KR20010099064A - 애기장대에서 분리된 식물의 잎맥 발달 조절 유전자awi31 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 분리된 잎맥 발달 조절 유전자AWI31및 그 단백질, 상기AWI31유전자의 센스 또는 안티센스 서열을 포함하는 재조합벡터, 및 재조합벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 잎맥 발달 조절 유전자AWI31는 식물의 잎맥 발달, 뿌리 발달, 성장 속도 및 수명 조절 활성을 가지고 있으므로, 그 유전자나 단백질을 이용하여 수명 연장을 통한 식물의 생산성 향상 및 저장 효율을 증대할 수 있으며, 식물의 수명 조절에 관련된 유전자 또는 식물 노화 억제 물질을 탐색하기 위한 생체 표지 개발에 상기 유전자들을 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 새로운 잎맥 조절 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 애기장대 (Arabidopsis thaliana)에서 분리된 잎맥 발달 조절 유전자AWI31및 그 단백질, 상기AWI31유전자의 센스 또는 안티센스 서열을 포함하는 재조합벡터, 및 재조합벡터로 형질전환된 식물체에 관한 것이다.
식물의 도관 시스템 또는 잎맥 패턴은 새싹(shoot)의 잎 및 기타 부분을 뿌리와 연결시키는 복잡하지만 질서정연한 네트워크로서, 잎 및 뿌리의 발달에 중요한 기능을 가지고 있을 뿐만 아니라, 노화 과정중에 노화가 먼저 일어나는 부분에서 나중에 노화되는 부분으로의 영양물질(nutrient)의 이동에 이러한 도관(vascular) 세포가 관여하므로 식물의 노화 억제와도 연관되어 있다. 그러나, 지금까지 도관 조직을 구성하는 체관(phloem), 물관(xylem) 세포 등의 발달은 정상이면서 잎 상에서 잎맥의 공간적인 배열만에 영향을 끼치는 돌연변이체 혹은 유전자는 거의 알려진 것이 없었다.
식물의 노화 억제는 그 자체로서의 학문적 중요성뿐만 아니라 작물의 생산성이나 수확 후 저장 효율에 있어서의 개량 가능성 때문에 산업적으로도 중요성이 높다. 이에 따라 식물 노화 현상을 밝히기 위한 유전학적, 분자 생물학적, 생리학적 및 생화학적 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히 수명 연장 돌연변이를 이용한 유전자 탐색 및 기능에 대한 연구는 노화 진행 속도에 영향을 주는 신호 전달 경로를 밝힐 뿐만 아니라 식물 생산성 향상 및 추수 전후의 과실의 저장 효율 증가와 같은 실용적 문제 해결에 중요한 실마리를 제공한다.
식물 노화에 있어서 노화에 관련된 유전자의 클로닝 및 그 유전자 기능의 탐색은 노화 과정의 연구 및 이의 조절을 위해 매우 중요한 수단이 될 수 있다. 그러나, 이러한 학문적 그리고 실용적 중요성에도 불구하고 식물 노화에 대해서는 아직도 많은 부분이 밝혀지지 않은 상태이다. 지금까지 식물의 노화에 관련된 연구들은 주로 싸이토키닌(Cytokinin)과 같은 식물 생장 호르몬에 관련된 보고가 주류를 이루고 있으며, 분자생물학적 연구가 시작된 것은 최근의 일이다.
노화를 지연시키고자 하는 분자생물학적 연구는 주로 노화과정에서 일어나는 생화학적 변화와 관련된 활성을 갖거나 신호전달 체계에 관여하는 관련 유전자의 조작에 초점이 맞춰져 있다. 토마토의 경우, 안티센스 DNA (antisense DNA)를 이용해 세포벽 분해와 관련된 유전자 발현을 막아 토마토의 연화를 방지하여 토마토의 운송성과 저장성을 증가시키는 방법이 보고된 바 있으며 (Giovannoni et al., Plant Cell 1(1):53-63, 1989), 지질 분해에 관련되는 인지질 분해효소 D (phospholipase D)를 안티센스 DNA로 발현을 저해할 경우 식물 호르몬에 의한 노화가 지연된다는 보고도 있다 (Fan et al., Plant Cell 9(12):2183-96,1997).
그러나 식물 노화를 보다 직접적으로 조절할 수 있는 방법은 노화와 함께 발현이 변화하는 유전자 분석을 통한 분자생물학적 연구와 노화관련 돌연변이를 분리, 분석하는 유전학적 연구를 통해 얻을 수 있다.
기존의 보고에 의하면 애기장대의 과일 숙성기나 꽃의 노화과정에서 에틸렌 수용체의 발현이 조절되고 (Payton S. et al., Plant Mol. Biol. 31(6):1227-1231, 1996), 잎의 노화과정에서clp유전자 발현이 조절된다 (Nakabayashi K. et al., Plant Cell Physiol. 40(5):504-514, 1999)고 알려져 있다. 최근에는 애기장대 변이형을 이용한 잎 노화 과정에 관련된 유전자 탐색(Oh S. A. et al., Plant Mol. Biol. 30(4):739-54, 1996)및 이와 관련된 3군데 유전자 자리 (Oh S. A. et al., The Plant Journal. 12(3):527-535, 1997), 노화 관련 유전자인 sen1 프로모터 활성 (Oh S. A. et al., journal of Plant Physiol. 151:339-345, 1997)등이 보고된 바 있으나, 아직까지 직접적으로 노화를 조절하는 유전자 및 역할에 관한 분자 생물학적 연구는 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 유전학적으로 장점이 많은 애기장대 중에서 식물의 수명 연장에 관계되는 유전자를 탐색하기 위해 노력하던 중, 실험실에서 새롭게 고안된 랜덤 안티센스 돌연변이유발(RAM: random antisense mutagenesis) 방법을 이용하여 1) 잎맥 패턴의 변화, 2) 뿌리 발달 저해 및 3) 느린 성장 등의 표현형을 보이는 돌연변이체(34-19 라인)을 선발하고, 그 돌연변이체의 해당 유전자인 AWI31 유전자의 발현억제가 애기장대의 수명을 크게 증가시킴을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식물의 잎맥 발달, 뿌리 발달, 성장 속도 및 수명을 조절할 수 있는 유전자 및 상기 유전자의 발현을 억제하여 식물의 수명을 연장하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 통하여 노화 진행 속도에 영향을 주는 신호전달 경로를 밝히거나 형질전환을 통해 식물 생산성 향상 및 추수 전후의 과실의 저장 효율 증가와 같은 실용적 문제를 해결하는 데 있다.
도 1은 본 발명의 돌연변이체(34-19 라인)와 야생형의 잎맥 패턴을 비교한 그림이고 [(A) 14일된 야생형의 1번 본엽, (B) 14일된 34-19 라인의 돌연변이체의 1번 본엽],
도 2은 본 발명의 돌연변이체(34-19 라인)와 야생형의 1번 본엽의 잎맥 발달 과정을 비교한 그림이고 [(A~E) 야생형, (F~J) 돌연변이체, 스케일 바: 100 μm (A, B, F 및 G), 200 μm (C 및 H), 1 mm (D 및 I) 및 2 mm (E and J)],
도 3은 본 발명의 돌연변이체(34-19 라인)와 야생형의 잎맥 구조의 조직학적 분석을 비교한 그림이고 [(A), (B) 9일된 야생형과 11일된 34-19 라인의 1번 본엽의 아랫부분을 횡단면으로 자른 것. (C), (D) 11일된 야생형과 13일된 34-19 라인의 1번 본엽의 엽병(petiole) 부분을 횡단면으로 자른 것. (E), (F) 21일된 야생형과 28일된 34-19 라인의 1~3cm길이의 어린 줄기부분을 횡단면으로 자른 것. (G, I), (H, J) 38일된 야생형과 45일된 34-19 라인의 성숙한 줄기부분을 횡단면으로 자른 것. (K), (L) 38일된 야생형과 45일된 34-19 라인의 성숙한 줄기부분을 300 μm 두께로 잘라 phloroglucinol-HCl (lignin 염색시약)로 염색한 것. 스케일 바: 100 μm (A~D, I~L), 20 (E~H)],
도 4는 RAM 방법에 이용된 벡터의 모식도와 PCR-클로닝을 통해 확인된 삽입 cDNA를 포함하는AWI31유전자의 서열을 나타낸 그림이고 [(A) pNB96 벡터의 T-DNA 부분의 모식도. (B)AWI31유전자의 염기서열 및 유추된 아미노산 서열. 삽입 cDNA 부분은 이탤릭체로 공통(consensus) 서열(TATA, TCA 모티프)는 밑줄로 표시],
도 5는 잎맥분포(venation) 표현형과AWI31유전자의 안티센스 억제(antisense suppression)와의 관계를 분석한 결과를 나타낸 그림이고 [(A) 야생형 (Ws), 34-19 라인 및 재형질전환을 통하여 선발된 두 라인(R13 및 R22)의 잎맥 복합도(complexity) 분석. 에러 바: s.d. (B) (A)에서 이용된 라인들에서의AWI31유전자 발현의 감소를 확인하기 위한 RNA 겔 블롯 분석],
도 6은AWI31유전자의 발현 패턴을 분석한 결과를 나타낸 그림이고 [(A) RNA 겔 블롯 분석 (a) 15일된 식물의 뿌리(R)와 32일된 식물의 본엽(RL), 줄기엽(CL), 줄기(S) 및 꽃(F)에서의 발현분석. (b) 손상(Wounding)을 준 이후 각 시간대에서의 발현분석, (B) pAWI31-GUS의 형질전환체 이용한 발현분석 (a) 15일된 식물의 GUS 활성, (b) 15일된 식물의 어린 뿌리에서의 GUS 활성, (c) 24일된 식물의 늙은 뿌리에서의 GUS 활성, (d) 15일된 식물의 본엽을 손상을 처리하지 않은 경우, (e, f) 15일된 식물의 본엽을 손상을 처리한 경우,(g) 15일된 식물의 어린 뿌리 정단 부분의 GUS 활성],
도 7은 본 발명의 돌연변이체(34-19 라인)와 야생형의 성장 속도 및 노화 표현형을 비교한 그림이고 [(A) 7일된 야생형과 34-19 라인, (B) 24일된 야생형과 34-19 라인, (C) 35일된 야생형과 34-19 라인, (D) 44일된 야생형과 34-19 라인],
도 8은 본 발명의 돌연변이체(34-19 라인)와 야생형의 뿌리 발달을 비교한 그림이고 [(A) 15일된 야생형의 뿌리, (B) 15일된 34-19 라인의 돌연변이체의 뿌리].
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana)로부터 분리된, 식물의 잎맥 발달, 뿌리 발달, 수명 및 노화 조절에 관여하는 유전자AWI31및 상기 유전자로부터 발현되는 AWI31 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 유전자AWI31은 서열번호 1의 염기서열을 가지고, 본 발명의 단백질 AWI31은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자AWI31의 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 서열을 포함하는 재조합벡터 및 이들 재조합벡터로 형질전환된 식물체를 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 재조합벡터는 p35S-안티센스 AWI31 (기탁번호 : KCTC 10036BP)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자AWI31, 단백질 AWI31, 이들의 절편 또는 유도체를 이용하여 식물체의 잎맥 발달, 뿌리 발달, 수명 및 노화와 관련된 유전자 또는 노화를 억제할 수 있는 물질을 탐색하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 탐색방법은 DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응, 노던 블럿 분석, 서던블럿 분석, 효소 면역 반응 (ELISA), 2-D 겔 분석을 포함하는 방법에 의해 유전자의 서열 상동성, 혼성화 반응 또는 단백질의 결합 반응을 조사하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은AWI31유전자의 발현을 억제하도록 유전공학적으로 조작하여 식물의 수명을 연장시키는 방법을 제공한다.AWI31유전자의 발현을 억제하는 방법은 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis) 또는 안티센스 억제(antisense suppression) 등과 같이 당업계에 널리 알려진 유전자의 발현억제방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 식물 수명 연장 방법은AWI31유전자의 안티센스 서열을 도입시킴으로써 유전자가 발현되지 못하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해 수명이 연장될 수 있는 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로부터 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 잎맥 발달, 뿌리 발달 및 수명 조절에 관여하는 유전자를 탐색하기 위하여 먼저 잎맥 패턴이 변화하고 수명이 연장된 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하였다. 이를 위해 식물의 유전학 및 분자생물학적 연구를 위한 재료로 많이 사용되는 애기장대를 실험 식물로 하였는데, 애기장대는 5개의 염색체내에 약 125 Mbp 정도로 크기가 작고 거의 완전히 해독된 게놈을 가지고 있으며, 이에 대해 상세한 유전학적 및 물리적 지도가 완성되어 있고, 일생이 짧은 반면 많은 씨앗을 생산하고, 경작 및 형질전환이 용이하다는 장점을 가져 식물의 유전학 모델 재료로 많이 이용된다 (http://www.arabidopsis.org).
본 발명에서는 식물에서 유전자의 대량 분리 및 기능 확인을 위한 기존 방법들의 한계를 극복하고자 랜덤 안티센스 돌연변이유발(RAM: random antisense mutagenesis)라 명명한 신기술을 이용하였다. RAM은 기본적으로 안티센스 cDNA 라이브러리를 이용하여 형질전환체 라이브러리를 만든 후 이들 형질전환체중 안티센스 cDNA 도입에 의해 특정 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하고 그로부터 간단한 PCR 방법에 의해 cDNA를 분리하는 기술이다. 이 기술의 개발을 위하여Arabidopsis로부터 얻어진 mRNA를 이용하여 합성된 cDNA를 안티센스 방향으로 식물 발현벡터에 도입한 후Agrobacterium에 도입하여Agrobacterium에 안티센스 cDNA 라이브러리를 만들었고 이를Arabidopsis에 형질 전환시켜 안티센스 라이브러리가 무작위로 도입된 독립적인 2000개의 형질전환체를 생성하였다. 이들 중 야생형에 비해 잎맥 발달이 제한되고 뿌리 발달이 저해되며 수명이 연장되는 표현형을 갖는 돌연변이체(34-19 라인)을 분리하였다.
본 발명에서, 라인 34-19의 돌연변이는 떡잎의 측 잎맥(lateral veins)과 같은 부 잎맥(minor veins) 및 본엽(rosette leavs)의 3차 잎맥에 심각한 결함을 유발하지만, 그들은 떡잎 및 로제트 잎의 중간잎맥(midveins)을 포함하는 주 잎맥(major veins)에는 해를 덜 주었다. 이상 잎맥 패턴은 잎 발달의 초기부터 관찰될 수 있었고 도관속의 폐쇄 루프 형성의 실패가 완전 성장된 떡잎과 진 잎(true leaves)에서 명백하였다(도 2). 이 관찰은 아마도 신호 결함 때문에 도관 가닥(vascular strand) 발달 안내가 명백히 결실되어 미숙한(premature) 잎맥 종료가 유발된다는 것을 제시한다. 이 표현형은 AWI31이 도관 가닥 형성의 진행을 양성적으로 조절하는 역할을 할 것이라는 것을 제시한다.
도관 패턴 형성에 대하여, 지금까지 두가지 일반적 가설이 제시되었다. 하나는 '옥신 신호 흐름 운하화 가설(auxin signal flow canalization hypothesis)'(Sachs, 1989, 1991)로서, 이것은 도관 가닥 형성에 대한 옥신의 유도 효과를 실험적으로 관찰한데 주로 기초한다. 다른 하나는 '확산-반응 프리패턴 가설(diffusion-reaction prepattern hypothesis)'(Koch and Meinhardt, 1994)로서, 이것은 확산성 물질들 사이의 상호작용을 컴퓨터 모델링한 것에 기초한다. 이들 가설중 어느 것도 도관 패턴 형성의 모든 면을 설명하지 못하며 지금까지 확증되지도 않았다(Nelson and Dengler 1997). 잎맥 패턴을 확립하기 위하여는 소스-싱크 방식(source-sink manner)으로 옥신의 극성 흐름이 필요하다는 가설에 기초하여, AWI31 유전자는 옥신-매개된 신호의 전달(transduction)이나 인식에 관여할 것으로 생각된다.
옥신-메카니즘에 관련된 것으로 보이는 라인 34-19의 또 다른 돌연변이 표현형은 측(lateral) 발달의 결함이다. 도 8에서 보여지듯이, 돌연변이 식물체의 측 뿌리의 개수 및 길이는 야생형 뿌리에 비해 현저히 감소되었다. 옥신이 측 뿌리 개시에 관여한다는 상당한 증거가 있다. 애기장대에서, 고 농도의 외생적 옥신은 거의 모든 페리사이클(pericycle) 세포를 시발(trigger)시키고(Laskowski et al. 1995), 이 표현형은 또한sur (supperroot)및rty (rooty)돌연변이체에서 관찰된다(Boerjan et al. 1995; King et al. 1995). 측 뿌리 개시에서 옥신의 주요 역할과 일치되게, 옥신-내성 돌연변이체axr1,axr4및aux1은 현저히 감소된 개수의 측 뿌리를 가진다고 보고되었다(Hobbie and Estelle 1995; Timpte 1995). 따라서, 라인 34-19의 측 뿌리 발달은 AWI31 유전자가 옥신-의존성 메카니즘에 관여될 것이라는 것을 제시한다. 돌연변이체에서 이들 새싹(shoot) 및 뿌리 표현형은 결함이 옥신 신호화에 관여된다는 것을 제시하지만, AWI31 유전자 산물이 실제로 이 프로세스에서 직접적인 역할을 하는지 옥신-의존성 경로에서 기능을 갖는지에 대하여는 아직 확인되지 않았다.
도관 발달의 이상에 더하여, 잎 발달의 결함이 라인 34-19에서 관찰되었다. 잎 팽창율이 매우 늦었으며 메소필(mesophyll) 세포수가 돌연변이체에서 감소되었다(도 3A, B). 잎 개시의 위치 및 타이밍은 돌연변이에서 정상이며, 이것은 새싹 분열조직(meristem)의 기본 프로그램이 돌연변이에 의해 영향 받지 않는다는 것을 제시한다. 늦은 성장 속도는 감소된 광합성능의 결과일 것이다. 그러나, 돌연변이의 성장 속도는 수크로스를 함유하는 성장배지상에서 회복되지 않았다. 잎 잎맥분포(venation)의 패턴 및 개체발생(ontogeny)은 잎 세포 분화 및 기능의 많은 측면을 안내하거나 제한한다고 보여진다. 광합성, 지지체(supportive), 기공(stomatal) 및 기타 특수화된 세포 유형은 도관 시스템에 대한 공간적 관계를 보이는 위치로 분화한다(Nelson 1997). 이들 관계가 잎 기능에 명백하게 중요하지만, 발달중 어떤 수단에 의해 이것이 성취되는지는 잘 이해되지 않는다. 따라서, 라인 34-19를 더욱 특성화하면 이러한 관계에 대한 정보가 제공될 수 있을 것이다.
라인 34-19의 돌연변이 표현형이 RAM 푸울에서 예상된대로 우성적 격리(segregation) 특성을 보이므로, 돌연변이 표현형을 책임지는 AWI31 cDNA의 삽입된 cDNA 단편은 PCR에 의해 쉽게 동정되었다. 비록 유추된 단백질 서열이 어떤 공지된 단백질 서열과도 상동성을 보이지 않지만, RNA 겔 블롯 분석 및 조직화학적 분석에 의해 분석된 발현 패턴은 AWI31 단백질이 도관 가닥 형성에 필수적이라는 것을 가리킨다(도 6). 그 발현은 우리가 시험한 기관의 도관 시스템에서 우선적으로 발생하엿고 잎의 손상 부위 부근에서 증가하였다. 도관이 절단되면, 근처의 유조직(parenchyma) 세포가 세포 분열을 다시 시작하여 물관(xylem) 및 체관(phloem) 둘다로 재분화되고(Steeves and Sussex 1989), 초기 도관 발달의 특이적 분자 마커인Athb-8의 발현이 손상된 줄기의 재도관화(re-vascularization)동안 초기에 검출되었다. AWI31 기능의 이해를 위해서는in situ국소화(localization)에 의해 더 자세한 mRNA 및 단백질 분석을 할 필요가 있다.
결론적으로,AWI31유전자의 안티센스 파괴에 의한 돌연변이 표현형 및 그 발현 패턴은AWI31유전자 산물이 도관 패턴의 조절에 중요한 역할을 하나 애기장대의 도관 분화에는 큰 역할을 하지 않는다는 것을 제시한다. 최근에 분리된 돌연변이cvp2및van3는 라인 34-19에서 보여진 것과 같은 부 잎맥의 형성에 특이적인 결함에 의해 특성화되었다. 입맥 패턴에 의해 특성화되는 많은 돌연변이들이 도관 분화 이상을 포함하는 표현형을 가지기 때문에, 도관 형성에 대한 해당 유전자의 역할을 평가하는 것은 어려워 보인다. 이 점에서,CAP1,VAN3및AWI31유전자의 관계는 도관 조직 패터닝에 매우 중요할 것이다. AWI31 단백질이 기능하는 분자적 메카니즘의 규명은 도관 발달의 공간적 조절에대한 중요한 정보를 제공할 것이다. AWI31의 기능 상실 대립유전자의 분리 및 특성화는 아마도 AWI31의 T-DNA 또는 트렌스포존에 의한 녹-아웃 식물들 또는 기능 획득(gain-of-function) 돌연변이들의 스크리닝에서 AWI31 단백질의 정상적 생리학적 및 발달학적 역할에 대한 이해를 높혀줄 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예1> RAM 푸울로부터 34-19 라인의 분리
본 실험에서 선택한Arabidopsis thaliana(L.) Heyn., ecotype Wassilevskija (Ws)는 장일조건의 성장 챔버 (16L/8D photoperiod, 20~22℃,100 μEinstein/m2/sec)에서 재배하였고 식물을 키우기 위한 배지로는 MS배지 (1X Murashige & Skoog salt, 0.5 g/L MES, 1X B5 vitamine, 2% sucrose, 0.8% phytoagar, pH 5.7)를 이용하였다.Arabidopsis의 형질 전환을 위하여 형질전환 하고자 하는 구조체(안티센스 cDNA가 도입된 pNB96 벡터)가 도입된Agrobacterium(AGL1 strain)을 28℃에서 3∼4 일간 배양하여 인필트레이션 배지 (1X MS salt,4.4 μM BAP, 5% sucrose, 0.005% silwet L-77)에 현탁하고, 이 현탁액에 30일 정도 키운Arabidopsis를 1~2분 정도 담가준 뒤 3∼4주 뒤에 종자를 받아 항생제(antibiotics) 에 대한 저항성을 가지는 형질전환체를 선발하였다.
식물에서 유전자의 대량 분리 및 기능 확인을 위한 기존 방법들의 한계를 극복하고자 본 실험에서는 랜덤 안티센스 돌연변이유발(RAM)이라 명명한 신기술을 확립하였다. RAM은 기본적으로 안티센스 cDNA 라이브러리를 이용하여 형질 전환체 라이브러리를 만든 후 이들 형질 전환체중 안티센스 cDNA 도입에 의해 특정 형질을 나타내는 돌연변이체를 선별하고 그로부터 간단한 PCR 방법에 의해 cDNA를 분리하는 기술이다. 이 기술의 개발을 위하여Arabidopsis로부터 얻어진 mRNA를 이용하여 합성된 cDNA를 안티센스 방향으로 식물 발현벡터인 pNB96 벡터에 도입한 후Agrobacterium에 도입하여Agrobacterium에 안티센스 cDNA 라이브러리를 만들었고 이를Arabidopsis에 형질 전환시켜 안티센스 라이브러리가 무작위로 도입된 독립적인 2000개의 형질전환체를 생성하였다. 이들 중 34-19 라인을 분리하였으며 T2 세대에서 돌연변이 형질이 RAM의 특징인 우성 격리(segregation) 패턴 (mutant : wild type=3:1)을 보였고 그 표현형은 잎에서 관찰되었는데 잎 날(leaf blade)을 따라 형성되는 잎맥의 발달이 야생형에 비해 극히 제한적으로 나타났다 (도 1).Arabidopsis잎에서 잎맥은 주 잎맥(main vein: 중심축을 형성하는 1차 잎맥과 그로부터 양옆으로 뻗어나온 2차 잎맥) 과 부 잎맥(minor vein: 주 잎맥으로부터 가지를 형성하는 3차 및 4차 잎맥)으로 나눌 수 있는데 34-19 라인에서는 부 잎맥의 이상이 두드러졌다.
<실시예 2> 34-19 라인의 Vasculature 분석
ethanol:acetic acid의 3:1 혼합물로 고정시킨 식물조직을 80%, 90%, 95%, 100% (v/v) 에탄올을 일련으로 처리하여 클로로필을 제거시킨 뒤 chloral hydrate (Wako)를 처리함 (12 시간). 처리한 조직을 슬라이드 글라스 위에 올린 뒤 현미경하에서 잎맥 패턴을 관찰하였다.
34-19 라인의 떡잎(cotyledon)에서의 venation 패턴의 변화
34-19 라인의 잎에서 관찰된 잎맥 패턴의 변화를 자세히 관찰하기 위하여 비교적 단순한 형태의 잎맥 모습을 보이는 떡잎(cotyledon)을 야생형과 34-19 라인에서 비교하였다. 야생형에서는 1차 잎맥과 2차 잎맥이 형성하는 3~4개의 그물눈틈(areole: 잎맥에 의해 형성되는 sector를 일컫는 말)이 관찰된 떡잎의 85% (133개중 43개)에서 나타난 반면 돌연변이체의 떡잎은 52% 만이 정상적인 잎맥 발달을 보였다. 반대로 돌연변이체에서는 1~2개의 그물눈틈을 형성하는 비정상적인 떡잎이 야생형e에 비해 30% 이상 높은 비율로 나타났다. 이러한 차이를 [표 1]에서 도표화하였다.
[표 1] 야생형과 34-19 라인의 떡잎에서의 잎맥 패턴 비교
라인 | 관찰한식물의 수 | 그물눈틈(areole)의 수 | |||
4 | 3 | 2 | 1 | ||
야생형 | 133 | 43 (32%) | 71 (53%) | 19 (14%) | 0 (0%) |
34-19 | 112 | 21 (19%) | 37 (33%) | 52 (46%) | 2 (1.8%) |
34-19 라인의 본엽(rosette leaf)에서의 venation 패턴의 변화
떡잎에서 관찰되는 잎맥 패턴 보다 훨씬 복잡한 구조를 가지는 본엽의 잎맥 패턴을 야생형과 34-19 라인에서 비교하였다. 야생형과 34-19 라인에서 본엽의 접점수(NBP(number of branching points): 잎맥들이 마주치는 접점의 개수)를 비교하여 [표 2]에 수치화하였다. 완전히 발달이 끝난 1, 2, 3, 4번 본엽 들을 비교하였는데 모든 잎에서 돌연변이체의 NBP가 야생형의 50% 정도로 감소해 있었다. 이러한 차이는 돌연변이체에서 3차 혹은 4차 잎맥의 수가 적고 주 잎맥으로의 혹은 상호간에 연결이 결핍된 결과이다.
[표 2] 본엽상에서의 venation complexity 개수
라인 | 각 잎마다의 접점수(NBP) | |||
본엽1 | 본엽2 | 본엽3 | 본엽4 | |
야생형 (n=12) | 67.8 (±4.1) | 74.6 (±3.0) | 167.0 (±17.1) | 211.8 (±21.0) |
34-19 (n=12) | 34.5 (±2.6) | 40.2 (±1.9) | 87.8 (±5.7) | 101.0 (±2.2) |
34-19 라인의 잎맥 발달과정
성숙한 본엽(rosette leaf)에서 관찰된 돌연변이형이 잎 발달의 어느 단계에서부터 일어나는지 알아보기 위하여 발달의 초기 단계에서부터 성숙 단계까지 1번 본엽을 야생형 34-19 라인에서 관찰하여 비교하였다. 도 2는 잎 발달의 초기부터 잎맥 패턴 형성에 이상이 생기고 부 잎맥의 발달이 극히 제한적으로 일어나는 과정을 보여준다. 야생형과 돌연변이체 모두에서 파종한지 4일째 되는 날 1번 잎의 primordia가 관찰 되었으며 야생형 식물에서는 5일째 되는 날 1차 잎맥이 발달하기 시작한 반면, 돌연변이체의 잎은 8일째 되어서야 1차 잎맥이 관찰되었다 (도 2A, F). 야생형 식물에서는 7일째 2차 잎맥이 어느 정도 팽창한 잎의 끝부분까지 자라난 1차 잎맥에서 시작하여 잎의 기저(basal) 부분으로 대칭적으로 발달하는 반면, 돌연변이체에서는 9일째 되어서야 1차 잎맥의 중간부분에서 비대칭적으로 두개 혹은 한 개의 2차 잎맥이 발달하고 2차 잎맥이 시작되는 위치나 발달의 양상이 매우불규칙적이었다 (도 2B. G). 도 2H-J에서 보여지는 바와 같이, 돌연변이체의 잎은 3차 혹은 4차 잎맥의 발달이 극히 제한된 수로 일어나며 주 잎맥과의 연결이 불완전한 표현형을 보였다. 도 2에서 돌연변이체의 잎의 발달이 야생형에 비해 3일 이상 느려지는 것을 관찰할 수 있는데, 그 작용기작은 알려져 있지 않으나 실제로 잎맥의 발달은 잎 발달에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다.
<실시예 3> 34-19 라인의 Histology 분석
시료의 잎과 줄기를 FAA solution (3.7% (v/v) formaldehyde, 5% (v/v) acetic acid, 50% (v/v) ethanol)을 이용하여 고정한 뒤 30%, 60%, 80%, 90%, 95%, 100% (v/v) 에탄올을 일련으로 처리하여 탈수(dehydration)시킨 후 파라틴에 임베딩(embedding)하였다. Microm HM 330 microtome을 이용하여 이들 시료를 10~15-m 두께로 자른 뒤 0.1% (w/v)의 toluidine blue로 염색하였다.
34-19 라인의 잎맥의 구조(anatomy)
잎 에서 관찰된 잎맥 패턴의 변화가 잎맥 구조상의 변화와 관계 있는지 알아보기 위하여 잎 과 엽병(petiole) 그리고 줄기의 구조를 단면 절단(sectioning)을 통하여 관찰하였다. 도 3에서 보여지듯이, 34-19 라인은 줄기나 잎의 개별적인 잎맥 구조에는 거의 영향을 주지 않으면서 잎맥 패턴만 문제가 있음을 확인 할 수 있다. 도 3A 및 B는 야생형과 돌연변이체의 어린 잎의 아랫부분을 절단한 것으로 돌연변이체 잎의 도관속(vascular bundle) 내의 물관(xylem) 과 체관(phloem) 그리고 나머지를 구성하는 세포들의 배열에는 이상이 없음을 보여준다. 엽병(petiole)의 section에서도 역시 잎의 뒷면과 앞면을 각각 향하는 물관과 체관의 배열에 이상이없었다 (도 3C, D). 줄기는 새싹(shoot)과 뿌리를 연결하는 기관으로 도관 조직이 잘 발달되어 있기 때문에 그 구조를 관찰하기에 용이하고 돌연변이체의 경우 줄기가 가늘어지고 매우 약한 표현형을 보였기 때문에 단면 절단하여 관찰하였다. 줄기의 경우 잎의 잎맥과 마찬가지로 잎맥의 구조에는 변화가 거의 나타나지 않았으며 (도 3E-H), 다만 도관속의 숫자가 야생형에서는 6~8개인 반면 돌연변이체에서는 4~6개로 감소한 표현형을 보였다 (도 3I-L). 이는 어린 줄기와 성숙한 줄기 모두에서 관찰되었으며 잎에서 보여지는 표현형과 유사성을 가진다. 도 3K 및 L의 phloroglucinol-HCl 염색에서 보여지는 바와 같이 2차 물관(xylem)의 발달도 돌연면이와 야생형에서 유사하게 나타났다. 또한 잎에서와 같이 줄기의 발달이 돌연변이체에서 매우 느려지는데 이는 도관속(vascular bundle) 수의 감소와 관련이 있는 것으로 여겨진다.
<실시예 4>
AWI31
유전자의 PCR 클로닝
100 ng의 genomic DNA, 200 ng의 P1 프라이머(5' TTCGCAAGACCCTTCCTCTA 3') 및 P4 프라이머(5' CTTATCTGGGAACTACTC 3') 와 ExTaq 효소 (Takara)이 포함된 50 μl 혼합물을 이용하여 94℃에서 30 초, 52℃에서 30 초, 68℃에서 1 분의 조건으로 35 사이클 PCR을 수행하였다. 그 PCR 산물을 가지고 안쪽의 프라이머 세트인 P2 프라이머(5' GGAAGTTCATTTCATTTGGAG 3') 및 P3 프라이머(5' TGTAGAGAGAGACTGGTGATT 3')를 이용하여 nested PCR을 수행하여 최종PCR 산물을 얻었다. 이 PCR 산물은 Not I 및 Eco RI을 처리한 뒤 pBluescript II SK(+) 벡터와 pNB96 벡터에 각각 클로닝하여 서열 분석과 식물 형질전환에 이용하였다.
RAM 법의 장점 중 하나는 PCR을 통하여 표현형과 관련된 유전자의 분리가 용이하다는 점이다. 34-19 라인에서 유전자를 분리하기 위하여 pNB96 벡터의 T-DNA 영역 안의 삽입 cDNA 클로닝 부위 주변의 서열을 프라이머(primer)로 하여 PCR을 수행하였다 (도 4a). 이로부터 분리된 0.7 kb cDNA를 pNB96에 다시 안티센스 방향으로 클로닝하여 재조합벡터 p35S-antisense AWI31을 만들었으며, 이 재조합벡터로 형질전환된 대장균을 2001년 8월 16일자로 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다 (기탁번호: KCTC 10036BP). 상기 재조합벡터를 야생형(Ws) 식물체에 도입하여 재형질전환(retransformation)한 결과 34-19 라인에서 보여지는 돌연변이 표현형과 동일한 표현형을 54개의 형질전환체중 5개 라인에서 확인하였다. 따라서 34-19 라인의 표현형은 분리된 0.7kb 삽입 cDNA에 의한 것임을 확인하였다.
이 0.7kb 삽입 cDNA의 유전자 서열을 분석하고 NCBI의 BLAST를 이용하여 확인한 결과AWI31클론(수탁번호 X99793)과 일치하였으므로 본 발명의 유전자를AWI31유전자로 명명하고 그 서열을 서열번호1로 기재하였다. AWI31 서열은 손상-유도성(wound-inducible) 유전자로 보고된 바 있으나 그 기능에 대한 연구는 아직 되어있지 않다. AWI31은Arabidopis게놈 상에서 한 사본으로 존재하며 388 아미노산을 암호화하므로 본 발명의 단백질을 AWI31단백질로 명명하고 그 서열을 서열번호2로 기재하였다.AWI31의 펩티드 서열을 이용하여 다시 데이터베이스 검색을 한 결과Arabidopsisgenome database (AB020755, 31.6% identity)와Saccharomycoes pombe의 hypothetical protein (AL031825, 24.1% identity)이 유사성을 가지는 것으로 나타났으나 이들 단백질에 대한 분자적 생화학적 기능은 알려진바 없고 기능이 알려진 어떤 단백질과도 매치되지 않았다. 도 5A 및 B에서 확인할 수 있듯이 표현형의 정도와 RNA 겔 블롯 분석을 통하여 확인한 내생적(endogenous)으로 발현되는AWI31유전자의 발현의 감소가 일치하여 34-19 라인의 표현형은AWI31유전자의 안티센스 억제(antisense suppression)에 의한 것임을 확인하였다.
<실시예 5>
AWI31
유전자의 발현분석
AWI31 유전자의 기능을 간접적으로 알아보기 위하여 RNA 겔 블롯 분석과 리포터 시스템을 이용하여 발현 패턴을 분석하였다.
RNA 겔 블롯 분석
안티센스 cDNA에 의해 형질이 변환된 개체를 선발하여 이들로부터 총(total) RNA를 추출한 뒤 다음과 같은 방법으로 노던(Northern) 분석을 하였다. 65℃에서 가열하여 변성(denaturation)시킨 총 RNA 10 μg을 1.5% 포름알데히드 겔에서 전기영동한 뒤 나일론 막으로의 블롯팅하고 32P로 표지된 프로브(probe)와 함께 막을 인큐베이션하여 혼성화(hybridization)시켰다 (16시간).
도 6A에서와 같이 기관별로 총 RNA를 분리하여 실시한 노던 분석의 결과 뿌리와 줄기에서 그 발현이 가장 높았으며 손상(wounding)을 처리한 경우 3~12 시간 사이에 발현이 현저히 증가하였다. 이는 기존에 보고된 바와 동일한 결과이다(Yang et al., 1997).
GUS 활성 분석
AWI31과 매치되는Arabidopsis의 게놈 서열중AWI31유전자의 프로모터 영역을 포함하는 50번째 아미노산의 앞쪽으로 약 1.0 kb 서열를 PCR을 통하여 분리하고 pCAMBIA1304 벡터의 glucuronidase (GUS) 유전자의 ATG 서열 앞에 융합(fusion)하여 pAWI31-GUS 구조체를 만들었다. 이 구조체를 야생형 (Ws) 식물체에 형질전환하고 히그로마이신(hygromycin) 시험을 통하여 트랜스제닉(transgenic) 식물을 골라낸 뒤 GUS 활성을 조사하였다. GUS 활성의 관찰은 다음의 방법을 이용하였다. GUS 염색 용액 (1 mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌일 글로쿠로나이드 [X-gluc] in 100 mM 소디움 포스페이트 버퍼 [pH 7.0], 10 mM EDTA, 0.5 mM 포타슘 페로시아나이드, 0.5mM 포타슘 페리시아나이드 및 0.1% Nonidet-P40)에 관찰하고자 하는 식물체를 담그고 37℃에서 5 ~16 시간 동안 인큐베이션 한 뒤 70% 에탄올을 이용하여 클로로필을 제거하고 관찰하였다.
도 6B(a), (d)에서 보는 바와 같이AWI31유전자의 프로모터 활성을 간접적으로 나타내는 GUS 발현은 잎과 엽병(petiole)의 잎맥에서 강하게 나타났으며 뿌리의 경우 도관속 발달이 일어나는 분열조직(meristem)의 바로 윗부분 신장 존(elongation zone)의 잎맥 부분에서 가장 강하게 관찰되었다 (도 6B(b), (g)). 도 6B(c)에서 보여지듯이 늙은 뿌리에서는 GUS 활성이 거의 관찰되지 않았으며 이는AWI31유전자의 발현이 활발한 도관 조직의 발달과 관련이 있음을 나타낸다. 상처를 준 잎에서는 GUS 활성이 상처주변에서 나타났으며 (도 6b(e), (f)), 실제로 상처를 받은 식물조직의 주변에서 새로운 잎맥이 발달하는 것이 알려져 있다. 이러한 발현 분석을 종합해보면AWI31단백질은 도관 발달에 중요한 기능을 할 것으로 추측되어진다. 즉, AWI31의 프로모터와 GUS 유전자를 융합시킨 구조체를 이용하여 조사한 결과 잎, 뿌리의 도관속에서 발현이 강하게 나타나 표현형상의 결함과 일치하는 결과를 보였다.
<실시예 6> 34-19 라인의 성장 및 노화 분석
시간대별로 34-19 라인과 야생형의 성장 속도 및 노화 표현형을 비교한 결과, 실제로 34-19 라인에서 잎의 발달이 상당히 느려지며 완전 성장 이후, 노화의 속도도 약간 늦어져 전체적인 수명은 야생형과 비교하였을 때 많이 길어지는 것을 관찰 할 수 있었다 (도 7). 잎의 발달과 잎맥 발달의 관계는 밀접한 관련이 있음이 알려져 있으나 그 상호조절 기작에 대한 보고는 없다. 한편 노화 과정중에 노화가 먼저 일어나는 부분에서 나중에 노화되는 부분으로의 영양물질의 이동에 이러한 도관 세포가 관여하므로 노화지연 표현형과 잎맥 발달의 결함을 연관지어 설명할 수도 있을 것이다.
본 발명의 신규 잎맥 발달, 뿌리 발달, 노화 및 수명 조절 유전자AWI31및 상기 유전자로부터 발현되는 AWI31 단백질은 식물의 노화 기작 연구, 노화 관련 유전자 또는 노화 억제 물질의 탐색 등에 유용하게 쓰일 수 있다. 또한 상기 유전자AWI31의 발현이 억제된 변이형 유전자로 식물체를 형질전환시키거나 식물체의AWI31유전자 자체를 발현이 억제되도록 변이시킴으로써 식물의 수명을 연장시켜 생산성 향상 및 저장 효율 증대 등을 이룰 수 있다.
Claims (13)
- 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 잎맥 발달, 뿌리 발달, 수명 및 노화 조절 단백질 AWI31.
- 제 1항에 있어서, 상기 단백질은 애기장대 (Arabidopsis thali1ana)로부터 분리한 것을 특징으로 하는 단백질 AWI31.
- 제 1항의 AWI31 단백질을 암호화하는 유전자.
- 제 3항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는AWI31유전자.
- 제 3항의 유전자의 센스 또는 안티센스 서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제 5항에 있어서, 안티센스 서열을 포함하는 p35S-안티센스 AWI31 (기탁번호 : KCTC 10036BP)
- 제 5항의 재조합 벡터로 형질전환된 식물체
- AWI31유전자, AWI31 단백질, 이들의 절편 또는 유도체를 이용하여 식물의 잎맥 발달, 뿌리 발달, 수명 또는 노화 조절 유전자 또는 단백질을 탐색하는 방법.
- 제 8항에 있어서, DNA 칩, 단백질 칩, 중합효소 연쇄반응, 노던 블럿 분석, 서던 블럿 분석, 효소 면역 반응 (ELISA), 2-D 겔 분석을 포함하는 방법에 의해 유전자의 서열 상동성, 혼성화 반응 또는 단백질의 결합 반응을 조사하는 것을 특징으로 하는 방법.
- AWI31유전자의 발현을 억제하도록 유전공학적으로 조작하여 식물의 수명을 연장시키는 방법.
- 제 10항에 있어서, 삽입 돌연변이(insertional mutagenesis) 또는 안티센스 억제(antisense suppression)에 의해AWI31유전자의 발현을 억제하도록 조작된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 11항에 있어서,AWI31유전자의 안티센스 서열을 식물 발현벡터에 도입한 후 이를 식물체에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제 9항에 있어서, 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 수수를 포함하는 식량작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩, 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 바나나를포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합, 튤립을 포함하는 화훼류; 또는 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐, 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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---|---|---|---|
KR1020010050747A KR20010099064A (ko) | 2001-08-22 | 2001-08-22 | 애기장대에서 분리된 식물의 잎맥 발달 조절 유전자awi31 |
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