KR102612108B1 - 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 벼 유래 OsERF 유전자 및 이의 용도 - Google Patents
고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 벼 유래 OsERF 유전자 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 식물의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 OsERF 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이의 용도에 관한 것으로, OsERF 유전자 과발현 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 고온에서 종자의 발아생존율을 증진시키며, 유묘기의 잎의 손상이 억제되어 고온 스트레스 내성이 증진되며, 물 사용량이 낮아져 건조 스트레스에 대한 내성 역시 증진되어 고온 및 건조 스트레스에 대한 내성이 증진된 식물 품종 개발에 유용하다.
Description
본 발명은 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 활용한 고온 또는 건조스트레스 내성이 증진된 식물체의 제조방법 등에 관한 것이다.
고온 또는 건조 스트레스는 종자 발달 및 성장을 저해하는 주요 환경 스트레스 중 하나로서 곡물류 종자의 발달과정 저해로 인한 종자의 품질저하 및 양적 감소를 초래하여 곡물류 종자 생산성을 저하시킬 수 있는 주요 환경 스트레스 중 하나이다.
지구온난화로 인한 고온 스트레스는 식물의 발달, 생장, 궁극적으로는 수확량 등 모든 면에서 불리한 영향을 미침으로 전 세계적으로 많은 지역에서 농업적으로 큰 문제가 되고 있어, 이로 인한 경제적 손실을 야기하고 있다. 특히 최근 전 세계적으로 점차 심해지는 지구온난화로 인한 온도상승은 열대 및 아열대에서의 작물의 수확량에 심각한 영향을 미칠 것으로 예상되며, 주요한 식량작물인 벼의 경우 평균온도가 1℃ 상승하면 벼 수확량이 약 10%까지 감소할 수 있다고 보고된 바 있다.
벼의 경우, 특히 개화기 (개약과 수정)와 소포자 형성기 단계에 온도에 가장 민감하며, 현재까지 많은 연구결과들로 볼 때, 벼 이삭이 가장 고온에 민감한 시기는 개화 직전과 직후인 것으로 추정된다. 특히 이시기에 38℃에 한 시간만 노출되어도 불임이 급격히 증가되며, 41℃에 4시간만 노출되어도 식물체가 비가역적인 손상을 입게 되어 완전히 불임이 되는 것으로 보고된 바 있다.
주곡 작물인 벼의 경우 동아시아의 가뭄과 홍수에 의한 경제적 손실이 매우 심각하여, 가뭄에 의한 세계 벼 수확량 감소가 연간 1800만 톤, 동인도에서만 연간 2.5억불의 경제적 손실이 유발한 것으로 보고된바 있다. 이런 경제적 손실은 앞으로 더욱 심화될 것으로 예견되며, 생명공학 기술의 도입이 내재해성 벼 품종 개발에 대한 요구되고 있다.
본 발명의 하나의 목적은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 포함하는, 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성 증진용 형질전환 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 식물체, 고온 또는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법 등을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 포함하는, 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성 증진용 형질전환 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 OsERF 유전자는 서열번호2로 표시될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고온 또는 건조 스트레스 내성이 증진된 식물체를 제공한다.
본 발명에서 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류;로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 OsERF 유전자는 서열번호2로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 ERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 고온 또는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 OsERF 유전자는 서열번호2로 표시될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 벼 유래의 OsERF 유전자가 형질전환된 식물체는 야생형 식물체에 비해 고온 스트레스 조건에서 종자의 발아생존율이 증진되었으며, 유묘기의 잎의 손상이 억제되어 고온 스트레스 내성이 증진되며, 또한 물 사용량이 낮아져 건조 스트레스에 대한 내성 역시 증진됨을 확인하였는바, 고온 및 건조 환경 하에서도 피해가 경감된 식물체 개발 및 작물의 생산성 증대에 효과적이며, 환경 스트레스 내성 작물 개발 플랫폼 구축에도 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 등숙기 종자에서 고온스트레스에 의한 OsERF 전사인자의 발현 변화를 qRT-PCR 분석한 결과이다.
도 2는 OsERF(Os08g0521600)와 합성 유전자 OsERF(이하에서는 OsERFM으로 표기)의 염기서열을 비교한 것이다.
도 3은 벼 원형질체에서 OsERFM-GFP 단백질의 형광 사진이다. (화살표는 핵의 위치)
도 4는 OsERFM 과발현 재조합 벡터(pGA2897-OsERFM-3xHA)의 모식도이다.
도 5는 OsERFM 과발현 형질전환 벼의 웨스턴 블랏 분석결과이다. DJ, 동진벼 (대조구); OE1, OE2, OE3, OE4 (OsERFM 과발현 형질전환 벼)
도 6은 DroughtSpotter를 이용한 OsERFM 과발현 형질전환와 동진 벼의 물 이용 형질 분석결과이다. (A) 3가지 온도 조건의 DroughtSpotter None mode에서 실시간 물 손실율 (water loss rate) 평균 곡선, (B) 3가지 온도 조건의 DroughtSpotter Dynamic mode에서 실시간 물 투입 빈도 (왼쪽) 및 각 온도 구간에서 총 물 사용량 비교 (오른쪽) *** (p<0.001), ** (p<0.01), * (p<0.05): T.Test 분석 결과 표시
도 7A는 3가지 온도 조건에서 열화상 이미지와 FLIR 1.2 SP2 프로그램으로 분석한 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 잎의 온도이다. 도 7B는 은 42℃의 고온 및 건조 스트레스 조건에서 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 열화상 이미지(왼쪽) 및 FLIR 1.2 SP2 프로그램으로 분석한 잎의 온도(오른쪽)이다 (BK, 배경온도; WT, 대조구 동진벼; OsERFM-OE1, OsERFM 형질전환벼).
도 8은 고온 처리에 의한 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 종자발아율을 비교한 결과이다. ** (p<0.01 T.Test)
도 9는 고온처리에 의한 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 유묘기 잎 손상율을 비교한 결과이다. ** (p<0.01 T.Test)
도 2는 OsERF(Os08g0521600)와 합성 유전자 OsERF(이하에서는 OsERFM으로 표기)의 염기서열을 비교한 것이다.
도 3은 벼 원형질체에서 OsERFM-GFP 단백질의 형광 사진이다. (화살표는 핵의 위치)
도 4는 OsERFM 과발현 재조합 벡터(pGA2897-OsERFM-3xHA)의 모식도이다.
도 5는 OsERFM 과발현 형질전환 벼의 웨스턴 블랏 분석결과이다. DJ, 동진벼 (대조구); OE1, OE2, OE3, OE4 (OsERFM 과발현 형질전환 벼)
도 6은 DroughtSpotter를 이용한 OsERFM 과발현 형질전환와 동진 벼의 물 이용 형질 분석결과이다. (A) 3가지 온도 조건의 DroughtSpotter None mode에서 실시간 물 손실율 (water loss rate) 평균 곡선, (B) 3가지 온도 조건의 DroughtSpotter Dynamic mode에서 실시간 물 투입 빈도 (왼쪽) 및 각 온도 구간에서 총 물 사용량 비교 (오른쪽) *** (p<0.001), ** (p<0.01), * (p<0.05): T.Test 분석 결과 표시
도 7A는 3가지 온도 조건에서 열화상 이미지와 FLIR 1.2 SP2 프로그램으로 분석한 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 잎의 온도이다. 도 7B는 은 42℃의 고온 및 건조 스트레스 조건에서 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 열화상 이미지(왼쪽) 및 FLIR 1.2 SP2 프로그램으로 분석한 잎의 온도(오른쪽)이다 (BK, 배경온도; WT, 대조구 동진벼; OsERFM-OE1, OsERFM 형질전환벼).
도 8은 고온 처리에 의한 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 종자발아율을 비교한 결과이다. ** (p<0.01 T.Test)
도 9는 고온처리에 의한 OsERFM 형질전환벼와 동진벼의 유묘기 잎 손상율을 비교한 결과이다. ** (p<0.01 T.Test)
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 지구온난화 및 이상기후로 고온 및 가뭄 환경에서도 적응할 수 있는 종자 또는 작물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 고온 또는 건조 스트레스에 관여하는 OsERF 유전자를 발굴하였으며, 합성 유전자 OsERF(이하에서는 OsERFM으로 표기)를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시킨 식물체를 제조하고, 상기 형질전환된 식물체 또는 이로부터 수득한 종자의 고온 또는 건조 스트레스에 대한 내성이 야생형 식물체 또는 종자와 비교하여 증진되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 일 관점에서, 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 ERF 유전자를 포함하는, 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성 증진용 형질전환 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 “고온 스트레스”는 온도가 높은 환경조건으로 인해 종자의 발달과정 저해로 인한 종자의 품질저하 및 양적 감소를 초래하여 곡물류 종자 생산성을 저하시킬 수 있는 주요 환경 스트레스의 일종이다.
식물의 적정 생육 온도는 식물의 종류 및 이의 발달 단계에 따라 상이하다. 또한 각 식물 종자 보관 적정 온도 역시 식물 종류에 따라 상이하다. 따라서 본 발명에서 고온 스트레스는 식물체의 종류 및 발달 단계에 따라 상이할 수 있다.
본 발명에서 고온 스트레스는 적정 생육 온도 또는 적정 종자 보관 온도의 최대 범위와 비교하여 높은 온도, 구체적으로 +1℃ 이상 높은 고온 환경에 노출되어 식물의 생육 또는 종자의 품질을 저하시키는 것을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예에서 벼에서 38℃, 42℃의 고온 스트레스를 처리하였으며, 종자에 50℃에서 10시간 동안의 고온 처리를 수행하였고, 발아 후 7일된 유묘 20개체를 37℃ 인큐베이터에서 8일간 처리하였다.
벼의 정상 생육온도는 27℃ 내지 32℃로 알려져 있다(J. Food Agric. Environ. 12, 741~746). 따라서 본 발명에서 고온 스트레스는 구체적으로 33℃ 이상의 온도에 벼, 식물체, 또는 종자를 노출시키는 것을 의미할 수 있고, 더욱 구체적으로 본 발명의 실시예에 따라 37℃ 이상의 온도에 벼, 식물체, 또는 종자를 노출시키는 것을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 고온 스트레스 내성 증진은 종자의 발아 생존율의 개선, 잎의 고온 피해를 감소시키거나 또는 식물체의 수분함량을 높게 유지시키는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "건조 스트레스"는 건조 또는 가뭄 환경, 즉 물 부족으로 인한 비 생물학적 스트레스를 의미하며 작물 수확량을 감소시키는 대표적인 스트레스에 해당한다.
본 발명에서 건조 스트레스 내성 증진은 야생형과 비교하여 식물체의 물의 사용량을 줄여 건조(가뭄) 환경에서 식물의 생육 또는 생장을 유지하는 것일 수 있다.
본 발명에서 OsERF(Ethylene Responsive Factor) 유전자는 서열번호1로 표시되는 아미노산 서열의 단백질을 코딩하는 유전자이다.
본 발명에서 상기 OsERF 유전자는 벼 유래 Os08g0521600 유전자로 구체적으로, 서열번호2의 염기서열로 표시되는 유전자일 수 있다.
상기 서열번호2의 유전자는 벼에서 사용가능한 코돈을 활용하여 코돈이 변경된 OsERFM일 수 있다.
상기 OsERF 유전자는 벼(Oryza sativa) 유래로, 구체적으로 동진벼 유래일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 OsERF 유전자는 서열번호2의 염기서열에 한정되지 않으며, 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈, 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 염기서열을 포함한다. 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 염기서열은 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 구체적으로는 70%의 상동성, 보다 더 구체적으로는 80%의 상동성, 가장 구체적으로는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 동진벼의 등숙기 종자(34 DAH)를 42℃ 고온에서 3일간 전처리한 후 마이크로어레이(Microarray) 분석을 수행하여 고온에 의해 유전자 발현이 3배 이상 증가하는 OsERF 전사인자 유전자(Os08g0521600)를 선별하였으며, 고온 처리한 종자에서 OsERF 유전자의 발현이 높다는 것을 확인하였다.
또한, Os08g0521600 유전자가 서열번호1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 코딩함을 확인하였다. Os08g0521600가 인코딩하는 아미노산 서열에 맞추어 벼에서 사용가능한 코돈을 활용하여 코동이 변경된 서열번호 2의 합성 DNA(OsERFM)를 제조하였고, 이의 아미노산 서열이 OsERF 전사인자 단백질(서열번호1)과 100% 동일함을 확인하였다.
또한, OsERF 유전자의 고온 또는 건조 스트레스 내성 증진 효과를 확인하고자, 옥수수 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터에 의해 조절되는 식물발현 벡터를 이용하여 OsERFM의 과발현 재조합 벡터(pGA2897-OsERFM-3xHA)를 제조하였다. 제조된 pGA2897-OsERFM-3xHA 벡터를 벼에 형질도입하여 OsERFM 과발현 형질전환 벼를 제조하였다.
OsERFM 과발현 형질전환 벼에서 고온건조 복합 스트레스 조건에서 물 이용 효율을 비교하기 위해 30℃, 38℃, 42℃에서 각각 건조 스트레스(가뭄) 처리를 수행하여 물 손실율(water loss rate)을 비교 분석한 결과, 건조 스트레스 처리 후 1일째 물 손실율이 최고치에 달하는 정오를 기준으로 대조구(동진벼)와 비교하여 30℃, 38℃ 조건에서 OsERFM 과발현 형질전환 벼에서 토양의 수분 사용량이 25% 이상 낮음을 확인하였다. 또한, 토양의 무게가 시작점에서 일정량(7%) 감소하면 처음 무게를 유지하도록 물을 공급해주는 실험 조건(Dynamic Mode)에서 물 사용량을 비교한 결과 역시 OsERFM 유전자 과발현 형질전환벼가 대조구에 비해 수분공급량과 공급횟수가 약 25% 이상 낮은 것을 확인하였다.
즉, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 대조구에 비해 물 사용량이 적어 건조 스트레스에 대한 내성이 증진됨을 확인하였다.
또한, 열화상 이미지 분석을 통해 동진 벼의 잎의 온도를 측정한 결과, 건조 스트레스 없이 물이 충분한 조건에서는 42℃ 고온조건에서도 평균 잎의 온도를 35℃ 이하로 유지하지만, 건조 스트레스를 받으면 잎의 온도가 상승하였다. 또한 42℃ 고온에서 물이 충분한 조건에서 OsERFM 과발현 형질전환 벼와 대조구인 동진벼의 잎의 온도는 뚜렷한 차이가 없었으나, 건조 스트레스를 주면 OsERFM 과발현 형질전환 벼가 대조구인 동진벼에 비해 잎의 온도가 2 내지 3℃ 더 낮게 유지되는 특성을 보였으며, 건조 스트레스 처리 후 물을 제공하였을 때 대조구보다 더 빠르게 회복되는 것을 확인하였다.
즉, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 고온 건조 조건에서 식물체의 수분함량을 높게 유지하여 잎의 온도를 대조군보다 낮춰 고온 및 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시킴을 확인하였다.
또한 고온처리 없이 28℃에서 종자발아를 진행한 경우 형질전환체와 대조구 모두 종자 발아율이 90% 이상으로 차이가 없었다. 반면, 50℃에서 10시간 동안 처리한 경우 대조구인 동진벼의 발아생존률이 1.3%인데 비해 OsERFM 과발현 형질전환체는 발아생존율이 10.4%로 뚜렷이 증가하였으며, 37℃에서 8일간 처리한 유묘의 경우, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 대조구인 동진벼에 비해 잎의 손상율이 낮음을 확인하였다.
즉, 고온 스트레스에서 OsERFM 과발현이 종자의 발아생존율을 개선하고, 유묘의 잎의 고온 피해를 경감시켜 고온 내성이 증진시킴을 확인하였다.
따라서 본 발명의 OsERF 유전자는 식물체에서 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 용어 “재조합”은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호화된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
본 발명에서 "형질전환 재조합 벡터"란 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물로, 플라스미드 벡터, 코스미드 벡터, 박테리오파지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함한 통상의 모든 벡터를 포함한다.
본 발명의 "형질전환 재조합 벡터"는 상기 OsERF 유전자가 발현될 수 있도록, 발현조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 예를 들어, 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 벡터는 선택성 마커를 포함할 수 있으며, 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 본 발명의 벡터는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명의 일실시예에서는, pGA2897-3XHA 계열 벡터의 옥수수 유비퀴틴(maize ubiquitin) 프로모터의 하류에 OsERFM을 연결하고, OsERFM 단백질의 C 말단에 HA 항원결정기(epitope)를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 형질전환 벡터 (pGA2897-OsERFM-3xHA)를 제작하였다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터는 형질전환 재조합 벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 상기 재조합 벡터는 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 재조합 벡터일 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 고온 또는 건조 스트레스 내성이 증진된 식물체에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은, 유전물질인 DNA를 다른 계통의 살아 있는 세포에 주입했을 때, DNA가 그 세포에 들어가 유전형질을 변화시키는 현상으로, 형질변환, 형전환, 또는 형변환이라고도 한다.
본 발명에서 상기 벡터로 식물체를 "형질전환"하는 것은 당업자에게 공지된 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로는, 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법, 미세사출법(microprojectile bombardment), 일렉트로포레이션 (electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method) 또는 아그로박테리아 분사법 (Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있으며, 보다 구체적으로는 아그로박테리움을 이용한 형질전환방법 또는 아그로박테리아 분사법(Agrobacterium spraying method)을 이용할 수 있다.
본 발명에서 용어 "식물체"는, 성숙한 식물체뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 수 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에서 상기 식물체는 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 또는 수수를 포함하는 식량 작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 또는 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 또는 유채를 포함하는 특용 작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 또는 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 또는 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 또는 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료 작물류로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이며, 구체적으로는 식량 작물류이며, 바람직하게는 벼 (Oryza sativa)이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 형질전환된 식물체는 OsERF 유전자 또는 이의 단백질을 발현하므로, 상기 OsERF 유전자 또는 OsERF 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 도입함으로써 식물체에 존재하는 OsERF 단백질의 발현을 증진시킬 수 있다.
본 발명의 전술한 실시예에서 OsERFM이 과발현된 식물체가 대조군과 비교하여 벼의 유묘기에서 고온 스트레스 내성을 증진시킴 확인하였으며, 식물체의 물 사용율을 감소시켜 건조 스트레스 내성을 증진시킴을 확인하였는바, 본 발명의 형질전환된 식물체는 고온 또는 건조 스트레스 내성 유전자인 OsERF 유전자 또는 OsERF 단백질의 세포 내 발현 수준을 증가시켜, 벼의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시킬 수 있음을 확인하였다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 포함하는 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성 증진용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 유효성분으로 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 식물에 형질전환함으로써 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 OsERF 유전자는 서열번호2로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 식물체에 형질전환 시키는 단계를 포함하는 고온 또는 건조 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 OsERF 유전자는 서열번호2로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 고온 또는 건조 스트레스 내성을 가지는 OsERF 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고, 이를 식물체에 형질전환시켜, 고온 스트레스 내성이 증진된 형질전환 식물체의 제조가 가능하다.
상기 식물체를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물체로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다 (Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호1로 표시되는 단백질을 코딩하는 OsERF 유전자를 식물체에 도입하는 단계를 포함하는, 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "유전자를 식물체에 도입하는 단계"는 특정 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제작하고, 그 재조합 벡터를 식물체에 형질전환시키는 단계를 의미한다.
본 발명에 의하면, 상기 OsERF 유전자의 발현이 증진되는 경우, 식물체의 고온 스트레스 내성이 증진되므로, 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키기 위하여, 전술한 바와 같이 OsERF 유전자의 발현을 증진하는 형질전환용 벡터를 이용하여, 식물체를 형질전환하거나 또는 다른 인위적인 물질의 처리에 의해 상기 유전자의 발현을 증진시켜 식물체의 고온 또는 건조 스트레스 내성을 증진시키는 것도 가능하며, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<실시예1> 종자에서 고온 스트레스에 의해 유도되는 유전자 선발
동진벼의 등숙기 종자(34 DAH)를 42℃ 고온에서 3일간 전처리한 후 마이크로어레이(Microarray) 분석을 수행하여 고온에 의해 유전자 발현이 3배 이상 증가하는 OsERF 전사인자 유전자(Os08g0521600)를 선발한 후, qRT-PCR 분석을 통해 30℃ 조건(대조군)과 비교하여 42℃에서 고온 처리한 종자에서 OsERF 유전자의 발현이 높다는 것을 확인하였다(도 1).
<실시예2> 합성 유전자 OsERF(이하에서는 OsERFM으로 표기) 합성 및 식물 발현 벡터의 제조
Os08g0521600가 인코딩하는 아미노산 서열(서열번호1)에 맞추어, 벼에서 사용가능한 코돈을 활용하여 코돈이 변경된 OsERFM을 제작하였다(서열번호2). OsERFM의 염기서열은 OsERF(Os08g0521600)과 79.8% 상동성을 보이지만(도 2), 아미노산 서열은 100% 동일하였다.
| 이름 | 아미노산 서열 또는 염기서열 |
| OsERF (Os08g0521600) 단백질 아미노산 서열 (서열번호1) |
MVPPAAHAPKNLGLRGVRRRLWGRWAAEIRVPRGHRAAARLWIGTFPSPAAAALAYDAALYCFHGGAPPGNRAFNFPHAPRLRIDDRRRHALTPGHVRAIAERYAHDVGSVLFRPLPPPPPPVAAAAVPVFAAPAPPMAPAPANHAADPYYCNEPDTTTDEDVMAAADRLLSMDIEEVAALIAIVQQGE |
| OsERFM 염기서열 (서열번호2) |
ATGGTTCCGCCCGCCGCGCACGCGCCTAAGAATCTGGGTTTGCGGGGCGTCCGAAGGAGACTCTGGGGGCGTTGGGCAGCGGAGATCCGCGTGCCTCGGGGCCATCGCGCGGCCGCACGACTGTGGATTGGGACATTCCCATCTCCAGCTGCGGCAGCACTAGCCTATGACGCTGCACTCTACTGCTTCCACGGAGGAGCCCCGCCGGGGAACCGCGCGTTCAACTTCCCTCATGCTCCCAGACTTAGGATCGATGACCGGCGGCGCCACGCGCTCACTCCAGGTCATGTGAGGGCCATAGCCGAGAGATACGCCCATGATGTAGGCAGCGTCCTCTTTCGTCCATTGCCGCCACCCCCCCCCCCGGTTGCTGCTGCCGCAGTCCCGGTGTTTGCTGCGCCTGCACCTCCGATGGCCCCAGCGCCTGCGAATCACGCTGCCGATCCCTATTACTGTAACGAACCGGATACCACGACCGATGAAGACGTGATGGCCGCTGCAGACCGCCTCCTCTCCATGGACATCGAAGAGGTCGCCGCCCTCATCGCCATCGTCCAGCAGGGCGAGTGA |
<실시예3> OsERFM 단백질의 세포내 위치분석
OsERFM의 단백질은 N-말단에 핵으로 타겟(target) 될 것으로 예측되는 시그널 펩타이드(signal peptide)를 가지고 있다. OsERFM 단백질의 세포내 위치를 규명하기 위하여 단백질의 C-말단에 형광단백질(GFP)을 융합한 벡터를 제작하고, 벼의 원형질체에서 일시 발현시킨 후 컨포칼 레이져주사현미경 (Leica TCS SP8)로 세포내 형광위치를 분석하였다. 그 결과 OsERFM의 단백질이 세포내 핵에 위치함을 확인하였다 (도 3).
<실시예4> OsERFM 발현 벡터의 제조
벼의 고온반응에서 OsERF 유전자의 기능을 조사하고 고온 내성 등 벼의 내재해성 형질을 개량하기 위한 목적으로 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여 OsERFM 유전자가 옥수수 유비퀴틴(ubiquitin) 프로모터에 의해 조절되는 식물발현 벡터를 제작하였다. 서열번호3 및 4의 프라이머 세트(OsERFM-entF 및 OsERFM-entR)를 이용하여 OsERFM을 PCR 증폭하여 pENTR 벡터에 클로닝한후 gateway 방법으로 pGA2897-3XHA 계열 벡터의 옥수수 유비퀴틴 프로모터(pUbi)의 하류에 OsERFM을 연결하고, OsERFM 단백질의 C 말단에 HA 항원결정기(epitope)를 연결하여 식물에서 항시 발현하는 형질전환 벡터(pGA2897-OsERFM-3xHA)를 제작하였다 (도 4).
OsERFM-entF(서열번호3):
5’-cgcccccttc accatggttc cgcccgccgc gcac-3’
OsERFM-entR(서열번호4):
5’-gcgcgcccac ccttctcgcc ctgctggacg atgg-3’
<실시예5> OsERFM 과발현 형질전환 벼의 제조 및 도입 단백질의 확인
동진벼의 종자로부터 유도한 캘루스에 상기 pGA2897-OsERFM-3XHA 벡터를 포함하는 아그로박테리아(Agarobacteria)를 접종하고, 히그로마이신(hygromycin, 30 ㎍/㎖) 포함 배지에서 형질전환 캘루스를 선발한 후 줄기와 뿌리를 유도하여 형질전환 벼를 제조하였다.
OsERFM 단백질의 C-말단에 표지된 HA 항원결정기(epitope)에 대한 항체를 이용하여, 형질전환벼에서 OsERFM 단백질이 제대로 발현되고 있는지를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다. 이를 위하여 동진벼와 OsERFM 형질전환 벼의 잎에서 각각 분리한 단백질 분획을 SDS-PAGE로 전개하여 나일론막으로 옮긴 후 anti-HA 항체를 이용하여 도입한 OsERFM-HA 단백질 발현을 분석하였으며, 내재 단백질 대조군으로 액틴(actin) 항체를 사용하였다.
웨스턴 블랏 분석 결과, 내재 단백질 액틴(actin)의 발현량은 대조구와 형질전환 벼간에 차이가 없었으나, 대조구인 동진벼에서는 OsERFM-HA 단백질 밴드가 전혀 나타나지 않았다. 반면, OsERFM 과발현 형질전환벼 (OE1, OE2, OE3)에서만 단백질 밴드가 확인되었다 (도 5).
즉, 형질전환벼에서 도입된 OsERFM 단백질이 높게 발현되고 있음을 확인하였다.
<실시예6> OsERFM 과발현 형질전환 벼의 물 이용 형질 분석
OsERFM의 과발현이 건조 스트레스 또는 고온 스트레스에 대한 내성 형질을 증진시키는 효과가 있는지를 조사하기 위하여 온도와 습도가 조절되는 정밀 환경 조절실에서 실시간 자동 무게 측정 장치(DroughtSpotter)를 이용하여 물 이용 형질을 분석하였다.
고온건조 복합 스트레스 조건에서 물 이용 효율을 비교하기 위하여 30℃, 38℃ 및 42℃에서 각각 건조 스트레스 처리 실험을 수행하였다. 먼저 물을 공급하지 않는 조건(None mode)에서 3일 동안 연속적으로 시간에 따른 화분의 무게 변화를 측정하고 물 손실율 (water loss rate)을 비교한 결과, 건조 스트레스 처리 후 1일째 물 손실율이 최고치에 달하는 정오 (12:00)를 기준으로 대조구인 동진벼의 물 손실율이 30℃와 38℃ 조건에서 각각 평균 4 g/분과 10.1 g/분인데 비해 OsERFM 과발현 형질전환벼의 물 손실율은 30℃와 38℃ 조건에서 각각 3 g/분과 7.15 g/분으로 OsERFM 과발현 형질전환벼가 대조구에 비해 25% 이상 토양의 수분사용량이 낮은 것을 알 수 있었다(도 6A).
한편, OsERFM 과발현 형질전환벼가 38℃ 조건에서 건조 스트레스 처리 후 3일째 및 42℃ 조건에서 건조 스트레스 처리 후 2일째 12시에서 24시 사이 토양의 물 손실율이 대조군과 비교하여 높은 경향을 나타냈다. 이러한 경향은 후술한 실험에서 42℃ 고온의 건조 스트레스 조건에서 OsERFM 과발현 형질전환 벼가 대조구인 동진벼에 비해 잎의 온도가 2 내지 3℃ 더 낮게 유지되는 특성과 연관된 것일 수 있다.
식물체내의 수분함량이 낮아져서 임계점 이하가 되면 식물은 시들고 토양에서 더 이상 물을 흡수 할 수 없는 상태가 된다. 즉, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 38℃ 내지 42℃의 고온 및 건조 스트레스 조건에서 대조군에 비해 수분 함량이 높기 때문에 토양에서 물을 흡수하는 특성을 유지하는 것으로 판단된다.
또한 토양의 무게가 시작점에서 일정량(7%) 감소하면 처음 무게를 유지하도록 물을 공급해주는 실험 조건(Dynamic Mode)에서 물 사용량을 비교한 결과 역시 OsERFM 과발현 형질전환벼가 대조구에 비해 수분공급량과 공급횟수가 약 25% 이상 낮은 것을 확인하였다(도 6B).
즉, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 대조구에 비해 물 사용량이 적어 건조 스트레스에 대한 내성이 증진됨을 확인하였다.
<실시예7> OsERFM 과발현 형질전환 벼의 고온 내성 분석
<실시예7-1> 잎의 온도 분석
OsERFM 과발현이 식물체의 고온 내성변화에 미치는 효과를 분석하고자, 열화상 카메라 (FLIR P620)를 이용하여 열 이미지를 촬영한 후 FLIR 1.2 SP2 소프트웨어를 이용하여 잎의 온도를 측정하였다.
식물체는 주위 환경의 온도가 올라가도 잎의 내부 온도를 낮게 유지할 수 있는 기작을 가지고 있는데, 열화상 이미지 분석을 통해 동진 벼의 잎의 온도를 측정한 결과, 건조 스트레스 없이 물이 충분한 조건에서는 42℃ 고온조건에서도 평균 잎의 온도를 35℃ 이하로 유지하지만, 건조 스트레스를 받으면 잎의 온도가 올라가는 특성을 보였다 (도 7). 또한 42℃ 고온에서 물이 충분한 조건에서 OsERFM 과발현 형질전환 벼와 대조구인 동진벼의 잎의 온도는 뚜렷한 차이가 없었으나, 건조 스트레스를 주면 OsERFM 유전자 과발현 형질전환 벼가 대조구인 동진벼에 비해 잎의 온도가 2 내지 3℃ 더 낮게 유지되는 특성을 보였으며, 건조 스트레스 처리 후 물을 제공하였을 때 대조구보다 더 빠르게 회복되는 것을 확인하였다 (도 7).
상기 결과를 통해, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 고온 및 건조 조건에서 식물체의 수분함량을 높게 유지하며 따라서 고온 및 건조 스트레스 내성이 높음을 확인하였다.
<실시예7-2> 종자 발아율 분석
고온 스트레스 내성을 검정하기 위한 또 다른 실험으로 1/2 MS-Agar 배지에서 침윤한 종자를 50도 고온에서 10시간 전처리한 후 28도로 옮겨서 생존율을 조사하였다.
독립적 형질전환 (T1 세대) 2 계통을 이용하여 실험을 진행하였다. 고온처리 없이 28℃에서 종자발아를 진행한 경우 형질전환체와 대조구 모두 침윤후 2일내에 종자발아율이 98% 이상으로 뚜렷한 차이가 없었다 (도 8A). 반면 50℃에서 10시간 동안 고온 스트레스를 준 뒤 28℃로 옮겨서 종자발아를 측정한 결과 침윤후 10일째 대조구인 동진벼의 발아 생존률이 1.3%인데 비해 OsERFM 과발현 형질전환 벼는 10% 이상 뚜렷이 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 OsERFM의 과발현을 통해 종자단계에서 고온스트레스 내성을 증진시킬 수 있다는 것을 증명하였다 (도 8A).
<실시예7-3> 유묘의 잎 손상율 비교
또한 발아 후 7일된 유묘 20개체를 37℃ 인큐베이터에서 8일간 처리 후 첫 번째, 두 번째 및 세 번째 잎의 평균 손상율을 조사하였을 때, OsERFM 과발현 형질전환 벼가 대조구인 동진벼에 비해 잎의 손상율이 낮다는 것을 확인하였다 (도 9).
즉, OsERFM의 과발현을 통해 유묘기 잎의 고온피해를 경감시킴을 확인하였다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> OsERF Gene enhancing heat or drought stress tolerance derived
from Oryza sativa and uses thereof
<130> DP20200257
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 189
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsERF protein
<400> 1
Met Val Pro Pro Ala Ala His Ala Pro Lys Asn Leu Gly Leu Arg Gly
1 5 10 15
Val Arg Arg Arg Leu Trp Gly Arg Trp Ala Ala Glu Ile Arg Val Pro
20 25 30
Arg Gly His Arg Ala Ala Ala Arg Leu Trp Ile Gly Thr Phe Pro Ser
35 40 45
Pro Ala Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Asp Ala Ala Leu Tyr Cys Phe His
50 55 60
Gly Gly Ala Pro Pro Gly Asn Arg Ala Phe Asn Phe Pro His Ala Pro
65 70 75 80
Arg Leu Arg Ile Asp Asp Arg Arg Arg His Ala Leu Thr Pro Gly His
85 90 95
Val Arg Ala Ile Ala Glu Arg Tyr Ala His Asp Val Gly Ser Val Leu
100 105 110
Phe Arg Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Val Ala Ala Ala Ala Val
115 120 125
Pro Val Phe Ala Ala Pro Ala Pro Pro Met Ala Pro Ala Pro Ala Asn
130 135 140
His Ala Ala Asp Pro Tyr Tyr Cys Asn Glu Pro Asp Thr Thr Thr Asp
145 150 155 160
Glu Asp Val Met Ala Ala Ala Asp Arg Leu Leu Ser Met Asp Ile Glu
165 170 175
Glu Val Ala Ala Leu Ile Ala Ile Val Gln Gln Gly Glu
180 185
<210> 2
<211> 570
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsERFM gene
<400> 2
atggttccgc ccgccgcgca cgcgcctaag aatctgggtt tgcggggcgt ccgaaggaga 60
ctctgggggc gttgggcagc ggagatccgc gtgcctcggg gccatcgcgc ggccgcacga 120
ctgtggattg ggacattccc atctccagct gcggcagcac tagcctatga cgctgcactc 180
tactgcttcc acggaggagc cccgccgggg aaccgcgcgt tcaacttccc tcatgctccc 240
agacttagga tcgatgaccg gcggcgccac gcgctcactc caggtcatgt gagggccata 300
gccgagagat acgcccatga tgtaggcagc gtcctctttc gtccattgcc gccacccccc 360
cccccggttg ctgctgccgc agtcccggtg tttgctgcgc ctgcacctcc gatggcccca 420
gcgcctgcga atcacgctgc cgatccctat tactgtaacg aaccggatac cacgaccgat 480
gaagacgtga tggccgctgc agaccgcctc ctctccatgg acatcgaaga ggtcgccgcc 540
ctcatcgcca tcgtccagca gggcgagtga 570
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsERFM-entF
<400> 3
cgcccccttc accatggttc cgcccgccgc gcac 34
<210> 4
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> OsERFM-entR
<400> 4
gcgcgcccac ccttctcgcc ctgctggacg atgg 34
Claims (9)
- 서열번호 2의 염기서열을 가지는 OsERF 유전자를 포함하는, 벼의 고온 또는 건조 스트레스에 대한 내성 증진용 형질전환 재조합 벡터.
- 삭제
- 제 1 항의 OsERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터로 형질전환된 고온 또는 건조 스트레스에 대한 내성이 증진된 벼.
- 삭제
- 제 1 항의 OsERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 포함하는 벼의 고온 또는 건조 스트레스에 대한 내성 증진용 조성물.
- 삭제
- 제 1 항의 OsERF 유전자를 포함하는 형질전환 재조합 벡터를 제조하는 단계; 및 상기 벡터를 벼에 형질전환 시키는 단계를 포함하는,
고온 또는 건조 스트레스에 대한 내성이 증진된 형질전환 벼의 제조방법. - 삭제
- 서열번호 2의 염기서열을 가지는 OsERF 유전자를 벼에 도입하는 단계를 포함하는, 벼의 고온 또는 건조 스트레스에 대한 내성을 증진시키는 방법.
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| Mei-Chun Cheng 등. Plant Physiology. Vol. 162, 페이지 1566-1582 (2013.05.29.)* |
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| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |