KR102072017B1

KR102072017B1 - 안트라퀴논-o-글루코시드 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 안트라퀴논-o-글루코시드 생산방법

Info

Publication number: KR102072017B1
Application number: KR1020180105807A
Authority: KR
Inventors: 송재경
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2018-09-05
Filing date: 2018-09-05
Publication date: 2020-01-31

Abstract

본 발명은 바실러스 리체니포미스 DSM 13 유래의 글라이코실전이효소(YjiC)가 도입된 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물 및 상기 미생물을 배양하는 단계에서 기질로 안트라퀴논을 첨가하여 안트라퀴논-O-글루코시드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 글라이코실전이효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 생체내 전환 방법으로 환경 친화적이고 저렴하게 안트라퀴논 유도체를 생산할 수 있는 효과가 있다.

Description

안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 안트라퀴논-O-글루코시드 생산방법{A Recombinant Microorganism for producing Anthraquinone-O-glucosides and a Method for Producing the Same}

본 발명은 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물 및 이를 이용한 안트라퀴논-O-글루코시드 생산방법에 관한 것으로, 더 상세하게는 바실러스 리체니포미스 DSM 13 유래의 글라이코실전이효소(YjiC)가 도입된 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물 및 상기 미생물을 배양하고 기질로 안트라퀴논을 첨가하여 안트라퀴논-O-글루코시드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

안트라퀴논은 9,10-안트라퀴논 골격을 기본으로 하는 천연 페놀 화합물로, 식물, 미생물, 곰팡이, 이끼류로부터 널리 이용 가능하며, 다양한 생물학적 이점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. Rubiaceae 계통의 안트라퀴논은 항균제, 항진균제, 저혈압 및 진통제, 항말라리아, 항산화제, 항백혈병 및 돌연변이 유발 기능과 같은 생체 내(in vivo) 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있고, 안트라퀴논의 여러 이성질체는 암 치료에 널리 사용되는데, 이들은 구아닌/시토신 풍부 위치에 선호적으로, DNA와 상호작용하여 세포 독성을 나타낸다. 에모딘(Emodin)은 제2형 당뇨병의 영향을 줄이고, 인간 사이토 메갈로 바이러스 발달을 억제할 수 있는 약제로 연구되었다. 알로에 베라와 루바브(Rheum rhaponticum)의 뿌리, 줄기의 젤 또는 잎에서 발견되는 알로에 에모딘 (Aloe emodin)은 강력한 자극-완하 작용을 가지고 있다. 크리사진(Chrysazin (Dantron으로 알려짐))은 주로 오피오이드(opioids)의 변비 효과를 막기 위한 완화 치료에 사용된다. 퀴니자린(Quinizarin)은 가솔린과 난방유의 색상을 표시하는 염료로 사용되고, 인단트렌 및 알리자린 유래 염료의 합성 중간체로 사용된다. 알리자린(Alizarin)은 주로 섬유 직물을 염색하기 위한 적색 염료로 사용되고 있다. 가수분해시 안트라퀴논 글리코사이드는 일반적으로 디-, 트리- 또는 테트라- 하이드록시 안트라퀴논 또는 이들 화합물의 유도체인 아글리콘(aglycone)을 생산한다. 유리 안트라퀴논 아글리콘도 치료 활성을 나타내지 만, 용해도가 증가된 글리코시드는 항염증성, 방부성, 항암 및 항종양 작용과 같은 다양한 약리학적 작용을 갖는 주요 활성 화합물로 인정받고 있다 (Huang et al., 2007; Malik et al., 2016).

최근, 안트라퀴논 유도체에 대한 합성이 중요한 관심 대상이 되며, 다양한 합성 방법이 보고되고 있다. 가장 일반적인 합성 방법으로는 발연 황산, 벤조일 클로라이드, 진한 황산, 염화 아연 및 POCl₃ / P₂O₃Cl₄를 사용하여 안트라퀴논 유도체를 생산하는 아릴 및 O- 아라일벤조산의 분자 내 응축 방법이 있다 (Madje et al., 2010). 안트라퀴논과 그 유도체는 이전에 화학 경로에 의해 합성되었지만, 이 방법은 비용이 많이 드는 등 여러 단점을 갖는다(Seidel et al., 2013).

본 발명에서는 다른 안트라퀴논 유도체로 변환시키기 위하여 글라이코실전이효소(glycosyltransferase)가 이용할 당 공여체로 E. coli 내의 당 (uridine diphosphate (UDP) - 포도당)을 활용하고자 하였는데, 이와 같은 공정은 비용이 저렴하고 환경 친화적인 장점이 있다. 본 발명에서는 야생형 E. coli BL21 (DE3) 균주에 Bacillus licheniformis DSM13 (YjiC) 유래의 글라이코실전이효소(glycosyltransferases)를 발현시키고 3개의 안트라퀴논을 각각의 글루코시드로 생체내 전환(biotransform)시킬 수 있음을 확인하였고, 더불어 이들 유도체가 항암 활성에 있어 아글리콘(aglycone)과 비교하여 유의한 효과를 나타냄을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

Huang, Q. et al., 2007, Med. Res. Rev. 27, 609-630. Madje, B.R. et al., 2010, Green Chem. Lett. Rev. 3, 269-273. Malik, E.M. et al., 2016, Med. Res. Rev. 36, 705-748. Pandey, R.P. et al., 2013b, Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 1889-1901. Pandey, R.P., 2013a, Appl. Environ. Microbiol. 79, 3516-3521. Parajuli, P. et al., 2015, Microb. Cell Fact. 14, 76. Seidel, N. et al., 2013, New J. Chem. 37, 601-610.

본 발명의 목적은 안트라퀴논-O-글루코시드 생물학적 방법으로 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법에 의해 생산된 안트라퀴논-O-글루코시드의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 리체니포미스 DSM 13 유래의 글라이코실전이효소(YjiC)가 도입되어 있는 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물를 제공한다.

본 발명은 또한, 글라이코실전이효소(YjiC)가 발현된 상기 재조합 미생물 및 당 존재하에 안트라퀴논을 안트라퀴논-O-글루코시드로 전환시키는 단계를 포함하는 안트라퀴논-O-글루코시드 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 안트라퀴논-O-글루코시드 및 이의 용도를 제공한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

<화학식 3>

안트라퀴논 유도체는 항암활성을 비롯한 다양한 활성을 가지고 있지만, 이를 화학적으로 합성하는데는 많은 비용이 소요되고 환경오염을 야기시키는 문제점이 있다. 본 발명에서는 글라이코실전이효소를 발현하는 재조합 대장균을 이용한 생체내 전환 방법으로 환경 친화적이고 저렴하게 안트라퀴논 유도체를 생산할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 선택된 안트라퀴논을 그에 상응하는 글루코시드로 전환시키기 위하여 바실러스 글라이코실전이효소(glycosyltransferase)에 의해 E. coli 에 내재된 UDP-글루코스를 이용하는 경로를 보여준다.
도 2는 생체내 전환 반응 혼합물의 HPLC-PDA 크로마토그램을 각각의 표준과 비교한 것으로, S는 기질 피크를 나타내고, P는 생성물질을 나타낸다. A) 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, B) 알리자린, C) 안트라플라빈산.
도 3은 글리코실화된 A) 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, B) 알리자린, C) 안트라플라빈산을 매스 프래그먼트(mass fragments)의 비교로 확인한 HQ-QTOF ESI/MS 분석 결과이다.
도 4는 안트라퀴논-O-글루코시드의 배양 시간과 포도당 보충에 따른 생산 프로파일을 나타낸다. A) 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, B) 알리자린, C) 안트라플라빈산.
도 5는 재조합 균주에서 포도당 보충 농도에 따른 안트라퀴논의 안트라퀴논 글리코시드의 전환을 비교한 것으로, P는 산물, S는 기질을 나타낸다. A) 알리자린, B) 안트라플라빈산, C) 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논.
도 6은 안트라퀴논 및 안트라퀴논 글리코시드 유도체의 암 세포주인 AGS, HeLa, HepG2의 증식 억제에 미치는 효과를 확인한 결과이다. 1. 안트라플라빈산, 2. 알리자린, 3. 2-아미노-3-히드록시 안트라퀴논, 4. 안트라플라빈산-O-글루코시드, 5. 알리자린-O-글루코시드, 6. 2-아미노-3-글루콕시 안트라퀴논
도 7은 각 배양 시간에 따른 알리자린-2-O-β-D-글루코시드의 생물반응기에서의 전환 퍼센트를 나타낸다.
도 8은 알리자린 및 알리자린-2-O-β-D-글루코시드의 ¹H 및 ¹³C NMR 결과이다.
도 9는 알리자린의 ¹H NMR 결과이다
도 10은 알리자린의 ¹³C NMR 결과이다.
도 11은 알리자린-2-O-β-D-글루코시드의 ¹H NMR 결과이다
도 12는 알리자린-2-O-β-D-글루코시드의 ¹³C NMR 결과이다.
도 13은 알리자린-2-O-β-D-글루코시드의 HSQC 상관관계를 나타낸다.
도 14는 알리자린-2-O-β-D-글루코시드의 HMBC 상관관계를 나타낸다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

안트라퀴논은 자연적으로 발생하는 생리활성 화합물로, 항염증제, 항바이러스제, 항균제 및 항암제 활성을 비롯한 다양한 활성에서 안트라퀴논의 생물학적 중요성이 보고되고 있다. 본 발명에서는 대장균에 바실러스 리체니포미스 DSM 13 유래의 글라이코실전이효소(YjiC)를 발현시키고 이를 이용하여 안트라퀴논을 O-글루코시드로 생체 내 전환시키는 생물학적 전환 방법을 개발하였다. 상기 플랫폼을 이용하여 3가지 다른 안트라퀴논을 생체 내 전환시키고자 기질로써 외부에서 공급하자, 이후 생체내 전환 산물인 안트라플라빈산-O-글루코시드, 알리자린-2-O-β-D-글루코시드 및 2-아미노-3-O-글루코실 안트라퀴논이 생성됨을 분광학적으로 확인하였다. 다양한 암세포 (위암 세포-AGS, 자궁 경부암 세포-Hela 및 간암 세포-HepG2)에 대한 항-증식 활성 분석에서는 합성된 화합물이 약 50μM 내지 100μM 범위의 농도에서 세포 성장 억제를 효과를 나타내어, 생체내 합성된 상기 화합물이 암 치료용도로 활용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 바실러스 리체니포미스 DSM 13 유래의 글라이코실전이효소(YjiC)가 도입되어 있는 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 사용할 수 있는 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 미생물로는 에스케리치아 속, 바실러스 속, 코리네박테리움 속, 피치아 속, 슈도모나스 속, 사카로마이세스 속 또는 루게리아 속 등을 예시할 수 있고, 바람직하게는 에스케리치아 속 미생물일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장균일 수 있다. 특히, 대장균은 산업적으로 많이 사용되고 있는 균주로 유전정보 및 배양조건이 알려져 있어 쉽게 산업화할 수 있다는 장점이 있다.

본 발명에서, 상기 글라이코실전이효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

<서열번호 1>

MGHKHIAIFNIPAHGHINPTLALTASLVKRGYRVTYPVTDEFVKAVEETGAEPLNYRSTLNIDPQQIRELMKNKKDMSQAPLMFIKEMEEVLPQLEALYENDKPDLILFDFMAMAGKLLAEKFGIEAVRLCSTYAQNEHFTFRSISEEFKIELTPEQEDALKNSNLPSFNFEDMFEPAKLNIVFMPRAFQPYGETFDERFSFVGPSLAKRKFQEKETPIISDSGRPVMLISLGTAFNAWPEFYHMCIEAFRDTKWQVIMAVGTTIDPESFDDIPENFSIHQRVPQLEILKKAELFITHGGMNSTMEGLNAGVPLVAVPQMPEQEITARRVEELGLGKHLQPEDTTAASLREAVSQTDGDPHVLKRIQDMQKHIKQAGGAEKAADEIEAFLAPAGVK

또한, 본 발명의 일실시예에서는 글라이코실전이효소가 벡터에 삽입된 형태로 도입되었으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 안트라퀴논-O-글루코시드 합성경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 중 어느 하나 이상 또는 모두가 숙주 미생물의 염색체상에 직접 도입될 수도 있으며, 상기 유전자 중 어느 하나 이상 또는 모두를 발현 벡터에 삽입하여 제조된 재조합 벡터의 형태로 숙주 미생물에 도입될 수 있다.

본 발명의 글라이코실전이효소를 코딩하는 유전자는 강한 프로모터를 함유하는 플라스미드 벡터 형태로 도입할 수 있고, 상기 강한 프로모터는 trc 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터, 락토스 프로모터 및 trp 프로모터인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서, 벡터는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 플라스미드 및 벡터는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환 되어야 한다. 형질전환은 Sambrook , et al., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동 가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합 벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 형질전환은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에서는 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, 알리자린, 또는 안트라플라빈산을 상기 재조합 미생물에 기질로 첨가하였을 때, 이들은 각각 신규한 안트라퀴논-O-글루코시드인 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드, 알리자린-O-글루코시드, 또는 안트라플라빈산-O-글루코시드로 전환되는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 다른 관점에서 글라이코실전이효소(YjiC)가 발현된 상기 재조합 미생물 및 당 존재하에 안트라퀴논을 안트라퀴논-O-글루코시드로 전환시키는 단계를 포함하는 안트라퀴논-O-글루코시드 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 당은 미생물 내에 존재하는 UDP-포도당 또는 외부로부터 첨가된 포도당인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 외부로부터 포도당을 첨가하는 경우, 포도당은 2~10%(w/v)의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 4~8%(w/v)의 농도로 첨가되는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 재조합 미생물에 기질로써 안트라퀴논을 첨가할 수 있으며, 안트라퀴논은 글라이코실전이효소(YjiC)의 발현을 유도한 후 15~25시간 후 첨가하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 첨가되는 안트라퀴논은 최종 농도는 0.1~0.3 mM인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 전환된 안트라퀴논-O-글루코시드는 재조합 미생물의 배양 후 36 내지 50 시간에 회수하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 40 내지 50시간에 회수하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서, 기질로 사용되는 안트라퀴논은 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, 알리자린, 또는 안트라플라빈산인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 상기 생성된 안트라퀴논-O-글루코시드는 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드, 알리자린-O-글루코시드, 또는 안트라플라빈산-O-글루코시드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서는 상기 제조방법을 통해 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드, 알리자린-O-글루코시드, 또는 안트라플라빈산-O-글루코시드를 제조할 수 있었다. 이는 종래 알려지지 않은 신규한 화합물에 해당하고, 암 세포주를 이용하여 실험한 결과 암 세포주의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서 하기 화학식 1로 표시되는 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드에 관한 것이다.

<화학식 1>

본 발명은 또한, 상기 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 또 다른 관점에서 하기 화학식 2로 표시되는 알리자린-O-글루코시드에 관한 것이다.

<화학식 2>

본 발명은 또한, 상기 알리자린-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 또 다른 관점에서 하기 화학식 3으로 표시되는 안트라플라빈산-O-글루코시드에 관한 것이다.

<화학식 3>

본 발명은 또한, 상기 안트라플라빈산-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 암은 간암, 유방암, 자궁경부암, 폐암, 난소암, 췌장암, 피부암, 뇌종양, 골수성 종양 및 림프종으로 구성되는 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 약학 조성물에 포함된 상기 제제의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총중량을 기준으로 00001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 001 내지 10 중량%의 함량으로 포함할 수 있다.

상기 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 약학조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 10 내지 100 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 30 ㎎/㎏으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 내지 3회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.

본 발명의 용어 "개체" 또는 "대상체"란, 상기 암이 발병된 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 암을 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어 "치료"란, 본 발명의 약학 조성물을 투여함으로써, 암이 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "투여"란, 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학 조성물을 도입하는 행위를 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다

본 발명의 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있다 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험방법

1-1. 재료 준비

안트라퀴논(2-아미노-3-하이드록시 안트라퀴논, 안트라플라빈산 및 알리자린)은 도쿄화학공업 (Tokyo Chemical Industry, 도쿄, 일본)으로부터 구입하였다. 다른 모든 화학 물질 및 시약은 가장 높은 화학적 등급으로 사용하였다. E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, La Jolla, CA, USA)를 발현 및 생체내 전환(biotransformation) 숙주로 사용하였다. 제한효소는 Takara Bio. Inc (일본) 또는 Promega (미국) 제품을 사용하였다. 적절한 항생제 (카나마이신 50 ㎍/㎖)를 보충한 Luria-Bertani(LB) 플레이트 및 브로쓰 배지를 대장균의 성장, 콜로니 선별, 배양 준비 및 형질전환에 사용 하였다. 생물학적 활성을 위한 생산 및 회수를 향상시키기 위하여 LB 배지에서 발효를 진행하였다.

1-2. 벡터 및 재조합 균주

기존에 구축된 재조합 벡터 pET28a-YjiC (Pandey et al., 2013a)를 재조합 균주 제작에 사용하였다. 상기 벡터는 BamHI / XhoI에 의한 제한 엔도뉴클레아제 활성 분해를 통해 확인하였고, 이후 생물형질전환 연구를 위해 야생형 대장균 BL21 (DE3)로 형질전환시켰다.

1-3. 배양 준비 및 전체 세포 생체내 전환( biotransformation )

pET28a-YjiC가 도입되어 있는 E. coli 균주는 재조합체의 유지를 위해 50 ㎍/mL 카나마이신이 보충된 5 ㎖ LB 배지에서 종 배양하였고, 이후 37℃에서 밤새 배양하였다. 이중 약 500μL를 동일 배지(50 mL)에 옮기고 세포의 광학 밀도가 600 nm (OD_600nm)가 0.5-0.7에 도달할 때까지 37 ℃에서 배양한 후, 0.5 mM 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)를 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후, 20℃에서 18시간 배양하였다. 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논(2-amino-3-hydroxyanthraquinone), 안트라플라빈산(anthraflavic acid), 및 알리자린(alizarin)과 같은 기질은 DMSO에 용해되기 때문에, 20 시간 동안 단백질 유도한 배양물로의 외부 공급을 위해 각 기질의 50 mM 스톡을 준비하였다. 0.2 mM의 농도로 각 기질을 공급하고 각각의 생성물로 생체내 전환(biotransform)시켰다. 동시에, 각각의 경우에 대응하여, 유전자가 없는 벡터 pET28a (+)만을 발현하는 재조합 균주에도 또한 대조군 실험과 동일한 농도의 안트라퀴논을 공급되었다. 배양 60 시간 후, 모든 생체내 전환 배양(대조군 포함)을 분액 깔때기로 수확하고, 에틸 아세테이트를 2배 부피로 첨가하여 30분 동안 수직으로 흔들어 주었으며, 이후 30분간 수성층(aqueous) 및 유기층(organic)을 정착시켰다. 각각의 경우 유기 에틸 아세테이트 층을 회전 증발기로 이동시켜 증발시켰다. 최종 잔류 샘플을 메탄올 1mL에 용해시켰다. 이 샘플은 HPLC-PDA및 HQ-QTOF ESI/MS) 분석법으로 분석되었다.

1-4. 생물 반응기에서 전체 세포 생촉매 작용

pET28a-YjiC가 도입되어 있는 E. coli BL21 (DE3)의 재조합 균주를 배양하고, 발효를 위한 종균을 제조하였다. 발효는 포도당을 탄소원으로 보충하면서 LB 배지에서 호기성 조건으로 수행되었다. 대부분의 실험방법은 기존 보고서 (Pandey et al., 2013b, Parajuli et al., 2015)에 기술한 것과 유사하게 진행되었다. 대규모로 안트라퀴논 글루코시드를 생산하기 위하여, 5L 발효조 시스템 (Biotron, Korea)을 사용하였다. 발효를 위해 3L의 LB 배지를 준비하고, 발효조 접종물로써, 글리코실 전이효소(glycosyltransferase)를 발현하는 재조합 균주의 종균 배양물을 쉐이크 플라스크(배지 100 mL)에서 37℃로 밤새 배양하였다. 발효를 위해, pH 미터 및 용존 산소(DO) 프로브를 제조자의 프로토콜에 따라 보정하였다. 시중에서 입수 가능한 수산화암모늄을 사용하여 pH를 7.0으로 유지시켰고 DO 수준은 전체 발효기간 동안 95% 이상으로 유지하였다. 600nm에서 배양된 배양액의 광학 밀도가 10에 이르면 유당(lactose)에 의해 배양이 유도되었고 온도는 20℃로 낮추어 주었다. 배양 6시간 후 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, 안트라플라빈산 및 알리자린 (최종 농도 약 0.3 mM)을 포함하는 240mg의 안트라퀴논을 생체내 전환을 위한 배양배지에 첨가하였다. 발효기를 60시간 동안 연속적으로 작동시키고, DO 및 pH를 상기와 같이 유지시켰다. 각 12시간 간격으로 50% 포도당 (멸균된) 100 mL를 적절한 성장을위한 탄소 공급원으로 공급했다. 발효가 끝날 때, 배양 배지를 수확하고 격렬하게 흔들면서 분액 깔때기에 2 배량의 에틸아세테이트를 첨가하였다. 이어, 수성층 및 유기층을 침전시켰다. 이어서 유기층을 회전 증발기를 사용하여 증발시켜 샘플을 농축시켰다. 최종 샘플을 메탄올에 용해시키고 preparative-HPLC를 사용하여 생성물을 정제하였다.

1-5. 분석과정

제조된 시료로부터 20 μL 부피를 주입하고, 역상 C18 칼럼 (Mightysil-RP-18GP, 250 x 4.6mm, Kanto Chemical, Japan)을 사용하여 HPLC-PDA (Shimadzu, Japan, SPD- M20A Detector)로 분석하였다. 이원 이동상은 용매 A (HPLC-grade water + 0.05% 트리플루오로 아세트산) 및 용매 B (100 % 아세토니트릴)로 구성되었다. 총 유속은 35분 프로그램에서 1 mL/min으로 유지되었다. ACN 농도는 10% (0-10 분), 20% (10-25 분), 100% (25-28 분), 70% (28-30 분) 및 10% (30-35 분)이었다.

생성물을 ACN 농도를 갖는 35분 바이너리 프로그램을 사용하여 420nm에서 설정된 UV 검출기에 연결된 C18 컬럼(YMC-Pack ADS-AQ (250 x 20 mm ID, 10 ㎛))을 갖는 prep-HPLC로 정제하였다. ACN 농도는 다음과 같다: 10% (0-10 분), 20% (10-15 분), 50% (15-20 분), 70% (20-25 분), 90% (25-30 분), 50% (30-34 분), 20% (34-35 분). 정제된 생성물은 동결 건조기에서 완전히 건조시키고 구조적 규명과 생체 활성을 분석하기 위해 사용되었다.

HQ-QTOF ESI/MS 스펙트럼은 SYNAPT G2-S (Waters)와 결합된 ACQUITY (UPLC; Waters, MA, USA)로 얻을 수 있었다. 생체내 전환된 대사산물의 구조적 규명을 위해, 표준물질을 포함한 샘플을 디메틸-설폭사이드-d6 (Sigma-Aldrich MO, USA)에 용해시켰다. 핵 자기 공명 (NMR)은 2 개의 2D NMR spectroscopies (heteronuclear single-quantum correlation [HSQC] and heteronuclear multiple-bond correlation [HMBC])로 ¹H, 1³C-NMR을 분석함으로써 수행되었다. 표준 분자는 300 MHz Brucker (Germany) BioSpin NMR을 사용하여 분석되었다. 대사산물의 구조는 MestReNova 11.0 프로그램 (Mestrelab Research S.L. Feliciano Barrera 9B - Bajo 15706 Santiago de Compostela, Spain)을 사용하여 규명하였다.

1-6. 암세포 증식 억제제의 효과

위암 세포(AGS)를 10% FBS가 함유된 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 배지에서 배양하였다. 자궁 경부암 세포(HeLa)와 간암 세포(HepG2)를 10% FBS가 첨가된 Dulbecco 's modified Eagle 's medium (DMEM)에서 성장시켰다. 모든 세포는 가습된 5 % CO₂ 배양기에서 37 ℃로 유지되었다. 세포 성장 분석을 위해 다양한 암세포를 96-웰 배양판에 2 x 10³ 세포/웰로 분주하였다. 화합물을 다양한 농도로 각 웰에 첨가하고, 세포를 72시간 동안 배양하였다. 세포 성장은 3- (4,5-디메틸 티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 (MTT) 비색 분석을 사용하여 측정되었다. 50 ㎕의 MTT (2 mg / mL 원액)를 첨가하고 플레이트를 추가로 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 100 ㎕의 DMSO를 첨가 하였다. 흡광도는 마이크로 플레이트 분광 광도계 (Thermo Scientific Multiskan　 Spectrum)를 사용하여 540 nm에서 측정하였다.

실시예 2. 안트라퀴논의 생체내 전환

글라이코실전이효소(glycosyltransefrase)를 발현시키기 위한 당 공여체로 E. coil 내의 UDP-포도당을 이용하여 안트라퀴논 글루코시드를 생합성하고자 하였다(도 1). 이를 위하여 실시예 1에 기재된 방법으로, pET28a-YjiC를 발현하는 재조합 균주를 이용하여 생체내 전환 반응을 위한 배양을 진행하였다. 안트라퀴논- 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, 안트라플라빈산 및 알리자린이 생체내 전환을 위해 선택되었다.

상기 3종의 안트라퀴논은 pET28a-YjiC가 도입된 E. coli BL21 (DE3)의 IPTG 유도 20 시간 후, 최종 농도가 0.2 mM이 되도록 각 플라스크에 넣어주었다. 배양 물은 60 시간까지 생체내 전환(biotransfrormation)을 허용한 후, 2배 용량의 에틸 아세테이트를 사용하여 수확하고, 분석용 HPLC-PDA로 분석하였다.

각 샘플의 HPLC-PDA를 분석한 결과, 예상대로 생성물의 피크는 각 반응 혼합물에서의 기질 피크보다 짧은 체류시간(t_R)을 나타내었다. 420nm의 UV 흡광도에서 2-아미노-3 하이드록시안트로퀴논-O-글루코시드의 경우, 그 기질의 피크의 t_R은 21.7분이었으나, 생체내 전환 후 새로운 피크의 t_R은 약 18.9분으로 나타났다. 안트라플라빈산-O-글루코시드의 경우, 그 기질의 피크의 t_R은 20.8분이었으나, 생체내 전환 후 새로운 피크의 t_R은 약 17.3분으로 나타났다. 그리고 알리자린-O-글루코시드의 경우, 그 기질의 피크의 t_R은 23.4분이었으나, 생체내 전환 후 새로운 피크의 t_R은 약 19.4으로 나타났다(도 2).

글리코실화 시스템으로부터 검출된 이들 생성물 피크를 양이온 모드에서 LC-QTOF-ESI/MS로 추가로 분석 하였다. 2-아미노-3-하이드록시 안트라퀴논 질량 스펙트럼의 [M+H]⁺m/z⁺는 ~ 240.0660의 정확한 질량을 나타내었고, 유도체는 2-아미노 -3-하이드록시 안트라퀴논의 글루코오스 컨쥬게이션 유도체와 유사한 [M+H]⁺m/z⁺ ~ 402.1175를 나타내었다. 마찬가지로, [M+H]⁺m/z⁺ ~403.1025 및 [M+H]⁺m/z⁺ ~ 403.1015의 질량 스펙트럼 질량값으로부터 안트라플라빈산 및 알리자린은 각각 글루코오스에 컨쥬게이션 된 것으로 예측할 수 있었다. 한편, 각 유도체는 안트라플라빈산 [M+H]⁺m/z⁺ ~ 241.0500 및 알리자린 [M+H]⁺m/z⁺~ 241.0490의 자매 조각과 함께 검출되었다(도 3). 본 실시예로부터 각 기질과 그들의 산물이 검출되었으나, 이들의 양을 확인할 수 없었기 때문에, 이후 산물로의 전환을 개선하기 위한 추가 실험을 진행하였다.

실시예 3. 진탕 플라스크에서 생산 최적화를 위한 포도당 보충

pET28a-YjiC를 발현하는 대장균 BL21 (DE3)이 공급된 안트라퀴논을 각각의 글루코시드로 생체내 전환시킬 수 있음을 확인한 후, 쉐이크 플라스크에서 안트라퀴논의 생체내 전환의 최적화를 유도하고자 하였다. 기질을 공급하지 않은 플라스크를 대조군으로서 유지하면서, 기질을 각 플라스크에 0.2 mM의 동일한 농도로 공급하였다. 각 플라스크에서 1 mL의 배양액 샘플을 60 시간까지 각 12 시간 간격으로 분리하여 이 중 0.5 mL의 배양액 시료는 세포 밀도를 분석하고, 0.5 mL의 배양액 시료는 HPLC 시료 준비를 위해 2배 부피의 에틸 아세테이트를 사용하여 추출하였다. HPLC를 통해 생산물을 분석한 결과, 36 시간 배양액으로부터 안트라퀴논 글루코시드의 최대 생산을 확인할 수 있었다(도 4).

안트라퀴논 글루코시드의 생산 수준을 향상시키기 위하여 여분의 포도당을 탄소 공급원으로 공급하고자 하였다. 각 균주 배양에서 포도당 농도를 각각 0%, 4%, 8%로 보충하였다. 서로 다른 시간 간격 (0 시간에서 60 시간)에서 각 글루코시드의 생산 프로필이 변경되었다. 이전에는 ~ 36 시간에 수확량이 가장 높았지만 포도당이 보충된 결과는 ~ 48 시간에 생산량이 가장 높다는 것을 보여주었다 (도 4).

48 시간 후의 HPLC-PDA 분석 결과, 4 % 포도당 보충시 알리자린의 약 53.89 %가 알리자린-O-글루코시드로 전환되었지만, 0%와 8%에서는 5.2%와 42.8%의 전환율을 보였다. 마찬가지로, 안트라플라빈산 반응 혼합물에서도 0%와 8% 포도당 보충시 각각 ~ 28 %와 84.6 %의 안트라플라빈산-O-글루코시드가 확인되었으나, 4% 포도당 보충시에는 87.5%가 안트라플라빈산-O-글루코시드로 전환되었다. 2-아미노-3-하이드록시 안트라퀴논의 글루코시드로의 전환율은 각각 0%, 4% 및 8% 글루코스 보충에서 50%, 53.8% 및 52.2%로 확인되었다.(도 4 및 도 5).

각 생체내 전환 반응에서 48 시간 후에는 생성물 형성이 감소하는 반면, 세포 성장은 방해받지 않는 것으로 나타났다(데이터는 표시되지 않음). 글루코시드 농도의 감소는 YjiC의 낮은 안정성 또는 탈 글리코실화 된 특성에 기인할 수 있을 것이다.

실시예 4. 안트라퀴논과 그 글루코시드 유도체의 항암 활성 비교

안트라퀴논의 항암 효과는 암세포 증식 억제 활성과 관련이 있다. 이에, 본 발명에서는 AGS, Hela 및 HepG2의 증식에 대한 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, 안트라플라빈산, 알리자린 및 이들의 글리코실화 유도체의 암세포 증식 억제 활성을 평가하였다. 암세포 성장에 대한 안트라플라빈산-O-글루코시드의 암세포 증식 억제 효과는 안트라플라빈산과 유사하였다. 한편, 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코 시드는 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논 보다 더 나은 성장 억제 효과를 나타내었다. 또한, 알리자린-O-글루코시드의 억제 효과는 다른 안트라퀴논 글루코시드보다 더 높게 나타나(도 6), 알리자린-O-글루코시드가 항암 활성에 가장 좋은 효과가 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. 생물 반응기에서 알리자린-O-글루코시드 생산 확대

알리자린-O-글루코시드의 항암 활성을 기반으로 실험실 규모의 발효조에서 미생물 생합성의 타당성을 연구하기 위해 동일한 분자에 대한 스케일 업 실험을 진행하였다. 반응 배양액을 12 시간의 일정한 시간 간격으로 수확하고 HPLC-PDA로 분석하여 알리자린의 글리코시드로의 전환율을 모니터링 하였다. 48 시간 후의 HPLC-PDA 분석 결과, 플라스크 (~ 53.89 %)보다 더 높은 비율인 67%로 알리자린이 알리자린-O-글리코시드로 전환되었다. 3 L 바이오 리액터로부터 ~ 265.32 mg의 알리자린-O-글루코시드가 생산되었다 (도 7).

실시예 6. 안트라퀴논 글루코시드 유도체의 구조 분석

생성물인 알리자린-O-글루코시드를 prep-HPLC를 사용하여 정제하였다. 정제 된 분획을 회전 증발기를 사용하여 농축시킨 후 동결 건조하여 수분 함량을 제거한 후 다양한 NMR 분석을 수행하였다. 아노머 양성자는 J value 7.4 Hz를 갖는 5.18 ppm에서에서 검출되었고, 아노머 탄소가 100 ppm에서 검출되어, 글루코오스가 베타 (β) 배열에서 컨쥬게이션 되었음을 나타내었다(도 8 내지 도 12, 표 1).

알리자린 글루코시드 생성물의 양성자 NMR 분석으로부터 10OH에 대한 유사한 피크는 12.62 ppm에서 유지되었으나, 2-OH의 수산기에 대한 사라진 피크로부터 가능한 당 컨쥬게이션이 알리자린의 2-OH에 위치함을 알 수 있었다. 이 결과는 아노머 탄소 및 아노머 양성장 사이의 HSQC에 의한 상관관계 분석에 의해서도 확인되었다(도 13). HMBC에서 151.57 ppm에서 나타나는 알리자린 신호의 2번 탄소는 δ 5.18 ppm에서 관찰되는 아노머 양성자와 직접적 관계를 갖는 것으로 나타났다(도 14). 이는 글리코실화 위치가 알리자린의 2-OH에 있음을 나타내고, 따라서 생성물은 알리자린 2-O-β-D- 글루코시드 임을 나타낸다. 또한, ¹H (3.0-5.5ppm) 및 ¹³C-NMR (60-100ppm) 분석에서 글루코오스 잔기에 대한 스펙트럼이 각각의 위치에 존재ㅎ하였다. NMR 분석은 이전에 발표된 보고서 (Kalidhar, B.S., 1989) 및 유기 화합물 SDBS의 스펙트럼 데이터베이스 (http://sdbs.db.aist.go.jp)와 비교하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다

<110> Industry-University Cooperation Foundation Sunmoon University <120> A Recombinant Microorganism for producing Anthraquinone-O-glucosides and a Method for Producing the Same <130> P18-B175 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Bacillus licheniformis <400> 1 Met Gly His Lys His Ile Ala Ile Phe Asn Ile Pro Ala His Gly His 1 5 10 15 Ile Asn Pro Thr Leu Ala Leu Thr Ala Ser Leu Val Lys Arg Gly Tyr 20 25 30 Arg Val Thr Tyr Pro Val Thr Asp Glu Phe Val Lys Ala Val Glu Glu 35 40 45 Thr Gly Ala Glu Pro Leu Asn Tyr Arg Ser Thr Leu Asn Ile Asp Pro 50 55 60 Gln Gln Ile Arg Glu Leu Met Lys Asn Lys Lys Asp Met Ser Gln Ala 65 70 75 80 Pro Leu Met Phe Ile Lys Glu Met Glu Glu Val Leu Pro Gln Leu Glu 85 90 95 Ala Leu Tyr Glu Asn Asp Lys Pro Asp Leu Ile Leu Phe Asp Phe Met 100 105 110 Ala Met Ala Gly Lys Leu Leu Ala Glu Lys Phe Gly Ile Glu Ala Val 115 120 125 Arg Leu Cys Ser Thr Tyr Ala Gln Asn Glu His Phe Thr Phe Arg Ser 130 135 140 Ile Ser Glu Glu Phe Lys Ile Glu Leu Thr Pro Glu Gln Glu Asp Ala 145 150 155 160 Leu Lys Asn Ser Asn Leu Pro Ser Phe Asn Phe Glu Asp Met Phe Glu 165 170 175 Pro Ala Lys Leu Asn Ile Val Phe Met Pro Arg Ala Phe Gln Pro Tyr 180 185 190 Gly Glu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Ser Phe Val Gly Pro Ser Leu Ala 195 200 205 Lys Arg Lys Phe Gln Glu Lys Glu Thr Pro Ile Ile Ser Asp Ser Gly 210 215 220 Arg Pro Val Met Leu Ile Ser Leu Gly Thr Ala Phe Asn Ala Trp Pro 225 230 235 240 Glu Phe Tyr His Met Cys Ile Glu Ala Phe Arg Asp Thr Lys Trp Gln 245 250 255 Val Ile Met Ala Val Gly Thr Thr Ile Asp Pro Glu Ser Phe Asp Asp 260 265 270 Ile Pro Glu Asn Phe Ser Ile His Gln Arg Val Pro Gln Leu Glu Ile 275 280 285 Leu Lys Lys Ala Glu Leu Phe Ile Thr His Gly Gly Met Asn Ser Thr 290 295 300 Met Glu Gly Leu Asn Ala Gly Val Pro Leu Val Ala Val Pro Gln Met 305 310 315 320 Pro Glu Gln Glu Ile Thr Ala Arg Arg Val Glu Glu Leu Gly Leu Gly 325 330 335 Lys His Leu Gln Pro Glu Asp Thr Thr Ala Ala Ser Leu Arg Glu Ala 340 345 350 Val Ser Gln Thr Asp Gly Asp Pro His Val Leu Lys Arg Ile Gln Asp 355 360 365 Met Gln Lys His Ile Lys Gln Ala Gly Gly Ala Glu Lys Ala Ala Asp 370 375 380 Glu Ile Glu Ala Phe Leu Ala Pro Ala Gly Val Lys 385 390 395

Claims

바실러스 리체니포미스 DSM 13 유래의 글라이코실전이효소(YjiC)가 도입되어 있는 안트라퀴논-O-글루코시드 생산용 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 재조합 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
제1항에 있어서, 상기 글라이코실전이효소는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
글라이코실전이효소(YjiC)가 발현된 제1항의 재조합 미생물 및 당 존재하에 안트라퀴논을 안트라퀴논-O-글루코시드로 전환시키는 단계를 포함하는 안트라퀴논-O-글루코시드 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 당은 미생물 내에 존재하는 UDP-포도당 또는 외부로부터 첨가된 포도당인 것을 특징으로 하는 안트라퀴논-O-글루코시드 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 안트라퀴논은 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논, 알리자린, 또는 안트라플라빈산인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제6항에 있어서, 상기 생성된 안트라퀴논-O-글루코시드는 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드, 알리자린-O-글루코시드, 또는 안트라플라빈산-O-글루코시드인 것을 특징으로 하는 제조방법.
하기 화학식 1로 표시되는 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드:
<화학식 1>

.
제8항의 2-아미노-3-하이드록시안트라퀴논-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.
하기 화학식 2로 표시되는 알리자린-O-글루코시드:
<화학식 2>
제10항의 알리자린-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.
하기 화학식 3으로 표시되는 안트라플라빈산-O-글루코시드:
<화학식 3>
제12항의 안트라플라빈산-O-글루코시드를 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물.