KR20230026185A - 식물의 해충 저항성을 증가시키는 OsF3H 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 해충 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법을 이용하면 내충성이 증가된 작물을 개발할 수 있으므로 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

식물의 해충 저항성을 증가시키는 OsF3H 유전자 및 이의 용도{OsF3H gene increasing insect resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 해충 저항성을 증가시키는 OsF3H (flavonone-3-hydroxylase) 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

벼(Oryza sativa L.)는 아시아 지역에서 특히 중요하며 세계 인구의 50%에게 중요한 식량 자원이다. 약 114개국에서 재배되며 아시아와 아프리카에서 1억 가구 이상의 소득과 고용의 주요 원천이다. 인구 증가로 개발도상국의 쌀 생산량이 소비보다 적어 향후 30년간 70% 증산해야 적자를 메울 수 있다는 조사 결과가 나왔다. 벼는 따뜻하고 습한 기후에서 번성하는데, 이러한 기후는 또한 해충의 증식에도 도움이 된다. 벼농사의 해충 피해는 궁극적으로 수확량을 감소시킬 수 있으며, 작물간 활용, 경작 품종 재배, 합성 비료의 광범위한 사용은 해충의 발달을 촉진한다. 해충이 처음 새로운 지역에 유입될 때는 방제 측정이 이루어지지 않지만, 이후부터는 통제가 불가능해져 농작물에 심각한 피해를 입힐 수 있다. 흰등멸구(White-backed planthopper, 학명 Sogatella furcifera)는 심각한 해충이다. 흰등멸구는 1966년 인도에서 처음 발병한 것으로 알려졌으며 중국, 한국, 일본 등지로 급속도로 확산됐다. 한국에서는 아직까지 흰등멸구가 크게 중요하지 않은 해충이며 관련된 심각한 피해가 보고된 바 없다. 그러나, 해충 방제가 제대로 이루어지지 않는다면 큰 피해가 예상될 수 있다.

식물은 병원체, 바이러스, 초식동물에 자주 노출되며 방어반응으로 2차 대사산물을 조절해 초식동물에 의해 유발되는 생물학적 스트레스를 처리한다. 플라보노이드를 포함한 2차 대사산물들은 해충 유도 스트레스를 포함한 환경 스트레스에 식물들이 적응하는 데 중요한 역할을 한다. 농약에 대한 수요가 증가하고 있으며, 과학자들은 살충제용 플라보노이드가 효소 억제를 통해 해충의 유충 성장을 막아주기 때문에 살충제용 플라보노이드에 집중하고 있다. 모든 플라보노이드 중에서, 캠프페롤(Kaempferol, Kr)과 퀘세틴(quercetin, Qu)는 가장 중요한 해충 기피제 물질이고, kaempferol-3,7-diglucoside가 베르싸 밤나방(Mamestra configurata) 억제제로 사용될 수 있고, Qu는 담배거세미나방(Spodoptera litura) 유충에 대한 기피제로 사용될 수 있다는 것이 알려졌다. Kr과 Qu는 강력한 항산화제이며, 매우 효율적인 활성산소 제거제이다. Kr은 3-OH 그룹을 포함하고, Qu는 C-링과 A-링에 각각 3개, 5개의 -OH 그룹을 포함하며, 가장 많은 전자를 기증할 수 있는 용량을 가지고 있다. 2차 대사산물(플라보노이드)은 병원성 또는 곰팡이의 공격으로 인한 생물학적 스트레스 동안 상향 조절된다. 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 식물 조직을 해치는 병원성 공격에 대응해 생산되며, 식물은 방어기제로 항산화 활동을 통해 ROS 축적을 방지한다. 이전의 보고에 따르면 식물 표피와 엽육(mesophyll) 조직의 Qu 축적물은 고광도에 의해 완화되는 산화 스트레스로부터 감염된 조직을 보호한다.

한편, 한국공개특허 제2001-0111723호에는 '자스몬산 메칠화 효소 유전자 및 이를 이용하여 병충해 및 스트레스 저항성 식물체를 제조하는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0028868호에는 '배추 유래의 해충 저항성 디펜신을 코딩하는 비알디 1 유전자, 이를 이용한 형질전환체 및 상기 유전자를 발현시켜 해충 저항성을 증진시키는 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물의 해충 저항성을 증가시키는 OsF3H 유전자 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼 유래 OsF3H 유전자를 형질전환시켜 과발현 식물체를 제조하였고, 동일한 조건에서 상기 형질전환 식물체와 야생형 식물체의 흰등멸구 침입에 대한 표현형을 비교한 결과 OsF3H 유전자를 과발현하는 형질전환 식물체의 흰등멸구에 대한 피해가 야생형에 비해 현저히 감소된 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 해충 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 벼 유래 OsF3H 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현시키는 단계; 및 상기 OsF3H 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 해충 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 해충 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsF3H 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 해충 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 벼 유래 OsF3H 단백질 코딩 유전자를 과발현시켜 식물체의 해충, 특히 흰등멸구에 대한 저항성이 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 내충성이 증가된 작물을 개발할 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 야생형(wild) 및 OsF3H 과발현 식물체(OsF3H)의 표현형 분석 결과이다.
도 2는 야생형 및 OsF3H 과발현 식물체의 흰등멸구(WBPH)에 대한 저항성을 분석한 결과이다. (A) 및 (B)는 수액을 빨아들이는 특성으로 인해 줄기와 잎 주맥을 주로 공격하는 WBPH의 모습을 보여주는 것이고, (C)는 WBPH 처리 후 시간 경과에 따른 야생형(wild) 및 OsF3H 과발현 식물체(OsF3H)의 감염된 식물체 수를 분석한 결과이며, (D)는 WBPH에 의한 병변 부위를 보여주는 것으로 좌측 2개의 줄기는 OsF3H 과발현 식물체이고, 나머지 4개의 줄기는 야생형 식물체의 줄기 모습이다. (E) 및 (F)는 각각 야생형과 OsF3H 과발현 식물체에서 WBPH의 밀도를 보여주는 것이며, (G)는 지속적인 WBPH의 공격이 벼 식물체의 초장 발달에 미치는 영향을 분석한 것으로, 좌측 1개의 식물체는 OsF3H 과발현 식물체이고, 나머지 2개는 야생형 식물체의 모습으로, 야생형 벼 식물체에서는 왜성(dwarfism)이 나타난 것을 알 수 있다.
도 3은 흰등멸구 처리(스트레스) 조건에서 야생형 및 OsF3H 과발현 식물체의 플라보노이드 관련 유전자의 발현 수준을 분석한 결과이다.
도 4는 흰등멸구 처리(스트레스) 조건에서 야생형 및 OsF3H 과발현 식물체의 수용성 당 함량 및 엽록소 함량 분석 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 해충 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 해충 저항성 증가 방법은 벼 유래 OsF3H 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 비형질전환 식물체에 비해 식물의 해충 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 "유전자 과발현"이란 비형질전환 식물체에서 발현되는 수준 이상으로 상기 OsF3H 유전자가 발현되도록 하는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 벼 유래 OsF3H 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물의 해충 저항성을 증가시키는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 벼 유래 OsF3H 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 상기 벼 유래 OsF3H 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 해충 저항성 증가 방법에 있어서, 상기 해충은 흰등멸구(Sogatella furcifera), 소가텔라 알보핌브리아타(Sogatella albofimbriata), 소가텔라 캠프티스틸리스(Sogatella camptistylis), 소가텔라 카펜시스(Sogatella capensis), 소가텔라 콜로라타(Sogatella colorata), 소가텔라 유폼페(Sogatella eupompe), 소가텔라 게미나(Sogatella gemina), 소가텔라 게라노르(Sogatella geranor), 소가텔라 콜로폰(Sogatella kolophon), 소가텔라 크루게리(Sogatella krugeri), 소가텔라 마네토(Sogatella manetho), 소가텔라 몰리나(Sogatella molina), 소가텔라 니게리엔시스(Sogatella nigeriensis), 소가텔라 니그리게니스(Sogatella nigrigenis), 소가텔라 파니시콜라(Sogatella panicicola), 소가텔라 페탁스(Sogatella petax), 소가텔라 수바나(Sogatella subana), 소가텔라 티매아(Sogatella timaea), 소가텔라 유니덴타타(Sogatella unidentata), 소가텔라 비빅스(Sogatella vibix), 소가텔라 예이(Sogatella yei)일 수 있으며, 바람직하게는 흰등멸구(Sogatella furcifera)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

본 발명의 재조합 벡터는 바람직하게는 식물 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 유전자를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스 (예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환 하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함한다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명에 따른 식물 발현 벡터에서, 터미네이터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린합성효소(nopaline synthase, NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseolin) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스의 옥토파인합성효소(Octopine synthase) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모 (예컨대, Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주(Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물 세포 등이 이용될 수 있으며, 바람직하게는 식물 세포이다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens et al., 1982, Nature 296: 72-74; Negrutiu et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8: 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito et al., 1985, Bio/Technol. 3: 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 179-185), 각종 식물 요소의(DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein et al.,1987, Nature 327: 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서(비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EPA 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 바이너리 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명은 또한, 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현시키는 단계; 및 상기 OsF3H 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 해충 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 벼 유래 OsF3H 단백질과 해충은 전술한 것과 같다.

본 발명의 제조 방법은 본 발명에 따른 벼 유래 OsF3H 단백질 코딩 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 어떤 식물 세포도 된다. 식물 세포는 배양 세포, 배양 조직, 배양 기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다. "식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 열매, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 해충 저항성이 증가된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

상기 형질전환 식물체는 신초(shoot) 길이, 원추(panicle) 길이, 천립중 또는 임실률(fertility rate)의 농업학적 특성이 향상된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 유채, 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 샐러리, 당근, 미나리, 파슬리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물일 수 있고, 가장 바람직하게는 벼 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 해충 저항성 증가용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효 성분으로서 벼 유래 OsF3H 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 OsF3H 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 해충, 바람직하게는 흰등멸구에 대한 저항성을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 게이트웨이 방법을 통한 플라스미드 구축 및 클로닝

청청벼 품종은 경북대학교 식물분자육종 실험실로부터 제공받았으며, RNA 분리 및 OsF3H 유전자 증폭을 위해 사용하였다. 파종 전에, 종자를 30℃에서 3일간 배양기 내에 담궈두었으며, 물은 매일 교환하였다. 발아된 종자는 포트에 정식하고 3일간 암 조건에 둔 후, 온실로 옮겼다. 14일령의 벼 유묘의 어린 잎으로부터 총 RNA를 RNeasy Plant Mini kit (Qiagen)를 이용하여 추출하였다. cDNA는 qPCRBIO cDNA Synthesis Kit (PCRBIOSYSTEMS)를 사용하여 총 RNA로부터 합성하였다. OsF3H의 전장 ORF 부위(483 bp)는 유전자 특이적 프라이머(표 2)를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 게이트웨이 클로닝 시스템은 다음과 같다. 엔트리(entry) 클론은 제조사의 지침에 따라 주형 DNA를 pENTR/D-TOPO 클로닝 벡터에 삽입하여 제조하였다. TOPO 클로닝 반응물은 열 충격을 사용하여 DH5α로 형질도입시키고, 선별 마커인 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 배양하였다. 하룻밤 배양 후 선발된 콜로니로부터 QIAprep Spin Miniprep Kit를 사용하여 플라스미드를 추출하였다. 분리한 플라스미드는 Not1 및 Asc1 제한효소를 사용하여 자른 후, 겔 로딩과 시퀀싱 분석을 통해 확인하였다. 과발현 벡터 구축을 위해, 엔트리 클론 단편을 데스티네이션(destination) 벡터인 pSB11의 BamH1 및 Xho1 자리로 Gateway LR Clonase enzyme mix kit (Invitrogen)를 사용하여 삽입하였다. 그 후 컨스트럭트를 아그로박테리움 LBA4404 (Takara) 균주로 도입하고 스펙티노마이신(spectinomycin)을 함유하는 LB 배지에서 배양하였다. 그 후, 아그로박테리움 균주로부터 플라스미드를 분리하고, BamH1 및 Xho1로 자른 후 라이게이션(ligation)과 형질도입을 확인하였다.

2. 형질전환 벼 제작

OsF3H 과발현 벼 계통은 Sahoo 등(Plant Methods (2011) 7:49)에 의해 기술된 방법에 따라 캘러스 배양으로부터 개발하였다. 캘러스 유도를 위해, 고품질의 성숙한 낙동벼 종자를 선발하여, 조심스럽게 겉껍질을 벗긴 후, 70% 에탄올을 이용하여 5분간 교반하며 멸균시켰다. 그 후, 2차 증류수를 사용하여 3회 세척하였다. 그 후 상기 종자를 3% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)으로 10분간 멸균시키고, 멸균수로 3회 세척하고, 클린 벤치 내에서 1시간 동안 건조시켰다. 건조된 종자를 캘러스 유도 배지에 접종하고 12일간 암 조건에 두었다. 본 발명에 사용된 배지 조성은 하기와 같다.

조직 배양에 사용된 배지 조성

배지	조성
캘러스 유도	4.4 g/ℓ MS powder, 30 g/ℓ sucrose, 600 mg/l proline, 300 mg/ℓ casein hydrolysate, 3 ppm 2,4-D, 4 g/ℓ gerlite, 100 mg/ℓ myo-Inositol
공배양	4.4 g/ℓ MS powder, 30 g/ℓ sucrose, 600 mg/ℓ proline, 300 mg/ℓ 300 mg/ℓ casein hydrolysate, 3 ppm 2,4-D, 4 g/ℓ gerlite, 100 mg/ℓ myo-Inositol, 100 mg/ℓ acetosyringone (after autoclave), pH 5.2
선발	4.4 g/ℓ MS powder, 30 g/ℓ sucrose, 30 g/ℓ proline, 300 mg/ℓ casein hydrolysate, 3 ppm 2,4-D, 4 g/ℓ gerlite, 100 mg/ℓ myo-Inositol, carbenicillin 500 mg/ℓ, 50 mg/ℓ spectinomycin (after autoclave), pH 5.2
재분화	4.4 g/ℓ MS powder, 30 g/ℓ sucrose, 30 g/ℓ sorbitol, 300 mg/ℓ casein hydrolysate, 2 mg/ℓ kinetin, 1 mg/ℓ NAA, 4 g/ℓ gerlite, 100 mg/ℓ myo-Inositol, carbenicillin 500 mg/ℓ, 50 mg/ℓ spectinomycin (after autoclave)

12일 동안 키운 후에, 캘러스를 작은 조각의 캘러스로 전배양하고, 암조건하에 캘러스 유도 배지에서 3일 동안 배양하였다. 동시에, 전장 OsF3H 유전자를 포함하는 pSB11 플라스미드를 함유하는 아그로박테리움 LBA4404 균주를 배양한 후 원심분리하여 세포 펠렛을 회수하고, 세포 펠렛을 아세토시린곤(acetosyringone)를 포함하는 MS 배지로 재현탁하였다. 상기 아그로박테리움 재현탁액에 캘러스를 담그고 30분간 교반시켰다. 멸균된 여과지 위에 캘러스를 올리고 30분간 건조시킴으로써 아그로박테리움 세포를 제거하였고, 공배양(Co-cultivation) 배지에 접종시켜 암조건 하에서 3일간 배양하였다. 과도한 아그로박테리움 성장은 500 mg/ℓ 카베니실린(carbenicillin)으로 3회 세척하여 조절하였고, 30분간 건조시킨 후, 50 mg/ℓ 스펙티노마이신을 포함하고 있는 선별 배지로 옮겨 광 조건(16시간 명/8시간 암)에서 12일 동안 배양하였다. 그 후, 캘러스를 새로운 선별 배지로 옮겨 10일간 배양하고, 그 후 새로운 선별 배지로 옮겨 5일간 추가 배양하였다. 검정색 또는 갈색의 캘러스를 제거하고, 크림색의(creamish) 캘러스를 재분화 배지로 옮겨 27℃, 암조건에서 10일간 배양하였다. 그 후, 캘러스를 동일한 배지로 옮겨 명 조건에서 두고 소식물체(plantlet)가 발달될 때까지 배양하였다. 그 후, 소식물체를 동일 배지를 포함하고 있는 실험 튜브로 옮겨 뿌리 발달을 유도하였다. 20일 후, 실험 튜브의 식물체를 토양 포트로 옮겨 심었다.

3. 흰등멸구에 대한 저항성 실험

본 실험은 흰등멸구(WBPH)에 대한 OsF3H 과발현 식물체의 저항성을 확인하는 것이다. OsF3H 과발현 식물체와 야생형 식물의 종자는 밤새 살균제로 소독해 3회 세척한 뒤 30℃에서 3일간 배양하였다. 각 식물체(야생형 및 OsF3H 과발현)의 약 20개의 발아된 종자를 멸균된 토양이 채워진 개별 포트로 옮겨 1주일 동안 성장실에서 재배하였다. 유묘를 온실로 옮기고 약 200 마리의 암수 WBPH(2령 및 3령)는 식물당 3개체의 WBPH 비율로 성장 3주 후 OsF3H 과발현 및 야생형 식물 모두에 도입시켰다. 도입 전 WBPH는 비커에 넣어 젖은 티슈를 이용하여 2시간 동안 굶겼다. 감염된 식물체의 수를 포함한 표현형적 평가는 WBPH 도입 10, 50, 70일 후에 하였으며, 감염 대 비감염에 근거하여 저항성 또는 감수성을 평가하였다. 식물체는 관찰된 증상(상처의 갈색 반점)에 근거하여 WBPH 감염으로 간주하였다. 증상이 없는 식물은 감염되지 않은 것으로 간주하였다. WBPH는 농촌진흥청 국립식량과학원에서 제공받았으며, WBPH 집단은 감수성 TN1 쌀을 이용하여 경북대학교에서 이상적 환경 조건(온도 27±1℃, 습도 60~70%, 광주기 16시간 명)에서 지속적으로 유지시켰다.

4. 정량적 실시간 PCR (Quantitative real-time PCR)

총 RNA는 WBPH 감염 2시간, 12시간, 24시간 경과 후 야생형 및 OsF3H 과발현 식물체의 잎 10개에서 분리하였다. 먼저 qPCRBIO cDNA Synthesis Kit를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 실시간 PCR은 qPCRBIO SYBR Green Kit를 사용하여 Illumina Eco Real-Time PCR System에서 수행하였다. 각 유전자의 발현 수준을 표준화하기 위해 각 반응마다 액틴을 사용하고 WBPH에 감염된 OsF3H 과발현 식물체 대비 WBPH에 감염된 야생형 식물에서의 발현 수준을 고려하여 계산했다. 반응은 7㎕ 이차 증류수, 1㎕ 프라이머, 10㎕ SYBR 그린, 1㎕ cDNA가 포함된 20㎕ 부피에서 수행되었으며 각 반응은 3회 반복하였다.

본 발명에 사용된 프라이머 정보

Gene name		Primer(5'→3')	서열번호
OsF3H	F	caccATGGCGCCGGTGGCCA	3
	R	TCACTGCTCTGACGAAGCAA	4
OsFLS	F	ATGGCGGAGGTGCAGAGCGTGCAG	5
	R	TTACATGGGGAGCTTATTGATCTTGC	6
OsDFR	F	ATGGGCGAGG CGGTGAAGGG GCCAGT	7
	R	ACATTTGACCAACGVTTCTGTTTC	8
OsWRKY13	F	ATGGCGGCCGGAGAGGAGGTGATGGAT	9
	R	TCAGGAGCACGGCGCGGTGGCCGCCAGGCC	10
OsSLR1	F	ATGAAGC GCGAGTACCA AGA	11
	R	CCGTCATCCGCGGCGCCG	12

5. 수용성 탄수화물 함량 측정

수용성 당 함량 정량화를 위해 WBPH에 감염된 야생형 및 OsF3H 과발현 식물의 잎과 줄기를 WBPH 감염 10일 후, 1주일 간격으로 3회 반복 채취하였다. 약 0.5 g의 냉동건조 조직을 이전의 방법(Correia, M. J. et al., Physiol. Plant. (2015) 124:61-70)에 따라 액체 질소에 분쇄하여 80℃에서 80% 에탄올(2㎖)로 20분간 균질화하였다. 그 후, 균질체는 15분간 10,000rpm으로 원심분리하고 상층액을 제거한 후, 6㎖ 증류수에 펠릿을 다시 현탁하고 0.2 mm 여과지를 사용하여 여과하였다. 당 함량은 Bio-Rad Aminex 87C 컬럼(300 × 7.8 mm)을 이용한 HPLC로 분석하였다.

6. 엽록소 함량 측정

WBPH에 감염된 야생형 및 OsF3H 과발현 식물체의 세 번째 잎을 대상으로 엽록소 함량을 1주일 간격으로 SPAD-502 엽록소계(Minolta Camera Co., Osaka)를 사용해 측정하였다. 각 실험군에 대한 평균 SPAD 측정을 위해 5회 반복실험하였다.

7. 통계분석

모든 실험은 3회 반복실험으로 수행되었으며, 데이터는 two-way ANOVA를 사용하여 분석한 다음 Bonferroni post hoc test (유의한 차이: p < 0.05)를 수행하였다. 완전히 랜덤화된 설계를 사용하여 여러 처리의 평균 값을 비교하였다. 데이터는 그래픽으로 표현하였고, 통계 분석은 Graph-Pad Prism 소프트웨어(version 5.01)를 사용하여 수행되었다.

실시예 1. OsF3H 과발현 식물체의 흰등멸구에 대한 저항성 검정

OsF3H 형질전환에는 흰등멸구(WBPH)에 취약한 낙동(Nagdong) 품종이 사용되었다. 야생형 및 OsF3H 과발현 식물체의 신초(shoot) 길이, 원추(panicle) 길이, 천립중, 임실률(fertility rate) 등의 표현형 특성을 분석하였다. 표현형 분석을 통해 OsF3H 과발현이 농업학적 특성을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(도 1). 상기 결과는 OsF3H가 방어 기작뿐만 아니라 농업학적 특성도 향상시킬 수 있음을 입증하였다.

WBPH는 주로 줄기와 잎 중간을 공격하여 수액을 빨아들이는 해충이다(도 2A 및 2B). WBPH 접종 후 감염식물의 수를 확인한 결과, 야생형 식물의 감염률이 OsF3H 과발현 식물체와 비교하여 유의미하게 높은 것을 관찰하였다(p < 0.05). 야생형 식물체는 접종 10일 후 16.6%가 감염되었으며, 50일 및 70일 후에는 각각 50%와 100%의 감염이 확인되어 감염률이 증가되었음을 알 수 있었다. 반면, 감염된 OsF3H 과발현 식물체의 수는 접종 10, 50 및 70일 이후 각각 0%, 5% 및 16.6%로 확인되었다(도 2C). WBPH 감염에 의한 병변 길이 또한 야생형 식물체에서 높게 확인되었다(도 2D). 또한, 야생형 식물체에서는 많은 수의 1령 애벌레가 발견되었으나, OsF3H 과발현 식물체에서는 성체 WBPH만 검출되었다(도 2E 및 2F). OsF3H 과발현 식물체에서는 수컷 WBPH만 발견되었고, 야생형 식물체에서는 암컷 WBPH가 더 많이 발견되었다. 상기 결과를 통해 WBPH가 식물체의 생장에 유의한 영향을 미친다는 것을 확인했으며, 야생 벼에서 지속적인 WBPH 감염이 왜소증과 조기 성숙을 유발한다는 것을 보여주었다(도 2G).

실시예 2. 흰등멸구 스트레스 조건에서 OsF3H 과발현 식물체의 플라보노이드 합성 관련 유전자 발현 수준, 당 및 엽록소 함량 분석

WBPH 스트레스 조건 하에서 OsF3H 과발현 식물체의 플라보노이드 관련 유전자의 발현 수준을 분석하였다. 그 결과, OsF3H, OsFLS 및 OsDFR 유전자의 발현 경향은 유사하였으며, 흰등멸구에 노출된 OsF3H 과발현 식물체에서의 발현 수준이 현저히 높은 것을 알 수 있었다(도 3). 반면, OsFLS 유전자의 발현은 야생형 식물체에서 낮게 확인되었다. 상기 결과는 디하이드로플라보놀(dihydroflavonol)(OsFLS) 및 안토시아닌(OsDFR)과 관련된 하위 유전자들의 발현이 벼에서 WBPH에 대한 방어를 용이하게 할 수 있음을 의미하였다.

또한, WBPH의 감염에 의해 야생형 식물체에서는 감염이 경과될수록 WBPH의 먹이인 수용성 당의 함량이 지속적으로 감소되었으나, OsF3H 과발현 식물체에서는 감염 후 시간이 경과함에 따라 수용성 당 함량이 증가되는 것이 관찰되었다(도 4A-4C). 엽록소 함량 또한 수용성 당 함량 변화와 유사한 패턴을 나타내었다(도 4D).

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsF3H gene increasing insect resistance of plant and uses thereof <130> PN21114 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggcgccgg tggccacgac gttcctcccg acggcgtcga acgaggcgac gctgcggccg 60 tcgttcgtgc gcgacgagga cgagcgcccc agggtggcgt acaaccagtt cagcgacgcg 120 gtcccggtga tctcgctcca ggggatcgac gaagcggcgc gggcggagat ccgtgcccgc 180 gtggccggcg cgtgcgagga gtggggcatc ttccaggtgg tggaccacgg cgtggacgcg 240 gggctcgtcg ccgacatggc gcgcctcgcc cgcgacttct tcgcgctgcc gccggaggac 300 aagctccggt tcgacatgtc cggcggcaag aagggcggat tcatcgtctc cagccacctc 360 caggtacgtc acgtcacgtc acttcacgtc gttacgttcc tagagcactc gaagtcgacg 420 cacgcgcggg aacggcgaca tgtcgatcac catgtctgct ctgttgcttc gtcagagcag 480 tga 483 <210> 2 <211> 160 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Ala Pro Val Ala Thr Thr Phe Leu Pro Thr Ala Ser Asn Glu Ala 1 5 10 15 Thr Leu Arg Pro Ser Phe Val Arg Asp Glu Asp Glu Arg Pro Arg Val 20 25 30 Ala Tyr Asn Gln Phe Ser Asp Ala Val Pro Val Ile Ser Leu Gln Gly 35 40 45 Ile Asp Glu Ala Ala Arg Ala Glu Ile Arg Ala Arg Val Ala Gly Ala 50 55 60 Cys Glu Glu Trp Gly Ile Phe Gln Val Val Asp His Gly Val Asp Ala 65 70 75 80 Gly Leu Val Ala Asp Met Ala Arg Leu Ala Arg Asp Phe Phe Ala Leu 85 90 95 Pro Pro Glu Asp Lys Leu Arg Phe Asp Met Ser Gly Gly Lys Lys Gly 100 105 110 Gly Phe Ile Val Ser Ser His Leu Gln Val Arg His Val Thr Ser Leu 115 120 125 His Val Val Thr Phe Leu Glu His Ser Lys Ser Thr His Ala Arg Glu 130 135 140 Arg Arg His Val Asp His His Val Cys Ser Val Ala Ser Ser Glu Gln 145 150 155 160 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caccatggcg ccggtggcca 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcactgctct gacgaagcaa 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atggcggagg tgcagagcgt gcag 24 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ttacatgggg agcttattga tcttgc 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgggcgagg cggtgaaggg gccagt 26 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 acatttgacc aacgvttctg tttc 24 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atggcggccg gagaggaggt gatggat 27 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 tcaggagcac ggcgcggtgg ccgccaggcc 30 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 atgaagcgcg agtaccaaga 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ccgtcatccg cggcgccg 18

Claims (12)

1. 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현하는 단계를 포함하는 식물의 해충 저항성을 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 OsF3H 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 해충은 소가텔라 속(Genus Sogatella) 해충인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 해충은 흰등멸구(Sogatella furcifera)인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 OsF3H 유전자를 과발현시키는 단계; 및
   상기 OsF3H 유전자가 과발현된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는, 해충 저항성이 증가된 형질전환 식물체의 제조 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 OsF3H 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 제조 방법.
7. 제5항에 있어서, 상기 해충은 소가텔라 속(Genus Sogatella) 해충인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 해충은 흰등멸구(Sogatella furcifera)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 해충 저항성이 증가된 형질전환 식물체.
10. 제9항에 있어서, 상기 형질전환 식물체는 신초(shoot) 길이, 원추(panicle) 길이, 천립중 또는 임실률(fertility rate)의 농업학적 특성이 향상된 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.
11. 제9항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
12. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsF3H (Oryza sativa flavonone-3-hydroxylase) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물의 해충 저항성 증가용 조성물.

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