CN106566891A - 一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子标记鉴定领域，具体公开一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，特定引物组由正向引物L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT，反向引物Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA、Cytb‑R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG组成。利用特定引物组PCR扩增黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA并电泳检测，电泳谱图显示：黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物仅在近500 bp处出现一条特异亮带，棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带，从而准确、快捷的区分两种幼鱼。

Description

一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法
技术领域
本发明涉及分子标记鉴别领域，具体涉及一种利用特定扩增引物组鉴别黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼的方法。
背景技术
黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼同属石首鱼科下的梅童鱼属，为我国重要的小型经济鱼类。棘头梅童鱼的成年个体一般体长9～14 cm、体重15～50 g，而黑鳃梅童鱼的成年个体一般体长7.5～9.5 cm、体重 9～20 g，且黑鳃梅童鱼的鳃腔上有深黑色斑块而棘头梅童鱼没有，因此很容易通过外部形态区分黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的成年个体，但是两种梅童鱼在幼鱼阶段的外部形态非常相似，无法通过外部形态进行区分。
分子遗传标记可快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，是当前用于分析水产生物种质鉴别与群体遗传特性的主要标记。利用电泳图谱分析技术，以条带的扩增情况来反映物种的特异遗传信息，操作方法简单、结果分析方便。
中国专利CN106086167A，专利名称一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列及方法，公开日期2016年11月9日，公开了一种利用有上游引物和下游引物组成的引物组对提取的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测从而鉴别大黄鱼、小黄鱼和棘头梅童鱼的方法，对应的碱基序列为上游引物：GGAAAGAGCCAGGAAAGC、下游引物：GGCGGAACTCTGAGCAAA，其中小黄鱼在近1000 bp处出现特异亮带，大黄鱼在近750 bp处出现特异亮带，棘头梅童鱼在低于500bp处出现特异亮带。但是该引物组对同属梅童鱼属的棘头梅童鱼和黑鳃梅童鱼的特异性不明显，PCR扩增后的产物均只在低于500 bp处出现特异亮带，因而无法有效鉴别棘头梅童鱼和黑鳃梅童鱼，当然也无法分别两种梅童鱼的幼鱼。
发明内容
针对无法通过外部形态区分黑鳃梅童鱼幼鱼与棘头梅童鱼幼鱼，而利用上述专利中所述引物组对基因组DNA扩增也无法准确有效区分两种梅童鱼的幼鱼的问题，本发明的目的在于提供一种特定的引物组并利用该特定引物组通过合适的PCR扩增途径鉴别两种梅童鱼的幼鱼的方法。
本发明提供如下的技术方案：
一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，所述特定引物组由一条正向引物L14734和两条反向引物Cytb、Cytb-R组成，对应的碱基序列分别为：
L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT；
Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA；
Cytb-R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。
作为本发明的优选，利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法包括以下步骤：
（1）利用黑鳃梅童鱼或棘头梅童鱼的幼鱼样品制备样本DNA；
（2）对包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；
（3）电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。
作为本发明的优选，通过以下方法判定电泳结果：PCR扩增产物只在近500 bp处出现一条特异亮带的为黑鳃梅童鱼幼鱼，PCR扩增产物分别在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带的为棘头梅童鱼幼鱼。
作为本发明的优选，样本DNA由经苯酚/氯仿抽提法从黑鳃梅童鱼幼鱼或棘头梅童鱼幼鱼的50～100 mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100(l双蒸水中制得。
作为本发明的优选，PCR扩增体系的体积为25 (l，其组成分别为：10×buffer 2.5(L、浓度为2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、浓度为10 (mol/L的L14734 1.5 (l、浓度为10 (mol/L的Cytb 1.3 (l、浓度为10 (mol/L的Cytb-R 0.2 (l、浓度为5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、样本DNA 2 (l、余量为H2O。
作为本发明的优选，PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系置于PCR仪中在94 ℃下保温3 min进行预变性，然后经40个温度循环处理，然后72 ℃下保持10 min，其中每个温度循环包括：94 ℃保持45 s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
作为本发明的优选，电泳检测条件为：琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%、电泳电压140V、电泳时间20 min。
本发明的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法基于分子生物学原理，根据黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA的序列差异设计三条特异引物：正向引物L14734、反向引物Cytb和反向引物Cytb220，并利用特异引物对黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经过凝胶电泳检测得到的电泳谱图显示：黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物仅在近500 bp处出现一条特异亮带，而棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360bp和近500 bp处各出现一条特异亮带，从而准确、简单、快捷的区分两种梅童鱼幼鱼。
本发明的有益效果如下：
本发明设计特定引物组对两种梅童鱼幼鱼的样本DNA进行PCR扩增并电泳检测，利用电泳谱图中出现的明显差异可准确的区分黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，也可以准确鉴别成年黑鳃梅童鱼和棘头梅童鱼，具有准确、灵敏、操作简单、快速、高效的优点。
附图说明
图1是两种梅童鱼的基因组DNA经特定引物组PCR扩增的PCR扩增产物的电泳图谱。
图中棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带，黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物在近500 bp处出现一条特异亮带。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
本发明中所采用的原料如无特别说明均可从市场上购得或是本领域常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1
一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为棘头梅童鱼幼鱼和黑鳃梅童鱼幼鱼，特定引物组由正向引物L14734和反向引物Cytb、Cytb-R组成，对应序列为：L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT、Cytb：CTCAGAATG ACATTTGTCCTCA、Cytb-R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。
一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法优选包括以下步骤：
（1）提取基因组DNA：利用黑鳃梅童鱼或棘头梅童鱼的幼鱼样品制备样本DNA，优选取幼鱼样品的背部肌肉50～100 mg经苯酚/氯仿提取法提取基因组DNA，并将提取后的基因组DNA溶于100 (l双蒸水中制得样本DNA。
（2）PCR扩增：将包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系置于PCR仪中进行PCR扩增，制取样本DNA的PCR扩增产物，其中PCR扩增体系的体积为25 (l，组成优选为： 10×buffer 2.5 (L、浓度为2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、浓度为10 (mol/L的L14734 1.5 (l、浓度为10 (mol/L的Cytb 1.3 (l、浓度为10 (mol/L的Cytb-R 0.2 (l、浓度为5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、样本DNA 2 (l、余量为H2O。PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系在94 ℃下保温3min进行预变性，然后经过40个温度循环处理，然后72 ℃下保持10 min，每个温度循环依次包括：94 ℃保持45 s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
（3）电泳检测：将PCR扩增产物置于琼脂糖凝胶质量浓度为1.5%的TBE溶液中进行电泳试验，电泳电压为140V，电泳时间为20 min。利用凝胶成像系统对电泳结果拍照、记录并读带，对电泳谱图的结果进行判定。
对电泳结果的判定依据如下：如图1所示，当PCR扩增产物电泳谱图仅在近500 bp处出现一条特异亮条带时，该幼鱼样品为黑鳃梅童鱼幼鱼；当PCR扩增产物的电泳谱图在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮条带时，该幼鱼样品为棘头梅童鱼幼鱼。
本发明利用特定引物组扩增两种梅童鱼幼鱼的基因组DNA，并在凝胶电泳检测结果中显示出清晰的条带差异，可准确地将黑鳃梅童鱼和棘头梅童鱼的幼鱼区分开，是一种有效且简便易行的鉴别手段。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江海洋大学
<120> 一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法
<130> JWE163557
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aaccaccgtt gttattcaac t 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcagaatga catttgtcct ca 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gttgcggccg cgacaataaa g 21

Claims (7)

1.一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，其特征在于，所述特定引物组由一条正向引物L14734和两条反向引物Cytb、Cytb-R组成，对应的碱基序列分别为：
L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT；
Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA；
Cytb-R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。
2.根据权利要求1所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，包括以下步骤：
（1）利用黑鳃梅童鱼幼鱼或棘头梅童鱼幼鱼制备样本DNA；
（2）对包含有样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；
（3）电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。
3.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，通过以下方法判定电泳结果：PCR扩增产物只在近500 bp处出现一条特异亮带的为黑鳃梅童鱼幼鱼，PCR扩增产物分别在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带的为棘头梅童鱼幼鱼。
4.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，样本DNA由经苯酚/氯仿抽提法从黑鳃梅童鱼幼鱼或棘头梅童鱼幼鱼的50～100 mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100 (l双蒸水中制得。
5.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，PCR扩增体系的体积为25 (l，其组成分别为：10×buffer 2.5 (L、浓度为2.5 mmol/L的dNTP 2 (L、浓度为10 (mol/L的L14734 1.5 (l、浓度为10 (mol/L的Cytb 1.3 (l、浓度为10 (mol/L的Cytb-R 0.2 (l、浓度为5 U/(l 的Taq酶0.2 (l、样本DNA 2 (l、余量为H2O。
6.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系置于PCR仪中在94 ℃下保温3 min进行预变性，然后经40个温度循环处理，然后72 ℃下保持10 min，其中每个温度循环包括：94 ℃保持45s、50 ℃保持45 s、72 ℃保持45 s。
7.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，电泳检测条件为：琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%、电泳电压140V、电泳时间20 min。
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