida como exocelobiohidrolasa I, CBH1 , o 1,4- ß-celobiohidrolasa . La secuencia para esta enzima puede derivarse de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo, Trichoderma reesei {Hypocrea jecorina) . Una secuencia de aminoácidos de exoglucanasa 1 ejemplar se muestra en SEQ ID NOS: 43 y 44.

En una modalidad, la proteína que será expresada es exoglucanasa II, tal como en la familia de proteínas (EC=3.2.1.91) , también conocida como exocelobiohidrolasa II, CBHII, CBH2 y 1,4- ß-celobiohidrolasa . La secuencia para esta enzima puede derivarse de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo, Trichoderma reesei {Hypocrea jecorina) . Una secuencia de aminoácidos de exoglucanasa II ejemplar se muestra en SEQ ID NOS: 45 y 46.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una endoglucanasa . Las endoglucanasas pertenecen generalmente a la familia de proteínas EC=3.2.1.4, y también se conocen como endo-1,4- ß-glucanasa El, celulasa El y endocelulasa El. La secuencia para esta enzima puede derivarse de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo, Acidothermus cellulolyticus . Una secuencia de aminoácidos de endoglucanasa ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 47.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una xilanasa. Ciertas xilanasas, tales como aquellas que pertenecen al grupo enzimático EC 3.2.1.8 ( 1 , 4 -beta-D-xilan xilanohidrolasa) , pueden catalizar la endohidrólisis de enlaces (1, 4) -beta-D-xilosídicos en xilanos. Algunas xilanasas, tales como 1,3-beta xilanasa (EC 3.2.1.32) catalizan la degradación de enlaces 1, 3 -beta-D-glicosídicos . Una secuencia de aminoácidos de xilanasa ejemplar de Aspergillus niger se muestra en SEQ ID NO: 48. Una secuencia de proteínas de xilanasa ejemplar de aspergillus niger se muestra en SEQ ID NO: 49.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una hemicelulasa . La secuencia de esta enzima se puede derivar de cualquier fuente adecuada.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una ligninasa. Estas enzimas catalizan la degradación de lignina de las paredes de células vegetales. La secuencia de esta enzima puede derivarse de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo, un basidiomicetes degradador de lignina, tal como Phanerochaete chrysosporium. Una secuencia de aminoácidos de ligninasa ejemplar de Phanerochaete chrysosporium se muestra en SEQ ID NO: 50.

En una modalidad, la proteína que será expresada es una enzima lignasa tal como una enzima manganeso peroxidasa (EC 1.11.1.13). La secuencia de proteínas para esta enzima puede derivarse de cualquier fuente adecuada, tal como, por ejemplo, Trametes versicolor. Una secuencia de aminoácidos de manganeso peroxidasa ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 51.

Otro tipo de enzima degradadora de lignina es lignina peroxidasa (por ejemplo, grupo enzimático EC 1.11.1.14), una hemoproteína que puede catalizar el corte oxidante de enlaces C-C y enlaces de éter (C-O-C) en un número de compuestos de lignina. Esta enzima puede catalizar la siguiente reacción: 1 , 2 -bis (3 , 4 -dimetoxifenil) propan- 1 , 3 -diol + H20. Una secuencia de aminoácidos de lignina peroxidasa ejemplar del microorganismo Phanerochaete chrysosporium (No. de registro P49012) se muestra en SEQ ID NO: 52.

En una modalidad, la proteína que será expresada puede tener al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99.5% de identidad con una de las secuencias anteriores. Como alternativa, la proteína que será expresada puede ser cualquier otra proteína de interés adecuada.

Métodos para la transformación estable de plantas Los ácidos nucleicos pueden ser incorporados en construcciones de ácido nucleico recombinantes , típicamente construcciones de ADN, capaces de ser introducidas establemente en una célula vegetal .

Para la práctica de la presente invención, las composiciones y métodos convencionales para preparar y usar vectores y células hospederas son empleadas, como las descritas, por ejemplo, en Sambrook et al. (eds.) (1989), 5 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, volumen 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y., y Ausubel et al., ediciones, (1992) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and iley-Interscience , Nueva York.

Un número de vectores adecuados para la transformación estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas han sido descritos en, por ejemplo, Pouwels et al. (1985, supp. 1987) Cloning Vectors : A Laboratory Manual; Weissbach eü al., (1989) Methods for Planta Molecular Biology, Ácademic Press: Nueva York; y Gelvin et al. (1990) Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers. Típicamente, los vectores de expresión de plantas incluyen, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5' y 3' y un marcador seleccionable dominante. Estos vectores de expresión vegetal también contienen una región reguladora de promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión específica de células o tejidos inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o en desarrollo) , un sitio de inicio de transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadenilación .

Existen varios métodos de transformación estable de la construcción de interés en el genoma vegetal. Los métodos ejemplares incluyen, pero no están limitados a, bombardeo de microproyectiles , electroporación, transformación mediada por Agrobacterium y absorción de ADN directa por protoplastos.

Los métodos de transformación a base de electroporación pueden utilizar un cultivo en suspensión de células, tallo embrionario o transformación directa de un tejido tal como un embrión inmaduro u otro tejido vegetal. Los protoplastos también pueden emplearse para la transformación por electroporación de plantas (Lazzeri et al., 1985, "A procedure for plant regeneration from inmature cotyledon tissue of soybean" , Plant Mol. Biol . Rep., 3:160-167) .

Transformación por bombardeo de partículas Un método particularmente eficiente para suministrar segmentos de ADN de transformación a células vegetales es llamado bombardeo de microproyectiles . Este método ha sido empleado exitosamente para la transformación de un número de especies vegetales. En este método, partículas son recubiertas con ácidos nucleicos y suministradas al interior de células por una fuerza propulsora. Las partículas ejemplares incluyen aquellas que comprenden tungsteno, platino u oro. Para el bombardeo, células en suspensión son concentradas sobre filtros o medio de cultivo sólido. Como alternativa, embriones inmaduros u otras células objetivo pueden ser dispuestos en medio de cultivo sólido. Muchos tipos de sistemas de bombardeo de partículas pueden usarse para el proceso de transformación. En un escenario de bombardeo de partículas típico, partículas de oro o tungsteno son recubiertas con la construcción de ADN de interés, y se ponen sobre una plataforma en donde se usa una fuerza potente (típicamente un gas) para acelerar las partículas en células en espera que hayan sido puestas de tal forma que acepten las partículas recubiertas con ADN. Un sistema ejemplar es el Biolistics Partióle Delivery System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) .

La transformación exitosa mediante bombardeo de partículas requiere generalmente que las células objetivo tengan división activa, sean accesibles a microproyectiles , puedan cultivarse in vitro y sean totipotentes , es decir, capaces de regeneración para producir plantas fértiles maduras. Los métodos de bombardeo de partículas adecuados se describen, por ejemplo, en patente de E.U.A. No. 5,100,792, patente de E.U.A. No. 5,179,022 y patente de E.U.A. No. 5,204,253. Además, la patente de E.U.A. No. 5,015,580 describe un método de transformación mediado por partículas de plantas de soya al bombardear el eje embrionario de una semilla de soya.

Los tejidos objetivo para el bombardeo de microproyectiles pueden incluir, pero no están limitados, a, células individuales, agregaciones de células, embriones inmaduros, callo embrionario joven de embriones inmaduros, mi-eroesporas , embriones derivados de microesporas y tejido de meristemo apical .

En una modalidad, el procedimiento de transformación incluye el bombardeo con partículas combinado con embriogénesis somática, como se describe, por ejemplo, en Schmidt et al., (2008), In Vitro Cellular & Developmental Biology Plant, 44:162-168. La embriogénesis somática se describe en Bailey, 1993, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 29(3): 102-108. Métodos adicionales se describen en Parrott, et al., 2004, Transgenic soybean, In: J.E. Specht and H.R. Boerma (eds) . Soybeans : Improvement, Production and Uses, 3a edición, -Agronomy Monograph No. 16. ASA-CSA-SSSA, Madison, WI . Pág. 265-302.

La transformación estable mediada por Agrojacterium también se puede usar para generar plantas transformadas establemente que contengan el transgén de interés . El uso de vectores de integración de plantas mediado por Agroiiacterium para introducir ADN en células vegetales se conoce bien en la técnica (Fraley et al., 1985; patente de E.U.A.. No. 5,563,055). Los métodos de transformación de soya usando sistemas a base de Agrobacterium han sido descritos en la patente de E.U.A. No. 5,569,834, la descripción de la cual se incorpora específicamente en la presente a manera de referencia en su totalidad. La patente de E.U.A. No. 5,932,782 describe métodos de transformación usando construcciones de Agrobacterium recubiertas sobre micropartículas que se usarán para el bombardeo de partículas. La solicitud de patente de E.U.A. No.

US2006260012 describe métodos para transformar células o tejidos de soya usando métodos a base de Agrobacterium.

La transformación de protoplastos vegetales también se puede lograr usando varios métodos, tales como precipitación de fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol , electroporación y combinaciones de estos tratamientos (Potrykus et al., 1985, Direct gene transifer to protoplasts: an efficient and generally applicable method for stable alterations o£ plant genomes, UCLA Sym Mol Cell Biol , 35:181-199). Además, la transformación de plantas mediante transferencia génica a base de electroporación o polen se describe en la patente de E.U.A. No. 5,629,183.

Marcadores seleccionables En modalidades de la invención, un gen marcador seleccionable se usa para detectar las células que han completado exitosamente la transformación de la construcción génica extraña. Típicamente, se tamizan células para transformación exitosa dentro de pocos días hasta pocas semanas después del procedimiento de transformación. El tamizado para transformantes exitosos puede llevarse a cabo más rápidamente al co-transformar uno o más casetes de expresión transgénicos con un cásete de expresión de marcador seleccionable y convenientemente al tamizar células de callo tomadas a través del proceso de transformación para un marcador seleccionable en cultivo o en placas de medios.

El gen marcador seleccionable en el cásete de expresión de marcador seleccionable es enlazado operablemente a elementos reguladores de marcador seleccionable incluyendo un promotor y terminador. La expresión en la célula vegetal transgénica del gen marcador seleccionable generalmente codifica para una proteína que confiere resistencia a un antibiótico o herbicida. Los genes marcadores seleccionables comunes incluyen, por ejemplo, el gen de resistencia a npfcll/kanamicina , para la selección en los medios que contienen kanamicina, el gen de fosfinotricina acetiltransferasa, para selección en medios que contengan fosfinotricina (PPT) , o el gen de hph higromicina fosfotransferasa, para selección en medios que contengan higromicina B. Otros marcadores seleccionables incluyen los genes marcadores de resistencia de bleomicina y los genes marcadores de resistencia a glufosinato.

En una modalidad, el marcador seleccionable es higromicina fosfotransferasa . Otra secuencia de higromicina fosfotransferasa ejemplar se muestra en SEQ ID NO: 33. En otra modalidad, la secuencia marcadora seleccionable es flanqueada por elementos reguladores hacia el extremo 3' de ubiquitina de papa 3 (SEQ ID NO: 30) . En una modalidad adicional, la secuencia de marcador seleccionable es flanqueada por una secuencia terminadora de ubiquitina de papa 3, tal como aquellas mostradas en SEQ ID NO: 31 y 32) .

Regeneración de plantas transformadas Cualquier método adecuado para regenerar el material vegetal transformado puede ser usado. Los métodos generales de embriogénesis somática se describen en Parrott et al., 1994, "Somatic embryogenesis in legumes" , pág. 199-227. En Y.P.S. Bajaj (ed) Biotechnology in Agriculture and Forestry. Somatic embryogenesis, vol . 31. Springer Verlag, Berlín & Heidelberg.

Cualquier medio de regeneración bien conocido puede usarse para regenerar plantas a partir del material genéticamente transformado. Según se usa en la presente, "medio de cultivo de plantas" se refiere a cualquier medio usado en la técnica para soportar viabilidad y crecimiento de una célula o tejido vegetal, o para el crecimiento de especímenes vegetales enteros. Estos medios incluyen comúnmente componentes definidos incluyendo, pero no limitados a: compuestos macronutrientes que proporcionan fuentes nutricionales de nitrógeno, fósforo, potasio, azufre, calcio, magnesio y hierro; micronutrientes , tales como boro, molibdeno, manganeso, cobalto, zinc, cobre, cloro y yodo; carbohidratos; vitaminas; fitohormonas ; agentes de selección (para células o tejidos transformados, por ejemplo, antibióticos o herbicidas) y agentes de gelificación (por ejemplo, agar, Bactoagar, agarosa, fitagel, Gelrite, etc.). El medio puede ser ya sea sólido o líquido. Los medios y métodos de regeneración adecuados se describen, por ejemplo, en Schmidt, et al., 2005, "Towards normalization of soybean somatic embryo naturation," Plant Cell Rep. 24:383-391.

Una vez que las plantas transformadas putativas son identificadas, el tejido puede ser probado para confirmar que el transgen haya sido transformado establemente en el genoma vegetal .

La producción de una línea homocigótica que tiene el gen heterólogo típicamente requerirá de varias etapas de cruza adicionales. En algunas modalidades, el tejido transformado es luego cultivado en plantas maduras o "transformantes primarios" (T0) , los cuales son después auto-cruzados. Las semillas de esta auto-cruza se cultivan (generación TI) y los transformantes positivos se identifican y se auto-cruzan. Estas semillas se cultivan después para crear plantas maduras (generación T2) y se tamizan para identificar la presencia homocigótica de la secuencia transformada, para producir una línea vegetal homocigótica.

Dicotiledóneas Una planta dicotiledónea (o "dicot"), según se proporciona en la presente, puede ser cualquier dicotiledónea. Opcionalmente, la dicotiledónea es un miembro del orden Fabales . Opcionalmente, la dicotiledónea es un miembro de la familia de las Fabáceas (conocidas comúnmente como legumbres) . Opcionalmente, la dicotiledónea es un grano de soya, tal como Glycine- max.

Ejemplos de dicotiledóneas útiles en las composiciones y métodos proporcionados en la presente son: Abrus Adans. (por ejemplo, semilla de abrus) , Acacia P. Mili, (por ejemplo, acacia) , Adenanthera L. (por ejemplo, árbol de baya china) , Aeschynomene L. (por e emplo, jointvetch) , Afzelia Smith (por ejemplo, caoba), Albizia Durazz . (por ejemplo, albizia) , Alhagi Gagnebin (por ejemplo, alhagi) , Alysicarpus Neck, ex Desv. (por ejemplo, moneda) , Amorpha L. (por ejemplo, false índigo, arbusto índigo), Amphicarpa) , Amphicarpaea Ell . ex Nutt . (por ejemplo, amphicarpaea, cacahuate) , Anadenanthera Speg. (por ejemplo, anadenanthera) , Andira Juss. (por ejemplo, andira) , Anthyllis L. (por ejemplo, kidneyvetch) , Apios Fabr. (por ejemplo, cacahuate), Arachis L. (por ejemplo, cacahuate) , Aspalathus L. (por ejemplo, aspalato) , Aspalthium Medik.), Astragalus L. (por ejemplo, astragales, astragalus spp., locoweed, locoweed species, milkvetch) , Baphia Lodd. (por ejemplo, bafia) , Baptisia Vent, (por ejemplo, baptisia, False índigo, índigo silvestre) , Barbieria DC. (por ejemplo, barbieria) , Bauhinia L. (por ejemplo, bauhinia) , Bituminaria Heister ex Fabr . (por ejemplo, bituminaria), Bonaveria Scop.), Brongniartia Kunth (por ejemplo, greentwig) , Brya P. Br. (por ejemplo, coccuswood) , Butea Roxb. ex Willd. (por ejemplo, butea) , Caesalpinia L. (por ejemplo, caesalpinia, nicker, poinciana) , Caiandra Benth.), Cajanus Adans . (por ejemplo, cájano) , Calliandra Benth. (por ejemplo, callandra, mesquita falsa, stickpea) , Calopogonium Desv. (por ejemplo, calopogonio) , Camelina sp. (por ejemplo, "lino falso"), Canavaia Adans. Mut. De, Canavalia Adans. (por ejemplo, jackbean) , Caragana Fabr. (por ejemplo, peashrub) , Cassia L. (por ejemplo, casia, especies de casia) , Centrosema (DC.) Benth. (por ejemplo, guisante mariposa, centrosema), Ceratonia L. (por ejemplo, ceratonia) , Cercidium L. R. Tulasne, Cercis L. (por ejemplo, redjbud) , Chamaecrista (L.) Moench (por ejemplo, guisante sensible) , Chamaecystis Link (por ejemplo, chamaecystis) , Chamaesenna (De.) Raf . Ex Pittier) , Chap annia Torr . & Gray (por ejemplo, chapmannia) , Christia Moench (por ejemplo, guisante isleño) , Cicer L. (por ejemplo, cicer) , Cladrastis Raf. (por ejemplo, podo sudafricano) , Clitoria L. (por ejemplo, clitoria, alas de pichón) , Codariocalyx Hassk. (por ejemplo, loto) , Cojoba Britt. & Rose (por ejemplo, cojoba) , Cologania Kunth (por ejemplo, cologania) , Colutea L. (por ejemplo, colutea) , Copaifera L. (por ejemplo, copaifera) , Coronilla L. (por ejemplo, crownvetch) , Corynella DC. (por ejemplo, corynella) , Coursetia DC. (por ejemplo, babybonnets, coursetia) , Cracca Benth.), Crotalaria L. (por ejemplo, rattlebox) , Crudia Schreb.), Cullen Medik. (por ejemplo, scurfpea) , Cyamopsis DC. (por ejemplo, cyamopsis) , Cynometra L. (por ejemplo, cynometra) , Cytiscus Linnaeus) , Cytisus Desf. (por ejemplo, rusco) , Dalbergia L. f. (por ejemplo, palo rosa de la India), Dalea L. (por ejemplo, dalea, dalea spp. , trébol del prado, trébol del prado, tréboles del prado) , Daniellia Bennett (por ejemplo, danielia) , Delonix Raf. (por ejemplo, delonix), Derris Lour, (por ejemplo, derris) , Desmanthus Willd. (por ejemplo, bundleflower) , Desmodium Desv. (por ejemplo, legumbres perennes, loto, trébol, trébol amarillo), Dialium L. (por ejemplo, dialio), Dichrostachys (DC.) Wight & Arn. (por ejemplo, dichrostachys) , Dioclea Kunth (por ejemplo, dioclea) , Diphysa Jacq. (por ejemplo, diphysa), Dipogon Lieb. (por ejemplo, dipogo) , Dipteryx Schreber (por ejemplo, dipterix) , Ebenopsis Britt. & Rose (por ejemplo, ébano de Texas), Entada Adans . (por ejemplo, vid de callingcard) , Enterolobium Mart, (por ejemplo, enterolobio) , Eriosema (DC.) D. Don (por ejemplo, guisante arenoso), Errazurizia Phil, (por ejemplo, rusco), Erythrina L. (por ejemplo, eritrina), Erythrophleum Afzel. ex R. Br. (por ejemplo, sasswood) , Eysenhardtia Kunth (por ejemplo, kidneywood) , Faidherbia A. Chev. (por ejemplo, acacia) , Falcataria (Nielsen) Barneby & Grimes (por ejemplo, pluma de pavo real), Flemingia Roxb. ex Ait . f. (por ejemplo, flemingia) , Galactia P. Br. (por ejemplo, guisante lechoso) , Galega L. (por ejemplo, mala hierba) , Genista L. (por ejemplo, rusco) , Genistidium LM. Johnston (por ejemplo, guisante de brocha, genistidium) , Gleditsia L. (por ejemplo, algarrobo melífero, algarrobo) , Gliricidia Kunth (por ejemplo, quickstick) , Glottidium Desv. (por ejemplo, glotidio) , Glycine max (por ejemplo, soya) , Glycine Willd. (por ejemplo, soya) , Glycyrrhiza L. (por ejemplo, regaliz) , Gymnocadus Lam.), Gymnocladus Lam. (por ejemplo, cafetal), Haematoxylum L. (por ejemplo, haematoxylum) , Halimodendron Fischer ex DC. (por ejemplo, halimodendron) , Havardia Small (por ejemplo, havardia) , Hedysarum L. (por ejemplo, veza dulce, sweetvetc ) , Hippocrepis L. (por ejemplo, hipocrepis) , Hoffmannseggia Cav. (por ejemplo, hoffmanseggia, guisante, especies de guisante, Hoffmanseggia Cavanilles, ) , Hoita Rydb. (por ejemplo, leather-root) , Hymenaea L. (por ejemplo, hymenaea) , Indigofera L. (por ejemplo, índigo), Inga P. Mili, (por ejemplo, inga), Inocarpus J. R. & G. Forst) , Kanaloa D.H. Lorence & K. R. Wood (por ejemplo, kanaloa) , Kummerowia Schindl . (por ejemplo, kummerowia), Lablab Adans . (por ejemplo, lablab) , Laburnum Medik. (por ejemplo, árbol dorado) , Lathyrus L. (por ejemplo, chícharo, vid, peavine sp . ) , Lens P. Mili, (por ejemplo, lenteja), Lespedeza Michx. (por ejemplo, lespedeza, lespedeza perenne) , Leucaena Benth. (por ejemplo, leadtree) , Lonchocarpus Kunth (por ejemplo, lancepod) , Lotononis (DC.) Ecklon & Zeyh. (por ejemplo, lotononis) , Lotus L. (por ejemplo, veza, deervetc spp. , trébol) , Lupinus L. (por ejemplo, lupina, lupinas) , Lysiloma Benth. (por ejemplo, tamarindo falso, lysiloma) , Maackia Rupr. (por ejemplo, maackia) , Machaerium Pers . (por ejemplo, machaerium) , Macroptilium (Benth.) Urban (por ejemplo, bushbean, macroptilium) , Macrotyloma (Wight & Amort) Verde, (por ejemplo, macrotyloma) , Marina Liebm. (por ejemplo, trébol del prado falso, marina) , Medicago L. (por ejemplo, alfalfa), Meibomia Heist. Ex Fabr. ) , Melilotus P. Mili, (por ejemplo, trébol dulce, sweetclover) , Mimosa L. (por ejemplo, mimosa, planta sensible), Mucuna Adans . (por ejemplo, mucuna) , Myrospermum Jacq. (por ejemplo, mirospermo) , Myroxylon L. f. (por ejemplo, myroxylon) , Neonotonia Lackey (por ejemplo, neonotonia), Neorudolphia Britt. (por ejemplo, neorudolphia) , Neptunia Lour, (por ejemplo, neptunia, puff) , Nissolia Jacq. (por ejemplo, nissolia, yellowhood) , Olneya Gray (por ejemplo, olneya) , Onobrychis P. Mili, (por ejemplo, esparceta) , Ononis L. (por ejemplo, parabueyes) , Orbexilum Raf. (por ejemplo, leather-root, orbexilum) , Ormosia G. Jackson (por ejemplo, ormosia) , Ornithopus L. (por ejemplo, pie de pájaro), Oxyrhynchus Brandeg. (por ejemplo, oxyrhynchus) , Oxytropis DC. (por ejemplo, maleza loca) , Pachyrhizus L. C. Rich, ex DC. (por ejemplo, pachyrhizus) , Paraserianth.es I. Nielsen (por ejemplo, paraserianth.es), Parkia R. Br. (por ejemplo, parquia) , Parkinsonia L. (por ejemplo, paloverde, parkinsonia) , Parryella Torr. & Gray ex Gray (por ejemplo, parryella) , Pediomelum Rydb. (por ejemplo, raíz, raíz de la India, pediomelo, scurfpea) , Peltophorum (T. Vogel) Benth. (por ejemplo, peltophorum), Pentaclethra Benth. (por ejemplo, pentaclethra) , Pericopsis Thwaites) , Peteria Gray (por ejemplo, peteria), Phaseolus Linnaeus) , Phaseolus L. (por ejemplo, judía, haba) , Physostigma Balf. (por ejemplo, physostigma) , Pickeringia Nutt. ex Torr. & Gray (por ejemplo, guisante chaparral) , Pictetia DC. (por ejemplo, pictetia) , Piscidia L. (por ejemplo, piscidia) , Pisum L. (por ejemplo, chícharo), Pitcheria Nutt.), Pithecellobium Mart, (por ejemplo, blackbead, pithecellobium) , Poitea Vent . (por ejemplo, wattapa a) , Pongamia Ventenat) , Prosopis L. (por ejemplo, mesquite) , Psophocarpus Necker ex DC. (por ejemplo, psophocarpus), Psoralea Linnaeus) , Psoralidium Rydb. (por ejemplo, ¿readroot, scurfpea), Psorothamnus Rydb. (por ejemplo, dalea, smokebush) , Pterocarpus Jacq. (por ejemplo, pterocarpus), Pueraria DC. (por ejemplo, kudzu) , .Retama Raf. , nom. cons.), Rhynchosia Lour, (por ejemplo, snoutbean) , Robinia L. (por ejemplo, algarrobo) , J?upertia J. Gri es (por ejemplo, rupertia) , Sabinea DC. (por ejemplo, sabinea) , Samanea Merr. (por ejemplo, raintree) , Schizolobium Vogel (por ejemplo, Brazilian firetree) , Schrankia Willd. (por ejemplo, schrankia) , Scorpiurus L. (por ejemplo, cola de escorpión) , Sécula Small) , Senna P. Mili, (por ejemplo, sena) , Sesbania Scop, (por ejemplo, cáñamo ribereño, sesjbania) , Sophora L. (por ejemplo, necklacepod, sophora) , Spartium L. (por ejemplo, rusco) , Sphaerophysa DC. (e.g., sphaerophysa) , Sphenostylis E. Meyer (por ejemplo, sphenostylis) , Sphinctospermum Rose (por ejemplo, sphinctospermum) , Sphinotospermum Rose) , Stahlia Bello (por ejemplo, stahlia) , Strongylodon Vogel (por ejemplo., strongylodon), Strophostyles EIl. (por ejemplo, haba peluda, haba silvestre fuzzy bean, fuzzybean, wildbean) , Stryphnodendron C. Martius (por ejemplo, stryphnodendron) , Stylosanthes Sw. (por ejemplo, pencilflower) , Sutherlandia R. Br. (por ejemplo, sutherlandia), Swainsonia Salisb.), Tamarindus L. (por ejemplo, tamarindo) , Taralea Aublet (por ejemplo, taralea) , Tephrosia Pers . (por ejemplo, hoarypea, tephrosia) , Teramnus P. Br. (por ejemplo, teraranus) , Tetragonolobus Scop, (por ejemplo, te ragonolojbus) , Thermopsis R. Br. ex Ait . f. (por ejemplo, goldenbanner, goldenpea spp. (golden banner) , thermopsis) , Ticanto Adans . (por ejemplo, gray nicker) , Trifolium L. (por ejemplo., trébol, clover spp., trefles) , Trigonella L. (por ejemplo, fenogreco) , Ulex L. (por ejemplo., tojo) , Vexillifera ), Vicia L. (por ejemplo, veza, vetch spp.) , Vigna Savi (por ejemplo., frijol de vaca, vigna), Wisteria Nutt . (por ejemplo, wisteria) , Zapoteca H. Hernández (por ejemplo, guisante blanco), Zornia J. F. G el . (por ejemplo, zornia) , y similares .

Procesamiento de proteínas Las proteínas producidas mediante los métodos descritos en la presente pueden extraerse de las semillas y usarse directamente en un proceso comercial. Como alternativa, las proteínas pueden ser purificadas parcial o completamente, luego ya sea almacenadas o usadas inmediatamente. Además, una "harina" o molienda de soya puede prepararse a partir de las plantas transgénicas , y el material se puede almacenar hasta que se requiera.

Aislamiento, purificación y análisis de proteínas Los niveles de proteínas pueden ensayarse usando procedimientos proteomicos estándares. El contenido total de proteínas puede determinarse, por ejemplo, usando un ensayo a base del método de Bradford (Bradford, 1976, Analytical Biochem, 72:248-254).

El análisis de proteínas puede proceder de acuerdo con métodos ampliamente conocidos. La identidad de la proteína puede confirmarse, por ejemplo, mediante el uso de ensayos a base de gel, inmunoblots y espectrometría de masas. El tamaño de la proteína puede determinarse, por ejemplo, usando cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

La actividad enzimática de una masa específica de material crudo o de enzima purificada puede llevarse a cabo usando protocolos estándares para ensayar la enzima de interés. Las mediciones de la estabilidad de la enzima, perfiles de temperatura, perfiles de pH y vida media útil de la enzima pueden determinarse también usando métodos estándares .

La proteína transgénica de interés puede purificarse a cualquier grado que se requiera para uso adicional . El grado de purificación requerido puede depender de muchos parámetros, tales como costo, estabilidad de la proteína purificada contra la proteína que permanezca en la semilla, requerimientos hacia abajo, remoción de contaminantes, requerimiento de procesamiento adicional de la proteína (es decir, doblez de proteína adecuado o modificaciones post-traduccionales) , etc. Un ejemplo de un método para aislar y purificar una proteína producida en semillas de soya se muestra en el ejemplo 16.

En modalidades de la invención, las semillas de soya pueden ser procesadas, por ejemplo, por molienda o pulverización. Un extracto crudo del material molido puede prepararse al añadir un líquido y agitar durante un tiempo, seguido por filtración opcional para remover las partículas grandes. Como alternativa, en algunas modalidades, podría no ser necesario purificar la proteína de interés en .absoluto -la molienda de semilla que contenga la proteína de interés, junto con el resto de la semilla de soya, simplemente puede ser usada.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) En algunas modalidades, un método de ELISA que se conoce generalmente en la técnica, puede usarse para el análisis de la proteína expresada. Usando la producción de beta-glucosidasa en soya como un ejemplo, se puede usar el siguiente escenario. Placas de varios pocilios son recubiertas con anticuerpo anti -beta-glucosidasa de conejo, después el extracto de semilla de soya y muestras de control se añaden a pocilios individuales de la placa y se incuban durante 1 hora a 35°C. Conjugado peroxidasa de rábano anti-conejo es luego añadido a cada pocilio e incubado durante 1 hora a 35°C, seguido por la adición y el substrato de tetramet i lbenc idina (Sigma, E.U.A.) e incubación durante 3 minutos a temperatura ambiente . La reacción se detiene al añadir H2S04 1N a cada pocilio. Las placas son leídas a 450 nm en un lector de microplaca (Bio-Rad, modelo 3550) y los datos se procesan, por ejemplo, usando MICROPLATE MANAGER™ III (Bio-Rad) . Los resultados de un análisis de varias líneas homocigót icas se miden para determinar la cantidad de proteína expresada por semilla.

Almacenamiento de plantas transgénicas en la semilla de soya Las semillas de soya transgénicas descritas en la presente también se pueden usar como recipientes de almacenamiento de proteínas naturales. Semillas de soya secas y maduras que contienen las proteínas transgénicas pueden almacenarse a temperatura ambiente o menos, hasta que se requieran. Así, el procesamiento adicional de la proteína puede retrasarse hasta el momento de uso. Este método puede ser un medio eficiente y económico de almacenar enzimas transgénicas que se usarán para propósitos comerc iales .

Características técnicas inesperadas de la presente invención Sorprendentemente, la presente invención se traduce en una planta con características superiores. Por ejemplo, la invención permite la producción ya sea de una proteína de interés que se presente naturalmente en la naturaleza, se modifique sobre una proteína natural, sea sintética (nuevo diseño) o una proteína que tenga combinaciones de las mismas. Puede producirse como una proteína que tenga propiedades fisicoquímicas deseables (tales como solubilidad o estabilidad bajo diferentes condiciones; puede producirse como una proteína de fusión enlazada a residuos que ayuden a la purificación o incrementen su utilidad) .

La presente invención es especialmente útil para producir proteínas que de otra manera sean sensibles a degradación y, a través del secuestro mediante compartimentalización enseñada en la presente, puedan demostrar estabilidad notable.

La presente invención es especialmente útil para producir proteínas que requieran baja humedad para conservar su función. Estas proteínas, por ejemplo, pueden ser dirigidas a vesículas derivadas del ER en una semilla y almacenarse durante meses o años y conservar su valor nutricional, actividad enzimática o una propiedad deseada.

La presente invención es especialmente útil para producir proteínas que se pueden usar comercialmente en forma no purificada o forma parcialmente purificada gracias al alto nivel de abundancia en una semilla u otra parte de la planta. En algunas modalidades, se pueden añadir porciones que proporcionen o eviten la agregación.

Las construcciones de la presente invención pueden combinarse con otras características útiles, tales como elementos reguladores adicionales que permitan al gen ser encendido o apagado mediante señales temporales o externas. Ejemplos de modalidades útiles se muestran en la tabla 2.

Tabla 2 Secuencias quiméricas ejemplares Ej emplos Los siguientes ejemplos se llevan a cabo usando técnicas estándares, las cuales se conocen bien y son de rutina para aquellos expertos en la técnica, excepto cuando se describa lo contrario en detalle. Los ejemplos son ilustrativos, más no limitan la invención.

Ejemplo 1 Generación de la línea de supresión de proteína de almacenamiento "SP-" Una construcción de AR i diseñada de acuerdo con la figura 2 para suprimir el contenido de proteína de almacenamiento en semillas fue transferida a soya usando protocolos de transformación biolística (Parrott, et al., 2004, "Transgenic soybean" , In: J.E. Specht and H. R. Boerma (eds) . Soybeans : Improvement, Production, and Uses, 3a edición. - Agronomy Monograph No. 16. ASA-CSA-SSSA, Madison, WI . Pág. 265-302). Un cásete de ARNi específico para la supresión simultánea de las proteínas de almacenamiento de soya endógenas y FAD2-1 omega-6 ácido graso desaturasa se produjo al invertir secuencias específicas para estos marcos de lectura abiertos que flanquean un intrón bajo el promotor de glicinina y terminador 3'. Una región de 331pb del gen AlbB2 de glicinina (SEQ ID NO: 55) se puso adyacente a una región de 128 pb del gen FAD2-la (SEQ ID NO: 57) . Este ADN heterólogo de 459 pb fue luego puesto en repeticiones invertidas aproximadamente un intrón. El intrón derivado sintéticamente se obtuvo de una porción de vector de silenciamiento p3UTR12850S. Este cásete (SEQ ID NO: 56) se puso después bajo los elementos reguladores de glicinina (figura 2) . El ARNi de FAD2 se añadió como una característica opcional de la construcción para proporcionar un marcador para potencial de tamizado adicional para fenotipo alto oleico y para mantener consistencia con la supresión de conglicinina anterior que también incluyó la supresión de FAD2 (Kinney and Hermán ("Cosuppressxon of the a Subunits of beta-conglycinin in Transgenic Soybean Seeds Induces the Formation of Endoplasmic Reticulum-Derived Protein Bodies" , Plant Cell 13:1165-1178 (2001).

Los embriones somáticos regenerados y semillas T0 fueron tamizados mediante ID SDS/PAGE para distribución de proteínas total y con inmunoblots que ensayan para reactividad cruzada con anticuerpos anti-glicinina y anti-conglicinina.

Las líneas transgénicas recuperadas no sólo exhibieron el fenotipo de contenido de glicinina suprimido sino que también exhibieron una supresión esencialmente completa de las subunidades a/a' y ß de conglicinina. Las líneas generadas en la presenta con una supresión tanto de glicinina como de conglicinina serán conocidas como SP- ( supresión de proteína de almacenamiento) .

Ejemplo 2 Contenido de proteínas y aceite en SP- Las líneas SP- fueron regeneradas en plantas de soya. Las plantas resultantes crecieron y dieron semillas no notablemente en comparación con los controles. Las semillas TO fueron fragmentadas para ensayar el fenotipo y las semillas SP- se volvieron a cultivar y se reseleccionaron dos veces más 'para producir una población homocigótica . El fenotipo SP- fue estable a lo largo de cada generación subsecuente con subunidades de a/a' y ß-conglicinina no siendo detectadas y los niveles de glicinina ampliamente reducidos. El nivel de ácido oleico en las semillas SP- fue > 94% indicando que la supresión del marcador de tamizado de FAD2 también estaba presente.

El tamaño y peso en seco para las semillas durmientes SP- cultivadas en invernadero que promedian 146 mg es similar al promedio de semilla durmiente "Jack" de variedad cultivado en invernadero tipo silvestre (WT) de 163 mg. El contenido de proteínas y aceite total de la SP- (40.2%, 19.1%) y la variedad "Jack" WT (37.5%, 20.5%) es similar. Así, los ensayos demuestran que la supresión de proteínas que corresponden a una mayoría de la proteína total de soya se traduce en el reequilibrio de la composición de proteína de soya a un contenido de proteína/aceite casi idéntico y tamaño de semilla.

Ejemplo 3 Microscopía electrónica e inmunocitoquimica con inmuno-oro Muestras de tejido fueron criofijadas con un dispositivo de alta presión Balzer (Bal-Tech, Principality of Liechtenstein) , sustituidas por congelación con acetona/0s04 e incrustadas en plástico epon. Secciones ultradelgadas fueron teñidas tanto con acetato de uranilo acuoso saturado como con citrato de plomo (33 mg/ml) antes de la observación. Se llevó a cabo después el análisis inmunocitoquímico . Muestras paralelas fueron criofijadas y luego procesadas mediante sustitución por congelación sin ningún fijador. Las muestras sustituidas fueron transferidas a resina Lowicryl HM-20 que se polimerizó mediante iluminación con luz UV. Secciones delgadas fueron marcadas con anti-GFP MAb (Clontech) o anti-glicinina policlonal de conejo producida previamente por este laboratorio. Las secciones fueron marcadas indirectamente con anti-IgG (conejo o ratón) de oro coloidal 10 nm (Sigma) , luego se contrastaron con 5% de acetato de uranilo antes de la observación EM. Toda la TEM se llevó a cabo con un microscopio LEO 912AB con imágenes capturadas usando una cámara CCD 2k x 2k operada en modo de montaj e .

Ejemplo 4 Morfología bruta normal de SP- Para examinar la estructura celular de la SP- en comparación con la WT, cotiledóneas maduras de ambas fueron preparadas mediante criofij ción de alta presión y las muestras resultantes se sustituyeron por congelación con acetona/0s04 y luego se incrustaron en plástico Epon, y se procesaron como se detalló arriba. Los granos de soya SP-forman PSVs (figura 3A) que son notoriamente similares en tamaño y apariencia a las PSVs formadas en semillas T (figura 3B) . Las PSVs en la SP- poseen una matriz amorfa rellena de proteínas típica de soya.

Ejemplo 5 Análisis de proteínas bidimensional Proteína total fue asilada de semillas de soya maduras como se describe en Joseph et al., (2006), "Evaluation of Glycine germplasm for nulls of the immunodominant allergen P34/Gly m Bd 30k" , Crop Science 46:1755-1763. Brevemente, un total de 150 ug de proteína se cargaron en una tira de gel (IPG) con gradiente de pH inmovilizado de 11 cm (pH 3-10 nL) (BioRad, Hercules CA) y luego se hidrataron durante la noche. Se llevó a cabo enfoque isoeléctrico (IEF) para un total de 40kVh usando Protean IEF Cell (BioRad) y luego se corrieron en el gel SDS-PAGE de segunda dimensión (gradiente lineal 8-16%) . Las células fueron teñidas durante la noche en azul de coomassie al 0.1% en 40% (v/v) de metanol y 10% (v/v) de ácido acético mientras se absorbía y la inmunodetección subsecuente usando anticuerpo monoclonal GFP (Clontech Inc, Mountain View, CA) como se describe en Joseph et al., (citado arriba). Cada muestra se corrió en geles triplicados y se escaneó y analizó 7 en Phoretix 2D Evolution (versión 2005; NOnlinear Dynamics Ltd.) . Los puntos de GFP identificados en el inmunoblot dejaron que los puntos correspondientes fueran ubicados en los geles replicados y el volumen de estos puntos fue normalizado contra el volumen de puntos de proteoma completo para determinar el volumen porcentual de la proteína GFP en el proteoma de semilla de soya soluble completo.

Ejemplo 6 Identificación de proteínas expresadas a un nivel incrementado debido a SP- El análisis proteómico de las soyas SP- muestra que otras proteínas de almacenamiento compensan la ausencia de polipéptidos de proteína de almacenamiento.

El fraccionado por IEF/SDS-PAGE bidimensional (2D) de la SP- en comparación con la WT muestra un dramático cambio en la distribución de puntos de las proteínas que resulta a partir de la supresión de las proteínas de almacenamiento .

Las figuras 4A a 4C muestran la comparación entre la supresión de proteína WT y de almacenamiento usando geles 2D de segunda dimensión de amplia gama, pH 3-10. La tinción de proteína total muestra que hay un cambio a gran escala en la distribución de proteínas en SP- con las proteínas de almacenamiento ausentes reemplazadas por otros puntos de proteínas abundantes.

La supresión de las proteínas de almacenamiento se confirmó más al sondear un inmunoblot replicado con anticuerpos específicos para fracción de proteína de almacenamiento de conglicinina y glicinina que mostraron una ausencia de las subunidades e isoformas de conglicinina y una reducción significativa de las subunidades e isoformas de glicinina. Los geles 2D de SP- por triplicado fueron evaluados mediante el volumen de punto de las proteínas totales en comparación con la tipo silvestre. Las proteínas alteradas significativamente fueron graduadas por examen visual con la ayuda de volumen de punto/escaneo de gel . Los puntos de proteína seleccionados fueron extirpados, sometidos a fragmentación tríptica y analizados mediante espectrometría de masas MS/ S tándem. El mapa de los puntos de proteínas numerados seleccionados para análisis de espectroscopia de masas se muestra en la figura 4C.

Los datos de proteómica compilados a partir de los puntos de proteínas en la figura 4C se muestran en la tabla 3. Gran parte del reequilibrio de contenido de proteínas se debe a un contenido incrementado del inhibidor de tripsina Kunitz (KTI) , lectina de soya (LE) , también conocida como "aglutinina" , y el alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 30k. Otras proteínas con contenido incrementado incluyen proteína de unión a glucosa (GBP) y proteína de maduración de semilla (SMP) . La identificación de proteómica y espectrometría de masas muestra que el reequilibrio del acortamiento de las proteínas de almacenamiento ocurre por acumulación incrementada sólo de unas pocas proteínas.

Tabla 3 figura 6 muestra una gráfica de tarta que demuestra las cantidades de varias proteínas en semillas de soya WT ("Jack") contra las semillas SP- . La gráfica demuestra claramente el reequilibrio o proceso de compensación, en donde un incremento de ciertas proteínas ocurre cuando otras proteínas se disminuyen en la semilla.

Ejemplo 7 Semillas SP- forman PSVs en una morfología y patrón correctos por desarrollo Vacuolas de almacenamiento de proteínas (PSVs) de semillas dicotiledóneas tales como soya se forman por la subdivisión de la vacuola central en forma coordinada con la síntesis y deposición de las proteínas de almacenamiento. Esto se traduce en PSVs rellenas de proteínas que llenan gran parte del citoplasma de semillas que están acumulando una proteína de almacenamiento.

Las células de parénquima de almacenamiento de plantas que tienen una supresión tanto de proteínas de almacenamiento de glicinina como de ß-conglicinina, tales como la línea SP- descrita en los ejemplos anteriores, parecen contener sólo PSV. Esto indica que las proteínas PSV compensadoras son y siguen siendo vacuolares sin ninguna redirección de las proteínas en los cuerpos proteicos derivados de ER. La estructura y distribución de todos los demás organelos subcelulares y estructuras parecieron ser idénticas en el SP- y control de wt .

En contraste, la supresión individual de conglicinina , ya sea mediante manipulación genética dirigida como se muestra abajo, por ejemplo, en el ejemploll, o la mutación de origen natural se traduce en una gran fracción de esa glicinina que permanece en la forma de proglicinina precursora que es acretada en cuerpos de proteínas derivados de ER.

Ejemplo 8 Semillas de soya SP- exhiben pocos cambios en transcripción Las soyas SP- de maduración tardía se compararon con la WT (tipo silvestre) usando el chip génico Affymetrix DNA con replicas tanto biológicas como técnicas. Los datos de transcritoma resultantes se analizaron y mostraron pocos transcritos sobre o subregulados usando un límite superior/inferior de dos veces relativamente severo con una relación de correlación positiva.

El chip génico Affymetrix se basa en las ESTs de soya por Shoemaker et al., 2002, A compilation of soybean ESTs : generation and analysis, Genome, 45 (2) :329-38, y una gran fracción de estas ESTs no son anotadas más allá de ser genes expresados. Notablemente, entre los transcritos que no mostraron ninguna variación significativa, estaban aquellos de las proteínas que sí demostraron abundancia de proteínas incrementada en el proteoma de la semilla SP-, en particular KTI, P34 y LE.

El transcrito que codifica para la proteína principal asociada con cuerpos óleos, oleosina, estuvo entre aquellos que no han diferido en la semilla SP- . Una mayoría del proteoma de la semilla de soya es remodelado con poca consecuencia paralela en el transcritoma . La estrecha similitud de los datos de disposición de los transcritos de SP- y T se ilustra en la gráfica de dispersión mostrada en la figura 5.

Ejemplo 9 GFP-KDEL conducida por promotor de glicinina Para demostrar cómo se puede usar el método para producir altos niveles de proteína en una semilla, se hizo una construcción que tenía el ORF del polinucleótido heterólogo que codifica para GFP, junto con un péptido de señal ER y señal de retención ER ejemplar "KDEL" conducida por el promotor de glicinina y una 3 ' TED derivada de glicinina (véase figura 7) . La transformación de embriones somáticos de soya {Glycine max WT variedad "Jack") por biolística se llevó a cabo como se describe en Trick et al. 1997, "Recent advances in soyean transíormation" , Plant Tissue Culture and Biology, 3(l):9-26), y la regeneración como se describe en Schmidt et al., 2004, "Towards normalization of soybean somatic embryo maturation" , Plant Cell Reports 24:383-391. The hygromicine resistance gene under the control of the potato ubiquitin 3 regulatory elements (Garbarino y Belknap, 1994, "Isolation of a ubiquitin-ribosomal protein gene (ubi3) de papa y la expresión de su promotor en plantas transgénicas , "Plant Mol. Biol . 24 (1) : 119-127) , se usó como un marcador seleccionable en cultivo de tejidos. Un marco de lectura abierto (SEQ ID NO: 34) de GFP disponible comercialmente (Clontech Inc., Mountain View, CA) , menos los codones de inicio y codones de paro, se pusieron en un cásete que contenía los elementos reguladores de glicinina específicos de semilla (Nielsen et al., 1989, "Characterization of the glycinin gene family in soybean" , Plant Cell, 1 (3) : 313-328) , una secuencia de señal ER de 21 aminoácidos del gen de quitinasa Arabidopsis (SEQ ID NO: 12), y un marcador de retención KDEL (SEQ ID NO: 23) como el descrito en Moravec et al., 2007, "Production of Escherichia coli heat labile toxin (LT) B subunit in soybean seed and analysis of its immunogenicity as an oral vaccine" , Vaccine, 25(9) :1647-57. La construcción se muestra en la figura 7.

Semillas secas maduras fueron cosechadas y observadas visualmente para la expresión de GFP-kdel bajo un microscopio de disección por fluorescencia usando luz azul (450nm) para excitación. Las plantas positivas a GFP-kdel se cultivaron hasta la generación TI para obtener semillas homocigóticas . Las semillas de GFP-kdel se examinaron a nivel celular usando un microscopio de excitación de dos fotones Zeiss LS 510 con excitación a 488 nm usando un filtro de emisión de 512 nm.

La construcción se introdujo en soya mediante transformación biolística seguida por selección y regeneración de las plantas. Las semillas positivas a GFP-kdel fueron recultivadas para las generaciones TI y T2 produciendo una línea homocigótica de semillas que expresaban GFP-KDEL específicas de semilla.

La expresión de GFP-KDEL en las semillas homocigóticas progenitoras se traduce en la acumulación de 1.6% de GFP-kdel en la soya ensayada mediante la comparación del volumen de puntos a partir de 2D IEF/SDS-PAGE y mediante el análisis de los lisados de semilla usando un ensayo de fluorómetro con un control de curva estándar usando GFP obtenida comercialmente . Las imágenes de microscopía de luz fluorescente mostraron que PBs de GFP-kdel se distribuyen a lo largo del citoplasma. Los « ensayos de TEM- inmuno-oro de las PBs de GFP-kdel usando un MAb comercial específico para estructuras tipo PB unidas a ER de 0.2-0.3 um marcadas con GFP como se observó previamente .

Ejemplo 10 GFP-kdel conducida por el promotor de glicinina en la línea SP- El impacto de la expresión de una proteína extraña se probó más en el contexto del proceso de reequilibrio de proteína que ocurre en la SP- . La construcción que contiene el GFP-kdel conducido por el promotor de glicinina se introdujo en soya mediante transformación biolística seguida por selección y regeneración de las plantas, como se describe en el ejemplo 9. Las semillas positivas para GFP-kdel fueron recultivadas para las generaciones TI y T2 produciendo una línea homocigótica de semillas que expresaban GFP-kdel específicas de semilla.

La expresión de GFP-kdel en las semillas homocigóticas progenitoras se traduce en la acumulación de 1.6-2% de GFP-kdel en la soya ensayada mediante comparación de volumen de punto a partir de 2D IEF/SDS-PAGE y por ensayos de lisado de semillas usando un ensayo de fluorómetro con un control de curva estándar usando GFP obtenida comercialmente . Estos datos se muestran en comparación con datos producidos en las plantas SP- introducidas se muestran en las figuras 13A a 13C y figura 14.

La microscopía de luz de fluorescencia muestra que las PBs de GFP-kdel son distribuidas a lo largo de citoplasma. Ensayos de TEM-inmuno-oro de las PBs de GFP-kdel usando un MAb comercial específico para estructuras tipo PB unidas a ER de 0.2-0.3 µt? de diámetro marcadas con GFP como se describió previamente.

Ejemplo 11 Producción de líneas de soya fiCS Para demostrar más el método para reducir el nivel de una proteína de almacenamiento de semilla, la línea de soya transgénica ("ß??), deficiente en subunidad a/a de ß-conglicinina, se preparó mediante dos tipos diferentes de supresión genética. En un método, la planta fue transformada con una construcción de "sentido" que tenía un promotor de ß-conglicinina que conducía la expresión del gen FAD2. Esto dio como resultado la supresión de la ß-conglicinina .

En otro ejemplo, una línea ß0= de soya se hizo al transformar una planta de soya con una construcción de ARNi diseñada para suprimir ß-conglicinina . Para preparar la construcción de AR i, un fragmento de secuencia del gen de ß-conglicinina (genbankAB030495) (SEQ ID NO: 53) se puso adyacente a un fragmento de 128 pb del gen FAD2 (SEQ ID NO: 57) . La región de 256 pb completa se puso después en repeticiones invertidas alrededor de un intrón que se clonó usando un vector pKannibal siguiendo el método descrito en Wesley et al., (2001) "Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plantas" , Plañí J. 27, 581-590. La secuencia de cásete completo se muestra en SEQ ID NO: 54.

La transformación usando estas secuencias se encontró que suprimía los niveles de ß-conglicinina en semillas de soya, dando como resultado el silenciamiento completo de la a/a' ß-conglicinina . Una fracción de la producción incrementada de glicinina se retuvo en forma de su precursor, proglicinina, y fue secuestrada en PBs .

Ejemplo 12 GFP-kdel conducida por el promotor de glicinina en una línea de soya pCS La expresión de una proteína extraña como un producto génico extrínseco debe ser relativamente independiente del proceso intrínseco de reequilibrio de contenido de proteínas. La proteína extraña seleccionada, una GFP modificada para incluir una secuencia de retención KDEL ER, se diseña para acretar en los cuerpos de proteína derivados de ER formadores de ER que son organelos inertes, creados de nuevo y normalmente no encontrados en soya. Debido a que los cuerpos GFP-kdel son acumulados establemente a través de la maduración de la semilla (Schmidt y Hermán 2008) , la GFP-kdel puede ser cuantificada para medir su acumulación a través de la maduración de semilla.

La línea GFP-kdel fue introducida en una línea de soya transgénica (^CS") deficiente en la subunidad a/a de ß-conglicinina como resultado de supresión genética. Las cruzas resultantes fueron tamizadas visualmente como semillas secas maduras analizadas para la expresión de GFP-kdel.

Las figuras 8A a 8D muestran las imágenes de luz blanca (Figura 8A) y luz azul (Figura 8B) de la expresión de GFP-kdel en soya. Los granos de soya fueron fragmentos e hidratados y usados para formar imágenes de la distribución subcelular de GFP-kdel usando un microscopio Zeiss LSM 510 de excitación de dos fotones con excitación a 488 nm usando un filtro de emisión de 512 nm. Las figuras 8A a 8D (panel inferior) muestra GFP-kdel en el fondo genético WT (Figura 8C) y en el fondo de ?? (Figura 8D) .

La porción restante del chip hidratado se usó para producir geles IEF/SDS-PAGE 2D de amplio alcance. En referencia a las figuras 9A a 9D, lisado de proteínas de la semilla CS se muestra en la Figura 9A, lisado de proteínas de semilla de GFP-kdel expresada en un fondo WT se muestra en el panel B, lisado de proteínas de CS x GFP-kdel se muestra en la Figura 9C y un inmunoblot de gel de lisado replicado (Figura 9D) se usó para identificar qué puntos eran GFP-kdel (en cuadro) .

GFP-kdel equivale a aproximadamente 2% del proteoma de semilla en el antecedente WT y cuando se cruza en el antecedente ßCS, se incrementa a >7% del proteoma de la semilla .

Como se muestra en las figuras 10A a 10C, (Figura 10A) , porciones de los fragmentos hidratados se visualizaron mediante microscopía de fluorescencia y las imágenes resultantes mostraron que la GFP-kdel es expresado a un nivel más alto en un fondo de ßCS en relación a un fondo de WT.

Los lisados de los fragmentos de semilla se fraccionaron después mediante ID PAGE. La figura 10B muestra geles ID de proteínas de plantas homocigóticas transformadas expresando GFP-kdel en un fondo de T en comparación con un fondo de CS . La figura 10C es un inmunoblot que usa un anticuerpo contra ß-conglicinina, confirmando la falta de proteína ß-conglicinina en los lisados de semillas de ßCS y ß?e x GFP-kdel.

Para obtener una evaluación adicional de la abundancia de GFP-kdel, lisados de semilla se prepararon y ensayaron usando un fluorómetro con GFP comercial como un parámetro de control. Los resultados mostrados en la figura 11 confirman tanto la impresión visual de la fluorescencia de GFP-kdel (figura 10A) como la abundancia de volumen de puntos (figuras 9A a 9D) que la construcción de GFP-kdel introducida en una planta ß?? se traduce en aproximadamente una mejora de 3.5 a 4.0 veces de la acumulación de GFP-kdel en comparación con una planta WT transformada con GFP-kdel.

La co-producción y acumulación de proglicinina y GFP-kdel que acretan para formar cuerpos de proteína derivados de ER se traduce en la formación de dos poblaciones distintas de cuerpos de proteína unidos a ER. Cuerpos de proteínas derivados de ER formados de nuevo y el secuestro de ER de productos transgénicos incrementan la estabilidad de proteínas de otra manera inestables después de la traducción. La subunidad a/a de la supresión de ß-conglicinina de granos de soya produce cuerpos de proteína de proglicinina y la introducción de la línea GFP-kdel produce también cuerpos de proteínas que se traducen en la formación de cuerpos de proteína GFP-kdel que son tanto más abundantes en número como en tamaño en comparación con los cuerpos de proteínas en el progenitor GFP-kdel. Proteínas estrechamente emparentadas tales como las a y ?-zeínas co-acretan, formando una sola población de cuerpos de proteínas. Esto en contraste con los resultados de proglicinina y GFP-kdel, proteínas que cuando son expresadas formaron dos cuerpos de proteína distintos con la GFP-kdel siendo favorecida para acreción en cuerpos de proteína. Esto indica que la acreción de proteínas en los cuerpos de proteínas que forman ER es un proceso dependiente de especie de proteína que forma cuerpos de proteína sólo con un tipo de proteína incluso si más de una proteína secuestrada de cuerpo de proteína es sintetizada. Esto es potencialmente adecuado para usar la formación de cuerpos de proteínas como una plataforma para biotecnología toda vez que aseguran que la proteína secuestrada en las acreciones sea relativamente pura. Los cuerpos de proteína pueden ser después aislados directamente de lisados, simplificando ampliamente la trayectoria de purificación hacia abajo.

Ejemplo 13 Procesamiento de proteínas heterólogas en la línea de soya El procesamiento del polinucleótido heterólogo que codifica para glicinina se examinó en plantas de soya WT y Como se muestra en la figura 12 (línea 1) , en soya WT (no transgénica) , ninguna cantidad de pro-glicinina pudo ser detectada en semillas. La línea 2 muestra que en la planta ß??, niveles elevados de glicinina son almacenados en cuerpos de proteínas como pro-glicinina. El porcentaje de pro-glicinina/glicinina es de aproximadamente ~24%.

Ejemplo 14 Producción de ß -glucosidasa en semillas de soya Las construcciones descritas en la presente pueden usarse para producir enzimas tales como ß-glucosidasa en semillas de soya. Por ejemplo, la secuencia de 0-glucosidasa Aspergillus kawachii (SEQ ID NO: 35) puede insertarse en una construcción genética que tenga las secuencias reguladoras de glicinina de soya, junto con una señal ER y secuencias de retención. La construcción puede ser después transformada en tejido de soya usando bombardeo biolístico, plantas son regeneradas y cruzadas y se obtienen plantas homocigóticas estables. Estas plantas son después introducidas en las líneas de soya ßCS . La producción de proteína de interés a partir de esas plantas es luego determinada. Las plantas con un alto nivel de expresión de ß -glucosidasa se seleccionan para la producción de escala ascendente de la proteína de interés .

Ejemplo 15 Producción de exocellobiohidrolasa I en semillas de soya Las construcciones descritas en la presente pueden usarse para producir enzimas tales como exocelobiohidrolasa I en semillas de soya. Por ejemplo, la exocelobiohidrolasa I de secuencia de Trichoderma reesei modificada (No. de registro P26294), puede modificarse para incluir la secuencia de señal ER de quitinasa de Arabisopsis y una secuencia de señal de retención de KDEL, como se muestra en SEQ ID NO: 22. La región reguladora de genes de KTI (o la región reguladora de genes de otra proteína que se encuentra que compensa la proteína reducida en la línea de soya que tiene la deficiencia genética) puede usarse para conducir la expresión de la proteína. La construcción puede ser después transformada en tejido de soya usando bombardeo biolístico, las plantas son después regeneradas a la población homocigótica para la expresión de la enzima. Las plantas homocigóticas que expresan enzima pueden ser después introducidas con plantas SP- homocigót icas para formar plantas que sean homocigóticas para la enzima exocelobiohidrolasa I y para el rasgo SP- . La producción de exocelobiohidrolasa I a partir de estas plantas es luego determinada. Plantas con un alto nivel de expresión de exocelobiohidrolasa I se seleccionan de preferencia para la producción de escala ascendente de la proteína.

Ejemplo 16 Procesamiento de la proteína de interés a partir de semillas La proteína puede utilizarse directamente, no purificada de la harina de semilla de soya, o la proteína de interés se puede purificar parcial o sust ancialmente . El método exacto dependerá del tipo de proteína que se produzca, así como de la pureza que se requerirá. Como un ejemplo, una proteína de interés transgénica puede extraerse de granos de soya secos y maduros al mezclar la molienda de semilla de soya con NaCl 0.35 M en PBS a 75 g/L a temperatura ambiente durante 2.5 horas. El extracto puede ser después pasado a través de varias capas de estopilla, y centrifugarse a 12,000 g durante 1 hora a 4°C. El sobrenadante es luego recuperado y la concentración de NaCl se ajusta a 0.4 M (pH 8.0) . Después de una segunda centrifugación a 12,000 g durante 10 minutos a 4°C, el sobrenadante puede ser recogido y filtrado a través de una membrana de ni trocelulosa de 0.45 µp?. El filtrado puede ser cargado en una columna SP SEPHAROSE™ (Bio-Rad, Hercules, Calif.) la cual sea previamente equilibrada con NaCl 0.4 M en 50 mM de fosfato de sodio, pH 8.0 (regulador de pH de unión) a una velocidad de flujo de 5 ml/min. La columna puede ser lavada con el regulador de pH de unión hasta que ya no eluya más contaminantes . La proteína de interés es luego eluida mediante un gradiente lineal, seguido por la diálisis contra PBS . La proteína purificada puede ser después analizada, por ejemplo, mediante SDS-PAGE y/o inmunoblot, y almacenada a 80°C, o, alternativamente, liofilizada y almacenada a temperatura ambiente o menos, hasta que se requiera.

Ejemplo 17 Producción de otras enzimas en semillas de soya Un gen sintético que codifica para una enzima industrial de interés seleccionada puede insertarse en el cásete de expresión génica específico de semilla de soya descrito en la presente que contiene los elementos reguladores 5' y 3' ya sea de glicinina, KTI , P34, SBP, SMP o LE. Los elementos reguladores de KTI, P34, SBP, SMP o LE se usarán para conducir la expresión de las enzimas industriales, tales como ß - glucos i dasa , en un fondo SP-. La construcción induce a la enzima industrial a precipitarse en el proceso de reequilibrio de proteína que resulta de la supresión de conglicinina y/o glicinina incrementando la síntesis y acumulación de la enzima industrial.

El ORF tiene de preferencia una secuencia de nucleótidos que codifica para la señal de dirección a ER del gen básico de quitinasa de Arabidopsis fusionado 5' y una secuencia de nucleótidos que codifica' para una secuencia de retención KDEL ER carboxi - terminal fusionada 3' al gen. El plásmido puede también contener un marcador de resistencia a higromicina para la selección de transformantes. La transformación y producción de líneas homocigót icas que contienen el gen de interés se producirá como se describe en la presente. Las plantas transgénicas son después introducidas en su SP-, PCS u otra línea deficiente en proteínas de almacenamiento de semilla. La cantidad de la proteína transgénica y la semilla será después determinada. Las plantas que tengan un alto nivel de expresión de la proteína industrial de interés se usarán para la producción a escala ascendente de la proteína. Mediante el uso de este método, se puede obtener un rendimiento incrementado de la proteína de interés industrial.

Ejemplo 18 Producción de un fragmento de anticuerpo humano en semillas de soya Los métodos descritos en la presente pueden usarse para producir fragmentos de anticuerpo en semillas de soya. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que se producirá se selecciona. El ácido nucleico que codifica para el fragmento de anticuerpo es luego insertado en una construcción de vector que tiene elementos reguladores hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' de glicinina, como se describió en la presente. La construcción es luego transformada en semillas de soya usando electroporación . Las plantas transformadas son luego regeneradas y cruzadas, y las plantas homocigót icas estables son obtenidas. Estas plantas son luego introducidas en una línea CS . La producción del fragmento de anticuerpo se confirma. Las plantas se cultivan para producción a escala ascendente de la proteína de interés. Los fragmentos de anticuerpo son luego aislados y purificados de las semillas de soya maduras .

A partir de lo anterior, se apreciará que, aunque modalidades específicas de la invención han sido descritas en la presente por motivos de ilustración, pueden hacerse varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las referencias citadas en la presente se incorporan a manera de referencia en sus totalidades.

Tabla 4 Secuencias de ácido nucleico y proteínas ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) Gücinina Glycine max región promotora' caaaacaaattaataaaacacttacaacaccggatttttt SEQ ID O: 1 reguladora 5' ttaattaaaatgtgccatttaggataaatagttaatattttt aataattamaaaaagccgtatctactaaaatgatttttat ttggttgaaaatattaatatgtttaaatcaacacaatctat caaaattaaactaaaaaaaaaataagtgtacgtggttaa cattagtacagtaatataagaggaaaatgagaaattaa gaaattgaaagcgagtctaatttttaaattatgaacctgc átatataaaaggaaagaaagaatccaggaagaaaag aaatgaaaccatgcatggtcccctcgtcatcacgagttt ctgccatttgcaatagaaacactgaaacacctttctcttt gtcacttaattgagatgccgaagccacctcacaccatg aacttcatgaggtgtagcacccaaggcttccatagcca tgcatactgaagaatgtctcaagctcagcaccctacttc tgtgacgtgtccctcattcaccttcctctcttccctataaa taaccacgcctcaggttctccgcttcacaactcaaacat tctctccattggtccttaaacactcatcagtcatcaccgc Glicinina (gen Gyl Glycine max región promotora/ caaaacaaattaataaaacacttacaacaccggatttttt SEQ ID NO: 2 de soya para sub- reguladora 5' tlaattaaaatgtgccatttaggataaatagttaatattttt unidad de glicina aataattantaaaaagccgtatctactaaaatgatttttat Gl ; número de ttggttgaaaatattaatatgtttaaatcaacacaatctat registro X15121.1) carta gtacagtaatataagaggaaaatgagaaattaa gaaattgaaagcgagtctaatttttaaattatgaacctgc atatatáaaaggaaagaaagaatccaggaagaaaag aaatgaaaccatgcatggtcccctcgtcatcacgagtrt ctgccatttgcaatagaaacactgaaacacctttctcttt gtcacttaattgagatgccgaagccacctcacaccatg aacttcatgaggtgtagcacccaaggcttccatagcca tgcatactgaagaatgtctcaagctcagcaccctacttc tgtgacgttgtccctcattcaccttcctctcttccctataa ataaccacgcctcaggttctccgcttcacaactcaaac attctcctccattggtccttaaacactcatcagtcatcac c Conglici ina Glycine max región promotora/ gttttcaaatttgaattttaatgtgtgttgtaagtataaattt SEQ ID NO: 3 reguladora 5' aaaataaaaataaaaacaattattatatcaaaatggcaa aaacatttaatacgtattatttattaaaaaaatatgtaataa tatatttatattttaatatctattcttatgtattttttaaaaatct attatatattgatcaactaaaatatttttatatctacacttatt ttgcatttttatcaattttcttgcgttttttggcatatttaataa tgactattctttaataatcaatcattattcttacatggtacat attgttggaaccatatgaagtgttcattgcatttgactatg tggatagtgttttgatccatgcccttcatttgccgctatta attaatttggtaacagattcgttctaatcagttacttaatcc ttcctcalcataattaatctgglagttcgaatgccataata ttgattagttttttggaccataagaaaaagcc aaggaac aaaagaagacaaaacacaatgagagtatcctttgcata gcaatgtctaagttcataaaattcaaacaaaaacgcaat cacacacagtggacatcacttatccactagctgatcag gatcgccgcgtcaagaaaaaaaaactggaccccaaa agccatgcacaacaacacgtactcacaaaggcgtcaa tcgagcagcccaaaacattcaccaactcaacccatcat gagcccacacatttgttgtttctaacccaacctcaaact cgtattctcttccgccacctcatttttgmatttcaacacc cgtcaaactgcatcccaccccgtggccaaatgttcatg catgttaacaagacctatgactataaatatctgcaatctc ggcccaagttttcatcatcaagaaccagttcaatatcct agtacgccetattaaagaatttaaeatatact ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) KTI Glycine max región promoattgatactgataaaaaaatatcatgtgctttctggactg SEQ ID NO: 4 tora/reguladora atgatgcagtatactmgacattgcctttattttatttttca 5' gaaaagctttcttagttctgggttcttcattatttgtttccc atctccattgtgaattgaatcatttgcttcgtgtcacaaat acatttagntaggtacatgcattggtcagattcacggttt attatgtcatgacttaagttcatggtagtacattacctgcc acgcatgcattatattggttagatttgataggcaaatttg gttgtcaacaatataaatataaataatgtttttatattatga aataacagtgatcaaaacaaacagttttatctttattaac aagattttgtttngtttgatgacgttttttaatgtttacgcttt cecee ttcttttgaamagaacacmatcatcataaaatc aaatactaaaaaaattacatatttcataaataataacaca aatatttttaaaaaatctgaaataataatgaacaatattac atattatcacgaaaattcattaataaaaatattatataaat aaaatgtaatagtagttatatgtaggttttttgtactgcac gcataatatatacaaaaagattaaaatgaactattataaa taataacactaaattaatggtgaatcatatcaaaataatg aaaaagtaaataaaatttgtaattaacttctatatgtatta cacacacaaataataaataatagtaaaaaaaattatgat aaatatttaccatctcataaagatamaaaataatgataa aaatatagattattttttatgcaactagctagccaaaaag agaacacgggtatatataaaaagagtacctttaaattct actgtacttcctttattcctgacgtttttatatcaagtggac atacgtgaagattttaattatcagtctaaatatttcattagc acttaatacttttctgttttattcctatcctataagtagtccc gattctcccaacattgcttattcacacaactaactaagaa agtcttccatagccccccaaaa LE Glycine max región promoaatgccatcgtatcgtgtcacaatggaatacagcaatg SEQ ID NO: 5 tora/reguladora aacaaatgctatcctcttgagaaaagtgaaatgcagca 5' gcagcagcagactagagtgctacaaatgcttatcctctt gagaaaagtgaaatgcagcggcagcagacctgagtg ctatatacaattagacacagggtctattaattgaaattgt cttanattaaatatttcgtmatattaattmtaaatmaatt aaatttatatatattatatttaagacagatatatttatttgtg anataaatgtgtcactttttcttttagtccatgtattcttcta ttmtcaaraaactttttatttttatmtaagtcactctgatc aagaaaacattgttgacataaaactattaacataaaatta tgttaacatgtgataacatcatatttlactaatataacgtc gcattttaacgtttttttaacaaatatcgactgtaagagta aaaatgaaatgtttgaaaaggttaatlgcatactaactat ttlttttcctataagtaatctttttlgggatcaattgtatatca ttgagatacgatattaaatatgggtaccttttcacaaaac ctacccttgttagtcaaaccacacataagagaggatgg atttaaaccaglcagcaccgtaagtatatagtgaagaa ggctgataacacactctattattgttagtacgtacgtattt cctttmgtnagtmtgaatttaanaanaaaatatatatg ctaacaacattaaattttaaatttacgtctaattatatattgt gatgtataataaattgtcaacctttaaaaattataaaaga aatattaattttgataaacaacttttgaaaagtacccaata algctagtataaataggggcatgactccccatgcatca cagtgcaatttagctgaagcaaagc P34 Glycine max región promoalggataaaaaatctagcattctctcttttctcactagcat SEQ ID NO: 6 tora/reguladora attaaattaacgatccagaaatatttataaatatttttttaat 5' gcttaatgactcaatacacggccagtcaaggtcaacct tggtcggataaacaaccctcataacatgacatacaana taatggaaaatictcatatagcacaattatgaaggcaaa aacatggcacacaaaaggtacttgttttaactataaacg attatgaatttttcagggaaaatagcatgttcgtcttgatt ctcngaagaacrmtaggtacctmactaagttggacg tgattttgtctatKttcaggagaaaataaaRRataaaatK ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) tcttttgtggacatgattttgattgtgatttcatgttaaggg agtaaggatgatgtagttttatgtagagtttgtaggtcttg gatctttticartaatgaagtcatngcttcttgaagatcaa tgacaacaaaatgaagaagtaagaaaggtgattggag acctcatttttaagaaaaaatgagtcaagaataagctta ccaccataggaagtcatgaataagagcttgaaagtaa gagaagatgagtggagggagagggagagagatgac acaaaatttatgcctcaaataaggtctgaacattgaagt ctaatttcttaaatgatcaaaattgaaaaaatacacacac aagacctctatagtttaagtgtcattcaaaattggagaa aaatttagatttctattcaaatttcacttgaatttgaatttat agagtcaaattttgagtcaaaatttcattaattataatcag tgaatttcaactatggtttagtctgctaatccaatatcaag tccaaagttctlcactaagtgtgcttaggtgtcatgagg catgtaaaatataaaggacatgtacaaagtatgaccat atgatgtgacaatgaggtgtaacaagcaaatgctcacc ttccctttaggctggtccaaaatttaattggattgagcttc tcccaattcaattaaatttcttttttaacacacacatcaaat agtgcactgaatgcacgtgaaattacaaaactatctca aatacaaaaactagtctaggtgtcctaaaatacaaaga ctgaaaaatcctatattatcagagtaccctccttacacta tggagtcctaaatacaagactcaaaaataatgaaatcct aatataatatatgtacaaaaataagtggattcatacttgg tctattgatcgaaaatctaccttaaggctcatgagaatcc taaggtcttctcctgcatctctgactcaatcttttaagtctc caaccatgactttggta GBP Glycine max región promotggatamaagtcttctataatatttcatttagagccaga SEQ ID NO: 7 tora/reguladora agccaggttcaaaggaataggtaattcacatgaattcat 5' tctcttgtttctatacagctattatttttccatcttaglgttgc aggaaactacctcagttgttgtagatgtgcaaaacttgt atggatatatatactgttcagtgttgggaaacccatgctt tcttaattcacagagatacatttaaactttttttagaaactt gcttagtatcttatcctgtttgttattcatttttggcagttgg tcctaaagatactcctatgaatcttgtgctagagaagac ttacgatgctaaaacaggacggggcatgcctgaacttt aaggagacgttgccctgttccacttccaattaggtaact 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ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) tgattttaaaaaaaatatgacagatgcaatcttattttcac tttttatactttcactactgcttcatatgacctaaagtcaga gaaatattttaaaaagataaatacgataaagaatacgat gagaaagaaacctcacacaatgaatagaccaaattag acctatttattttccttagaaataaagaaaataattatttttt attttttcacattacatttatatttttctatcactttctctattta ggtattgattggcatatgagtgtacatgaatttttttttttaa aaaaagcgtaaatattaattatattcatgcattatttgtttt ctgtctttcattttctatltaatcttacgttatcaataatttatt attaaattttatagttgatgatgaatatataagagatataa ataaaaaaaataattaattttataataaaaattaaaaaata attattttgagataaaaaattttaagagaacaattataaac ggagagtattatatttagttttatgtaccgtgtacgtgtct actaacatggtgtctctccatcattttcgtaggaaaaaac attataggagtatgaaaaaagcaaaagttttgtctgttta tggttttgtatatacccagctctacttggcagcaattacc cgtcttgcttgctacttacgagacacgtacattaacactt gtcctagctagtgcatgcaatlgccaccccattcatcac tcctcccttttccttctcntatatttatatatatatatatatat atatatatatatatatatatatatatatatataaacaagcac aatgcatcatctcaaagaaatlaagagagmtttttgttc ctcactgaccaagcc SMP Glycine max región promogtttcacatgatccttcartctgtglggcttaggagactc SEQ ID NO: 8 tora/reguladora aactlcagagtccgtgatgatcaatgactcttaagttgtg 5' acttatggcttcatg ttaataaattacttcatagacaatg atgccctttcattattccatcccaaattaactaatgtttaa gattttctttacacaaaactagaaaataaatattttaagag aattaatatttagttgggggataattttaattattagaatat tcttgttttctctcttaatttcaataaatatattagtaaattttt taaaacaacattatgtatatatatatgtgaaaanagaata aatattttgaatatttcaatatcaaccaatttaaatattttttt aaaggttaaaattatagtcattttggaacatagacagta atatggagctagagttatgttaaatacaggtcagaaaa ataaaactcatgaaaatttgtaaaccaacgaaacttaca ataagttcagcagtgatcttttgtctcatttttttacatttctt tagtctcmattttttggttaaacgttgctttttagtttattat gttttagtaattttttttlactttattacattaaa tttaaaattt ctattttgttttttttatgtttttgaaaattttattttgttaattttt Rcataagaacactaatacttagaaaagaataaaaaaa aaaaaggaaagttcgatggaattcaagctcatgaaattt tatgttaaaaacatgagtaattcattaatattttaaaattta aaataaaaaaaaaaaggaaagttcgatggaattcaag ctcatgaaamtatgttaaaaacatgagtaattcattaat attttaaaatttaaaataartaartgttttacrtatattaaata 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ctcttatggtagcagaataagacgtaaactggttctttgc tecaa SMP Glycine max Terminador ttaaaacgtgatctatgatacaacaatattagtatatata SEQ ID NO: 21 (3'TED) gacgcatgcagtttatatagtatatattgtcatgttgtatg tttttacattttggtttgcttgtttacattctcttcaaaaaaaa aaaaatgtgtagtacgtgtaaggttttgaagattggttct aggctccgtgggaaccatttcaacaataaacattttgcg cgttcttgtacacgtagtgatgagaagagatgccttatg ggcagtatcatctaaaacttattttcatccatcatagaatt tggatctattggactggactgaactgaactgaatgatcc ttttttcttttttaatttcattcactaacaaatacataaaaca ccagatattaacttagccagtatgaattttaactattttgtc taatgctatgacttatcactgtctgtatcatctttaattctttt ttcatattatttatattaaataa marcador de Sintético Secuencia de aaggatgaacmaatga SEQ ID NO: 22 retención ER señal de reten(codifica KDEL, ción ER-CDS · seguido por 2 codones de paro Marcador de Sintético Retención ER- kdel SEQ ID NO: 23 retención ER secuencia de KDEL aminoácidos (codificada por secuencia de ácido nucleico anterior) marcador de Sintético retención ER aagcatgatgaactttaatga SEQ ID NO: 24 retención ER (codifica KDEL, seguido por 2 codones de paro Marcador de Sintético Retención ÉR- khdel SEQ ID NO: 25 retención ER secuencia de KDEL aminoácidos (codificada por secuencia de ácido nucleico anterior) Marcador de Sintético retención ER hdel SEQ ID NO: 26 retención ER Marcador de Sintético retención ER keel SEQ ID NO: 27 retención ER Marcador de Sintético : retención ER sekdel SEQ ID NO: 28 retención ER Marcador de Sintético retención ER sehdel SEQ ID NO: 29 retención ER Ubiquitina 3 Solanum región proccaaagcacatacttatcgatttaaatncatcgaagag SEQ ID NO: 30 tuberosum motora/ attaatatcgaataatcatatacatactttaaatacataac reguladora 5' aaattttaaatacatatatctggtatataattaattttttaaa gtcatgaagtatgtatcaaatacacatatggaaaaaatt aactattcataatttaaaaaatagaaaagatacatctagt gaaattaggtgcatgtatcaaatacattaggaaaaggg ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) catatatcttgatctagataattaacgattttgatttatgtat aatttccaaatgaaggtttatatctacttcagaaataaca atatacttttatcagaacattcaacaaagcaacaaccaa ctagagtgaaaaatacacattgttctctagacatacaaa attgagaaaagaatctcaaaatttagagaaacaaatct gaatttctagaagaaaaaaataattatgcactttgctatt gctcgaaaaataaatgaaagaaattagacttttttaaaa gatgttagactagatatactcaaaagctattaaaggagt aatattcttcttacattaagtattttagttacagtcctgtaat taaagacacattttagattgtatctaaacttaaatgtatct agaatacatatatttgaatgcatcatatacatgtatccga cacaccaattctcataaaaaacgtaatatcctaaactaa tttatccttcaagtcaacttaagcccaatatacattttcatc tctaaaggcccaagtggcacaaaatgtcaggcccaat tacgaagaaaagggcttgtaaaaccctaataaagtgg cactggcagagcttacactctcattccatcaacaaaga aaccctaaaagccgcagcgccactgatttctctcctcc aggcgaag Ubiquitina 3 Solanum terminador ttgattttaatgtttagcaaatgtcttatcagttttctcttttt SEQ ID NO: 3 l tuberosum gtcgaacggtaatttagagtttttmgctatatggattttc gtttttgatgtatgtgacaaccctcgggaTtgttgatttati tcaaaactaagagtttttgtcttattgttctcgtctattttgg atatcaa Monómero de Solanum terminador ttttaatgtttagcaaatgtcttatcagttttctctttttgtcg SEQ ID NO: 32 ubiquitina/pro- tuberosum aacggtaatttagagtttttttttgctatatggattttcgtttt teína ribosómica tgatgtatgtgacaaccctcgggattgttgatttatttcaa (Genbank No. aactaagaglttttgcttattgttetcgtctattttggatatc de registro aa Zl 1669.1) Gen de resistencia Escherichia ORF atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgaga SEQ ID NO: 33 a higromicina col i agtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctg (hph) atgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcag cttcgatgtaggagggcgiggatatgtcctgcgggtaa atagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgttta tcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaa gtgcttgacattggggcattcagcgagagcctgaccta ttgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaag acctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagcc ggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccga tcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccg caaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcata tgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaact gtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcag gctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccc cgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctcc aacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcg gtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattccc aatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtgg ttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcg gaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccg ggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatca gagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttggg cgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggag ccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaa gcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtact cgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtcc gagggcaaaggaatag Proteína Sintético atgttcagtaaaggagaagaacttttcactRgagttgtc SEQ ID NO: 34 ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) Fluorescente secuencia - ccaattctlgttgaattagatggtgatgttaatgggcaca Verde (GFP) (derivada aattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaaca originalmente tacggaaaacttaccctlaaatttatttgcactactggaa de Aequorea aactacctgttccatggccaacacttgtcactactttctct Victoria tatggtgttcaatgcttttcaagatacccagátcatatga agcggcacgacttcttcaagagcgccatgcctgaggg atacgtgcaggagaggaccatctctttcaaggacgac gggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagg gagacaccctcgtcaacaggatcgagcttaagggaat cgatttcaaggaggacggaaacatcctcggccacaa gttggaatacaactacaactcccacaacgtatacatca cggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagctaactt caaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaac tagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgat ggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccaca caatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagag accacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctggga rtacacatggcatggatgaactatactga Beta Aspergí Mus (secuencia CDS atgaggttcactngangaggcggtggctctcactgct SEQ ID NO: 35 glucosidasa kawachii original - gtctcgctggccagcgctgatgaattggcttactcccc AB003470 accgtattacccatccccttgggccaatggccagggc gactgggcgcaggcataccagcgcgctgttgatattgt ctcgcagatgacattggctgagaaggtcaatctgacca caggaactggatgggaattggagctatgtgttggtcag actggcggggttccccgattgggagttccgggaatgl gtttacaggatagccctctgggcgttcgcgactccgac tacaactctgctttcccttccggtatgaacg ggctgca acctgggacaagaatctggcatacctccgcggcaag gctatgggtcaggaatttagtgacaagggtgccgatat ccaattgggtccagctgccggccctctcggtagaagt cccgacggtggtcgtaactgggagggcttctcccccg acccggccctaagtggtglgctctttgcagagaccatc aagggtatccaagatgctggtgtggtcgcgacggcta agcactacattgcctacgagcaagagcattlccgtcag gcgcctgaagcccaaggttatggatttaacatttccga gagtggaagcgcgaacctcgacgataagactatgca cgagctgtacctctggcccttcgcggatgccatccgtg cgggtgctggcgctgtgatgtgctcctacaaccagatc aacaacagctatggctgccagaacagctacactctga acaagctgctcaaggccgagctgggtttccagggcttt gtcatgagtgattgggcggctcaccatgctggtgtgag tggtgctttggcaggattggatatgtctatgccaggaga cgtcgactacgacagtggtacgtcttactgggg acaa acctgaccgttagcgtgctcaacggaacggtgcccca atggcgtgttgatgacatggctglccgcatcatggccg cctactacaaggtcggccgtgaccgtctgtggactcct cccaacttcagctcatggaccagagatgaatacggct acaagtactactatgtgtcggagggaccgtacgagaa ggtcaaccactacglgaacgtgcaacgcaaccacag cgaactgatccgccgcattggagcggacagcacggt gclcctcaagaacgacggcgctctgcctttgactggta aggagcgcctggtcgcgcttatcggagaagatgcgg gclccaacccttatggtgccaacggctgcagtgaccgt ggatgcgacaatggaacattggcgatgggctgggga agtggtactgccaacttcccatacctggtgacccccga gcaggccatctcaaacgaggtgctcaagaacaagaat ggtgtattcaccgccaccgataactgggctatcgatca gattgaggcgcttgctaagaccgccagtgtctctcttgt ctngtcaácgccgactctggcgagggttacatcaatgt cgacggaaacctRgfitgaccgcaagaacctgaccct ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) gtggaggaacggcgataatgtgatcaaggctgctgct agcaactgcaacaacaccattgttatcattcactctgtc ggcccagtcttggttaacgaatggtacgacaacccca atgttaccgctattctctggggtggtctgcccggtcagg agtctggcaactctcttgccgacgtcctctatggccgtg tcaaccccggtgccaagtcgccctttacctggggcaa gactcgtgaggcctaccaagattacttggtcaccgagc ccaacaacggcaatggagccccccaggaagacttcg tcgagggcgtcttcattgactaccgcggattcgacaag cgcaacgagaccccgatctacgagttcggctatggtct gagctacaccactttcaactactcgaaccttgaggtgc aggttctgagcgcccccgcgtacgagcctgcttcggg tgagactgaggcagcgccaacttttggagaggttgga aatgcgtcgaattacctctaccccgacggactgcaga aaatcaccaagttcatctacccctggctcaacagtacc gatctcgaggcatcttctggggatgctagctacggaca ggactcctcggactatcttcccgagggagccaccgat ggctctgcgcaaccgatcctgcctgctggtggcggtc ctggcggcaaccctcgcctgtacgacgagctcatccg cgtgtcggtgaccatcaagaacaccggcaaggttgct ggtgatgaagttccccaactgtatgtttcccttggcggc cccaacgagcccaagatcgtgctgcgtcaattcgagc gcatcacgctgcagccgtcagaggagacgaagtgga gcacgactctgacgcgccgtgaccttgcaaactggaa tgttgagaagcaggactgggagattacgtcgtatccca agatggtgtttgtcggaagctcctcgcggaagccgcc gctccgggcgtctctgcctactgttcactaa Beta Aspergillus (proteína de mrftlieavaltavslasadelaysppyypspwang SEQ ID NO: 36 glucosidasa kawachii secuencia qgdwaqayqravdivsqmtlaekvnlttgtgwelel (No. de registro original de cvgqtggvprlgvpgmclqdsplgvrdsdynsafp BAA19913) longitud sgmnvaat dknlaylrgkamgqefsdkgadiql completa) gpaagplgrspdggmwegfspdpalsgvlfaetik giqdagwatakhyiayeqehrrqapeaqgygfhis esgsanlddktmhelylwpfadairagagavmcsy nqinnsygcqnsytlnkllkaelgfqgfvmsdwaa hhagvsgalagldmsmpgdvdydsgtsywgtnlt vsvlngtvpqwrvddmavrimaayykvgrdrlwt ppnfsswtrdeygykyyyvsegpyekvnhyvnv qmhselirrigadstvllkndgalpltgkerlvaliged agsnpygangcsdrgcdngtlamg gsgtanrpyl vtpeqaisnevlknkngvftatdnwaidqiealakta svslvfvnadsgegyinvdgnlgdrknltlwmgdn vikaaasncnntiviihsvgpvlvnewydnpnvtai Iwgglpgqesgnsladvlygrvnpgakspfrwgktr eayqdylvtepnngngapqedfvegvfidyrgfdk rnetpiyefgyglsyttfnysnlevqvlsapayepasg eteaaptfgevgnasnylypdglqkitkfiypwlnst dleassgdasygqdssdylpegatdgsaqpilpagg gpggnprlydelirvsvtikntgkvagdevpqlyvsl ggpnepkivlrqferitlqpseetkwsnltrrdlan n vekqdweitsy pkm vfvgsssrkppl rasl ptvh Beta Aspergillus Secuencia de delaysppyypspwangqgdwaqayqravdivs SEQ ID NO: 37 glucosidasa kawachii arriba con 19aa qmtlaekvnlttgtgwelelcvgqtggvprlgvpgm (secuencia (Proteína clqdsplgvrdsdynsafpsgmnvaatvvdknlayl parcial de No. removida de rgkamgqefsdkgadiqlgpaagplgrspdggm de registro secuencia de wegfspdpalsgvlfaetikgiqdagwatakhyia BAA19913) señal) yeqehfrqapeaqgygfnisesgsanlddktmhely íwpfadairagagavmcsynqinnsygcqnsytln kllkaelgfqgfvmsdwaahhagvsgalagldms mpgdvdydsgtsywgtnltvsvlnRtvpqwrvdd ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) mavrimaayykvgrdrlwtppnfsswtrdeygyk yyyvsegpyekvnhyvnvqmhselirrígadstvll kndgalpltgkerlvalígedagsnpygangcsdrg cdngtlamgwgsgtanfpylvtpeqaisnevlknk ngvftatdnwaidqiealaktasvslvfvnadsgegy invdgnlgdrknltlwmgdnvikaaasncnntivii hsvgpvlvnewydnpnvtailwgglpgqesgnsla dvlygrvnpgakspfrwgktreayqdylvtepnng ngapqedfvegvfidyrgfdkmetpiyefgyglsyt tfnysnlevqvlsapayepasgeteaaptfgevgnas nylypdglqkitkfiypwlnstdleassgdasygqds sdylpegatdgsaqpilpagggpggnprlydelirvs vtikntgkvagdevpqlyvslggpnepkivlrqferi tlqpseetk sttltrrdlanwnvekqdweitsypk mvfvgsssrkpplraslptvh Beta Aspergillus (Secuencia de MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEdelaysp SEQ ID NO: 38 glucosidasa - kawachíi/ con señal sustituida pyypspwangqgdwaqayqravdivsqmtlaek "GSF V I" secuencia y secuencias de vnlttgtgwelelcvgqtggvprlgvpgmclqdspl sintética KDEL gvrdsdynsafpsgmnvaatwdknlaylrgkamg en letras qefsdkgadiqlgpaagplgrspdggmwegfspd MAYÚSCULAS) palsgvlfaetikgiqdagvvatakhyiayeqehfrq apeaqgygfnisesgsanlddktmhelylwpfadai ragagavmcsynqinnsygcqnsytlnkllkaelgf qgfvmsdwaahhagvsgalagldmsmpgdvdy dsgtsywgtnltvsvlngtvpqwrvddmavrimaa yykvgrdrlwtppnfsswtrdeygykyyyvsegp yekvnhyvnvqrnhselirrigadstvllkndgalplt gkerlvaligedagsnpygangcsdrgcdngtlam gwgsgtanfpylvtpeqaisnevlknkngvñatdn waidqiealaktasvslvrvnadsgegyinvdgnlg drknltlwmgdnvikaaasncnntiviihsvgpvlv newydnpnvtailwgglpgqesgnsladvlygrvn pgakspf vgktreayqdylvtepnngngapqedf vegvfidyrgfdkmetpiyefgyglsyttftiysnlev qvlsapayepasgeteaaptfgcvgnasnylypdgl qkitkfiypwlnstdleassgdasygqdssdylpega tdgsaqpilpagggpggnprlydelirvsvtikntgk vagdevpqlyvslggpnepkivlrqferitlqpseet kwsttltrrdlanwnvekqdweitsypkmvfvgss srkpplraslptvhKDEL Beta Aspergillus Secuencias de MK TNLFLFLIFS LLLSLSSAEd SEQ ID NO: 39 glucosidasa - kawachíi con señal sustituida elaysppyyp spwangqgdw aqayqravdi "GSF V2" secuencia y de KDEL vsqmtlDekvnlttgtg el elcvgqtggv sintética en MAYÚSCUprlgvpgmcl qdsplgvrds dynsafpAgm LAS y las sustitunvaa wdknlaylrgkamgq efsdkgadiq ciones de 13 Igpaagplgr spdggmweg fspdpalsgv aminoácidos Ifaetikgiqdagwatakh yiayeqehfr en MAYÚSCUqapeaqgFgf nisesgsanl ddktmhelyl LAS y subrayadas) wpfadairagagavmcsynq innsygcqns ytlnkllkae Igfqgfvmsd waahhagvsg alagldmsmp gdvdydsgts ywgtnltlsv Ingtvpq rv ddmavrimaa yykvgrdrlw tppnfssvrtrdeygykyyyv segpyekvnQ yvnvqmhse lirrigadst vllkndgalp Itgkerlvaligedagsnpy gangcsdrgc dngtlamgwg sgtanfpylv tpeqaisnev IkHkngvftatdnwaidqie alaktasvsl vfvnadsgeg yinvdgnlgd rRnltlwrng dnvikaaasncnntivVihs vgpvlvne y •dnpnvtailw gglpgqesgn sladvlygrv ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) npgakspftwgktreayqdy Ivtepnngng apqedfvegv fidyrgfdkr netpiyefgy glsyttfhysnlevqvlsap ayepasgete aaptfgevgn asDylypSgl qRitkfiypw InGtdleassgdasygqdss dylpegatdg saqpilpagg gpggnprlyd elirvsvtik ntgkvagdevp lyvslggp nepkivlrqf eritlqpsee tkwsttlrrr díanwnvekq dweitsypkmvfvgsssrkL plraslptvh KDEL Secuencia de Aspergillus proteína mrftlieavaltavslasadelaysppyypspwang SEQ ID NO: 40 beta niger qgdwaqayqravdivsqmtldekvnlttgtgwelel glucosidasa 2 cvgqtggvprlgvpgmclqdsplgvrdsdynsafp de Patente de agmnvaatwdknlaylrgkamgqefsdkgadiql E.U.A. No. gpaagplgrspdggmwegfspdpalsgvlfaetik 7223902 giqdagwatakhyiayeqehfrqapeaqgfgfnis (No. Reg. esgsanlddktmhelylwpfadairagagavmcsy ABT13410.1) nqinnsygcqnsytlnkllkaelgfqgfvmsdwaa hhagvsgalagldmsmpgdvdydsgtsywgtnlti svlngtvpqwrvddmavrimaayykvgrdrlwtp pnfsswtrdeygykyyyvsegpyekvnqyvnvqr nhselirrigadstvllkndgalpltgkerlvaligeda gsnpygangcsdrgcdngtlamgwgsgtanfpyl vtpeqaisnevlkhkngvftatdnwaidqiealakta svslvrfvnadsgegyinvdgnlgdrmltlwrngdn vikaaasncnntiwihsvgpvlvnewydnpnvtai Iwgglpgqesgnsladvlygrvnpgakspflrwgktr eayqdylvtepnngngapqedfvegvfidyrgfdk metpiyefgyglsyttfnysnlevqvlsapayepasg eteaaptfgcvgnasdylypsgllritkfiypwlngtd leassgdasygqdssdylpegatdgsaqpilpaggg pggnprlydelirvsvtikntgkvagdevpqlyvslg gpnepkivlrqferitlqpseelk sttltrrdlanwn vekqdweitsypkmvfvfisssrklplraslptvh Precursor Aspergillus CDS atgaagctttccattttggaggcagcagctrtgacagct SEQ ID NO: 41 XM_00121225 terreus gcctccgtagtcagcgcacaggacgatclcgcatact de beta- N1H2624 ccccgccgtactacccttctccctgggccgatggcca glucosidasa I cggtgagtggtcgaacgcgtacaagcgcgctgtagat atcgtctctcagatgacartgacggagaaggtcaatct caccaccggtactggatgggagttggagaggtgtgtc ggtcagacgggcagtgtccctagactgggaatcccaa gcctctglctgcaggatagccctctgggtattcgcatgt cggactataactcggccttccctgcgggiartaacgttg cggccacctgggacaagaagcttgcctaccaacgcg gcaaggcaatgggcgaggaattcaglgacaagggta ttgatgttcagttgggccctgctgccggtcctcnggca ggtcccccgatggaggccgaaactgggagggcttct ctcctgatcccgccctgactggtgtgttgttcgccgaga cgatcaagggtatccaggacgccggagttartgctac cgcgaagcactacattctcaacgaacaagagcatttcc gccaggtcggcgaagcccagggctatggcttcaacat caccgaaaccgtgagctcaaatgtggatgacaagacc atgcacgagctgtatctctggcccttcgccgatgcggl gcgcgcgggcgtgggcgctgtgatgtgctcctacaac cagatcaacaacagctacggatgccaaaacagtttga ccctgaacaagctcttgaaagccgaactcggatttcag ggantgtcatgagtgactggagtgctcaccacagcgg tgttggcgccgccttggctggtttggacatgtccatgcc gggagatatcagtttcgacagcggcacttccttctatgg cacgaacctRactRttggcgtcctcaacggcaccattc ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) cccagtggcgtgtggatgacatggccgtccggatcat ggctgcctactacaaggttggccgcgaccgtctctgg actcctcccaatttcagctcgtggactcgcgatgaatat ggcttcgcgcacttcttccc tccgaaggcgcttatgaa cgtgtcaatgaattcgtcaacgtgcagcgtgaccatgc ccaggtgatccgtcggattggcgcggatagtgtcgtg ctcttgaagaacgacgglgcccttcccttgacgggcca ggagaagactgttggcattctgggcgaagacgccgg glcgaatccgaagggagcaaatggttgcagtgaccgl ggctgtgacaagggtactctggccatggcttggggta gtggtactgccaacttcccttaccttgtgactcccgaac aggccattcagaacgaggttctgaagggccgtggaa atgtctttgccgtgacggacaactatgatacacagcag attgccgccgttgcctctcaatccacggtttcattggtttt cgtgaacgcagacgccggtgaaggtttccttaatgtgg acggaaacatgggtgatcgcaagaacctcaccctctg gcagaacggagaggaagtgatcaagactgtcacgga gcactgcaacaacaccgtlgttgtgatccattcggtgg gacctgttcicatcgatgagtggtatgcgcaccccaat gtcaccggcattctgtgggctggtctcccgggccagg agtctggcaacgccattgcggacgtgctgtacggccg cgtcaaccctggcggcaagaccccctttacctggggt aagacgcgcgcgtcctacggcgactacctcctcaccg agcccaacaacggcaacggtgctcctcaagacaactt caacgagggcgtgtttattgactaccgtcgcttcgaca agtacaatgagacgcccatctacgagttcggtcatggt ctgagctacacgacgtttgagctgtctggcctccaggt ccagcttatcaacggatccagctatgttcccactacgg gtcagacgagcgccgcccaggca ttggtaaagtcga ggacgcgtctagctacctgtaccctgagggactgaag aggatttccaagttcatctatccctggctgaactctacc gatcttaaagcgtctaccggcgatcctgaatacggaga gcccaacttcgaglatattcctgaaggtgctaccgatg gctctcctcagccccgtctgcctgccagcgggggtcc tggcggcaaccccggtctctatgaggatctcttccagg tttctgtgaccatcaccaacaccggcaagg tgctggt gatgaggtgcctcagctgtatgtttcgctgggtggccc caacgagccgaagcgggtgctgcgcaagttcgagcg cctgcacatcgcccctggtcagcaaaaggtctggacg actaccctgaaccgccgtgacctagccaactgggatg tcgtggcccaggactggaagatcactccctatgctaag accatctttgttggcacctcttcgcgcaagctgcctctc EctgstcgcngccacKKRtRcagtaa XM 001212225 Aspergillus Traducción de mklsileaaahaaswsaqddlaysppyypspwad SEQ ID NO: 42 de beta-glucosidasa terreus CDS anterior ghgewsnaykravdivsqmtltekvnlttgtg ele N1H2624 rcvgqtgsvprlgipslclqdsplgirmsdynsafpa ginvaatwdkklayqrgkamgeefsdkgidvqlgp aagplgrspdggmwegfspdpallgvlfaetikgiq dagviatakhyilneqehfrqvgeaqgygfhitetvs snvddktmhelylwpfadavragvgavmcsynqi nnsygcqnslllnkllkaelgfqgrvmsdwsahhsg vgaalagldmsmpgdisfdsg sfygtnltvgvlngt ipqwrvddmavrimaayykvgrdrlwtppnfssw trdeygfahffpsegayervnefVnvqrdhaqvirri gadswllkndgalpltgqektvgilgedagsnpkg angcsdrgcdkgtlamawgsgtanfpylvtpeqai qnevlkgrgnvfavtdnydtqqiaavasqstvslvfv nadagegflnvdgnmgdrknltl qngeeviktvt chcnntvwihsvgpvlidcwyahpnvtgilwagl PKqesgnaiadvIysrvnpggktprVwfiktrasye ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) dylltepnngngapqdnfhegvfidyrrfdkynetpi yefghglsyttfelsglqvqlingssyvpttgqtsaaqa fgkvedassylypeglkriskfiypwlnstdlkastg dpeygepnfeyipegatdgspqprlpasggpggnp glyedlfqvsvtitntgkvagdevpqlyvslggpnep krvlrkferlhiapgqqkvwtttlnrrdlan dwaq dwkitpyaktifvgtssrklplagrlprvq Exoglucanasa 1 Trichoderma Proteína de myrklavisaflataraqsactlqsethppltwqkcss SEQ ID NO: 43 (No. de registro reesei longitud completa ggtctqqtgswidanwrwthatnsstncydgntws P62694) (aa 1-17 = señal) stlcpdnetcaknccldgaayastygvttsgnslsigf vtqsaqknvgarlylmasdttyqeftllgnefsfdvd vsqlpcglngalyfvsmdadggvskyptntagaky gtgycdsqcprdlkfingqanvegwepssnnantgi gghgsccsemdiweansisealtphpcttvgqeice gdgcggtysdnryggtcdpdgcdwnpyrlgntsty¦ gpgssftldttkkltwtqfetsgainryyvqngvtfq qpnaelgsysgnelnddyctaeeaefggssfsdkgg Itqfkkatsggmvlvmslwddyyanmlwldstyp tnetsstpgavrgscstssgvpaqvesqspnakvtfs nikfgpigstgnpsggnppggnrgttttnpatttgssp gptqshygqcggigysgptvcasgttcqvlnpyysq el Proteína Trichoderma Proteína - MXT LFLFLIFSLLLSLSSAEqsactlqs SEQ ID NO: 44 exocelobiohitlro- reesei (sec anterior cthppitwqkcssggtctqqtgsvvidanwrwthat lasa I modificada con señal ER nsstncydgntwsstlcpdnetcaknccldgaayast reemplazada y ygvttsgnslsigfVtqsaqknvgarlylmasdttyq KDEL añadida eftllgnefsfdvdvsqlpcglngalyfvsmdadgg en MAYÚSCUvskyptntagakygtgycdsqcprdlkfmgqanve LAS) gwepssnnantgigghgsccsemdiweansiseal tphpcttvgqeicegdgcggrysdnryggtcdpdgc dwnpyrlgntsrygpgssftldttkkltwtqfetsgai nryyvqngvtfqqpnaelgsysgnelnddyctaeea efggssfsdkggltqfkkatsggmvlvmslwddyy anmlwldstyptnetsstpgavrgscstssgvpaqv esqspnakvtfsnikfgpigstgnpsggnppggnrg ttttrrpatltgsspgptqshygqcggigysgptvcas gttcqvlnpyysqclKDEL Exoglucanasa 2 Trichoderma Proteína de mivgilttlatlatlaasvpleerqacssvwgqcggqn SEQ ID NO: 45 (No de reesei longitud wsgptccasgstcvysndyysqclpgaassssstraa Registro completa sttsrvspttsrsssatpppgstttrvppvgsgtatysgn P07987) (1-24 = pfvgvtpwanayyasevsslaipsltgarnataaaav secuencia de akvpsrmwldtldktplmeqtladirtanknggnya señal) gqfvvydlpdrdcaalasngeysiadggvakykny idtirqiweysdirtllviepdslanlvtnlgtpkcana qsaylecinyavtqlnlpnvamyldaghagwlgw panqdpaaqlfanvyknasspralrglatnvanyng wnitsppsytqgnavyneklyihaigpllanhgwsn affitdqgrsgkqptgqqqwgdwcnvigtgfgirps antgdsllds vkpggecdgtsdssaprfdshcal pdalqpapqagawfqayfvqlltnanp.fi Exoglucanasa 2 Trichoderma Proteína - MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEqacssv SEQ ID NO: 46 Modificada reesei (sec anterior wgqcggqnwsgptccasgstcvysndyysqclpg con señal ER aassssstraasttsrvsprtsrsssatpppgstttrvppv reemplazada y gsgtatysgnpfvgvtpwanayyasevsslaipsltg KDEL añadida amataaaavakvpsfVnwldtldktplmeqtladirt en MAYÚSCUanknggnyagqfwydlpdrdcaalasngeysiad LAS) ggvakyknyidtirqiweysdirtllviepdslanlvt nlgtpkcanaqsaylecinyavtqlnlpnvamylda ghag lgwpanqdpaaqlfanvyknasspralrgl atnvanyngwnitsppsytqgnavyneklyihaie ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) pllanhgwsnaffitdqgrsgkqptgqqqwgdwc nvigtgfgifsantgdslldsfvwvk ggecdgtsd ssaprfdshcalpdalqpapqagawfqayfvqlltna npsfl DEL Endoglucanasa Acidothermus Proteína de mpralrrvpgsrvmlrvgvwavlalvaalanlavp SEQ ID NO: 47 El (No. de cellulolyticus longitud rparaagggywhtsgreildannvpvriaginwfgf registro P54583) completa (1-41 etcnywhglwsrdyrsmldqikslgyntirlpysd = secuencia dilkpgtmpnsinfyqmnqdlqgltslqvmdkiva de señal a qiglriildrhfdcsgqsalwy1ssvseatwisd Iqalaqrykgnptwgfdlhnephdpacwgcgdps idwrlaaeragnavlsvnpnllifvegvqsyngdsy wwggnlqgagqypwlnvpnrlvysahdyatsvy pqtwfsdptfpnnmpgiwnknwgylfhqniapv wlgefgttlqsttdqtwlktlvqylrptaqygadsfqw tfwswnpdsgdtggilkddwqtvdtvkdgylapik ssifdpvgasaspssqpspsvspspspspsasrtptpt ptptasptptltptatptptasptpsptaasgarclasyq vnsdwgngftvtvavtnsgsvatktwtvswtfggn qtitnswnaavtqngqsvtammsynnviqpgqntt fgfqasytgsnaaptvacaas Xílanasa - Aspergillus CDS atgaaggtcactgcggcttttgcaagtctcttgcttacg SEQ ID NO: 48 U39784 niger gccttcgcggcccctgctccggagcctgttctggtgtc gcgaagtgccggtatcaactacgtgcagaactacaac ggcaaccttggtgacttcacctacgacgagagtaccg ggacattttccatgtactgggaggatggagtcagttcc gacttcgtcgttggtttgggctggaccactggctcctct aaatctatcacctactctgcccaatacagcgcttctagc tccagctcctacctggctgtctacggctgggtcaactct cctcaggccgaatactacatcgtcgaggattacggtga ttacaacccttgcagctcggccacgagccttggtaccg tgtactctgatggaagcacctaccaagtctgcaccgac actcgacgaacgcggccatctatcacaggaacaagc acgttcacgcagtacnctccgttcgtgaaagtacacgc acatccggaacagtgactatcgccaaccatttcaatttc tgggcgcagcatgggttcggcaatagcaacttcaatta tcaggtcatggcggtggaggcatggaacggtgtcgg cagtgccagtgtcacgatctcctcttaa Xilanasa - Aspergillus Traducción de mkvtaafasllltafaapapepvlvsrsaginyvqny SEQ ID NO: 49 AAA99065.1 niger proteína de ngnlgdftydestgtfsmywedgvssdfvvglgwtt secuencia gssksitysaqysasssssylavygwvnspqaeyyi anterior vedygdynpcssatslgtvysdgstyqvctdtrrtrps itgtstftqy fsvrestrtsgtvtianh fnfwaqhgfgns nfnyqvmaveawngvgsasvtiss Ligninasa Phanerochaete Enzima mafkqlfaaislalslsaanaaaviekratcsngktvg SEQ ID NO: 50 1508163 A chrysosporium dasccawfdvlddiqqnlfhggqcgaeahesirlvf hdsiaispameaqgkfggggadgsimifddietafh pnigldeivklqkpfvqkhgvtpgdfiafagavalsn cpgapqmnffigrapatqpapdglvpepfhtvdqii nrvndagefdelelvwmlsahsvaavndvdptvq glpfdstpgifdsqffvetqlrgta pgsggnqgeves plpgeiriqsdhtiardyrtacewqsfvnnqsklvdd fqfiflaltqlgqdpnamtdcsdvipqskpipgnlpfs ffpagktikdveqacaetpfptlttlpspetsvqri Ligninasa: Trametes Enzima vaxpdgvntatnaaxxqlfdggecgeevhesiarhx SEQ ID NO: 51 manganeso versicolor aigvsncpgapqigvsnxpgapqlardsrtaxewq peroxidasa (EC slliexselvpxpppalsnadveqaxaetpf 1.1 1 .1.13) Lignina Phanerochaete Enzima matKqlfaaitvalsItaanaawkekratcangktv SEQ ID NO: 52 peroxidasa chrysosporium gdasccawfdvlddiqanmfhggqcgaeahesirl ORIGEN ORIGEN FUNCIÓN SECUENCIA SEQ ID NO: (GEN) (ESPECIE) attgcaatggtgagagagtgtttgatggagagctgcaa gagggacaggtgttaactgtgccacaaaactttgcggt ggctggatatcgagctcgggctgtttctcttctcgtcac actcacaatagggtggcctatgtatttagccttcaatgtc tctggtagaccctatgatagttttgcaagccactaccac ccttatgctcccatatattctaaccgtgaaagcttactag tctagtaccccaattggtaaggaaataattattttctttttt ccttttagtataaaatagttaaglgatgttaattagtatgat tataataatatagttgttataattgtgaaaaaataatttata aatatattgtttacataaacaacatagtaatgtaaaaaaa tatgacaagtgatgtgtaagacgaagaagataaaagtt gagagtaagtatattatttttaatgaatttgatcgaacatg taagatgatatactagcattaatatttgttttaatcataala gtaattctagctggtttgatgaattaaatatcaalgataaa atactatagtaaaaataagaataaataaattaaaataata tttttttatgattaatagtttattatataattaaatatctatacc attactaaatattttagtttaaaagttaataaatattttgtta gaaattccaatctgcttgtaatttatcaataaacaaaatat taaataacaagctaaagtaacaaataatatcaaactaat agaaacagtaatctaatgtaacaaaacataatctaatgc taatataacaaagcgtaaagctttcacggttagaatatat gggagcataagggtggtagtggcttgcaaaactatcat agggtctaccagagacattgaaggctaaatacatagg ccaccctattgtgagtgtgacgagaagagaaacagcc cgagctcgatatccagccaccgcaaagttttgtggcac agttaacacctgtccctcttgcagctctccatcaaacac tctctcaccattgcaattcaccacttgtaccaatgcccgt ccattcaatgcgtatattatgctgtttgcgttcaggttgta gtgtggcacgaacatagcattcttgcggagtgatccaa actgggcactgagtttgagccacgagagggctggga agtcgaggctggtagcggttgtgatgctaccagcttga gggttgaagatgtcaggtgatgaagtctggcctatgtt gtggcgaagtcccattgtgcaaatggtctcgtcaatgct ceagtctagaecegccRc ARNi de FAD2 sintético ARNi - suprime gggctgtttctcttctcgtcacactcacaatagggtggc SEQ ID NO: S7 (genbank FAD2 ctatgtatttagccttcaatgtctctggtagaccctalgat ab 188250) agttttgcaagccactaccacccttatgctcccatatatt ctaaccgtga Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (27)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una planta dicotiledónea transgénica, caracterizada porque comprende: a. una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento de semilla, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en proteína de almacenamiento de semilla endógena en comparación con aquella de una planta tipo silvestre; y b. un polinucleótido heterólogo que comprende un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura abierto que comprende una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una secuencia de señal de retención en ER, en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al promotor de proteína de almacenamiento de semilla; y en donde la semilla de la planta transgénica es capaz de producir una proteína heterologa a un nivel que es mayor que 5% del peso en seco total de la semilla.

2. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido heterólogo comprende además un dominio potenciador de traducción 5' y/o un dominio potenciador de traducción 3' .

3. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de señal de retención en ER induce la acreción de la proteína heteróloga en el lumen del ER o una vesícula derivada del ER.

. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque es un miembro de la familia de las Fabáceas, y opcionalmente del orden Fabales , y opcionalmente del- género soya.

5. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es un miembro del género Glycine.

6. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque es una soya.

7. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el promotor se deriva de inhibidor de tripsina Kunitz, lectinas de soya, alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 30k, proteína de unión a glucosa, proteína de maduración de semilla, glicinina o conglicinina .

8. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el dominio potenciador de traducción se deriva de inhibidor de tripsina Kunitz, lectina de soya, alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 30k, proteína de unión a glucosa, proteína de maduración de semilla, glicinina o conglicinina.

9. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la deficiencia de proteína de almacenamiento es de uno o más de inhibidor de tripsina unitz, lectina de soya, alérgeno de soya inmunodominante P34 o Gly m Bd 30k, proteína de unión a glucosa, proteína de maduración de semilla, glicinina o conglicinina .

10. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la semilla tiene una deficiencia de más del 75% de las proteínas de almacenamiento endógenas de la semilla.

11. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un dominio potenciador de traducción 5' y un dominio potenciador de traducción 3', en donde el promotor y los dominios potenciadores de traducción 3' y 5' se derivan de la misma proteína de almacenamiento.

12. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína heteróloga se acumula en una semilla de la planta dicotiledónea hasta un nivel que es mayor que aproximadamente 5% del peso en seco total de la semilla.

13. Una semilla caracterizada porque es de la planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1.

14. Una proteína transgénica caracterizada porque se obtiene de la semilla de conformidad con la reivindicación 13.

15. La proteína transgénica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la proteína heterologa ha sido purificada.

16. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de codificación de proteína deseada codifica para una enzima o fragmento de la misma.

17. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la enzima es una enzima celulolítica .

18. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la enzima celulolítica se deriva de una fuente fúngica, una fuente bacteriana, una fuente animal o una fuente vegetal.

19. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la enzima celulolítica es una ß-glucosidasa, una exoglucanasa I, una exoglucanasa II, una endoglucanasa, una xilanasa, una hemicelulosa, una ligninasa, una ligina peroxidasa o una manganeso peroxidasa.

20. Un producto caracterizado porque comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 14.

21. Una composición de enzima comercialmente útil, caracterizada porque comprende la proteína de conformidad con la reivindicación 14.

22. La planta dicotiledónea de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento de semilla se debe a la presencia de un ARNi, un fragmento de antisentido o de sentido de un ácido nucleico que codifica para una proteína de almacenamiento de semilla.

23. Una planta dicotiledónea caracterizada porque comprende: a. una deficiencia de una o más proteínas de almacenamiento de semilla, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en proteína de almacenamiento de semilla endógena en comparación con aquella de una planta tipo silvestre; y b. un polinucleótido heterólogo que comprende una región reguladora génica de una proteína compensadora enlazada operablemente a un marco de lectura abierto que codifica para una secuencia que comprende una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una secuencia de señal de retención en ER; en donde la semilla de la planta dicotiledónea transgénica es capaz de producir la proteína heteróloga a un nivel que es mayor que 5% del peso en seco total de la semilla .

2 . Un método para almacenar establemente una enzima antes de usar, caracterizado porque comprende: almacenar una enzima endógena en semillas de una planta dicotiledónea transgénica, en donde la enzima endógena comprende al menos aproximadamente 5% del peso en seco total de las semillas y la enzima endógena se acumula predominantemente en cuerpos de proteínas ER dentro de las semillas .

25. Un método para producir una cantidad incrementada de una proteína heteróloga en semillas de una planta dicotiledónea, caracterizado porque comprende: a. transformar establemente una célula vegetal con un polinucleótido que comprende un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura abierto que comprende una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una secuencia de señal de retención en ER, en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al 1 promotor de proteína de almacenamiento de semilla; b. obtener una línea vegetal homocigótica de la célula vegetal establemente transformada; c. introducir la línea vegetal establemente transformada en una planta que tenga una deficiencia en una o más proteínas de almacenamiento de semilla endógenas, en donde la deficiencia se traduce en una reducción de al menos 50% en la proteína de almacenamiento de semilla endógena en comparación con aquella de una planta tipo silvestre; d. cultivar semillas de la planta transgénica transgredida, las semillas de la planta transgénica transgredida produciendo una proteína heteróloga a un nivel que es mayor que 5% del peso en seco total de la semilla; y e. obtener la proteína heteróloga de las semillas de la planta transgénica transgredida.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la deficiencia en una proteína de almacenamiento de semilla se debe a la presencia de un ARNi , un fragmento de antisentido o de sentido de un ácido nucleico que codifica para una proteína de almacenamiento de semilla.

27. Un método para producir una cantidad incrementada de una proteína heteróloga en semillas de una planta dicotiledónea, caracterizado porque comprende: a. transformar establemente una célula vegetal con un polinucleótido que comprende un promotor de proteína de almacenamiento de semilla, un marco de lectura abierto que comprende una secuencia de señal ER, una secuencia de codificación de proteína deseada y una secuencia de señal de retención en ER, en donde el marco de lectura abierto está enlazado operablemente al promotor de proteína de almacenamiento de semilla, en donde el polinucleótido comprende además una secuencia de ARNi que es capaz de la subregulación de una proteína de almacenamiento de semilla endógena; b. obtener una línea vegetal homocigótica de la célula vegetal establemente transformada; c. cultivar las semillas de la línea vegetal homocigótica; y e. obtener la proteína heteróloga de las semillas de la planta dicotiledónea homocigótica.