ES2471464T3 - Derivados de ácidos aure�licos, su procedimiento de obtención y sus usos - Google Patents

Derivados de ácidos aure�licos, su procedimiento de obtención y sus usos Download PDF

Info

Publication number
ES2471464T3
ES2471464T3 ES10801992.8T ES10801992T ES2471464T3 ES 2471464 T3 ES2471464 T3 ES 2471464T3 ES 10801992 T ES10801992 T ES 10801992T ES 2471464 T3 ES2471464 T3 ES 2471464T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
mtm
formula
overlapping
overlap
nmr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10801992.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Luz Elena N��Ez Gonz�Lez
Nuria Men�Ndez S�Nchez
Javier Gonz�Lez Sabin
Francisco Mor�S Varas
Beatriz Garc�A Fern�Ndez
Mar�A P�Rez Solares
Alfredo Fern�Ndez Bra�A
Mar�A Del Carmen M�Ndez Fern�Ndez
Jos� Antonio Salas Fern�Ndez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Entrechem SL
Original Assignee
Entrechem SL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Entrechem SL filed Critical Entrechem SL
Application granted granted Critical
Publication of ES2471464T3 publication Critical patent/ES2471464T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/545—Streptomyces griseus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Derivados de ácidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos. La presente invención proporciona una cepa bacteriana que produce compuestos pertenecientes a la família del ácido aureólico, de aplicación en el tratamiento del cáncer o enfermedades neurológicas.

Description

Derivados de ácidos aure�licos, su procedimiento de obtención y sus usos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta descripción se adscribe al campo farmacéutico y en concreto se refiere a compuestos con aplicación en oncología, con estructura química derivada de ácidos aure�licos y que se obtienen por fermentación de microorganismos y/o acilaci�n enzim�tica catalizada por lipasas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La familia del ácido aure�lico comprende a un grupo de metabolitos secundarios sintetizados por miembros del género bacteriano Streptomyces. Esta familia est� integrada por la mitramicina (MTM), las cromomicinas, las olivomicinas, la cromociclomicina, el UCH9 y la durhamicina (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14).
Los miembros de la familia del ácido aure�lico presentan interesantes actividades biológicas de aplicación farmacéutica, tales como propiedades antibacterianas, antivirales y neuroprotectoras, aunque su principal interés farmacol�gico reside en su actividad antitumoral. As� por ejemplo, la MTM tiene aplicación clónica en el tratamiento de determinados tipos de cáncer, tales como el carcinoma testicular, la leucemia mieloide crónica y la leucemia mieloide aguda. También se ha utilizado en el tratamiento de la enfermedad de Paget y de la hipercalcemia causada por lesiones óseas asociadas al cáncer (Oncology 1973, 28, 147-163; Biochem. Biophys. Res. Comun. 1993, 195, 1245-1253; Treat. Endocrinol. 2002, 1, 241-257; Treat. Endocrinol. 2003, 2, 273-292). Además, la MTM y la cromomicina A3 (CRM) se han descrito como potentes inhibidores de la apoptosis neuronal aberrante característica de ciertos desórdenes neurol�gicos (Ann. Neurol. 2001, 49, 345-354), lo que podría convertir a estas moléculas en agentes para el tratamiento de enfermedades neurol�gicas tales como accidente cerebrovascular, esclerosis lateral amiotr�fica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple y encefalitis v�rica (J. Neurosci. 2004, 24, 10335-10342; J. Biol. Chem. 2006, 281, 16672-16680). Más recientemente, se ha descrito que la MTM en combinación con otros fármacos podría constituir una nueva terapia antiangiog�nica para el tratamiento del cáncer de páncreas y otros tipos de cáncer (Cancer Res. 2007, 67, 4878-4885).
Las diferentes actividades biológicas de los ácidos aure�licos son consecuencia de su mecanismo de acción a nivel celular, que consiste en la unión no covalente de estas moléculas (en forma de d�meros en presencia de iones Mg2+) al surco menor del ADN en regiones con alto contenido GC. De este modo inhiben la transcripción g�nica, ya que desplazan a los activadores transcripcionales que se unen a las regiones ricas en GC presentes en determinadas secuencias promotoras (J. Clin. Invest. 1989, 83, 2003-2007; J. Clin. Invest. 1991, 88, 1613-1621). Tal es el caso de los factores de transcripción Sp1, una familia de proteínas de unión al ADN muy importantes para la transcripción de muchos genes celulares y virales que contienen cajas GC en sus regiones promotoras. Los factores Sp1 regulan múltiples funciones biológicas, incluyendo supervivencia celular, crecimiento y diferenciación, as� como desarrollo y progresión tumoral (J. Cell. Physiol. 2001, 188, 143-160).
Estructuralmente los compuestos del grupo del ácido aure�lico poseen una parte crom�fora (aglic�n) de origen policet�nico formada por tres anillos (cuatro en el caso de la cromociclomicina) y una cadena lateral altamente funcionalizada en el carbono 3. También presentan (con excepción de la olivomicina) un alquilo de cadena corta (metilo,
isobutilo) en el carbono 7. Asimismo, estos compuestos poseen 2-6 desoxiaz�cares unidos en forma de trisac�rido o tetrasac�rido (en el carbono 2) y monosac�rido o disac�rido (en el carbono 6). Los compuestos del grupo del ácido aure�lico difieren en la naturaleza y el modo de unión de sus cadenas gluc�dicas, que contienen diferentes 2,6didesoxiaz�cares. Estas variaciones estructurales son las responsables de las sutiles diferencias que existen entre los miembros del grupo en cuanto a su unión al ADN y su perfil de actividad biológica. Es bien conocido que el patrón de glicosilaci�n de los fármacos antitumorales que actúan uniéndose al ADN, como es el caso de los ácidos aure�licos, tiene gran importancia en su actividad biológica. Por ello, la obtención de nuevos derivados de MTM con patrones glicos�dicos alterados puede generar fármacos con actividad mejorada.
La MTM y la CRM (FIGURA 1) son los miembros más representativos de la familia del ácido aure�lico. La MTM es un fármaco antitumoral producido por microorganismos del género Streptomyces, incluyendo Streptomyces argillaceus ATCC 12956. La CRM es producida, entre otros, por Streptomyces griseus ssp. griseus ATCC13276. La biosíntesis de MTM y CRM ha sido ampliamente estudiada en las cepas productoras previamente citadas (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). Los agrupamientos g�nicos responsables de la biosíntesis de ambas moléculas han sido secuenciados íntegramente. Adicionalmente, la inactivaci�n específica de muchos de los genes biosint�ticos ha permitido obtener información acerca del mecanismo de biosíntesis de los ácidos aure�licos. As�, se ha descrito que la biosíntesis de estas moléculas comienza con la condensación de 10 unidades de acil-coenzima A para generar un intermediario tetrac�clico, denominado premitramicinona. A continuación, 5 unidades de desoxiaz�cares son añadidas de forma sucesiva, gener�ndose intermediarios tetrac�clicos con diferente grado de glicosilaci�n. La acción de una oxigenasa en uno de los pasos finales de la biosíntesis tiene como consecuencia la ruptura de uno de los anillos, generando una estructura tric�clica con una cadena lateral alif�tica unida a la posición 3 del aglic�n. Finalmente, la reducción de un grupo ceto en la cadena lateral, genera la molécula final.
En el caso de la CRM cabe destacar la existencia de dos pasos biosint�ticos adicionales que suponen la modificación de los azúcares después de haber sido transferidas al aglic�n: una metilaci�n en posición 4B (llevada a cabo por CmmMIII) y dos acetilaciones en posiciones 4A y 4E (catalizadas por CmmA). La presencia de estos grupos metilo y acetilo en los azúcares de la CRM confiere características específicas a la unión con el ADN, ya que aportan enlaces de hidrógeno adicionales con los grupos amino de las bases de guanina, incrementando as� la especificidad en la unión al ADN (Biochem. 1997, 36, 2291-2299). La gran importancia de los grupos acetilo en la actividad biológica de la CRM qued� de manifiesto con la inactivaci�n del gen cmmA en S. griseus, que permitió obtener un derivado desacetilado de la CRM que presenta una actividad antitumoral significativamente inferior a la molécula parental (Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915). Por ello, la obtención de nuevos derivados de ácidos aure�licos con distintos patrones de acilaci�n puede generar fármacos con propiedades farmacol�gicas más interesantes.
Actualmente existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. En este sentido, el desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos. Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.
La manipulación genética de microorganismos ha sido ya utilizada para la obtención de nuevos derivados de tipo ácido aure�lico (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). Algunos de estos derivados presentan características mejoradas con respecto a la molécula parental. Tal es el caso de los derivados obtenidos a partir de Streptomyces argillaceus M7W1, cepa generada a partir de Streptomyces argillaceus mediante inactivaci�n del gen mtmW (US 7,423,008 B2; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753). El gen mtmW codifica una cetorreductasa, y su inactivaci�n da como resultado la acumulación de 3D-desmicarosil-MTM-SK, MTM-SK, MTM-SA y MTM-SDK, moléculas que difieren de la MTM a nivel de la cadena lateral de la posición 3.
La biocat�lisis por su parte es una herramienta muy eficaz para modificar productos naturales complejos y generar diversidad estructural (Curr. Opin. Chem. Biol. 2001, 5, 106-111; Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10, 130-136). En particular, el descubrimiento de que tanto lipasas como proteasas (enzimas hidrol�ticos de lípidos y proteínas respectivamente) son capaces de catalizar reacciones en disolventes orgánicos distintos a su medio acuoso natural desencaden� una intensa investigación con estos biocatalizadores. Entre sus atractivos fundamentales destacan los excelentes niveles de quimio-, regio-y estereoselectividad exhibidos as� como su capacidad para operar en condiciones de reacción suaves. En la literatura existen ejemplos de acilaci�n regioselectiva catalizada por lipasas de una gran variedad de productos naturales polihidroxilados tales como nucle�sidos, saponinas, flavonoides, terpenos, alcaloides y polic�tidos glicosilados. De estas librerías de compuestos acilados han surgido nuevos derivados con una mejora sustancial de actividad respecto a los compuestos originales.
Los ácidos aure�licos presentan en su estructura numerosos grupos hidroxilo susceptible de ser acilados, tanto en los azúcares como en el aglic�n. Sin embargo, y a pesar de su potencial evidente, no existen antecedentes de este tipo de acilaciones enzim�ticas con esta familia de compuestos.
Documentos M. Bataller et al., 2008; Lily L. Remsing et al., 2003; Perez, M. et al., 2008; US2005/192432A1 y WO2008/096028A1; divulgan compuestos parecidos al compuesto VII de la invencion. Sin embargo, ninguno de dichos documentos divulga un compuesto que tiene la combinacion especifica de restos en R5 y R2 del compuestos VII de la invención.
DESCRIPCI�N DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona una nueva cepa bacteriana denominada Streptomyces argillaceus ΔAH-W(pMP3*BII), la cual produce nuevos derivados de MTM. Para la obtención de esta cepa se partió de la cepa recombinante ya existente Streptomyces argillaceus ΔAH, un mutante sobreproductor de MTM que presenta inactivados los genes mtmA y mtmH (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). Sobre este mutante se llev� a cabo posteriormente la inactivaci�n del gen mtmW, obteniéndose de esta manera el doble mutante S. argillaceus ΔAH-W-(ver Ejemplo 1). El gen mtmW codifica una cetorreductasa, y su inactivaci�n en la cepa silvestre da como resultado la acumulación de 3D-desmicarosil-MTM-SK, MTM-SK, MTM-SA y MTM-SDK (US 7,423,008 B2; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753). Finalmente, la generación de la cepa Streptomyces argillaceus ΔAH-W-(pMP3*BII) implica la introducción de un ácido nucleico adicional en el mutante ΔAH-W-.
Concretamente el ácido nucleico utilizado para la presente invención es el contenido en el pl�smido pMP3*BII (Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 6644-6652). Dicho pl�smido contiene ácidos nucleicos que codifican enzimas para la biosíntesis de nucleosidildifosfato (NDP)-D-digitoxosa, un azúcar no sintetizado de manera natural por S. argillaceus.
La introducción de ácidos nucleicos en Streptomyces argillaceus (o en cepas derivadas) se puede realizar mediante transformación de protoplastos, conjugación, u otros métodos conocidos (tales como lo descritos en Practical Streptomyces Genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000), de tal forma que los ácidos nucleicos son replicables en el organismo, bien en forma de elemento extracromos�mico o bien integrados en el cromosoma del organismo. La cepa bacteriana de esta invención pueden ser cultivada en cualquier medio adecuado, en condiciones que permitan su crecimiento, tal como se describe en Gene 1996, 172, 87-91; J. Bacteriol. 1998, 180, 49294937; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753. Tras varios días de incubaci�n, estos cultivos contienen una cantidad elevada de células (micelio), junto con una mezcla de compuestos, incluyendo derivados de ácidos aure�licos. A continuación, los cultivos son sometidos a diferentes procesos para la separación de una fase líquida (sobrenadante) y una fase sólida (micelio). Seguidamente las dos fases son sometidas, separadamente, a diversos procedimientos que pueden incluir extracción con diversos solventes orgánicos, y varios tipos de cromatograf�as (tales como HPLC, cromatograf�a líquida de alto rendimiento), con el fin de obtener los derivados de ácidos aure�licos en forma de compuestos puros.
Asimismo, esta descripción divulga nuevos compuestos pertenecientes a la familia del ácido aure�lico, derivados de MTM y CRM. Estos nuevos derivados presentan modificaciones a nivel del patrón de glicosilaci�n y/o acilaci�n con respecto a las moléculas parentales y pueden ser obtenidos mediante a) producción directa de nuevos compuestos llevada a cabo por una cepa modificada genéticamente; b) bioconversi�n realizada por actividades enzim�ticas presentes en un microorganismo sobre sustratos añadidos al medio de cultivo; c) acilaci�n enzim�tica catalizada por lipasas.
En el sentido de la presente invención se entiende por bioconversi�n la transformación biológica de un sustrato, llevada a cabo por un microorganismo, a una forma modificada químicamente. Más concretamente, en la presente invención se utiliza el microorganismo recombinante Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV (Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 167-177), para obtener el derivado de ácido aure�lico de la invención. Esta cepa es capaz de acetilar derivados de MTM añadidos al medio de cultivo por la actividad del enzima CmmA, una aciltransferasa responsable de la modificación de los azúcares de la CRM en posiciones 4A y 4E (Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915).
En el sentido de la presente invención se entiende por acilaci�n enzim�tica la transformación regioselectiva de un sustrato en un derivado acilado a partir de su reacción con un agente acilante catalizada por lipasa. Lipasas útiles para la acilaci�n pueden encontrarse en Tetrahedron 2004, 60, 501-519; Chem. Soc. Rev. 2004, 33, 201-209; o Adv. Synth. Catal. 2006, 348, 797-812. Más concretamente, en la presente invención se utiliza la lipasa B de Candida antarctica (CAL-B) y la lipasa A de Candida antarctica (CAL-A), para obtener el compuesto de la invención. Estas lipasas se presentan en diferentes formas de inmovilización sobre soportes hidrófobos y mecánicamente resistentes o sobre resinas acril�cas, como puede ser una resina epoxiacr�lica activada con grupos deca-octilo. Agentes acilantes útiles para la presente invención son aquellos que pueden actuar como sustratos de la lipasa utilizada dando lugar a la acilaci�n del ácido aure�lico, y pueden ser ésteres, carbonatos y anh�dridos. Preferiblemente, el agente acilante y el disolvente son el mismo, a excepción de aquellos casos en que el ácido aure�lico es poco soluble en el agente acilante o éste último es un sólido, en cuyo caso se facilita la disolución con un pequeño volumen de tetrahidrofurano. En general la temperatura debe mantener la estructura de la enzima intacta sin que se produzcan fenómenos de desnaturalización. La reacción puede llevarse a cabo entre 5 y 60�C, preferiblemente entre 10 y 60�C, más preferiblemente entre 20 y 50�C.
Asimismo, la presente descripción divulga compuestos caracterizados por la fórmula general (I):
Me OMe
(I)
donde,
R1 es hidrógeno o un grupo protector,
R2 es hidrógeno, o un grupo protector, o un monosac�rido de fórmula (II),
R1O
OR1
o un monosac�rido de fórmula (III), R1O
OR1
o un monosac�rido de fórmula (IV),
20
R3 es hidrógeno o un grupo acetilo, R4 es un monosac�rido de fórmula (V),
30 o un monosac�rido de fórmula (VI)
35 R5 puede ser seleccionado entre los siguientes sustituyentes:
teniendo en consideración que si R2 es el monosac�rido de fórmula (III) o el monosac�rido de fórmula (IV), al menos un R1 debe ser un grupo protector, y
considerando igualmente que si R2 es hidrógeno y R5 es entonces, al menos un R1 debe ser un grupo protector.
Un grupo protector comprende, pero no est� limitado a, un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo
10 heteroc�clico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heteroc�clico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carbox�lico, un grupo aldehido, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxo o una combinación de ellos.
15 La estereoqu�mica de los carbonos a, b y c, as� como la de los centros quirales presentes en R5 puede ser R, S, o una mezcla de ambos.
A los efectos de la presente descripción, los dos enlaces ondulantes presentes en la fórmula general (I) sobre los carbonos d y e indican que los correspondientes sustituyentes pueden estar tanto en posición axial como en ecuatorial.
20 En particular, la presente descripción divulga, entre otros, los compuestos con las fórmulas (VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIV, XXIII, XXIV, XXV, XXIX, XXX, XXXI, XXXII, XXXIV, XXXVI, XXXVIII, XLI, XLIV, XLV, XLVI, XLVII, XLVIII, XLIX, LI, LII, LIII, LIV, LV, LVI, LVII, LVIII, LXI, LXIX, LXXX, XCII, XCIII, XCIV, XCV y XCVI):
Me HO
OMe
O OO
HO HO Me
Me HO
O O OH
Me HO OMe
O OO
HO HO Me
HO
Me HO OMe
O OO
HO HO Me
Me HO
O O OH
Me Me HO O
OO
HO O HO Me
HO
Me HO OMe
O OO
HO HO Me
Me HO
O O OH
OMe O
Me
OMe O
Me
OMe O
Me
OMe
OH
OMe
OH
(XI)
Me OMe OH
OH
Me OMe OH
OH
OH
Me OMe OH
OH
OH
Me OMe OH
OH
OH
O Me OMe OH
OH
OH
OH
Me OMe OH
OH
Me OMe OH
OH Me OMe OH
OH Me OMe OH
OH
Me OMe OH
OH Me OMe O
OH
Me OMe O
OH
Me
HO
Me
HO HO
(XCVI)
Los compuestos divulgados en la presente descripción son inhibidores del crecimiento de tumores y son por tanto útiles en el tratamiento del cáncer.
De esta forma, son objeto de la presente descripción las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento.
Es también objeto de la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo para inhibir el crecimiento de un tumor.
Tal como es usado aquí, “inhibir” significa disminuir, hacer más lento, o detener. Por tanto, un compuesto de esta descripción puede disminuir, hacer más lento, o detener el crecimiento de una célula tumoral. Tal como es usado aquí, “crecimiento” significa aumento en tamaño, o proliferaci�n, o ambos. Por tanto, un compuesto de esta descripción puede inhibir el aumento de tamaño de una célula tumoral y/o puede impedir que la célula tumoral se divida y aumente el número de células tumorales. Una “célula tumoral” es una célula que constituye un neoplasma (crecimiento nuevo), el cual puede ser canceroso (maligno) o no canceroso (benigno). Una célula tumoral cancerosa puede invadir los tejidos normales a su alrededor y los vasos sanguíneos/linfáticos y formar metástasis en tejidos alejados del tumor original. Por el contrario, una célula tumoral no cancerosa puede crecer y comprimir los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos, y tampoco puede formar metástasis en tejidos alejados del tumor original.
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo para tratar el cáncer.
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento con actividad antitumoral.
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
Es también divulgado en la presente descripción un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con cáncer, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo.
Tal como es usado aquí, un “sujeto” puede incluir animales domesticados (por ejemplo, gatos, perros, etc.), ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, cobayas, etc.) y pájaros. De manera preferente, el sujeto es un mamífero tal como un primate y, con mayor preferencia, un ser humano.
En general, una “cantidad efectiva” de un compuesto es aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado. Por ejemplo, la cantidad efectiva de un compuesto divulgado en la presente descripción trata el cáncer mediante la inhibición del crecimiento de las células que constituyen el tumor, con lo que previene la invasión de tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos por parte de las células tumorales y, por tanto, previene metástasis. Ejemplos de c�nceres que pueden ser tratados incluyen, pero no est�n limitados a, pulmón, colon, ovario, pr�stata, testículo, melanoma, ri��n, mama, sistema nervioso central y leucemia. La expresión “composición farmacéutica aceptable”
consiste en un material adecuado biol�gicamente, es decir, que el material puede ser administrado al sujeto sin causarle efectos biológicos sustancialmente dañinos.
Las dosis o cantidades de los compuestos divulgados en la presente descripción deben ser suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Sin embargo, la dosis no debe ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, por ejemplo reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafil�cticas, y similares. Generalmente, la dosis variar� con la edad, condición, sexo y el grado de la enfermedad del sujeto, y puede ser determinada por cualquier experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por cada m�dico, en base a la condición clónica del sujeto implicado. La dosis, régimen de dosificación y ruta de la administración pueden variarse. Las dosis y el régimen de dosificación actualmente empleados para la MTM proporcionan una guía para las dosis y el régimen de dosificación que pueden emplearse para los nuevos derivados de ácidos aure�licos (ver por ejemplo Cancer Treat. Rep. 1979, 63, 1835-1838; Ann. Intern. Med. 1975, 83, 659-660).
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad de Paget.
Es también divulgado en la presente descripción un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con la enfermedad de Paget, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento para el tratamiento de la hipercalcemia.
Es también divulgado en la presente descripción un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con hipercalcemia, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento para el tratamiento de la hipercalciuria.
Es también divulgado en la presente descripción un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con hipercalciuria, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Es también divulgado en la presente descripción el uso de un compuesto de fórmula (I) una sal o solvato farmac�uticamente aceptable del mismo en la manufacturaci�n de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurol�gicas.
Es también divulgado en la presente descripción un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con una enfermedad neurol�gica, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de fórmula (I) o una sal o solvato farmac�uticamente aceptable. El sujeto puede ser un mamífero, preferentemente un ser humano, y el compuesto puede ser, entre otras vías, administrado parenteralmente.
Ejemplos de enfermedades neurol�gicas que pueden ser tratadas incluyen, pero no est�n limitados a, enfermedades neurodegenerativas tales como las de Parkinson, Alzheimer, y Huntington. Los compuestos divulgados en la presente descripción pueden ser útiles para la investigación en bioquímica o biología celular. Por ejemplo, los compuestos pueden ser útiles para bloquear la expresión de c-Src (y otros enzimas dependientes de Sp1) en osteoclastos u otros tipos celulares.
Cualquiera de los compuestos divulgados en la presente descripción puede ser utilizado terapéuticamente formando parte de una composición farmacéutica aceptable. Cualquier experto en la materia puede crear composiciones farmacéuticas aceptables, las cuales pueden consistir en soluciones estériles en agua, soluciones salinas, o soluciones tamponadas a pH fisiológico. Cualquiera de los compuestos divulgados en la presente descripción puede ser preparado en forma de composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir diversos agentes transportadores, espesantes, diluentes, tamponantes, conservantes, tensoactivos, y otros, además del compuesto divulgado en la presente descripción. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, antiinflamatorios, anestésicos, etc.
Los compuestos divulgados en la presente descripción pueden ser administrados al sujeto de varias maneras distintas, dependiendo de si se desea que el tratamiento sea local o sist�mico, y dependiendo del área a ser tratada. As� por ejemplo, un compuesto divulgado en la presente descripción puede ser administrado en forma de solución oft�lmica, de aplicación en la superficie del ojo. Además un compuesto puede ser administrado a un sujeto por vía vaginal, rectal, intranasal, oral, por inhalaci�n, o por vía parenteral, ya sea por ruta intradermal, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinf�tica, intravenosa, intratecal e intratraqueal. La administración parenteral, si se emplea, se realiza generalmente mediante inyección. Los inyectables pueden ser preparados de diversas formas, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para ser disueltas o puestas en suspensión antes de la inyección, o como emulsiones. Otras formas de administración parenteral emplean sistemas de liberación lenta o sostenida, de tal forma que se consigue mantener una dosis constante (ver, por ejemplo, patente US 3,710,795). Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones, que además pueden contener tampones y aditivos diluentes y otros. Ejemplos de solventes no acuosos son: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Ejemplos de solventes acuosos son: agua, soluciones alcohólico-acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo soluciones salinas y tamponadas. Ejemplos de vehículos parenterales son: solución de cloruro sádico, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc. Las formulaciones para administración típica pueden incluir cremas, lociones, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. También pueden ser necesarios o deseables ciertos transportadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, oleosas, o en polvo, espesantes, etc. Las composiciones para administración oral pueden incluir polvos o gránulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, o tabletas. Puede ser deseable la inclusión de agentes espesantes, saborizantes, diluentes, emulsionantes, dispersantes, etc.
A los efectos de la presente descripción, el término “derivado” de ácidos aure�licos debe interpretarse como un compuesto cubierto por la fórmula general (I).
EXPLICACI�N DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE
Ejemplo 1: Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces argillaceus ΔAH-W-(pMP3*BII)
En el presente ejemplo se emplean técnicas de Biología Molecular convencionales en el actual estado de la técnica. Las preparaciones de pl�smidos, aislamiento de ADN total, digestiones con enzimas de restricción, tratamientos con fosfatasa alcalina, ligaciones de ADN, etc., se llevaron a cabo siguiendo métodos estandarizados previamente descritos por Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001), y por Kieser y colaboradores (Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000). Los fragmentos de ADN fueron aislados de geles de agarosa utilizando el kit de extracción “GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit” (GE Healthcare) La cepa Escherichia coli DH10B (Invitrogen) se utilizó como huésped general de clonaci�n.
Las cepas derivadas de S. argillaceus descritas en la presente invención se cultivaron para su esporulaci�n en medio A
(J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998) a 30�C; para la producción de antibiótico se cultivaron en medio R5A (J. Bacteriol., 180, 4929-4937, 1998), utilizando un in�culo previamente obtenido de un cultivo en medio TSB (Merck). La introducción de ADN en cepas de Streptomyces se llev� a cabo mediante transformación de protoplastos (Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000). Para el cultivo de cepas conteniendo marcadores de resistencia, los medios de cultivo fueron suplementados con los antibióticos apropiados en cada caso a las concentraciones siguientes: 100 μg/ml ampicilina, 25 μg/ml tiostreptona (en medio sólido), 5 μg/ml tiostreptona (en medio líquido) y 100 μg/ml higromicina.
La generación de la cepa bacteriana Streptomyces argillaceus ΔAH-W-(pMP3*BII) se llev� a cabo en dos etapas:
1.1. Obtención de la cepa mutante S. argillaceus ΔAH-W
1.2. Introducción del pl�smido pMP3*BII en la cepa S. argillaceus ΔAH-W
1.1. Obtención de la cepa mutante S. argillaceus ΔAH-W-
La caracterización de la ruta de biosíntesis de MTM implicó la generación de cepas mutantes que presentasen inactivados de manera selectiva diferentes genes identificados en el agrupamiento g�nico. Una de dichas cepas fue S. argillaceus ΔAH, un mutante generado por reemplazamiento g�nico en el cual se inactivaron conjuntamente los genes mtmA y mtmH. MtmA es una proteína de fusión que presenta un dominio S-adenosilmetionina sintetasa y otro metilentetrahidrofolato reductasa; por su parte, MtmH es similar a S-adenosilhomociste�na hidrolasas (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). Este tipo de enzimas est�n relacionados con la síntesis de S-adenosilmetionina, cofactor utilizado por las metiltransferasas que participan en la biosíntesis de MTM (J. Biol. Chem. 2000, 275, 3065-3074). Sin embargo, a pesar del papel asignado previamente a estos dos genes, el mutante S. argillaceus ΔAH result� no estar afectado en el perfil de metilaci�n de los productos acumulados, ya que seguía produciendo MTM, y además a niveles sustancialmente superiores a los de la cepa silvestre, lo cual sugiere un papel regulador de uno o ambos genes en la biosíntesis de MTM (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006, 73, 1-14). La obtención del mutante S. argillaceus ΔAH y los
an�lisis de la producción se describen detalladamente en la Tesis Doctoral: “Biosíntesis de mitramicina por Streptomyces argillaceus: caracterización de genes implicados en la metilaci�n de la estructura policet�dica” (María José Fernández Lozano, 1999).
Sobre la cepa sobreproductora de MTM S. argillaceus ΔAH se llev� a cabo la inactivaci�n del gen mtmW, un gen que codifica una cetorreductasa que participa en la reducción en la cadena lateral y que constituye el paso final en la biosíntesis de MTM. La inactivaci�n previa de mtmW en S. argillaceus ATCC12956 permitió obtener la cepa mutante M7W1, la cual acumula nuevos derivados de MTM que presentan diferencias a nivel de la cadena lateral: 3Ddesmicarosil-MTM-SK, MTM-SK, MTM-SDK y MTM-SA (US 7,423,008 B2; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753).
Para inactivar mtmW en el mutante S. argillaceus ΔAH se sustituyó en el cromosoma de dicho mutante la copia activa del gen mtmW por otra modificada in vitro. Para ello, se abord� el siguiente experimento de reemplazamiento g�nico: un fragmento de ADN BamHI de 4.5 kb conteniendo el extremo 3´ de mtmV, los genes mtmW, mtmGIV y el extremo 5´ de mtmGIII se clon� en el vector pBSKT (J. Bacteriol. 1999, 181, 642-647) digerido con BamHI, generando la construcción pM7W0 (J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 5745-5753). A continuación se clon� un gen de resistencia a higromicina en un sitio de restricción BglII (previamente hecho romo mediante tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa) interno a mtmW y único en pM7WO, obteniéndose as� el pl�smido pW0Hyg1. En este pl�smido el gen de resistencia a higromicina est� clonado en el mismo sentido de la transcripción que mtmW. El gen de resistencia a higromicina fue obtenido del vector pLHyg (Chem. Biol. 2004, 11, 87-97) mediante digestión con EcoRV.
El pl�smido pW0Hyg1 fue introducido en S. argillaceus ΔAH mediante transformación de protoplastos según ha sido descrito (Practical Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, England, 2000). Para obtener el reemplazamiento de la copia silvestre del gen por la mutada es necesario un doble sobrecruzamiento. Los transformantes en los que había ocurrido un acontecimiento de doble sobrecruzamiento fueron seleccionados por su resistencia a higromicina (100 μg/ml) y su sensibilidad a tiostreptona (25 μg/ml). Entre estos transformantes, uno de ellos fue seleccionado para continuar su caracterización, correspondiendo a la cepa S. argillaceus ΔAH-W-.
Posteriores análisis por HPLC-MS de extractos de cultivos de la cepa S. argillaceus ΔAH-W-mostraron que dicha cepa había perdido la capacidad de producir MTM, acumulando en su lugar los derivados previamente caracterizados 3Ddesmicarosil-MTM-SK, MTM-SK, MTM-SDK y MTM-SA.
1.2. Introducción del pl�smido pMP3*BII en la cepa S. argillaceus ΔAH-W-
La cepa S. argillaceus ΔAH-W-(pMP3*BII) se gener� introduciendo, mediante transformación de protoplastos, el pl�smido pMP3*BII en S. argillaceus ΔAH-W-. El pl�smido pMP3*BII ha sido descrito con anterioridad, y contiene una serie de genes que codifican la biosíntesis de nucleosidildifosfato (NDP)-D-digitoxosa (Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 6644-6652).
La cepa Streptomyces argillaceus ΔAH-W-(pMP3*BII) fue depositada con fecha 04/06/2009 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de identificación CECT 7556.
Ejemplo 2: Producción y aislamiento de 3D-desmicarosil-3D- -D-digitoxosil-MTM-SK (fórmula VII), 3Ddesmicarosil-MTM-SDK (fórmula VIII), 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SDK (fórmula IX), 3Ddesmicarosil-MTM-SA (fórmula X), 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SA (fórmula XI).
Para la purificación de los nuevos derivados de MTM-SK, MTM-SDK y MTM-SA producidos por S. argillaceus ∀AH-W(pMP3*BII), se cultiv� esta cepa en medio R5A sólido (J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937) suplementado con tioestreptona (concentración final 25 #g/ml). De este modo, se sembraron uniformemente 150 placas de agar con esporas de la cepa recombinante ∀AH-W-(pMP3*BII). Tras 10 días de incubaci�n a 30� C, los cultivos se extrajeron 6 veces con acetato de etilo y los extractos obtenidos fueron secados en vacío. A continuación, el extracto seco fue disuelto en 50 ml de agua destilada para realizar una extracción en fase sólida (SepPak Vac C18, Waters) (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531). Los compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol y agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min), recogiendo fracciones cada 5 minutos. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC, empleando un equipo cromatogr�fico Agilent Technologies 1200 Series, usando como solventes acetonitrilo y ácido trifluoroac�tico (0.1%) en agua y una columna de fase reversa (Zorbax Eclipse XDB-C18, RR, 1.8 #m, 4.6 x 50 mm, Agilent). Las muestras fueron elu�das empleando un método de tres gradientes lineales, el primero del 10% al 60% de acetonitrilo a lo largo de 5.7 minutos, a continuación hay otro gradiente del 60% al 100% de acetonitrilo durante 0.5 minutos y el tercer gradiente del 100% al 10% de acetonitrilo durante 1.9 minutos, a un flujo de 2 ml/min. La longitud de onda a la que se obtuvieron los cromatogramas fue de 278 nm. Aquellas fracciones que contenían los compuestos de interés (fracciones del 70% al 100% metanol) fueron mezcladas y evaporadas en el rotavapor. Este extracto seco, previamente disuelto en 10 ml de metanol, fue cromatografiado en una columna XBridge Prep C18 (30 x 150 mm, Waters), utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (35:65) a un flujo de 20 ml/min y se colectaron los picos de interés. Todos los compuestos recogidos fueron repurificados empleando la misma columna e idéntica mezcla de solventes. Cada una de las fracciones obtenidas fue colectada sobre tampón fosfato 0,1M pH 7 y tras cada la purificación, las muestras se diluyeron cuatro veces con agua y se sometieron a extracción en fase sólida para eliminar el ácido de la fase móvil y concentrar los compuestos, los cuales por último fueron liofilizados para su conservación. De este modo fueron aislados seis compuestos, tres de los cuales corresponden a nuevos derivados (FIGURA 2): 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK (fórmula VII), 3Ddesmicarosil-MTM-SDK (fórmula VIII), 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SDK (fórmula IX) y los tres restantes son compuestos anteriormente descritos: 3D-desmicarosil-MTM-SK, MTM-SK y MTM-SDK (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 5745-5753; Nucleic Acids Res., 2006, 34, 1721-1734; US 7,423,008 B2).
Adicionalmente, después de las extracciones con acetato de etilo, los cultivos fueron sometidos a una nueva extracción, esta vez con metanol. El extracto una vez filtrado y secado en el rotavapor, fue procesado de modo similar al descrito al inicio de este ejemplo. De esta manera, fue posible aislar y purificar otros tres compuestos, dos de los cuales corresponden a nuevos derivados: (FIGURA 3) 3D-desmicarosil-MTM-SA (fórmula X), 3D-desmicarosil-3D-!-Ddigitoxosil-MTM-SA (fórmula XI) y el tercer compuesto aislado es MTM-SA, la cual ya fue descrita con anterioridad (J. Am. Chem. Soc., 2003, 125, 5745-5753).
Los nuevos derivados se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y el tiempo de retención. A continuación se realizó el análisis de MS para determinar la masa de los nuevos compuestos en un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters-Micromass) mediante ionizaci�n de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Las masas de los iones moleculares obtenidas para los nuevos derivados fueron: m/z [H+] 1042 en el caso del 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK (fórmula VII), m/z [H+] 910 en el caso del 3D-desmicarosil-MTM-SDK (fórmula VIII), m/z [H+] 1040 en el caso del 3D-desmicarosil-3D-!-Ddigitoxosil-MTM-SDK (fórmula IX), m/z [H+] 884 en el caso del 3D-desmicarosil-MTM-SA (fórmula X), m/z [H+] 1014 en el caso del 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SA (fórmula XI).
5 La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Los espectros fueron registrados a 298K en un espectrofotómetro Bruker Avance 600, empleando acetona-d6 como disolvente. Las señales del disolvente se utilizaron como referencia interna. Los experimentos de RMN fueron procesados usando el programa Topsin 1.3 (Bruker GMBH, Karlsruhe, Alemania). Todas las asignaciones de RMN est�n basadas en espectros de 1H, COSY y TOCSY. En aquellos casos en que se estim� necesario se llevaron a cabo
10 también experimentos de 13C, DEPT-135, y HSQC. Las tablas 1 a 5 muestran los datos obtenidos para los compuestos de fórmulas (VII), (VIII), (IX), (X) y (XI).
Tabla 1: RMN de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK (fórmula VII). C50H72O23 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto VII
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1 202.1 C
2 4.76 d (11.3) 78.0 CH
3 2.50 (solapado) 43.4 CH 4ec 3.17 dd (15.7, 3.6) 29.7 CH2 4ax 3.00 (solapado) 4a 135.2 C
5 6.92 (s) 101.2 CH 6 159.7 C 7 110.1 C 7-CH3 2.16 (s) 7.6 CH3 8 152.2 C 8a 107.2 C 9 164.0 C 9a 107.9 C
10 6.92 (s) 116.5 CH 10a 138.8 C 1' 4.25 dd (3.4, 1.5) 78.9 CH 1'-OCH3 3.57 (s) 59.6 CH3 2' 4.32 d ancho (3.4) 79.1 CH 3' 209.5 C 4' 2.34 (s) 25.8 CH3
1A 5.42 dd (9.6, 1.9 ) 96.7 CH 2Aax 1.88 ddd (12.0, 12.0, 9.6) 37.1 CH2 2Aec 2.50 (solapado) 3A 3.78 ddd (12.0, 8.9, 5.0) 80.9 CH 4A 3.08 t (8.9) 75.0 CH 5A 3.55 (solapado) 72.3 CH 6A 1.34 d (6.1) 17.6 CH3
1B 4.77 dd (9.5 y 1.7) 99.5 CH 2Bax 1.56 ddd (12.0, 12.0, 9.5) 39.6 CH2
Tabla 1 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto VII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
2Bec
2.20 ddd (12.0, 4.9, 1.7)
3B
3.55 (solapado) 71.0 CH
4B
2.99 t (9.2) 77.2 CH
5B
3.40 dc (9.2 y 6.2) 72.3 CH
6B
1.32 d (6.2) 17.2 CH3
1C
5.13 dd (9.6 y 1.6) 100.4 CH
2Cax
1.62 ddd (12.1, 12.0, 9.6) 37.5 CH2
2Cec
2.50 (solapado)
3C
3.70 (solapado) 81.4 CH
4C
3.03 t (8.9) 75.3 CH
5C
3.33 dc (8.9 y 6.4) 72.3 CH
6C
1.33 d (6.4) 17.2 CH3
1D
4.70 dd (9.5 y 1.5) 99.8 CH
2Dax
1.81 ddd (12.0, 12.0, 9.5) 32.1 CH2
2Dec
1.96 ddd (12.0, 5.0 y 1.5)
3D
3.90 ddd (11.9, 5.0, 1.9) 76.5 CH
4D
3.70 (solapado) 68.5 CH
5D
3.70 (solapado) 70.6 CH
6D
1.31 d (6.2) 16.1 CH3
1E
5.03 dd (9.6 y 1.9) 96.9 CH
2Eax
1.70 ddd (13.0, 9.6, 2.8) 38.3 CH2
2Eec
1.92 ddd (13.0, 2.0 y 1.9)
3E
4.05 s ancho 67.8 CH
4E
3.20 dd (9.5, 2.9) 72.8 CH
5E
3.70 (solapado) 69.6 CH
6E
1.23 d (6.2) 16.1 CH3
Tabla 2: RMN de 3D-desmicarosil-MTM-SDK (fórmula VIII). C44H60O20 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto VIII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1
204.1 C
2
4.76 d (12.1) 76.9 CH
3
2.74 t (12.1) 42.3 C
4ax
2.95 (solapado) 27.3 CH2
4ec
2.64 d ancho (15.5)
4a
135.5 C
5
6.90 (s) 100.9 CH
6
159.5 C
7
110.3 C
7-CH3
2.18 (s) 7.5 CH3
8
152.4 C
Tabla 2 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto VIII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad Tabla 3: RMN de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SDK (fórmula IX). C50H70O23
8a
107.4 C
9
164.5 C
9a
107.9 C
10
6.90 (s) 116.3 CH
10a
138.5 C
1'
5.07 d (2.0) 79.6 CH
1'-OCH3
3.45 (s) 58.4 CH3
2'
198.3 C
3'
198.3 C
4'
2.34 (s) 23.6 CH3
1A
5.39 d (9.7) 96.8 CH
2Aax
1.87 ddd (12.0, 12.0, 9.7) 37.1 CH2
2Aec
2.48 ddd (12.0, 12.0, 4.9)
3A
3.78 ddd (12.0, 9.0, 4.9) 81.3 CH
4A
3.08 t (9.0) 74.9 CH
5A
3.58 (solapado) 72.2 CH
6A
1.34 d (6.1) 17.5 CH3
1B
4.76 dd (9.7 y 1.7) 99.5 CH
2Bax
1.55 ddd (12.0, 12.0, 9.7) 39.5 CH2
2Bec
2.21 ddd (12.0, 5.0, 1.7)
3B
3.55 ddd (12.0, 8.9, 5.0 ) 70.9 CH
4B
3.00 t (8.9) 77.1 CH
5B
3.39 dc (8.9 y 5.9) 72.2 CH
6B
1.31 d (5.9) 17.2 CH3
1C
5.10 dd (9.7 y 1.6) 100.6 CH
2Cax
1.63 ddd (12.0, 12.0, 9.7) 37.5 CH2
2Cec
2.53 ddd (12.0, 5.2, 1,6)
3C
3.68 (solapado) 81.6 CH
4C
3.00 t (8.9) 75.3 CH
5C
3.31 dc (8.9, 5.6) 72.2 CH
6C
1.33 d (5.6) 17.5 CH3
1D
4.69 d (10.0) 100.0 CH
2Dax
1.77 ddd (12.0, 12.0, 10.0) 34.8 CH2
2Dec
1.92 ddd (12.0, 4.9 y 1.9)
3D
3.80 ddd (12.0, 4.9 y 2.9) 68.4 CH
4D
3.53 (solapado) 69.7 CH
5D
3.70 c ancho (6.0) 70.9 CH
6D
1.31 d (6.0) 16.1 CH3
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto IX Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1
203.8 C
2
4.78 d (13.1) 76.8 CH
3
2.74 t (13.1) 42.4 C
4ax
3.05 (solapado) 27.3 CH2
4ec
2.65 d ancho (16.3)
4a
135.8 C
5
6.92 (s) 101.2 CH
6
159.6 C
7
110.2 C
7-CH3
2.15 (s) 7.5 CH3
8
154.0 C
8a
107.2 C
9
164.0 C
9a
108.2 C
10
6.92 (s) 116.4 CH
10a
138.6 C
1'
5.06 d (1.4) 79.7 CH
1'-OCH3
3.45 (s) 58.4 CH3
2'
198.2 C
3'
198.3 C
4'
2.37 (s) 23.7 CH3
1A
5.38 d (9.2) 96.8 CH
2Aax
1.89 ddd (12.0, 12.0, 9.2) 37.1 CH2
2Aec
2.55 dd (12.0, 5.0)
3A
3.75 (solapado) 80.9 CH
4A
3.08 t (9.0) 75.0 CH
5A
3.54 dc (9.0, 6.1) 72.3 CH
6A
1.34 d (6.1) 17.8 CH3
1B
4.75 dd (9.7 y 1.4) 99.5 CH
2Bax
1.55 ddd (12.0, 12.0, 9.7) 39.6 CH2
2Bec
2.21 ddd (12.0, 4.9, 1.4)
3B
3.58 ddd (12.0, 8.9, 4.9) 71.0 CH
4B
3.00 t (8.9) 77.2 CH
5B
3.40 dc (8.9 y 6.2) 72.3 CH
6B
1.31 d (6.2) 17.2 CH3
1C
5.10 d (9.4) 100.6 CH
2Cax
1.62 c ancho (12.0) 37.5 CH2
2Cec
2.55 dd (12.0, 4.8)
3C
3.70 (solapado) 81.5 CH
4C
3.00 t (8.9) 75.3 CH
5C
3.32 dc (8.9 y 6.2) 72.3 CH
C
1.32 d (6.2) 17.5 CH3
Tabla 3 (continuación)
H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto IX Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1D
4.68 s ancho 99.9 CH
2Dax
1.81 c ancho (12.0) 32.1 CH2
2Dec
1.95 m
3D
3.90 (solapado) 76.5 CH
4D
3.76 s ancho 68.5 CH
5D
3.72 c ancho (6.2) 70.6 CH
6D
1.31 d (6.2) 16.1 CH3
1E
5.04 dd (9.6 y 1.6) 96.9 CH
2Eax
1.70 ddd (12.8, 9.6, 2.8) 38.3 CH2
2Eec
2.01 ddd (12.8, 2.0 y 1.6)
3E
4.05 d ancho (2.8) 67.8 CH
4E
3.20 dd (9.2, 2.3) 72.8 CH
5E
3.75 (solapado) 69.6 CH
6E
1.24 d (6.1) 14.7 CH3
Tabla 4: RMN de 3D-desmicarosil-MTM-SA (fórmula X). C42H58O20
1H-RMN (piridina-d5, 600 MHz). Datos para el compuesto X
Posici�n
1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
2 4.80 (solapado parcialmente)
3 3.12 t ancho (11.0) 4ax 3.50 (solapado) 4ec 3.19 d ancho (15.3) 4a
5 6.95 (s) 6 7 7-CH3 2.50 (s) 8 8a 9 9a
10 6.44 (s) 10a 1' 4.89 (s) 1'-OCH3 3.80 (s) 2'
1A
5.54 d (9.5)
2Aax
2.20 c ancho solapado parcialmente (11.4)
2Aec
2.61 (solapado)
3A
4.15 (solapado)
4A
3.55 (solapado)
28
Tabla 4 (continuación)
1H-RMN (piridina-d5, 600 MHz). Datos para el compuesto X Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
5A
3.90 (solapado)
6A
1.66 d (5.9)
1B
4.99 d (9.5)
2Bax
2.15 (solapado)
2Bec
2.61 (solapado)
3B
4.15 (solapado)
4B
3.55 (solapado)
5B
3.75 (solapado)
6B
1.60 (solapado)
1C
5.44 d (9.7)
2Cax
1.91 c ancho (10.8)
2Cec
2.74 d ancho (9.7)
3C
3.75 (solapado)
4C
3.47 t solapado parcialmente (9.0)
5C
3.63 dc (9.0 y 6.0)
6C
1.51 d (6.2)
1D
4.79 d (11.0)
2Dax
2.15 (solapado)
2Dec
2.38 cancho (10.6)
3D
4.05 m (señal no resuela)
4D
3.90 s ancho (solapado parcialmente)
5D
3.55 (solapado)
6D
1.60 (solapado)
Tabla 5: RMN de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SA (fórmula XI). C48H68O23 1H-RMN (piridina-d5, 600 MHz). Datos para el compuesto XI Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
2 4.80 (solapado)
3 3.15 t ancho (13.7) 4ax 3.50 (solapado) 4ec 3.20 d ancho (14.8) 4a
5 6.94 (s) 6 7 7-CH3 2.50 (s) 8 8a 9 9a
Tabla 5 (continuación)
1H-RMN (piridina-d5, 600 MHz). Datos para el compuesto XI Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
10 6.42 (s) 10a 1' 4.91 (s) 1'-OCH3 3.81 (s) 2'
1A
5.53 d ancho (7.8)
2Aax
2.16 c ancho (10.4)
2Aec
2.61 (solapado)
3A
4.12 (solapado)
4A
3.55 (solapado)
5A
3.87 dc (9.0, 6.2)
6A
1.65 d (5.6)
1B
4.99 d (9.5)
2Bax
2.14 c ancho (11.4)
2Bec
2.61 (solapado)
3B
4.12 (solapado)
4B
3.55 (solapado)
5B
3.75 (solapado)
6B
1.60 (solapado)
1C
5.44 d (9.2)
2Cax
1.93 c ancho (11.0)
2Cec
2.76 d ancho (10.1)
3C
3.75 (solapado)
4C
3.55 (solapado)
5C
3.55 (solapado)
6C
1.48 d (6.1)
1D
4.79 d (11.3)
2Dax
2.20 (solapado)
2Dec
2.32 cancho (11.4)
3D
4.10 (solapado)
4D
4.06 s ancho (solapado parcialmente)
5D
3.55 (solapado)
6D
1.60 (solapado)
1E
5.57 d (9.4)
2Eax
2.01 t ancho (11.5)
2Eec
2.39 d ancho (11.8)
3E
4.45 s ancho
4E
3.20 d ancho solapado parcialmente (10.1)
5E
4.39 dc (9.0, 6.5)
6E
1.60 (solapado)
Ejemplo 3: Bioconversi�n de MTM utilizando la cepa Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV.
Para la purificación de los nuevos derivados acetilados de MTM, se realizó un experimento de bioconversi�n en el cual la cepa S. griseus ssp. griseus C10GIV fue incubada en presencia de MTM (concentración final 50 #g/ml, actúa como 5 sustrato de la reacción) y CRM (concentración final 2 #g/ml y es el inductor de la acetiltransferasa CmmA) (Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, 167-177; Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915). De este modo, la cepa recombinante se cultiv� en medio R5A empleando un método de cultivo en dos pasos, tal como se ha descrito anteriormente (J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). En la etapa de producción, se emplearon 5 matraces Erlenmeyer de 2 litros conteniendo 400 ml de medio cada uno, que fueron incubados durante cinco días, a 250 rpm y 30� C. Los cultivos fueron centrifugados a 10 4000 rpm durante 20 minutos, el precipitado fue descartado y el sobrenadante se filtr� en primer lugar a través de una placa filtrante conteniendo Celite� y a continuación se realizó una segunda filtración empleando un cartucho MiniProfile de 1 μm (Pall). El caldo filtrado se sometió a una extracción en fase sólida (SepPak Vac C18, Waters) (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531) y los compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol y agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min), recogiendo fracciones cada 5 minutos. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC,
15 empleando el mismo equipo cromatogr�fico e idéntico método analítico al descrito previamente en el Ejemplo 2. Las fracciones conteniendo los compuestos de interés (fracciones del 70% al 90% metanol) fueron mezcladas y evaporadas en el rotavapor. El extracto seco obtenido fue disuelto en 5 ml de metanol y cromatografiado en una columna XBridge Prep C18 (30 x 150 mm, Waters), utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (45:55) a un flujo de 20 ml/min. Los picos de interés se colectaron sobre tampón fosfato 0,1M pH 7, fueron diluidos
20 cuatro veces con agua para ser desalados y concentrados mediante extracción en fase sólida. Por último, estos compuestos fueron liofilizados para su conservación. De este modo fueron aislados dos nuevos compuestos.
Estos nuevos derivados se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y el tiempo de retención (FIGURA 4). A continuación se realizó el análisis de MS para determinar la masa de los nuevos
25 compuestos en un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters-Micromass) mediante ionizaci�n de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Las masas de los iones moleculares obtenidas para los nuevos derivados fueron: m/z [H+] 1128 en el caso del compuesto de fórmula XII, es decir, se correspondía con una MTM monoacetilada y m/z [H+] 1170 en el caso del compuesto de fórmula XIII, correspondiente con la incorporación de dos grupos acetilo en la molécula de MTM.
30 La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 6 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XII).
Tabla 6: RMN de 4E-acetil-MTM (fórmula XII) C54H78O25 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XII
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) multiplicidad
1
205.0 C
2
4.83 d (11.6) 76.5 CH
3
2.85 (solapado) 42.5 CH
4ax
3.00 (solapado) 29.6 CH2
4ec
2.70 dd (16.1, 3.3)
4a
136.4 C
5
6.93 (s) 101.4 CH
6
159.6 C
7
110.4 C
7-CH3
2.17 (s) 7.5 CH3
8
152.0 C
8a
107.0 C
9
164.2 C
9a
107.5 C
10
6.90 (s) 116.7 CH
10a
138.8 C
1'
4.86 d ancho (3.0) 81.6 CH
1'-OCH3
3.46 (s) 58.3 CH3
2'
210.9 C
3'
4.30 (solapado) 78.8 CH
4'
4.30 (solapado) 68.0 CH
5'
1.30 (solapado) 19.2 CH3
1A
5.42 dd (9.2, 1.8) 96.7 CH
2Aax
1.87 c ancho solapado parcialmente (10.0) 37.1 CH2
2Aec
2.47 ddd (12.0, 5.0, 1.8)
3A
3.80 (solapado) 80.9 CH
4A
3.08 t (8.7) 75.0 CH
5A
3.55 dc (9.1, 6.1) 72.2 CH
6A
1.30 (solapado) 17.2 CH3
1B
4.76 dd (9.8, 1.9) 99.5 CH
2Bax
1.55 (solapado) 39.6 CH2
2Bec
2.20 ddd (11.8, 5.0, 1.9)
3B
3.60 (señal compleja) 71.0 CH
4B
3.00 (señal compleja) 77.2 CH
5B
3.39 dc (9.2, 6.2) 72.2 CH
6B
1.30 (solapado) 17.5 CH3
1C
5.14 dd (9.6, 1.5) 100.5 CH
2Cax
1.60 (solapado) 37.6 CH2
2Cec
2.55 ddd (12.0, 5.0, 1.5)
3C
3.70 (solapado) 81.5 CH
4C
3.00 (solapado) 75.3 CH
5C
3.33 dc (8.8, 5.8) 72.2 CH
6C
1.30 (solapado) 17.6 CH3
Tabla 6 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) multiplicidad
1D
4.73 dd (9.8, 2.0)
2Dax
1.82 ddd (12.0, 12.0, 9.8)
2Dec
1.95 (señal compleja)
3D
3.94 s ancho (solapado parcialmente)
4D
3.75 señal compleja (solapado)
5D
3.73 c ancho solapado parcialmente (6.4)
6D
1.30 (solapado)
99.9 32.0
CH CH2
76.5 68.5 70.6 16.1
CH CH CH CH3
97.6 44.2
CH CH2
69.9 26.4 77.4 19.8 170.0 68.2 17.2
C CH3 CH CH3 C CH CH3
1E 5.06 dd (9.7, 2.0 ) 2Eax 1.60 (solapado) 2Eec 1.91 dd (13.0, 2,0) 3E 3E-CH3 1.14 (s) 4E 4.50 d (9.7) 4E-CH3 2.10 s (solapado) 4E-CO 5E 3.96 dc (9.2, 6.2) 6E 1.12 d (6.2)
Ejemplo 4: Bioconversi�n de MTM-SK utilizando la cepa Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV.
Para la purificación de los nuevos derivados acetilados de MTM-SK, se realizó un experimento de bioconversi�n en el cual la cepa S. griseus ssp. griseus C10GIV fue incubada en presencia de MTM-SK (concentración final 50 #g/ml, actúa como sustrato de la reacción) y CRM (concentración final 2 #g/ml, es el inductor de la acetiltransferasa CmmA) (Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, 167-177; Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915). De este modo, la cepa recombinante se cultiv� en medio R5A empleando un método de cultivo en dos pasos, tal como se ha descrito anteriormente (J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). En la etapa de producción, se emplearon 5 matraces Erlenmeyer de 2 litros conteniendo 400 ml de medio cada uno, que fueron incubados durante cinco días, a 250 rpm y 30� C. Los cultivos fueron centrifugados a 4000 rpm durante 20 minutos, el precipitado fue descartado y el sobrenadante se filtr� en primer lugar a través de una placa filtrante conteniendo Celite� y a continuación se realizó una segunda filtración empleando un cartucho MiniProfile de 1 μm (Pall). El caldo filtrado se sometió a una extracción en fase sólida (SepPak Vac C18, Waters) (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531) y los compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol y agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min), recogiendo fracciones cada 5 minutos. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC, empleando el mismo equipo cromatogr�fico e idéntico método analítico al descrito previamente en el Ejemplo 2. Las fracciones conteniendo los compuestos de interés (fracciones del 70% al 90% metanol) fueron mezcladas y evaporadas en el rotavapor. El extracto seco obtenido fue disuelto en 5 ml de metanol y cromatografiado en una columna XBridge Prep C18 (30x150 mm, Waters), utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (45:55) a un flujo de 20 ml/min. Los picos de interés se colectaron sobre tampón fosfato 0,1M pH 7, fueron diluidos cuatro veces con agua para ser desalados y concentrados mediante extracción en fase sólida. Por último, estos compuestos fueron liofilizados para su conservación. De este modo fueron aislados dos nuevos compuestos.
Estos nuevos derivados se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y el tiempo de retención (FIGURA 5). A continuación se realizó el análisis de MS para determinar la masa de los nuevos compuestos en un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters-Micromass) mediante ionizaci�n de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Las masas de los iones moleculares obtenidas para los nuevos derivados fueron: m/z [H+] 1098 en el caso del compuesto de fórmula XIV, es decir, se correspondía con una MTM-SK monoacetilada y m/z [H+] 1140 en el caso del compuesto de fórmula XV,
5 correspondiente con la incorporación de dos grupos acetilo en la molécula de MTM-SK.
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 7 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XIV).
10 Tabla 7: RMN de 4D-acetil-MTM-SK (fórmula XIV) C53H76O24 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XIV
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1
203.1 C
2
4.75 (solapado) 76.5 CH
3
2.50 (solapado) 43.4 CH
4ax
3.17 d ancho (14.3) 29.6 CH2
4ec
3.00 (solapado)
4a
136.6 C
5
6.92 (s) 101.3 CH
6
159.5 C
7
110.6 C
7-CH3
2.15 (s) 7.5 CH3
8
154.2 C
8a
107.8 C
9
165.3 C
9a
108.3 C
10
6.92 (s) 116.6 CH
10a
138.7 C
1'
4.26 (solapado) 78.9 CH
1'-OCH3
3.57 (s) 59.6 CH3
2'
4.31 d (3.7) 79.1 C
3'
209.5 C
4'
2.34 (s) 25.8 CH
1A
5.42 d (9.0) 96.3 CH
2Aax
1.90 c ancho (10.4) 37.1 CH2
2Aec
2.50 (solapado)
3A
3.80 ddd (12.1, 8.8, 5.2) 80.9 CH
4A
3.09 t (8.8) 75.0 CH
5A
3.60 (solapado) 72.3 (solapado) CH
6A
1.34 d (solapado) 17.8 CH3
1B
4.76 dd (9.7 y 1.5) 99.5 CH
2Bax
1.57 ddd (12.0, 12.0, 9.7) 39.6 CH2
2Bec
2.20 ddd (12.0, 4.9, 1.5)
3B
3.55 (solapado) 71.0 CH
4B
3.01 t (8.9) 77.2 CH
5B
3.40 dc (9.0 y 6.2) 72.3 (solapado) CH
6B
1.31 d (6.1) 17.5 CH3
34
Tabla 7 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XIV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1C
5.15 solapado (con 4D) 100.4 CH
2Cax
1.65 (solapado) 37.5 CH2
2Cec
2.53 dd (12.0, 4.9)
3C
3.36 (señal no resuelta) 81.5 CH
4C
3.05 t (8.9) 75.3 CH
5C
3.75 (señal no resuelta) 72.3 (solapado) CH
6C
1.34 (solapado) 17.6 CH3
1D
4.80 d ancho (9.2) 99.7 CH
2Dax
1.74 c ancho (10.6) 32.7 CH2
2Dec
2.15 (solapado)
3D
4.15 (solapado) 72.3 CH
4D
5.10 (solapado) 70.6 CH
4D-CH3
2.10 (s) 20.0 CH3
4D-CO
169.7 C
5D
3.90 (solapado) 69.9 CH
6D
1.15 d (6.2) 16.1 CH3
1E
4.93 dd (9.5 y 1.7) 96.6 CH
2Eax
1.46 dd (13.3, 9.6) 43.8 CH2
2Eec
1.84 dd (13.3, 1.8)
3E
70.3 C
3E-CH3
1.22 (s) 26.7 CH3
4E
2.92 dd (9.2, 7.7) acoplado con 4E-OH 70.4 CH
4E-OH
3.89 d (7.7)
5E
3.60 (solapado) 72.3 CH
6E
1.22 d (6.2) 17.2 CH3
Ejemplo 5: Bioconversi�n de 3D-desmicarosil-3D- -D-digitoxosil-MTM utilizando la cepa Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV.
5 Para la purificación de los nuevos derivados acetilados de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM (J. Nat. Prod. 2008, 71, 199-207; WO 2008/096028 A1), se realizó un experimento de bioconversi�n en el cual la cepa S. griseus ssp. griseus C10GIV fue incubada en presencia de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM (concentración final 15 #g/ml, es el sustrato de la reacción) y CRM (concentración final 2 #g/ml, actúa como inductor de la acetiltransferasa CmmA) (Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, 167-177; Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915). De este modo, la cepa recombinante se
10 cultiv� en medio R5A empleando un método de cultivo en dos pasos, tal como se ha descrito anteriormente (J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). En la etapa de producción, se emplearon 12 matraces Erlenmeyer de 2 litros conteniendo 400 ml de medio cada uno, que fueron incubados durante cinco días, a 250 rpm y 30� C. Los cultivos fueron centrifugados a 4000 rpm durante 20 minutos, el precipitado fue descartado y el sobrenadante se filtr� empleando un cartucho MiniProfile de 1 μm (Pall). El caldo filtrado se sometió a una extracción en fase sólida (SepPak Vac C18, Waters)
15 (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531) y los compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol y agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min), recogiendo fracciones cada 5 minutos. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC-MS empleando un equipo cromatogr�fico acoplado a un espectrómetro de masas ZQ4000
(Waters-Micromass), usando como solventes acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua, y una columna de fase reversa (Symmetry C18, 2.1 x 150 mm, Waters). Las muestras fueron elu�das con 10% acetonitrilo durante los primeros 4 minutos, seguido de un gradiente lineal 10-88% de acetonitrilo durante 26 minutos, a un flujo de 0.25 ml/min.
La detección y caracterización espectral de los picos fue realizada con un detector de fotodiodos y software Empower (Waters). Los análisis de MS fueron realizados mediante ionizaci�n de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Tras su análisis, las fracciones que contenían los compuestos de interés se mezclaron (FIGURA 6) y desecaron en vacío. El extracto obtenido fue resuspendido en 2 ml de DMSO/Metanol (1:1) y cromatografiado en una columna SunFire C18 (10x250mm, Waters) con flujo de 7 ml/min, empleando como fase móvil mezclas de acetonitrilo y 0.1% TFA en H2O (45:55). Cada uno de los compuestos de interés fue repurificado empleando la columna semipreparativa anterior pero utilizando diferentes proporciones de solventes en la fase móvil. Los picos de interés se colectaron sobre tampón fosfato 0,1M pH 7, fueron diluidos cuatro veces con agua para ser desalados y concentrados mediante extracción en fase sólida. Por último, estos compuestos fueron liofilizados para su conservación.
De este modo fueron aislados cinco nuevos compuestos. Las masas de los iones moleculares obtenidas para los nuevos derivados fueron: m/z [H+] 1114 en el caso de los compuestos de fórmula XVI, XVII y XVIII es decir, se correspondería con una 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM monoacetilada en tres posiciones diferentes, m/z [H+] 1156 en el caso del compuesto de fórmula XIX, correspondiente con la incorporación de dos grupos acetilo en la molécula de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM, m/z [H+] 1198 en el caso del compuesto de fórmula XX, correspondiente con la incorporación de tres grupos acetilo en la molécula de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM.
Ejemplo 6: Bioconversi�n de 3D-desmicarosil-3D- -D-digitoxosil-MTM-SK utilizando la cepa Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV.
Para la purificación de los nuevos derivados acetilados de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK, se realizó un experimento de bioconversi�n en el cual la cepa S. griseus ssp. griseus C10GIV fue incubada en presencia de 3Ddesmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK (concentración final 25 #g/ml, actúa como sustrato de la reacción) y CRM (inductor de la acetiltransferasa CmmA) (Appl. Environ. Microbiol. 2006. 72, 167-177; Mol. Microbiol. 2004, 53, 903-915). De este modo, la cepa recombinante se cultiv� en medio R5A empleando un método de cultivo en dos pasos, tal como se ha descrito anteriormente (J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). En la etapa de producción, se emplearon 2 matraces Erlenmeyer de 2 litros conteniendo 400 ml de medio cada uno, que fueron incubados durante cinco días, a 250 rpm y 30� C. Los cultivos fueron centrifugados a 4000 rpm durante 20 minutos, el precipitado fue descartado y el sobrenadante se filtr� en primer lugar a través de una placa filtrante conteniendo Celite� y a continuación se realizó una segunda filtración empleando un cartucho MiniProfile de 1 μm (Pall). El caldo filtrado se sometió a una extracción en fase sólida (SepPak Vac C18, Waters) (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531) y los compuestos retenidos se eluyeron con un gradiente lineal de metanol y agua (0 a 100% metanol en 60 min, a 10 ml/min), recogiendo fracciones cada 5 minutos. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC, empleando el mismo equipo cromatogr�fico e idéntico método analítico al descrito previamente en el Ejemplo 2. Las fracciones conteniendo los compuestos de interés (fracciones del 70% al 90% metanol) fueron mezcladas y evaporadas en el rotavapor. El extracto seco obtenido fue disuelto en 5 ml de metanol y cromatografiado en una columna XBridge Prep C18 (30x150 mm, Waters), utilizando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (45:55) a un flujo de 20 ml/min. Los picos de interés se colectaron sobre tampón fosfato 0,1M pH 7, fueron diluidos cuatro veces con agua para ser desalados y concentrados
mediante extracción en fase sólida. Por último, estos compuestos fueron liofilizados para su conservación. De este modo fueron aislados dos nuevos compuestos.
Estos nuevos derivados se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y el tiempo de retención (FIGURA 7). A continuación se realizó el análisis de MS para determinar la masa de los nuevos compuestos en un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters-Micromass) mediante ionizaci�n de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Las masas de los iones moleculares obtenidas para los nuevos derivados fueron: m/z [H+] 1084 en el caso del compuesto de fórmula XXI, es decir, se correspondía con una 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK monoacetilada y m/z [H+] 1126 en el caso del compuesto de fórmula XXII, correspondiente con la incorporación de dos grupos acetilo en la molécula de 3Ddesmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK.
Ejemplo 7: Acilaci�n enzim�tica de MTM catalizada por CAL-B empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de MTM catalizadas por CAL-B se llevaron a cabo incubando a 45 �C y 250 rpm una suspensión de 150 mg de lipasa en una disolución de 15 mg de MTM en 3 ml del agente acilante correspondiente. Eventualmente, en aquellos casos en que la MTM present� baja solubilidad en el agente acilante se añadieron 0.5 ml de THF. La conversión de la biotransformaci�n fue monitoreada mediante HPLC empleando el mismo equipo cromatogr�fico e idéntico método analítico al descrito previamente en el ejemplo 2. Cuando la conversión alcanzó un valor próximo al 90%, el enzima se filtr� a vacío en placa filtrante y se lav� con abundante metanol y THF. El filtrado se concentr� a vacío y el residuo resultante, previamente disuelto en 5 ml de metanol, fue cromatografiado en una columna XBridge Prep C18 (30x150 mm, Waters), utilizando como fase móvil mezclas de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua a un flujo de 20 ml/min. Los picos de interés se colectaron sobre tampón fosfato 0,1M pH 7, diluidos cuatro veces con agua para ser desalados y concentrados mediante extracción en fase sólida. Por último, los compuestos obtenidos fueron liofilizados para su conservación.
Los nuevos derivados acilados se identificaron inicialmente mediante análisis por HPLC, comparando el espectro de absorción y el tiempo de retención (FIGURA 8). A continuación, se caracterizaron mediante el análisis de MS y RMN de acuerdo con los ejemplos anteriores.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de un día y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificaron tres nuevos compuestos los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (45:55) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 4’-acetilmitramicina, 3B-acetilmitramicina y 4’,3Bdiacetilmitramicina (fórmulas XXIII, XXIV y XXV, respectivamente).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. Las tablas 8 a 10 muestran los datos obtenidos para los compuestos de fórmula (XXIII), (XXIV) y (XXV).
Tabla 8: RMN de 4’-acetil-MTM (fórmula XXIII)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XXIII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) multiplicidad
1
203.1 C
2
4.75 (solapado) 76.6 CH
3
2.80 (solapado) 42.0 CH
4ax
3.15 (solapado) 29.6 CH2
4ec
3.00 (solapado)
4a
135.2 C
5
6.91 (s) 101.3 CH
6
159.5 C
7
110.4 C
7-CH3
2.15 (s) 7.5 CH3
8
152.2 C
8a
107.0 C
9
164.0 C
9a
107.8 C
10
6.91 (s) 116.4 CH
10a
138.7 C
1'
4.86 (s ancho) 81.4 CH
1'-OCH3
3.41 (s) 58.0 CH3
2'
209.4 C
3'
4.47 dd (6.7, 2,9) acoplado con OH 76.3 CH
4'
5.29 dc (5.9, 2.9) 71.0 CH
4'-CO
169.3 C
4'-CH3
2.05 (s) 19.8 CH3
5'
1.32 (solapado) 15.1 CH3
1A
5.41 d ancho (9.6) 96.7 CH
2Aax
1.85 (solapado) 37.1 CH2
2Aec
2.50 (11.7, 5.1, 1.9)
3A
3.78 ddd (11.7, 8.8, 5.1) 80.9 CH
4A
3.07 t (9.0) 74.9 CH
5A
3.53 dc (9.0, 6.1) 72.3 CH
6A
1.32 (solapado) 17.9 CH3
1B
4.76 d ancho (9.7) 99.5 CH
2Bax
1.55 (solapado) 39.6 CH2
2Bec
2.18 ddd (11.5, 5.0, 1.5)
3B
3.55 (solapado) 71.0 CH
4B
3.00 (solapado) 77.2 CH
5B
3.35 dc solapado parcialmente (8.9, 6.2) 72.3 CH
6B
1.32 (solapado) 17.5 CH3
1C
5.11 d ancho (9.7) 100.6 CH
2Cax
1.70 (señal no resuelta) 37.4 CH2
2Cec
2.50 ddd (12.0, 4.9, 2.0)
3C
3.50 (solapado) 81.6 CH
Tabla 8 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XXIII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) multiplicidad
4C 3.00 (solapado) 75.2 CH 5C 3.30 (señal no resuelta) 72.3 CH 6C 1.32 (solapado) 17.6 CH3
1D 4.74 d ancho (9.5) 99.9 CH 2Dax 1.80 (señal no resuelta) 32.1 CH2 2Dec 1.95 (solapado) 3D 3.85 (señal no resuelta) 76.4 CH 4D 3.75 (solapado) 68.4 CH 5D 3.67 dc (9.0, 6.1) 70.7 CH 6D 1.32 (solapado) 16.1 CH3
1E 4.99 d ancho (9.7) 97.5 CH 2Eax 1.55 (solapado) 44.0 CH2 2Eec 1.90 (solapado) 3E 70.3 C 3E-CH3 1.24 (s) 26.6 CH3 4E 3.00 (solapado) 76.4 CH 5E 3.66 dc (9.0, 6.0) 70.6 CH 6E 1.24 d (6.0) 17.2 CH3
ESI-MS (XXIII): 463.00, 593.22, 723.33, 867.36, 1127.50
Tabla 9: RMN de 3B-acetil-MTM (fórmula XXIV)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XXIV
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1 203.6 C
2 4.85 (solapado) 76.5 CH
3 2.80 (solapado) 42.5 CH 4ax 3.00 (solapado) 29.6 CH2 4ec 2.69 (16.6, 3.5) 4a 136.2 C
5 6.93 (s) 101.4 CH 6 159.6 C 7 110.4 C 7-CH3 2.15 (s) 7.5 CH3 8 152.1 C 8a 107.0 C 9 164.1 C 9a 107.7 C
10 6.90 (s) 116.8 CH 10a 138.8 C 1' 4.86 dd (3.8, 1.6) 81.6 CH
Tabla 9 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XXIV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1'-OCH3
3.50 (s) 58.3 CH3
2'
210.8 C
3'
4.29 (solapado) 78.8 CH
4'
4.29 (solapado) 67.9 CH
5'
1.32 (solapado) 19.2 CH3
1A
5.42 dd (9.7, 1.9) 96.7 CH
2Aax
1.87 ddd (11.8, 11.7, 9.7) 37.0 CH2
2Aec
2.52 ddd (11.7, 5.2, 1.9)
3A
3.82 ddd (11.8, 8.7, 5.2) 80.8 CH
4A
3.09 t solapado parcialmente(8.7) 75.0 CH
5A
3.57 dc (9.1, 6.1) 72.2 CH
6A
1.32 (solapado) 17.9 CH3
1B
4.85 (solapado) 98.7 CH
2Bax
1.55 (solapado) 36.7 CH2
2Bec
2.29 ddd (11.5, 5.2, 1.8)
3B
4.85 (solapado) 73.2 CH
3B-CH3
2.03 (s) 20.1 CH3
3B-CO
169.9 C
4B
3.20 (señal no resuelta) 73.7 CH
5B
3.52 dc (9.4, 6.2) 72.2 CH
6B
1.32 (solapado) 17.5 CH3
1C
5.14 dd (9.7, 1.6) 100.5 CH
2Cax
1.63 ddd (12.0, 12.0 , 9.7) 37.6 CH2
2Cec
2.50 ddd (12.0, 4.9, 1.6)
3C
3.70 (solapado) 81.5 CH
4C
3.00 (solapado) 75.3 CH
5C
3.34 dc (9.1, 6.1) 72.2 CH
6C
1.32 (solapado) 17.6 CH3
1D
4.72 dd (9.8, 1.9) 99.9 CH
2Dax
1.82 ddd (12.0, 12.0, 9.8) 32.1 CH2
2Dec
1.95 (señal no resuelta)
3D
3.90 ddd (12.0, 5.0, 3.0) 76.5 CH
4D
3.75 s ancho 68.5 CH
5D
3.67 c ancho solapado parcialmente(6.3) 70.6 CH
6D
1.32 (solapado) 16.1 CH3
1E
4.99 dd (9.6, 2.0 ) 97.5 CH
2Eax
1.55 (solapado) 44.0 CH2
2Eec
1.90 dd (13.6, 2,0)
3E
70.3 C
3E-CH3
1.24 (s) 26.6 CH3
4E
3.00 (solapado) 76.4 CH
5E
3.66 dc (9.2, 6.1) 70.6 CH
6E
1.25 d (6.1) 17.2 CH3
40
ESI-MS (XXIV): 421.20, 551.14, 723.36, 825.29, 1127.43 Tabla 10: RMN de 4’,3B-diacetil-MTM (fórmula XXV) 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XXV
Posici�n
1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1
solapado (205) C
2
4.85 (solapado) 76.5 CH
3
2.80 (solapado) 42.1 CH
4ax
3.10 (solapado) 29.4 CH2
4ec
3.00 (solapado)
4a
136.1 C
5
6.91 (s) 101.2 CH
6
159.2 C
7
110.4 C
7-CH3
2.14 (s) 7.4 CH3
8
152.3 C
8a
107.1 C
9
164.1 C
9a
107.4 C
10
6.91 (s) 116.7 CH
10a
138.5 C
1'
4.85 (solapado) 81.6 CH
1'-OCH3
3.42 (s) 58.1 CH3
2'
209.3 C
3'
4.50 d (2.9) 76.5 CH
4'
5.30 dc (6.0, 2.9) 70.5 CH
4'-CO
169.2 C
4'-CH3
2.05 (s) 20.1 CH3
5'
1.32 (solapado) 15.1 CH3
1A
5.40 m (señal no resuelta) 96.7 CH
2Aax
1.95 (solapado) 37.4 CH2
2Aec
2.49 m (señal no resuelta)
3A
3.80 (señal no resuelta) 80.8 CH
4A
3.08 t solapado parcialmente (8.8) 75.0 CH
5A
3.53 (solapado) 72.2 CH
6A
1.32 (solapado) 17.9 CH3
1B
4.85 (solapado) 98.7 CH
2Bax
1.60 (solapado) 37.0 CH2
2Bec
2.30 ddd (11.8, 5.0, 2.0)
3B
4.85 (solapado) 73.2 CH
3B-CH3
1.98 (s) 20.2 CH3
3B-CO
169.8 C
4B
3.25 m (señal no resuelta) 73.7 CH
5B
3.53 (solapado) 72.2 CH
6B
1.32 (solapado) 17.5 CH3
Tabla 10 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XXV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1C
5.11 d ancho (9.3) 100.6 CH
2Cax
1.63 ddd (12.0, 12.0 , 9.3) 37.6 CH2
2Cec
2.55 m (señal no resuelta)
3C
3.70 (solapado) 81.5 CH
4C
3.05 (solapado) 75.3 CH
5C
3.30 dc (9.1, 6.1) 72.2 CH
6C
1.32 (solapado) 17.6 CH3
1D 4.74 m (señal no resuelta) 99.9 CH
2Dax 1.80 ddd (12.0, 12.0, 9.7) 32.1 CH2
2Dec 2.00 (solapado)
3D 3.85 m (señal no resuelta) 76.5 CH
4D 3.74 s ancho 68.4 CH
5D 3.70 (solapado) 70.6 CH
6D 1.32 (solapado) 16.1 CH3
1E 5.00 d ancho (9.2) 97.6 CH
2Eax 1.55 (solapado) 44.0 CH2
2Eec 1.90 (solapado)
3E 70.3 C
3E-CH3 1.25 (s) 26.6 CH3
4E 2.97 d (9.1) 76.4 CH
5E 3.68 (9.1, 6.1) 70.5 CH
6E 1.24 d (6.1) 17.2 CH3
ESI-MS (XXV): 463.07, 593.22, 765.43, 867.29, 1169.48
Para el caso particular de emplear acetato de 2,2,2,-trifluoroetilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 4 días y se alcanzó una conversión de 70%. Por HPLC se identificaron tres derivados acilados (FIGURA 9) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (45:55) a un flujo de 20 ml/min. Los tres compuestos aislados resultaron ser idénticos a aquellos obtenidos con el acetato de etilo (XXIII, XXIV y XXV) aunque en esta ocasión el rendimiento fue sensiblemente inferior.
Para el caso particular de emplear cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 60%. Por HPLC se identificaron tres nuevos compuestos (FIGURA 10) con tiempos de retención de 4.21, 4.49 y 4.82 minutos (fórmulas XXVI, XXVII y XXVIII, respectivamente).
Para el caso particular de emplear propanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 11) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 4’-propanoilmitramicina y 4’,3Bdipropanoilmitramicina (fórmulas XXIX y XXX, respectivamente). ESI-MS (XXIX): 477.13, 607.24, 737.22, 881.31, 1141.76. ESI-MS (XXX): 477.06, 607.11, 793.29, 881.31, 1197.51.
Para el caso particular de emplear butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cuatro días y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 12) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (60:40) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 4’-butanoilmitramicina y 4’,3Bbutanoilmitramicina (fórmulas XXXI y XXXII, respectivamente). ESI-MS (XXXI): 491.31, 621.08, 751.17, 895.39, 1155.78, 1172.99. ESI-MS (XXXII): 491.24, 621.22, 820.30, 895.41, 1225.60.
Para el caso particular de emplear levulinato de acetonoxima como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 20%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 13) con un tiempo de retención de 4.00 minutos (fórmula XXXIII).
Para el caso particular de emplear decanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 14) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (55:45) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 4’-decanoilmitramicina (fórmula XXXIV).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 11 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XXXIV).
Tabla 11: RMN de 4’-decanoil-MTM (fórmula XXXIV) 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXIV
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
2 4.75 (solapado)
3 2.82 t (12.0) 4ax 3.20 (solapado) 4ec 3.00 (solapado) 4a
5 6.88 (s) 6 7 7-CH3 2.15 (s) 8 8a 9 9a
10 6.91 (s) 10a 1' 4.91 (s ancho) 1'-OCH3 3.40 (s) 2' 3' 4.44 d (2,5) 4' 5.30 dc (5.8, 2.5) 4'-CO
Tabla 11 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXIV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
5' 1.32 (solapado) 6'-CO 7' 2.10 (solapado) 8' 1.46 m (señal no resuelta) 9' 1.30 (solapado) 10' 1.30 (solapado) 11' 1.30 (solapado) 12' 1.30 (solapado) 13' 1.30 (solapado) 14' 1.30 (solapado) 15' 0.89 t (7.1)
1A 5.40 d ancho (9.2) 2Aax 1.90 (solapado) 2Aec 2.46 (12.0, 5.1, 1.9) 3A 3.78 (solapado) 4A 3.15 t (9.0) 5A 3.53 dc (9.0, 6.1) 6A 1.30 (solapado)
1B 4.75 (solapado) 2Bax 1.55 (solapado) 2Bec 2.20 ddd (11.8, 5.0, 1.5) 3B 3.55 (12.0, 8.9, 5.0) 4B 3.00 (solapado) 5B 3.50 (solapado) 6B 1.30 (solapado)
1C 5.10 d ancho (9.0) 2Cax 1.70 c ancho (11.0) 2Cec 2.53 ddd (12.0, 5.9, 2.0) 3C 3.55 (solapado) 4C 3.00 (solapado) 5C 3.25 dc (9.1, 6.0) 6C 1.30 (solapado)
1D 4.75 (solapado) 2Dax 1.80 c ancho (11.0) 2Dec 1.90 (solapado) 3D 3.87 (señal no resuelta) 4D 3.75 s ancho (solapado parcialmente) 5D 3.75 (solapado) 6D 1.30 (solapado) 1E 5.00 d ancho (9.4) 2Eax 1.55 (solapado) 2Eec 1.90 (solapado) 3E
Tabla 11 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXIV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
3E-CH3
1.25 (s)
4E
3.00 (solapado)
5E
3.70 (solapado)
6E
1.30 (solapado )
ESI-MS (XXXIV): 575.22, 705.30, 835.37, 979.37, 1240.76
Para el caso particular de emplear dodecanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 70%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 15) con un tiempo de retención de 6.32 minutos (fórmula XXXV).
Para el caso particular de emplear benzoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de nueve días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 16) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 4’-benzoilmitramicina (fórmula XXXVI).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 12 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XXXVI).
Tabla 12: RMN de 4’-benzoil-MTM (fórmula XXXVI) 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXVI
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
2 4.70 (solapado)
3 2.80 (solapado) 4ax 3.10 (solapado) 4ec 3.00 (solapado) 4a
5 6.33 (s ancho) 6 7 7-CH3 2.15 (s) 8 8a 9 9a
10 6.63 (s ancho) 10a 1' 4.85 (s ancho) 1'-OCH3 3.32 (s) 2' 3' 4.61 dd (6.5, 2,0) acoplado con OH
Tabla 12 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXVI Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
4' 5.66 dc (6.4, 2.0) orto (2H) 7.95 d (7.4) para (1H) 7.42 t (7.4) meta (2H) 7.32 t (7.4) 5' 1.48 d (6.4)
1A 5.39 d ancho (9.4) 2Aax 1.92 (solapado) 2Aec 2.48 (12.0, 5.0, 1.9) 3A 3.80 br señal no resuelta (solapado) 4A 3.09 t (8.8) 5A 3.54 dc (8.8, 6.1) 6A 1.32 (solapado)
1B 4.77 dd (9.0, 1.8) 2Bax 1.57 (solapado) 2Bec 2.20 ddd (11.5, 5.0, 1.8) 3B 3.60 (solapado) 4B 3.00 (solapado) 5B 3.41 dc (9.1, 6.1) 6B 1.32 (solapado)
1C 5.08 d ancho (9.2) 2Cax 1.19 c ancho (10.1) 2Cec 2.51 ddd (12.0, 4.9, 2.0) 3C 3.60 (solapado) 4C 3.00 (solapado) 5C 3.30 (solapado) 6C 1.32 (solapado)
1D 4.67 (solapado) 2Dax 1.80 (señal no resuelta) 2Dec 1.92 (solapado) 3D 3.85 señal no resuelta (solapado parcialmente) 4D 3.74 (s ancho) 5D 3.70 (solapado) 6D 1.32 (solapado)
1E 5.00 d ancho (8.5) 2Eax 1.57 (solapado) 2Eec 1.92 (solapado) 3E 3E-CH3 1.24 (s) 4E 3.00 (solapado) 5E 3.70 (solapado) 6E 1.22 d (6.0)
Para el caso particular de emplear crotonato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 7 días y se alcanzó una conversión de 25%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 17) con un tiempo de retención de 4.18 minutos (fórmula XXXVII).
Para el caso particular de emplear carbonato de dialilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 50%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 18) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 3B-(prop-2-eniloxicarbonil)-mitramicina (fórmula XXXVIII) en lugar del esperado 3B-aliloxicarbonilmitramicina. La formación de este producto puede ser consecuencia de una isomerizaci�n catalizada por el ácido trifluoroac�tico contenido en la fase móvil de la cromatograf�a preparativa.
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 13 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XXXVIII).
Tabla 13: RMN de 3B-(prop-2-eniloxicarbonil)-MTM (fórmula XXXVIII)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXVIII
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
2 4.70 (señal no resuelta)
3 2.85 (solapado) 4ax 3.02 d ancho (15.0) 4ec 2.75 d ancho (15.0) 4a
5 6.90 (s) 6 7 7-CH3 2.10 (s) 8 8a 9 9a
10 6.90 (s) 10a 1' 4.85 (solapado) 1'-OCH3 3.46 (s) 2' 3' 4.30 (solapado) 4' 4.30 (solapado) 5' 1.32 (solapado)
1A 5.40 d ancho (señal no resuelta) 2Aax 1.90 (solapado) 2Aec 2.50 d ancho (señal no resuelta) 3A 3.85 (solapado) 4A 3.08 t (8.7)
Tabla 13 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto XXXVIII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
5A 3.55 (solapado) 6A 1.32 (solapado)
1B 4.85 (solapado) 2Bax 1.60 (solapado) 2Bec 2.31 ddd (11.5, 5.0, 2.0) 3B 4.85 (solapado) 3B-1 5.88 dd (15.2, 1.0) 3B-2 6.99 dc (15.2, 6.5) 3B-3 2.00 (solapado) 3B-CO 4B 3.30 (solapado) 5B 3.55 (solapado) 6B 1.32 (solapado)
1C 5.14 d ancho (9.1) 2Cax 1.60 (solapado) 2Cec 2.55 ddd (12.0, 5.0, 1.8) 3C 3.70 (solapado) 4C 3.00 (solapado) 5C 3.30 (solapado) 6C 1.32 (solapado)
1D 4.70 d ancho (9.2) 2Dax 1.75 ddd (12.0, 12.0, 10.0) 2Dec 1.85 (señal no resuelta) 3D 3.90 (solapado con OH) 4D 3.75 s ancho 5D 3.70 (solapado) 6D 1.32 (solapado)
1E 4.98 dd (9.6, 2.0 ) 2Eax 1.60 (solapado) 2Eec 1.90 (solapado) 3E 3E-CH3 1.24 (s) 4E 3.00 (solapado) 5E 3.67 dc (9.0, 6.1) 6E 1.25 d (6.4)
Para el caso particular de emplear el carbonato mixto de alilo y oxima como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 10%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 19) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. El compuesto aislado result� ser idéntico a aquel obtenido con carbonato de dialilo como agente acilante (XXXVIII).
Para el caso particular de emplear carbonato de vinileno como agente acilante el tiempo de reacción fue de 3 días y se alcanzó una conversión mayor de 95%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 20) con tiempos de reacción 3.11 y 4.13 minutos (fórmulas XXXIX y XL).
Ejemplo 8: Acetilaci�n enzim�tica de 4’-Benzoil-MTM catalizada por CAL-B y empleando acetato de vinilo como agente acilante.
La acetilaci�n enzim�tica de la 4’-benzoil-MTM se llev� a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 1 empleando para este caso particular la lipasa B de Candida antarctica (CAL-B) como biocatalizador y acetato de vinilo como agente acilante. El tiempo de reacción fue de cuatro días y se alcanzó una conversión mayor de 95%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 21) el cual se identificó mediante espectrometr�a de masas como 3Bacetil-4’-benzoilmitramicina (fórmula XLI).
Ejemplo 9: Acilaci�n enzim�tica de MTM catalizada por CAL-A empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de MTM catalizadas por CAL-A se llevaron a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 7 pero empleando en este caso la lipasa A de Candida antarctica (CAL-A) como biocatalizador. Del mismo modo, el protocolo de purificación, aislamiento y caracterización de los nuevos derivados acilados es idéntico al anteriormente descrito en el Ejemplo 7.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de un día y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificaron dos derivados acilados (FIGURA 22) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados se identificaron los nuevos compuestos como 4’-acetilmitramicina y 3Bacetilmitramicina de acuerdo al ejemplo anterior (fórmula XXIII y XXIV).
Para el caso particular de emplear cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 4 días y se alcanzó una conversión de 10%. Por HPLC (FIGURA 23) se identificaron dos nuevos compuestos con tiempos de retención de 4.54 y 4.88 minutos (fórmulas XLII y XLIII, respectivamente).
Para el caso particular de emplear propanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 24) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 3B-propanoilmitramicina y 4Bpropanoilmitramicina (fórmulas XLIV y XLV, respectivamente). ESI-MS (XLIV): 421.21, 551.31, 737.31, 825.29, 1141.51. ESI-MS (XLV): 421.15, 551.20, 737.32, 825.30, 1141.51.
Para el caso particular de emplear butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de tres días y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 25) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (60:40) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 3B-butanoilmitramicina y 4Bbutanoilmitramicina (fórmulas XLVI y XLVII, respectivamente).
ESI-MS (XLVI): 421.07, 551.17, 750.90, 825.36, 1155.30. ESI-MS (XLVII): 421.34, 551.11, 751.57, 825.43, 1155.77.
Para el caso particular de emplear decanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cuatro días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 26) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (55:45) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 3B-decanoilmitramicina y 4Bdecanoilmitramicina (fórmulas XLVIII y XLIX, respectivamente). ESI-MS (XLVIII): 421.14, 551.24, 825.36, 835.39, 1239.52. ESI-MS (XLIX): 421.14, 551.31, 825.36, 835.46, 1239.74.
Para el caso particular de emplear benzoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 5 días y se alcanzó una conversión de 20%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 27) con un tiempo de retención de 5.65 minutos (fórmula L).
Para el caso particular de emplear crotonato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 28) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 3B-crotonoilmitramicina (fórmulas LI). ESI-MS (LI): 421.14, 551.17, 749.29, 825.36, 1153.46. Para el caso particular de emplear carbonato de dialilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 29) idéntico al obtenido en el ejemplo anterior empleando CAL-B como biocatalizador (XXXVIII).
Para el caso particular de emplear anh�drido succ�nico como agente acilante el tiempo de reacción fue de tres días y se alcanzó una conversión de 85%. Por HPLC se identificaron cinco nuevos compuestos (FIGURA 30) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (45:55) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 4’-(3-carboxipropanoil)-mitramicina, 4B-(3carboxipropanoil)-mitramicina, 4’,4B-di-(3-carboxipropanoil)-mitramicina, 3B-(3-carboxipropanoil)-mitramicina y 4’,3B-di(3-carboxipropanoil)-mitramicina (fórmulas LII, LIII, LIV, LV y LVI, respectivamente). ESI-MS (LII): 521.11, 651.09, 925.16, 1185.23. ESI-MS (LIII): 421.31, 551.29, 781.26, 825.30, 1185.42. ESI-MS (LIV): 521.24, 651.32, 881.26, 925.46, 1285.54. ESI-MS (LV): 421.18, 551.23, 781.13, 825.43, 1185.60. ESI-MS (LVI): 521.27, 651.24, 881.40, 925.49, 1285.71.
Para el caso particular de emplear adipato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de seis días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 31) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (55:45) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 3B-(5-viniloxicarbonil)-pentanoilmitramicina (fórmula LVII). ESI-MS (LVII): 421.25, 551.36, 825.41, 835.12, 1239.92.
Para el caso particular de emplear sorbato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cuatro días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 32) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (55:45) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 3B-(2,4-hexadienoil)-mitramicina (fórmula LVIII). ESI-MS (LVIII): 421.32, 551.31, 775.63, 825.63, 1180.13.
Para el caso particular de emplear carbonato de vinileno como agente acilante el tiempo de reacción fue de 3 días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificaron dos nuevo compuestos (FIGURA 33) con tiempos de retención de 3.13 y 4.36 minutos (fórmulas LIX y LX, respectivamente).
Ejemplo 10: Acilaci�n enzim�tica de MTM-SK catalizada por CAL-B empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de MTM-SK catalizadas por CAL-B se llevaron a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 7 pero empleando en este caso mitramicina SK como sustrato de partida. Del mismo modo, el protocolo de purificación, aislamiento y caracterización de los nuevos derivados acilados es idéntico al anteriormente descrito en el Ejemplo 7.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de tres días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 34) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 3B-acetilmitramicina SK (fórmula LXI).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 14 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (LXI).
Tabla 14: RMN de 3B-acetil-MTM-SK (fórmula LXI) 1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto LXI
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
2 4.76 d (10.9)
3 2.50 (solapado) 4ec 3.17 dd (16.4, 3.1) 4ax 3.00 (solapado) 4a
5 6.92 (s) 6 7 7-CH3 2.16 (s) 8 8a 9 9a
10 6.92 (s) 10a
Tabla 14 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto LXI Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
1' 4.25 d ancho, solapado parcialmente (3.2) 1'-OCH3 3.56 (s) 2' 4.32 d solapado parcialmente (3.2) 3' 4' 2.34 (s)
1A 5.44 d (8.9) 2Aax 1.90 (solapado) 2Aec 2.50 (solapado) 3A 3.84 ddd (11.8, 8.9, 5.2) 4A 3.10 t (8.9) 5A 3.59 dc (8.9, 6.1) 6A 1.32 d (solapado)
1B 4.87 dd (9.7 y 1.9) 2Bax 1.55 (solapado) 2Bec 2.29 ddd (12.1, 5.2, 1.9) 3B 4.83 ddd (11.8, 9.2, 5.2) 3B-Ac 2.05 (s) 4B 3.27 dt (9.1, 5.0) acoplado con 4B-OH 4B-OH 4.58 d (5.0) 5B 3.53 dc (9.1 y 6.1) 6B 1.32 d (solapado)
1C 5.14 dd (9.5 y 1.9) 2Cax 1.60 ddd (solapado) 2Cec 2.50 (solapado) 3C 3.70 (solapado) 4C 3.02 t (9.1) 5C 3.33 dc (8.9 y 6.3) 6C 1.32 d (solapado) 1D 4.67 d ancho (solapado parcialmente) 2Dax 1.79 c ancho (10.2) 2Dec 1.90 d ancho (solapado) 3D 3.90 (solapado) 4D 3.70 (solapado) 5D 3.74 s ancho 6D 1.32 d (solapado) 1E 4.98 dd (9.5 y 1.9) 2Eax 1.60 (solapado) 2Eec 1.90 dd (13.5, 2.0) 3E 3E-CH3 1.24 (s) 4E 2.97 dd (9.2, 7.8) acoplado con 4E-OH 4E-OH 3.90 d solapado parcialmente (7.8) 5E 3.65 dc (9.0 y 6.2) 6E 1.24 d (6.2)
Para el caso particular de emplear cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 40%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 35) con tiempos de retención de 4.72 y 5.05 minutos (fórmulas LXII y LXIII, respectivamente).
Para el caso particular de emplear propanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 80%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 36) con tiempos de retención de 5.12 y 6.07 minutos (fórmulas LXIV y LXV, respectivamente).
Para el caso particular de emplear butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 50%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 37) con tiempos de retención de 4.96 y 5.55 minutos (fórmulas LXVI y LXVII, respectivamente).
Para el caso particular de emplear carbonato de dialilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 60%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 38) con un tiempo de retención de 5.30 minutos (fórmula LXVIII).
Ejemplo 11: Acilaci�n enzim�tica de MTM-SK catalizada por CAL-A empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de MTM-SK catalizadas por CAL-A se llevaron a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 7 pero empleando en este caso mitramicina SK como sustrato de partida y CAL-A como biocatalizador. Del mismo modo, el protocolo de purificación, aislamiento y caracterización de los nuevos derivados acilados es idéntico al anteriormente descrito en el Ejemplo 7.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificaron dos nuevos derivado acilados (FIGURA 39) los cuales se purificaron empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislados los compuestos se identificaron como 3B-acetilmitramicina SK (fórmula LXI, identificado en el ejemplo anterior) y 4B-acetilmitramicina SK (fórmula LXIX). ESI-MS (LXIX): 391.10, 521.22, 693.22, 795.33, 1098.50.
Para el caso particular de emplear cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 6%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 40) con tiempos de retención de 4.75 y 5.08 minutos (fórmulas LXX y LXXI, respectivamente).
Para el caso particular de emplear decanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 70%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 41) con tiempos de retención de 6.64 y 6.86 minutos (fórmulas LXXII y LXXIII, respectivamente). Para el caso particular de emplear benzoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 15%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 42) con un tiempo de retención de 5.96 minutos (fórmula LXXIV).
Para el caso particular de emplear crotonato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 75%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 43) con un tiempo de retención de 5.46 minutos (fórmula LXXV).
Para el caso particular de emplear carbonato de dialilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 75%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 44) con un tiempo de retención de 5.41 minutos (fórmula LXXVI).
Para el caso particular de emplear anh�drido succ�nico como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificaron tres nuevos compuestos (FIGURA 45) con tiempos de retención de 4.17, 4.34 y 4.51 minutos (fórmulas LXXVII, LXXVIII y LXXIX, respectivamente).
Ejemplo 12: Acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK catalizada por CAL-B empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de MTM-SDK catalizadas por CAL-B se llevaron a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 7 pero empleando en este caso mitramicina SDK como sustrato de partida. Del mismo modo, el protocolo de purificación, aislamiento y caracterización de los nuevos derivados acilados es idéntico al anteriormente descrito en el Ejemplo 7.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 46) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (60:40) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 3B-acetilmitramicina SDK (fórmula LXXX).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 15 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (LXXX).
Tabla 15: RMN de 3B-acetil-MTM-SDK (fórmula LXXX)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto LXXX
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
1
2
4.78 d ancho (11.5)
3
2.75 (señal no resuelta)
4ax
3.03 d ancho (14.8)
4ec
2.64 d ancho (14.8)
4a
5
6.87 (s)
6
7
7-CH3
2.10 (s)
8
8a
9
54
Tabla 15 (continuación)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz). Datos para el compuesto LXXX Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz)
9a
10 6.87 (s) 10a 1' 5.06 s ancho 1'-OCH3 3.45 (s) 2' 3' 4' 2.37 (s)
1A 5.40 d (9.1) 2Aax 1.90 (solapado) 2Aec 2.50 dd (12.0, 5.0) 3A 3.83 ddd (11.9, 8.9, 5.0) 4A 3.09 t (8.8) 5A 3.55 dc solapado parcialmente (8.9, 6.2) 6A 1.32 d (solapado) 1B 4.85 (solapado) 2Bax 1.60 (solapado) 2Bec 2.28 ddd (12.0, 5.0, 1.8) 3B 4.82 ddd (11.8, 9.2, 5.2) 3B-Ac 2.10 (s) 4B 3.26 dt (9.1, 4.0) acoplado con 4B-OH 4B-OH 4.50 d (4.0) 5B 3.52 dc solapado parcialmente (9.0 y 6.2) 6B 1.32 d (solapado) 1C 5.10 d ancho (9.1) 2Cax 1.60 (solapado) 2Cec 2.55 (12.0, 5.2, 1.9) 3C 3.70 (solapado) 4C 3.00 (solapado) 5C 3.30 (señal no resuelta) 6C 1.32 d (solapado) 1D 4.85 (solapado) 2Dax 1.79 c ancho (10.0) 2Dec 1.90 (solapado) 3D 3.90 (solapado) 4D 3.70 (solapado) 5D 3.74 s ancho 6D 1.32 d (solapado) 1E 4.99 dd (9.5 y 1.8) 2Eax 1.60 (solapado) 2Eec 1.91 dd (13.4, 1.8) 3E 3E-CH3 1.24 (s) 4E 3.00 (solapado) 4E-OH 4.00 d (7.8) acoplado con 4E 5E 3.67 dc (9.1 y 6.0) 6E 1.24 d (6.0)
Para el caso particular de emplear cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 35%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 47) con un tiempo de retención de 5.48 minutos (fórmula LXXXI).
Para el caso particular de emplear propanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 65%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 48) con un tiempo de retención de 5.56 minutos (fórmula LXXXII).
Para el caso particular de emplear butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 25%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 49) con tiempos de retención de 5.46 y 5.99 minutos (fórmulas LXXXIII y LXXXIV, respectivamente).
Para el caso particular de emplear carbonato de dialilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de cinco días y se alcanzó una conversión de 25%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 50) con un tiempo de retención de 5.72 minutos (fórmula LXXXV).
Ejemplo 13: Acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK catalizada por CAL-A empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de MTM-SDK catalizadas por CAL-A se llevaron a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 7 pero empleando en este caso mitramicina SDK como sustrato de partida y CAL-A como biocatalizador. Del mismo modo, el protocolo de purificación, aislamiento y caracterización de los nuevos derivados acilados es idéntico al anteriormente descrito en el Ejemplo 7.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de tres días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificaron dos nuevos derivados acilados (FIGURA 51) con tiempos de retención de 4.89 minutos (fórmula LXXXVI) y 5.21 minutos (descrito en el ejemplo anterior con la fórmula LXXX)
Para el caso particular de emplear cloroacetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 3%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 52) con un tiempo de retención de 5.45 minutos (fórmula LXXXVII).
Para el caso particular de emplear crotonato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 4 días y se alcanzó una conversión de 75%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 53) con un tiempo de retención de 5.78 minutos (fórmula LXXXVIII).
Para el caso particular de emplear carbonato de dialilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de 4 días y se alcanzó una conversión de 80%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 54) con un tiempo de retención de 5.73 minutos (fórmula LXXXIX).
Para el caso particular de emplear anh�drido succ�nico como agente acilante el tiempo de reacción fue de 2 días y se alcanzó una conversión de 60%. Por HPLC se identificaron dos nuevos compuestos (FIGURA 55) con tiempos de retención de 4.59 y 4.77 minutos (fórmulas XC y XCI, respectivamente).
Ejemplo 14: Acilaci�n enzim�tica de CRM catalizada por CAL-B empleando diferentes agentes acilantes.
Las acilaciones enzim�ticas de CRM catalizadas por CAL-B se llevaron a cabo de forma análoga a como se ha expuesto en el Ejemplo 7 pero empleando en este caso cromomicina A3 como sustrato de partida. Del mismo modo, el 5 protocolo de purificación, aislamiento y caracterización de los nuevos derivados acilados es idéntico al anteriormente descrito en el Ejemplo 7.
Para el caso particular de emplear acetato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 95%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 56) el cual se purificó 10 empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (50:50) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 4’-acetilcromomicina A3 (fórmula XCII).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 16 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XCII). 15 Tabla 16: RMN de 4’-acetil-CRM (fórmula XCII)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCII
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad
1
203.5 C
2
4.80 (solapado) 76.6 CH
3
2.80 (solapado) 42.0 CH
4ax
2.55 (solapado) 26.9 CH2
4ec
3.00 (solapado)
4a
136.8 C
5
6.88 (s) 101.4 CH
6
159.3 C
7
110.5 C
7-CH3
2.20 (s) 7.5 CH3
8
155.7 C
8a
108.1 C
9
164.9 C
9a
107.8 C
10
6.92 (s) 117.1 CH
10a
138.5 C
1'
4.86 (s ancho) 81.3 CH
1'-OCH3
3.54 (s) 61.0 CH3
2'
211.3 C
3'
4.48 dd (6.5, 2,9) acoplado con OH 76.3 CH
4'
5.30 dc (6.0, 2.9) 70.7 CH
4'-CO
169.2 C
4'-CH3
1.95 (s) 19.9 CH3
5'
1.33 (solapado) 15.2 CH3
1A
5.47 d ancho (9.5) 97.1 CH
2Aax
2.10 (solapado) 32.9 CH2
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCII Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad

Tabla 16 (continuación)
2Aec
2.15 (solapado)
3A
4.17 ddd (11.0, 6.2, 3.0) 69.7 CH
4A
5.21 d (2.5) 67.5 CH
4A-CH3
2.15 (s) 20.1 CH3
4A-CO
170.0 C
5A
4.04 c ancho (6.4) 69.4 CH
6A
1.20 d (6.2) 16.1 CH3
1B
5.07 (solapado) 95.0 CH
2Bax
1.59 dd (12.3, 4.7) 32.2 CH2
2Bec
1.90 m (señal compleja)
3B
3.99 ddd (10.8, 6.0, 3.0) 66.1 CH
4B
3.22 s ancho 81.6 CH
4B-OCH3
3.41 (s) 58.0 CH3
5B
3.93 c ancho (6.8) 67.0 CH
6B
1.21 d (6.1) 17.2 CH3
1C
5.13 d ancho (9.7) 100.6 CH
2Cax
1.70 c ancho (10.4) 37.4 CH2
2Cec
2.60 (solapado))
3C
3.72 (solapado) 81.6 CH
4C
3.00 (solapado) 75.2 CH
5C
3.33 dc (9.0, 6.2) 72.1 CH
6C
1.31 d (6.2) 17.4 CH3
1D
4.80 (solapado) 99.4 CH
2Dax
1.49 c ancho (10.7) 36.5 CH2
2Dec
2.40 d ancho (10.3)
3D
3.72 (solapado) 76.1 CH
4D
3.13 m (señal no resuelta) 74.9 CH
5D
3.45 dc (9.0, 6.1) 72.4 CH
6D
1.33 (solapado) 17.6 CH3
1E
5.07 (solapado) 94.4 CH
2Eax
2.00 (solapado) 43.9 CH2
2Eec
2.10 (solapado)
3E
70.6 C
3E-CH3
1.42 (s) 22.7 CH3
4E
4.68 d (9.7) 79.3 CH
4E-CH3
2.05 (s) 20.3 CH3
4E-CO
170.3 C
5E
4.11 dc (10.0, 6.2) 65.7 CH
6E
1.12 d (6.2) 16.6 CH3
Para el caso particular de emplear propanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un nuevo compuesto (FIGURA 57) con un tiempo de retención de 3.62 minutos (fórmula XCIII).
Para el caso particular de emplear butanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 58) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (60:40) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 4’-butanoilcromomicina A3 (fórmula XCIV).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 17 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XCIV).
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCIV
Posici�n 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad

Tabla 17: RMN de 4’-propanoil-CRM (fórmula XCIII)
1
202.0 C
2
4.80 (solapado) 76.4 CH
3
2.80 (solapado) 42.0 CH
4ec
2.55 (solapado) 26.9 CH2
4ax
3.00 (solapado)
4a
136.9 C
5
6.89 (s) 101.5 CH
6
159.1 C
7
110.6 C
7-CH3
2.17 (s) 7.5 CH3
8
155.4 C
8a
108.1 C
9
165.0 C
9a
107.8 C
10
6.93 (s) 117.2 CH
10a
141.3 C
1'
4.84 (s ancho) 81.3 CH
1'-OCH3
3.54 (s) 61.0 CH3
2'
209.4 C
3'
4.48 dd (6.4, 2,4) acoplado con OH 76.2 CH
4'
5.32 dc (6.0, 2.7) 70.5 CH
5'
1.32 (solapado) 15.3 CH3
6'
171.9 C
7'
2.22 t (5.9) 35.6 CH2
8'
1.50 (solapado) 18.0 CH2
9'
0.84 t (7.3) 13.0 CH3
1A
5.46 d ancho (8.9) 97.2 CH
2Aax
2.05 (solapado) 32.9 CH2
2Aec
2.15 (solapado)
3A
4.15 (solapado)) 69.7 CH
4A
5.22 (s ancho) 67.5 CH
4A-CH3
2.15 (s) 19.9 CH3
4A-CO
169.9 C
5A
3.93 c ancho (6.5) 69.4 CH
6A 10
1.20 d (6.5) 16.1 CH3
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCIV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) 13C-RMN (∃ en ppm) Multiplicidad

Tabla 17 (Continuación)
2Bax
1.58 dd (12.5, 4.4) 33.1 CH2
2Bec
1.90 m (señal compleja)
3B
3.98 ddd (10.5, 6.0, 3.3) 66.1 CH
4B
3.21 s ancho 81.6 CH
4B-OCH3
3.41 (s) 58.1 CH3
5B
4.02 c ancho (6.2) 67.0 CH
6B
1.22 d (6.2) 17.2 CH3
1C
5.13 d ancho (9.3) 100.5 CH
2Cax
1.70 (señal no resuelta) 37.4 CH2
2Cec
2.55 (solapado)
3C
3.70 (solapado) 81.6 CH
4C
3.00 (solapado) 75.3 CH
5C
3.35 dc (9.0, 6.0) 72.1 CH
6C
1.32 (solapado) 17.4 CH3
1D
4.80 (solapado) 99.4 CH
2Dax
1.49 c ancho (10.4) 36.5 CH2
2Dec
2.40 s ancho (señal no resuelta)
3D
3.70 (solapado) 76.0 CH
4D
3.12 m (señal no resuelta) 74.9 CH
5D
3.45 dc (9.0, 6.0) 72.4 CH
6D
1.32 (solapado) 17.6 CH3
1E
5.07 (solapado) 94.5 CH
2Eax
1.95 (solapado) 43.9 CH2
2Eec
2.00 (solapado)
3E
69.5 C
3E-CH3
1.43 (s) 22.7 CH3
4E
4.68 d (9.7) 79.3 CH
4E-CH3
2.06 (s) 20.1 CH3
4E-CO
170.2 C
5E
4.11 dc (9.8, 6.0) 65.7 CH
6E
1.12 d (6.0) 16.5 CH3
Para el caso particular de emplear decanoato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de dos días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 59) el cual se purificó 5 empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (70:30) a un flujo de 20 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 4’-decanoilcromomicina A3 (fórmula XCV).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 18 muestra los datos
obtenidos para el compuesto de fórmula (XCV).
Tabla 18: RMN de 4’-decanoil-CRM (fórmula XCV)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) ∃13C (ppm) multiplicidad
203.5
2 4.82 d (11.6) 76.8
3 2.85 m (señal no resuelta) 41.8 4ax 3.05 (solapado) 26.8 4ec 2.55 dd (16.0, 3.5)
135.8
4a
5 6.85 (s) 101.3
159.6
6 110.7
7 7-CH3 2.17 (s) 7.5
155.8
8 108.1
8a 164.9
9 107.6
9a
10 6.95 (s) 117.0
138.7
10a 1' 4.92 d (1.3) 81.1 1'-OCH3 3.54 (s) 61.0
209.7
2' 76.5
3' 4.45 s ancho 4' 5.30 dc (6.0, 2.7) 70.6 5' 1.34 d (6.0) 15.3
172.0 C
6' 7' 2.29 t (7.4) 33.9 CH2 8' 1.60 (solapado) 24.7 CH2 9' 1.20 (solapado) 29.2 CH2 10’ 1.20 (solapado) 29.4 CH2 11’ 1.20 (solapado) 29.6 CH2 12’ 1.20 (solapado) 29.4 CH2 13’ 1.20 (solapado) 31.7 CH2 14’ 1.20 (solapado) 22.4 CH2 15’ 0.89 t (7.3) 13.5 CH3
1A 5.50 dd (9.6, 2.2) 97.1 CH 2Aax 2.05 (solapado) 32.9 CH2 2Aec 2.15 (solapado) 3A 4.15 ddd (12.2, 4.8, 2.8) 79.7 CH 4A 5.22 d (2.8) 67.5 CH 4A-CH3 2.15 (s) 19.9 CH3
169.9
4A-CO C 5A 3.91 c ancho (6.6) 69.5 CH 6A 1.20 d (6.6) 16.1 CH3
1B 5.06 d ancho (3.2) 95.0 CH 2Bax 1.60 (solapado) 33.1 CH2
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCV Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) ∃13C (ppm) multiplicidad

Tabla 18 (continuación)
2Bec
1.90 dt (11.9, 3.2)
3B
3.98 ddd (11.9, 4.4, 2.9) 66.1 CH
4B
3.22 s ancho 81.6 CH
4B-OCH3
3.40 (s) 58.0 CH3
5B
4.05 c ancho (6.4) 67.0 CH
6B
1.21 d (6.4) 17.2 CH3
1C
5.11 dd (9.7, 1.7) 100.5 CH
2Cax
1.70 m (señal no resuelta) 37.4 CH2
2Cec
2.56 ddd (11.3, 5.2, 1.7)
3C
3.72 (solapado con 3D) 81.6 CH
4C
3.04 t solapado parcialmente (9.0) 75.3 CH
5C
3.33 dc (9.0, 6.2) 72.1 CH
6C
1.30 d (6.2) 17.5 CH3
1D
4.81 d (9.8) 99.4 CH
2Dax
1.50 (solapado) 36.5 CH2
2Dec
2.41 ddd (12.4, 5.0, 1.8)
3D
3.72 (solapado con 3C) 76.2 CH
4D
3.13 t (9.0) 74.9 CH
5D
3.47 dc (9.0, 6.3) 72.4 CH
6D
1.33 d (6.3) 17.6 CH3
1E
5.09 dd (4.0, 1.5) 94.5 CH
2Eax
1.95 dd (12.0, 4.0) 43.9 CH2
2Eec
2.00 dd (12.0, 1.5)
3E
69.5 C
3E-CH3
1.43 (s) 22.7 CH3
4E
4.68 d (9.7) 79.3 CH
4E-CH3
2.07 (s) 20.1 CH3
4E-CO
170.2 C
5E
4.11 dc (9.8, 6.4) 65.7 CH
6E
1.12 d (6.4) 16.6 CH3
Para el caso particular de emplear adipato de vinilo como agente acilante el tiempo de reacción fue de siete días y se alcanzó una conversión de 90%. Por HPLC se identificó un único derivado acilado (FIGURA 60) el cual se purificó empleando como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroac�tico en agua (60:40) a un flujo de 20
5 ml/min. Una vez aislado se identificó el nuevo compuesto como 4’-(5-viniloxicarbonil)-pentanoilcromomicina (fórmula XCVI).
La elucidaci�n estructural definitiva de los nuevos derivados se realizó mediante RMN. La tabla 19 muestra los datos obtenidos para el compuesto de fórmula (XCVI). 10
Tabla 19: RMN de 4’-adipoil-CRM (fórmula XCVI)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCVI Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) ∃13C (ppm) multiplicidad
1 200.5 C
2 4.80 (solapado) 76.4 CH
3 2.80 (solapado) 41.8 CH 4ax 3.00 (solapado) 26.9 CH2 4ec 2.50 (solapado con 2Cec) 4a 138.6 C
5 6.88 (s) 101.6 CH 6 159.5 C 7 110.6 C 7-CH3 2.17 (s) 7.5 CH3 8 155.0 C 8a 108.1 C 9 165.0 C 9a 107.8 C
10 6.92 (s) 117.0 CH 10a 141.2 C 1' 4.90 (s) 81.2 CH 1'-OCH3 3.54 (s) 61.0 CH3 2' 209.6 C 3' 4.45 s ancho 76.2 CH 4' 5.35 m (señal no resuelta) 70.6 CH 5' 1.30 (solapado) 15.3 CH3 6' 171.8 C 7' 2.40 m (solapado) 33.4 CH2 8' 1.50 (solapado) 24.1 CH2 9' 1.50 (solapado) 24.0 CH2 10’ 2.40 m (solapado) 33.3 CH2 11’ 179.8 C 12’ 7.25 dd (14.0, 6.3) 141.3 CH 13’ (Z) 4.55 dd (6.3, 1.5) 96.8 CH2 13’ (E)
4.85 dd (14.0, 1.5)
1A 5.50 d (8.9) 97.1 CH 2Aax 2.05 (solapado) 32.9 CH2 2Aec 2.15 (solapado) 3A 4.15 (solapado)) 69.8 CH 4A 5.20 (s) 67.6 CH 4A-CH3 2.15 (s) 19.9 CH3 4A-CO 170.0 C 5A 4.05 c (6.3) 69.4 CH 6A 1.32 d (solapado) 16.1 CH3
1B 5.05 m (señal no resuelta) 95.0 CH 2Bax 1.60 (solapado) 33.1 CH2 2Bec 1.80 m (señal no resuelta)
1H-RMN (acetona-d6, 600 MHz) y 13C-RMN (acetona-d6, 150 MHz). Datos para el compuesto XCVI Posición 1H-RMN (∃ en ppm, multiplicidad, J en Hz) ∃13C (ppm) multiplicidad

Tabla 19 (continuación)
3B
4.00 m (señal no resuelta) 66.1 CH
4B
3.20 s ancho 81.6 CH
4B-OCH3
3.40 (s) 58.1 CH3
5B
4.00 m (solapado) 67.0 CH
6B
1.20 d (solapado) 17.2 CH3
1C
5.12 d (9.1) 100.5 CH
2Cax
1.70 (solapado) 37.4 CH2
2Cec
2.50 (solapado con 4ec)
3C
3.70 (solapado con 3D) 81.6 CH
4C
3.00 (solapado con 4ax) 75.3 CH
5C
3.30 m (señal no resuelta) 72.1 CH
6C
1.35 d (solapado) 17.4 CH3
1D
4.80 (solapado) 99.4 CH
2Dax
1.50 (solapado) 36.5 CH2
2Dec
2.35 m (señal no resuelta)
3D
3.70 (solapado con 3C) 76.2 CH
4D
3.10 m (solapado) 74.9 CH
5D
3.40 m (señal no resuelta) 72.4 CH
6D
1.35 d (solapado) 17.6 CH3
1E
5.10 (solapado) 94.5 CH
2Eax
1.95 (solapado) 43.9 CH2
2Eec
2.00 (solapado)
3E
69.5 C
3E-CH3
1.44 (s) 22.7 CH3
4E
4.68 d (9.7) 79.3 CH
4E-CH3
2.10 (s) 20.1 CH3
4E-CO
170.2 C
5E
4.15 (solapado) 65.7 CH
6E
1.12 d (6.0) 16.5 CH3
Ejemplo 15: Actividad antitumoral de los compuestos de fórmula (VII), (VIII), (IX), (XII), (XIII), (XIV), (XVI), (XVII), (XVIII), (XIX), (XX), (XXXI), (XXXVIII), (XLVI), (LI), (LII), (LIII), (LV), (LXI), (LXVIII), (LXIX).
5 Cultivo Celular
Los derivados de MTM y CRM se ensayaron frente a una serie de líneas celulares procedentes de tumores. Todas las líneas celulares tumorales se obtuvieron a partir de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC): A549 (carcinoma de pulmón humano); H116 (adenocarcinoma de colon); PSN1 (adenocarcinoma pancreático) y T98G (glioblastoma
10 humano). Las células fueron cultivadas en medio RPMI conteniendo glutamina (2 mM), penicilina (50 IU / ml) y estreptomicina (50 μg / ml). En el caso de las líneas A549 y H116 el medio fue suplementado con 5 % FBS. En el caso de las líneas PSN1 y T98G el medio se suplement� con 10% FBS.
Ensayo de proliferaci�n celular
Para evaluar el efecto citot�xico de los diferentes compuestos se han realizado estudios de viabilidad celular, mediante un ensayo basado en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazolio (MTT; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Esta reducción metabólica es llevada a cabo por el enzima mitocondrial succinatodeshidrogenasa de las células viables, y da como resultado la formación de formaz�n, un producto coloreado cuya concentración puede ser determinada por espectrofotometría.
El ensayo se realizó esencialmente según la técnica descrita por Mosmann, (J. Immunol. Methods 1983, 65, 55). Las células tumorales se incubaron en placas “microtiter” de 96 pocillos, en un volumen total de 200 #L de medio completo (4x103 células por pocillo en el caso de la línea A549 y 6x103 células por pocillo en el caso de las líneas H116, PSN1 y T98G). A continuación se añadieron a cada pocillo diluciones seriadas en DMSO del compuesto a ensayar (10 #g/ml, 5 #g/ml, 1 #g/ml, 0.5 #g/ml, 0.1 #g/ml, 0.05 #g/ml, 0.01 #g/ml, y 0.005 #g/ml). Tras 2 días de incubaci�n (a 37�C, 5% de CO2 en una atmósfera húmeda), se añadieron a cada pocillo 50 #L de MTT (1 mg/mL en PBS), y las placas se incubaron durante 2 horas a 37�C. Tras este periodo de incubaci�n, el formaz�n resultante se resuspendi� en 100ul de DMSO y se midió espectrofotom�tricamente a 490 nm. Todas las determinaciones se realizaron por triplicado. Los resultados se muestran en la Tabla 20.
Tabla 20: Ensayo de la actividad antitumoral de derivados de ácidos aure�licos de fórmula (VII), (VIII), (IX), (XII), (XIII), (XIV), (XVI), (XVII), (XVIII), (XIX), (XX), (XXXI), (XXXVIII), (XLVI), (LI), (LII), (LIII), (LV), (LXI), (LXVIII), (LXIX) frente a diversas líneas celulares tumorales. Como referencia se incluyen también los datos obtenidos con MTM, MTM-SK, MTM-SDK, 3D-desmicarosil-MTM-SK, y 3D-desmicarosil-3D-β-D-digitoxosil-MTM. Los valores numéricos hacen referencia al IC50 (μM), o concentración a la que el compuesto ensayado inhibe el 50% del crecimiento celular en comparación con células no tratadas.
Compuestos
Líneas celulares (tipo de cáncer)
A549 (pulmón)
H116 (col�n) PSN1 (pr�stata) T98G (glioblastoma)
MTM
0,046 0,0092 0,0092 0,069
MTM-SK
0,0094 0,0094 0,0094 0,0473
MTM-SDK
0,0094 0,0094 0,0094 0,0474
3D-desmicarosil-MTM-SK
1 0,5 1 >1
3D-desmicarosil-3D- -DDigitoxosil-MTM
0,0466 0,0466 0,0466 0,069
(VII)
0,05 0,01 0,1 0,3
(VIII)
0,05 0,05 0,1 0,3
(IX)
0,005 0,005 0,005 0,01
(XII)
0,05 0,01 0,05 0,3
(XIII)
0,01 0,003 0,01 0,05
(XIV)
0,05 0,01 0,05 0,75
(XVI)
0,0449 0,0089 0,0089 0,4716
(XVII)
0,0449 0,0449 0,0089 0,0674
(XVIII)
0,0449 0,0449 0,0089 0,0898
(XIX)
0,0432 0,0432 0,0086 0,2121
(XX)
0,0417 0,0083 0,0083 0,309
(XXXI)
0,043 0,043 0,043 0,043
(XXXVIII)
0,008 0,008 0,004 0,043
(XLVI)
0,433 0,043 0,043 0,043
(LI)
0,043 0,043 0,043 0,087
(LII)
0,42 0,42 0,42 0,844
(LIII)
4,21 0,844 0,633 0,844
(LV)
4,21 4,21 0,422 4,21
(LXI)
0,045 0,009 0,0065 0,045
(LXVIII)
0,0065 0,004 0,009 0,004
(LXIX)
0,009 0,009 0,045 0,004
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
5 FIGURA 1: Estructura de la mitramicina y la cromomicina A3.
FIGURA 2: Análisis por HPLC de un extracto de acetato de etilo de S. argillaceus ΔAH W– (pMP3*B2). Identificador de los picos: 1 = desmicarosil-3D-MTM-SK; 2 = 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK [fórmula (VII)]; 3 = MTM-SK; 4
10 = desmicarosil-3D-MTM-SDK [fórmula (VIII)]; 5 = 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SDK [fórmula (IX)]; 6 = MTM-SDK.
FIGURA 3: Análisis por HPLC de un extracto de metanol de S. argillaceus ΔAH W– (pMP3*B2). Identificador de los picos: 1 = desmicarosil-3D-MTM-SA [fórmula (X)]; 2 = 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SA [fórmula (XI)]; 3 = MTM-SA.
FIGURA 4: Análisis por HPLC de la bioconversi�n de MTM utilizando S. griseus C10GIV.Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = acetil-MTM [fórmula (XII)]; 3 = diacetil-MTM [fórmula (XIII)].
FIGURA 5: Análisis por HPLC de la bioconversi�n de MTM-SK utilizando S. griseus C10GIV.Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = acetil-MTM-SK [fórmula (XIV)]; 3 = diacetil-MTM_SK [fórmula (XV)].
FIGURA 6: Análisis por HPLC de la bioconversi�n de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM empleando S. griseus C10GIV. Identificador de los picos: 1 = 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM; 2 = acetil-3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM pico 1 [fórmula (XVI)]; 3 = acetil-3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM pico 2 [fórmula (XVII)]; 4 = acetil-3Ddesmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM pico 3 [fórmula (XVIII)]; 5 = diacetil-3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM [fórmula (XIX)]; 6 = triacetil-3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM [fórmula (XX)].
FIGURA 7: Análisis por HPLC de la bioconversi�n de 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK empleando S. griseus C10GIV. Identificador de los picos: 1 = 3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK; 2 = acetil-3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK [fórmula (XXI)]; 3 = diacetil-3D-desmicarosil-3D-!-D-digitoxosil-MTM-SK [fórmula (XXII)].
FIGURA 8: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con acetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-acetil-MTM [fórmula (XXIII)]; 3 = 3B-acetil-MTM [fórmula (XXIV)]; 4 = 4’,3Bdiacetil-MTM [fórmula (XXV)].
FIGURA 9: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con acetato de 2,2,2-trifluoroetilo catalizada por CAL-
B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-acetil-MTM [fórmula (XXIII)]; 3 = 3B-acetil-MTM [fórmula (XXIV)]; 4 = 4’,3Bdiacetil-MTM [fórmula (XXV)].
FIGURA 10: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con cloroacetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula XXVI; 3 = compuesto de fórmula XXVII; 4 = compuesto de fórmula XXVIII.
FIGURA 11: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con propanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-propanoil-MTM [fórmula (XXIX)]; 3 = 4’,3B-dipropanoil-MTM [fórmula (XXX)].
FIGURA 12: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con butanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = 4’-butanoil-MTM [fórmula (XXXI)]; 2 = 4’,3B-dibutanoil-MTM [fórmula (XXXII)].
FIGURA 13: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con levulinato de acetonoxima catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula XXXIII.
FIGURA 14: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con decanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-decanoil-MTM [fórmula (XXXIV)].
FIGURA 15: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con dodecanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula XXXV.
FIGURA 16: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con benzoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-benzoil-MTM [fórmula (XXXVI)].
FIGURA 17: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con crotonato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula XXXVII.
FIGURA 18: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con carbonato de dialilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-alliloxicarbonil-MTM [fórmula (XXXVIII)].
FIGURA 19: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con carbonato mixto de alilo y oxima catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-alliloxicarbonil-MTM [fórmula (XXXVIII)].
FIGURA 20: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con carbonato de vinileno catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = compuesto de fórmula XXXIX; 2 = compuesto de fórmula XL.
FIGURA 21: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de 4’-Bz-MTM con acetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = 4’-Bz-MTM [fórmula (XXXVI)]. ; 2 = 3B-acetil-4’-benzoil-MTM [fórmula (XLI)].
FIGURA 22: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con acetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-acetil-MTM [fórmula (XXIII)]; 3 = 3B-acetil-MTM [fórmula (XXIV)].
FIGURA 23: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con cloroacetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula XLII; 3 = compuesto de fórmula XLIII.
FIGURA 24: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con propanoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-propanoil-MTM [fórmula (XLIV)]; 3 = 4B-propanoil-MTM [fórmula (XLV)].
FIGURA 25: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con butanoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-butanoil-MTM [fórmula (XLVI)]; 3 = 4B-butanoil-MTM [fórmula (XLVII)].
FIGURA 26: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con decanoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-decanoil-MTM [fórmula (XLVIII)]; 3 = 4B-decanoil-MTM [fórmula (XLIX)].
FIGURA 27: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con benzoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula L.
FIGURA 28: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con crotonato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-crotonoil-MTM [fórmula (LI)].
FIGURA 29: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con carbonato de dialilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-aliloxicarbonil-MTM [fórmula (XXXVIII)].
FIGURA 30: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con anh�drido succ�nico catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 4’-(3-carboxipropanoil)-MTM [fórmula (LII)], 2 = 4B-(3-carboxipropanoil)-MTM [fórmula (LIII)], 3 = 4’,4B-di-(3-carboxipropanoil)-MTM [fórmula (LIV)], 4 = 3B-(3-carboxipropanoil)-MTM [fórmula (LV)], 5 = 4’,3B-di-(3-carboxipropanoil)-MTM [fórmula (LVI)].
FIGURA 31: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con adipato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-adipoil-MTM [fórmula (LVII)].
FIGURA 32: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con sorbato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = 3B-(2,4-hexadienoil)-MTM [fórmula (LVIII)].
FIGURA 33: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM con carbonato de vinileno catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM; 2 = compuesto de fórmula LIX; 3 = compuesto de fórmula LX.
FIGURA 34: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con acetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = 3B-acetil-MTM-SK [fórmula (LXI)].
FIGURA 35: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con cloroacetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXII; 3 = compuesto de fórmula LXIII.
FIGURA 36: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con propanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXIV; 3 = compuesto de fórmula LXV.
FIGURA 37: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con butanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = comuesto de fórmula LXVI; 3 = compuesto de fórmula LXVII.
FIGURA 38: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con carbonato de dialilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXVIII. FIGURA 39: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con acetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = 3B-acetil-MTM-SK [fórmula (LXI)]; 3 = 4B-acetil-MTM-SK [fórmula (LXIX)].
FIGURA 40: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con cloroacetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXX; 3 = compuesto de fórmula LXXI.
FIGURA 41: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con decanoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXXII; 3 = compuesto de fórmula LXXIII.
FIGURA 42: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con benzoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXXIV.
FIGURA 43: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con crotonato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXXV.
FIGURA 44: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con carbonato de dialilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXXVI.
FIGURA 45: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SK con anh�drido succ�nico catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SK; 2 = compuesto de fórmula LXXVII; 3 = compuesto de fórmula LXXVIII; 4 = compuesto de fórmula LXXIX.
FIGURA 46: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con acetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = 3B-acetil-MTM-SDK [fórmula (LXXX)].
FIGURA 47: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con cloroacetato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXI.
FIGURA 48: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con propanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXII.
FIGURA 49: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con butanoato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXIII; 3 = compuesto de fórmula LXXXIV.
FIGURA 50: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con carbonato de dialilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXV.
FIGURA 51: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con acetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXVI; 3 = compuesto de fórmula LXXX.
FIGURA 52: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con cloroacetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXV. FIGURA 53: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con crotonato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXVIII.
FIGURA 54: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con carbonato de dialilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula LXXXIX.
FIGURA 55: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de MTM-SDK con anh�drido succ�nico catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = MTM-SDK; 2 = compuesto de fórmula XC; 3 = compuesto de fórmula XCI.
FIGURA 56: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de CRM con acetato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = CRM; 2 = 4’-acetil-CRM [fórmula (XCII)].
FIGURA 57: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de CRM con propanoato de vinilo catalizada por CAL-A. 5 Identificador de los picos: 1 = CRM; 2 = 4’-propanoil-CRM [fórmula (XCIII)].
FIGURA 58: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de CRM con butanoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = CRM; 2 = 4’-butanoil-CRM [fórmula (XCIV)].
10 FIGURA 59: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de CRM con decanoato de vinilo catalizada por CAL-A. Identificador de los picos: 1 = CRM; 2 = 4’-decanoil-CRM [fórmula (XCV)].
FIGURA 60: Análisis por HPLC de la acilaci�n enzim�tica de CRM con adipato de vinilo catalizada por CAL-B. Identificador de los picos: 1 = CRM; 2 = 4’-adipoil-CRM [fórmula (XCVI)]. 15

Claims (12)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Compuesto caracterizado por la fórmula VII:
    10 2. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 para la elaboración de una composición farmacéutica destinada al tratamiento del cáncer, de la enfermedad de Paget, de enfermedades neurol�gicas, de la hipercalcemia o de la hipercalciuria.
  2. 3. Composición farmacéutica caracterizada por comprender un compuesto según la reivindicación 1 y sales 15 farmac�uticamente aceptables.
  3. 4. Cepa bacteriana Streptomyces argillaceus ΔAH-W-(pMP3*BII), caracterizada por tener inactivados los genes mtmA, mtmH y mtmW, as� como por poseer un ácido nucleico adicional que codifica enzimas activos para la biosíntesis de azúcares que no est�n presentes en Streptomyces argillaceus ATCC12956.
  4. 5. Cepa bacteriana de la reivindicación 4, caracterizada por poseer un ácido nucleico adicional contenido en el pl�smido pMP3*BII, el cual codifica enzimas activos para la biosíntesis del azúcar D-digitoxosa y sus intermediarios biosint�ticos.
    25 6. Procedimiento para obtener la cepa bacteriana de las reivindicaciones 4 � 5, que comprende la introducción del pl�smido pMP3*BII en Streptomyces argillaceus ΔAH-W-, que codifica enzimas activos para la biosíntesis de azúcares que no est�n presentes en Streptomyces argillaceus ATCC12956.
  5. 7. Procedimiento para la obtención de un derivado de ácido aure�lico según la reivindicación 1 que comprende: 30 a. Incubaci�n de una cepa bacteriana de las reivindicaciones 4 � 5 en un medio de cultivo apropiado; y
    b. Aislamiento del derivado de ácido aure�lico de la reivindicación 1 del caldo de cultivo.
  6. 8. Procedimiento para la obtención de derivados acilados del derivado de ácido aure�lico de la reivindicaion 1, que comprende
    35 a. Incubaci�n de la cepa bacteriana Streptomyces griseus ssp. griseus C10GIV en presencia del ácido aure�lico según la reivindicación 1; y
    b. Aislamiento de derivados de ácido aure�lico según la reivindicación 1 del caldo de cultivo.
  7. 9. Procedimiento para la obtención de derivados acilados del ácido aure�lico de la reivindicación 1, que comprende reaccionar el ácido aure�lico según la reivindicación 1 con un agente acilante en presencia de una hidrolasa.
  8. 10. Procedimiento, de la reivindicación 9, donde la enzima es una lipasa, preferiblemente la fracción A o B de la 5 lipasa Candida antarctica.
  9. 11. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, donde la enzima est� inmovilizada sobre un soporte, preferiblemente sobreuna resina epoxiacr�lica activada con grupos deca-octilo cuando la enzima es una lipasa.
    10 12. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, donde el agente acilante es un éster, anh�drido
    o carbonato.
  10. 13. Procedimiento, de la reivindicación 12, donde el agente acilante se selecciona del grupo que consiste en acetato de vinilo, acetato de trifluoroetilo, cloroacetato de vinilo, propanoato de vinilo, butanoato de vinilo, levulinato de
    15 acetonoxima, decanoato de vinilo, dodecanoato de vinilo, benzoato de vinilo, crotonato de vinilo, carbonato de dialilo, carbonato mixto de alilo y oxima, carbonato de vinileno, anh�drido succ�nico, adipato de vinilo y sorbato de vinilo.
  11. 14. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde la reacción se realiza empleando como
    disolvente el propio agente acilante. 20
  12. 15. Procedimiento, de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, donde la reacción se realiza empleando como disolvente tetrahidrofurano si el agente acilante es sólido o si la solubilidad del ácido aure�lico en el agente acilante es baja.
    FIG. 1
    FIG. 2
    FIG.3
    FIG.4
    FIG.5
    FIG. 9
    FIG. 10
    FIG. 11 FIG. 12
    FIG. 13
    FIG. 14 FIG. 15
    FIG. 16
    FIG. 17 FIG. 18
    FIG. 19 FIG. 21
    FIG. 22 FIG. 24
    FIG. 25
    FIG. 26 FIG. 27
    FIG. 29 FIG. 30
    FIG. 32 FIG. 33 FIG. 36
    FIG. 37
    FIG. 38 FIG. 39
    FIG. 41 FIG. 42
    FIG. 44 FIG. 45
    FIG. 47 FIG. 48
    FIG. 49
    FIG. 50 FIG. 51
    FIG. 52
    FIG. 53 FIG. 54
    FIG. 55 FIG. 57 FIG. 60
    REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN
    La lista de referencias citadas por el solicitante es, únicamente, para conveniencia del lector. No forma parte del documento de patente europea. Si bien se ha tenido gran cuidado al compilar las referencias, no pueden excluirse errores u omisiones y la OEP declina toda responsabilidad a este respecto.
    Documentos de patente citados en la descripción
    Literatura no patente citada en la descripción
ES10801992.8T 2009-07-23 2010-07-14 Derivados de ácidos aure�licos, su procedimiento de obtención y sus usos Active ES2471464T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES200930497 2009-07-23
ES200930497A ES2355032B1 (es) 2009-07-23 2009-07-23 Derivados de �?cidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos.
PCT/ES2010/070489 WO2011009987A2 (es) 2009-07-23 2010-07-14 Derivados de ácidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2471464T3 true ES2471464T3 (es) 2014-06-26

Family

ID=43499471

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES200930497A Expired - Fee Related ES2355032B1 (es) 2009-07-23 2009-07-23 Derivados de �?cidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos.
ES10801992.8T Active ES2471464T3 (es) 2009-07-23 2010-07-14 Derivados de ácidos aure�licos, su procedimiento de obtención y sus usos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES200930497A Expired - Fee Related ES2355032B1 (es) 2009-07-23 2009-07-23 Derivados de �?cidos aureólicos, su procedimiento de obtención y sus usos.

Country Status (5)

Country Link
US (1) US8772253B2 (es)
EP (1) EP2457921B1 (es)
DK (1) DK2457921T3 (es)
ES (2) ES2355032B1 (es)
WO (1) WO2011009987A2 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093652A1 (en) * 2012-12-14 2014-06-19 University Of Kentucky Research Foundation Semi - synthetic mithramycin derivatives with anti-cancer activity
US9447135B2 (en) 2012-12-14 2016-09-20 University Of Kentucky Research Foundation Semi-synthetic mithramycin derivatives with anti-cancer activity
ES2766772T3 (es) 2015-09-17 2020-06-15 Entrechem S L Combinaciones de un análogo de mitramicina y otro agente quimioterápico para el tratamiento de cáncer de mama triple negativo

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US7423008B2 (en) * 2004-03-01 2008-09-09 University Of Kentucky Research Foundation Derivatives of mithramycin and methods of making and uses thereof
ES2303789B1 (es) * 2007-02-06 2009-06-05 Universidad De Oviedo Derivados glicosilados de mitramicina, su procedimiento de obtencion y sus usos.

Also Published As

Publication number Publication date
US20120270823A1 (en) 2012-10-25
US8772253B2 (en) 2014-07-08
EP2457921A4 (en) 2013-01-02
DK2457921T3 (da) 2014-06-10
ES2355032B1 (es) 2012-03-21
EP2457921A2 (en) 2012-05-30
WO2011009987A3 (es) 2011-07-21
ES2355032A1 (es) 2011-03-22
EP2457921B1 (en) 2014-03-19
WO2011009987A2 (es) 2011-01-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Remsing et al. Mithramycin SK, A Novel Antitumor Drug with Improved Therapeutic Index, Mithramycin SA, and Demycarosyl-mithramycin SK: Three New Products Generated in the Mithramycin Producer Streptomyces a rgillaceus through Combinatorial Biosynthesis
Sakai et al. Pladienolides, new substances from culture of Streptomyces platensis Mer-11107 II. Physico-chemical properties and structure elucidation
US8598132B2 (en) Glycosylated indolocarbazoles, method for obtaining same and uses thereof
Ishibashi et al. NOVEL ANTIBIOTICS, FURAQUINOCINS C, D, E, F, G AND H
Tsukamoto et al. Lignans from bark of the Olea plants. II
ES2471464T3 (es) Derivados de ácidos aure�licos, su procedimiento de obtención y sus usos
Tang et al. Feigrisolides A, B, C and D, new lactones with antibacterial activities from Streptomyces griseus
Harwoko et al. Azacoccones FH, new flavipin-derived alkaloids from an endophytic fungus Epicoccum nigrum MK214079
HU206221B (en) Process for producing acylated derivatives of etoposide and pharmaceutical compositions comprising such compounds as active ingredient
Golik et al. AT2433-A1, AT2433-A2, AT2433-B1 AND AT2433-B2 NOVEL ANTITUMOR COMPOUNDS PRODUCED BY ACTINOMADURA MELLIAURA II. STRUCTURE DETERMINATION
EP1963349B1 (en) Novel loganin analogues and a process for the preparation thereof
Kuroda et al. Structure of a novel 22-homo-23-norcholestane trisaccharide from Ornithogalum saundersiae
Liu et al. Trichodermamide A and aspergillazine A, two cytotoxic modified dipeptides from a marine-derived fungus Spicaria elegans
RU2285008C2 (ru) Новые полициклические ксантоны и их применение
Alaoui-Jamali et al. Relationship between the structure and cytotoxic activity of new unsaturated ketonucleosides tested on eight cell lines
ES2483265T3 (es) Derivados glicosilados de mitramicina, su procedimiento de obtención y sus usos
Sakushima et al. Taxifolin 3-arabinoside from Trachelospermum jasminoides var. Pubescens
CA2029537C (en) Pradimicin derivatives
Noda et al. A novel quinoline alkaloid possessing a 7-benzyl group from the centipede, Scolopendra subspinipes
Královcová et al. Anthraquinones related to anthracyclinones from the mutant strain Streptomyces galilaeus J-14
JP7026185B2 (ja) 新規化合物コッコキノン類、その製造方法、及びその用途、並びに新規微生物
DK173937B1 (da) Antitumor aktive epoxyforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling heraf, biologisk ren mikroorganismekultur til brug derved, farmaceutisk præparat omfattende disse forbindelser og anvendelse af forbindelserne
KR100225458B1 (ko) 믹소코크스 속의 점액세균, 이로부터 생산되는 신규 항종양활성 화합물 및 그의 제조방법
US5093248A (en) BU-3862T antitumor antibiotic
Khan et al. Isolation and Biological Activity of Seven New Drimane-Type Sesquiterpenoids from an Earwig-Associated Aspergillus sp. NF2396