CN117721244A - 与玉米种子耐储性相关主效qtl紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了与玉米种子耐储性相关主效QTL紧密连锁的分子标记及应用。所述分子标记与位于玉米第7号染色体Bin7.05区域内玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE‑7紧密连锁，所述的InDel分子标记为ID128或ID136，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。本发明基于基因组重测序方法在qRGE‑7所在区段内开发Indel分子标记，将目标QTL区段缩小至0.33Mb范围内，本发明所提供的分子标记可应用于玉米种子耐储性相关遗传研究和分子辅助育种。
Description
技术领域
本发明涉及玉米种子耐储性相关的分子标记，尤其涉及与玉米种子耐储性相关主效QTLqRGE-7紧密连锁的分子标记，本发明进一步涉及其所述分子标记在分子辅助育种中的应用，属于分子标记及其应用领域。
背景技术
种子是农业生产过程中的基本资料，一般收获后都需要进行储藏，在储藏过程中会不可避免的发生老化现象。据联合国粮农组织（http://www.fao.org）资料显示，世界平均每年因储藏而导致种子发芽率下降甚至丧失种用价值的种子量占粮食总产量的10%-18%，不发达国家甚至高达30%。通过控制储藏条件（温调和气调），虽可延缓种子活力下降的速率，但不能从根本上解决这一问题。不同种质资源的种子耐储性存在显著差异，解析其遗传基础，选育耐储新品种是解决这一问题的重要途径。
种子的老化是一个循序渐进的过程，其内部会发生一系列生理生化变化。大量研究表明，种子在储藏过程中发生的膜损伤、DNA和RNA的损伤、蛋白质合成能力下降和蛋白质损伤、活性氧自由基（ROS）过量积累等生理生化变化是导致其老化的主要原因。
种子耐储性是复杂的性状，综合表现在发芽率、发芽势、根长、苗长、鲜重、干重等多个方面，且耐储性是一个数量性状位点，由多基因控制。对于种子耐储性评价的方法主要有：对老化处理后的种子测量其耐老化相关指标进行直接评价，或是通过老化前后的各种指标计算相对值进行耐老化评价。主要测定指标有种子发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、简易活力指数、幼苗长、根长、苗干重等指标。
一般情况下，发芽率、发芽势和活力指数是评价种子活力的常用指标。发芽率是指在规定日期内正常发芽的种子数占试验种子总数的百分比，一般为7d，常用来评估种子的耐储性。种子随着储藏时间的延长，为了维持正常的生命活动而降低能量的消耗，同时又能保持自身的活力，当外界条件合适时可以快速提高其新陈代谢速度而发芽。发芽势是指在规定日期内发芽种子数占供试种子总数的百分数，一般认为规定第4d进行测定。当发芽率相同时，在一定范围内发芽势越高，说明种子的生命力就越强。活力指数是评价种子耐储性的另一关键指标，一般指发芽指数与幼苗长度的乘积。活力指数不但能反映种子发芽速度和发芽率，而且能够反应幼苗的生长活力。
种子耐储性是由多基因控制的数量性状位点，国内外研究者对相关的基因和调控机制的研究大多是利用模式植物水稻和拟南芥获得的，在玉米中的研究相对较少，还处于QTL定位阶段。研究者利用不同玉米自交系构建F2:3和RIL等分离群体定位到的QTL在1-10号染色体上均有分布，其中2、5、6、8号染色体上比较集中。目前只有在10号染色体上有精细定位的报道将主效QTLqGR10定位到大小为1.37Mb的区段，并预测到了4个相关候选基因。因此有必要进一步加强此领域的研究。
本发明发明人前期以种子耐储性差异极显著的玉米自交系东156和东237为试材，构建F2:3群体和RIL群体进行QTL分析，在7号染色体获得大小为7.97Mb控制相对发芽势的主效QTL qRGE-7，表型贡献率为14.63%（CN110423838B）。在此基础上，本发明以qRGE-7为目标，对东156和东237进行全基因组测序，开发目标区段内的InDel标记，构建回交群体群体，采用人工老化方法检测耐储性相关表型，利用开发的InDel标记检测基因型，进行qRGE-7的精细定位。研究结果对玉米种子耐储性遗传机制研究和资源创新具有重要意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记；
本发明的目的之二是将所筛选得到的InDel分子标记应用于玉米种子耐老化新品种的分子辅助育种。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
本发明首先基于前期研究对玉米自交系东156（耐储）和东237（不耐储）进行基因组重测序，在耐储性相关主效QTL qRGE-7所在目标区段内的挖掘到9702个InDel位点，以小片段的插入/缺失为主，且不同长度的InDel主要集中位于内含子和基因间。
本发明依据qRGE-7目标区段内的东156与东237重测序数据，设计和筛选出30个Indel标记，分布均匀且在两亲本自交系之间具有多态性。
本发明以含有219个单株东156（耐储）和东237创建的BC4F3群体为试材，结合热水浴老化法耐储性相关表型检测和30个InDel标记目标区段基因型检测数据，采用复合区间作图法进行耐储性相关QTL分析，将qRGE-7定位在标记ID128与ID136之间，物理位置为170228614-170561554（参考B73 RefGen V4），大小为0.33Mb。
在上述研究的基础上一种与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记，所述分子标记与位于玉米第7号染色体Bin7.05区域内玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁，所述的InDel分子标记为ID128以及ID136，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。
用于扩增分子标记ID128的上游引物：5'-CAATTTGAACCGCGTGAC-3'（SEQ ID No:1）
用于扩增分子标记ID128的下游引物：5'-CGCAGATAACCCGACCA-3’（SEQ ID No:2）
用于扩增分子标记ID136的上游引物：5'-TAAACACCTCGCCCACCT-3'（SEQ ID No:3）
用于扩增分子标记ID136的下游引物：5'-CTTTCGCCTGTTCCTTGAG-3'（SEQ ID No:4）
进一步的，本发明还提出了所述的与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记在玉米种子耐储新品种选育中的应用。
再进一步的，本发明还提出了用于扩增所述的与玉米种子耐储性相关主效QTLqRGE-7紧密连锁的InDel分子标记的引物对，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQID No:3和SEQ ID No:4所示。
更进一步的，本发明还提出了所述的引物在玉米种子耐储新品种选育中的应用。
更进一步的，本发明还提出了一种玉米耐储新品种的选育方法，包括以下步骤：
（1）获得东237和东156杂交获得F1杂交种，以东156为轮回亲本进行回交获得BC1F1群体；
（2）利用所述的与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记ID128以及ID136分子标记对回交后代进行前景选择，其中，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示；
（3）根据均匀分布于10条染色体的40对多态性SSR标记P01-P40，对入选单株进行背景选择，用于扩增背景选择的SSR标记的引物如SEQ ID No:5-SEQ ID No:84所示；
（4）保留背景回复率高且同时含有ID128以及ID136分子标记的单株，继续与东237进行回交，在BC3F1世代中，获得背景回复率为98.75-99.60%且包含ID128以及ID136分子标记的改良单株。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提出了一种与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的分子标记及其应用。所述分子标记与位于玉米第7号染色体Bin7.05区域内玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁，所述的InDel分子标记为ID128或ID136。本发明基于基因组重测序方法在qRGE-7所在区段内开发Indel分子标记，将目标QTL区段缩小至0.33Mb范围内，同时本发明所提供的分子标记可应用于玉米种子耐储性相关遗传研究和分子辅助育种中。
附图说明
图1为东156和东237基因组测序深度；
注：图（A）为亲本东156基因组DNA测序水平；图（B）为亲本东237基因组测序水平。横坐标表示亲本东156与东237基因组DNA测序深度，纵坐标表示此深度所对应的碱基所占百分比；
图2为qRGE-7区段内不同长度的InDel数目；
图3为部分InDel标记在亲本自交系东156和东237之间的多态性筛选；
小写字母(a-v)分别表示标记：（a）ID54；（b）ID57；（c）ID60；（d）ID64；（e）ID67；（f）ID78；（g）ID81；（h）ID85；（i）ID89；（j）ID97；（k）ID107；（l）ID117；（m）ID118；（n）ID128；（o）ID136；（p）ID141;（q）ID146;（r）ID152;（s）ID182;（t）ID245;（u）ID251;（v）ID261.每个字母中左侧泳道代表东156，右侧代表东237；
图4为BC4F3群体遗传连锁图谱；
相对发芽势：▲；相对发芽率：▼；相对发芽指数：■ ；相对苗长：●；相对活力指数：◆；相对简易活力指数： ★；D值：。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
实施例1 玉米种子耐储性相关qRGE-7区段内DNA序列变异分析
1 试验材料
2份种子耐储性差异极显著的玉米自交系，其中东156，籽粒类型为硬粒，在自然条件下储藏8年其种子发芽率仍保持在90%以上；东237，籽粒类型为半马齿，在自然条件下储藏1年后其种子发芽率降至80%左右；东156，东237已记载在题为“不同人工老化法测定玉米种子耐储性的比较分析，邸宏等，玉米科学. 2015,23(03)”中，均由东北农业大学玉米遗传育种团队选育、保存和提供。
2 试验方法
采用CTAB小量法提取自交系东156和东237三叶一心期幼苗叶片总DNA，利用紫外分光光度计测定DNA浓度和质量，OD260/OD280比值在1.8-2.0之间、含量在1.0μg以上的DNA样品用来建库。利用Covaris破碎仪将基因组DNA随机打断成长度为350bp的片段，在片段两端分别连接上接头，创建DNA文库，库检合格后进行Illumina HiSeq Xten平台PE150（Pairend 150bp）测序。
采用BWA软件将clean reads与玉米B73参考基因组做比对，运用Annovar软件对SNP、InDel位点进行注释，确定变异位点对应的信息、突变类型等。根据变异位点在参考基因组上的位置以及参考基因组上的基因位置信息，得到变异位点在基因组发生的区域（基因间区、基因区或CDS区等），以及变异产生的影响（同义/非同义突变等）。
3 主要结果
（1）测序数据统计与比较
对前期研究中创建QTL遗传分析群体的2个亲本自交系东156和东237，进行了全基因组测序。对测序数据进行质量控制和检查，东156过滤后共44273869200个碱基，东237过滤后共6917565500个碱基，有效读长分别为147579564和156391885，GC含量分别为47.13%和47.22%，质量值大于20的碱基数分别为97.19%和97.18%，质量值大于30的碱基数分别为92.66%和92.75%，测序数据质量较好。测序原始数据见表1。
采用BWA软件将clean reads与自交系B73作为参考基因组进行比对，再利用amtools软件将结果转为bam格式并排序，然后用picard标注并去除重复序列，最后进行数据基本信息统计及map比对统计，统计结果见表2。结果表明，98.48%的东156有效读长和98.61%的东237的有效读长可以比对到参考基因组玉米自交系B73上，覆盖率分别为87.42%和91.06%，两个样品的平均测序深度分别为17倍（东156）和19倍（东237）。东156与东237基因组DNA深度分布图见图1，两亲本的单碱基深度符合正态分布。
（2） 主效QTL qRGE-7区段内基因组插入、缺失变异（InDel）分析
东156与东237在目标区段qRGE-7进行DNA序列进行比对，挖掘目标区段内的不同长度的InDel进行统计，发现共有9702个InDel位点，其中发生在编码区和非编码区的InDel位点数量分别为246和9456。发现InDel位点的差别主要发生在纯合突变上，4952个纯合突变占所有突变的51.04%，其次是杂合突变，再次是杂合缺失，最后是其他类型的突变，见表3。
对检测到的InDel的长度分析发现，主要是以小片段的插入/缺失为主。在检测到的InDel中，InDel长度主要集中在1-3bp，共有5852个位点（60.31%），InDel长度在大于3bp的共3850个（39.69%）。在长度为1-3bp的位点中，长度为1bp的InDel位点最多，共有3493，占InDel总数的36.00%。同时对位于内含子、外显子及基因间的InDel长度分析结果显示，不同长度的InDel主要集中位于内含子和基因间，且位于基因间的InDel显著大于位于内含子上的InDel，数目最少的是位于外显子上的InDel，但在InDel长度为14时，位于内含子上的InDel数目大于位于基因间的InDel数目，结果见图2。
实施例2 玉米种子耐储性相关qRGE-7区段内Indel标记的开发
1 试验材料
依据东156与东237的重测序数据，挖掘主效QTL qRGE-7区段内基因组插入、缺失变异（InDel）位点。
2 试验方法
提取InDel位点上下游150bp序列，从MaizeGDB基因组数据库（http://www.maizegdb.org/）中查取参考基因组B73序列，使用Primer5.0软件设计引物开发新分子标记。设计引物设计原则为：退火温度选择在50-60℃之间，最佳温度为55℃；产物大小为100-300bp；引物（G+C）含量在40%-60%之间，避免引物出现二级结构、发夹结构和二聚体。引物由擎科生物科技有限公司合成。将新设计出的InDel标记在东156和东237两个亲本间进行多态性筛选，筛选出具有多态性的引物用于下一步的群体检测。
将所有PCR反应物按表4所示体系混匀后，加入18uL矿物油覆盖，按照表5所示程序进行扩增，扩增产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物片段，银染显影。
3 主要结果
基于对东156与东237在目标区段qRGE-7内的重测序结果，在区段内均匀选取其中的240个InDel位点设计引物开发标记，标记全长8.69Mb（物理位置参考B73 RefGen V4版本），标记之间平均物理距离为5.7Kb。将InDel标记的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，共筛选出30个条带清晰、在亲本（东156和东237）间有多态性、重复性好的标记。其中发生插入类型的标记数为12个，发生缺失类型的标记数为18个，插入/缺失的碱基数多数在30bp以下。30个InDel标记的引物名称和序列见表6，部分引物亲本间多态性筛选结果见图3。
实施例3 玉米种子耐储性相关qRGE-7区段内Indel标记的应用
1 试验材料
以玉米自交系东237为轮回亲本，构建东156和东237的回交群体，早代群体不进行选择，从BC3F1开始进行SSR标记辅助选择，对BC4F2和BC4F3群体进行InDel标记选择。
2 试验方法
（1）基因型检测
根据玉米种子耐储性主效QTLqRGE-7两侧的2个SSR标记umc1671和phi328175，在BC3F1回交群体家系中进行前景选择。利用在目标区段内设计的InDel标记对BC4F2群体进行前景选择。引物信息见表7，PCR体系和程序见表4和表5。
选择均匀分布于玉米10条染色体上且在2个亲本自交系间具有多态性的40个SSR标记，在BC3F1群体中进行背景回复率的检测。背景回复率（recovering ratio of geneticbackground，RRGB）计算公式为：Gg=（L+Xg）/2L，理论值G=1-（1/2）g+1其中，Gg指在g代的遗传背景回复率；Xg指在回交g代表现为轮回亲本带型的分子标记数量；L指所分析的分子标记数量。40对SSR引物信息见表8。
/>
（2）耐储性相关表型检测
取大小均匀、无破损的玉米种子用1%次氯酸钠消毒液消毒30min后，放入小网袋内，置于水浴锅内老化45min，温度58±1℃，该老化方法参照颜启传等（2006年）；自来水冲洗3遍蒸馏水冲洗3遍；室温晾干2-3d，平衡水分后进行发芽试验，发芽方法参照朱京斌等（2016年）中的试验方法并进行改良，将发芽纸用蒸馏水润湿，将种子等距排列在润湿的发芽纸上，胚根朝向发芽纸底部，覆上1层湿润的发芽纸，将2层发芽纸紧紧卷好，保证种子能够充分接触湿润的发芽纸；将卷后的发芽纸放入发芽盘中，上层覆上不透气的塑料板；发芽盘置于25℃培养箱中培养，湿度65%RH±5%。
试验设置老化处理组和对照组，每组3次重复，每个重复50粒种子，每天记录发芽数，第4d开始计算种子发芽势，第7d结束计算发芽率和发芽指数。
发芽势（GE）=发芽试验播种第4 d的发芽种子数/供试种子数×100%；
发芽率（GP）=发芽试验播种第7 d长成的正常幼苗数/供试种子数×100%；
发芽指数（GI）=∑Gt/Dt，式中Dt为相应的发芽天数，Gt为与Dt相对应的不同时间的发芽数。
为了避免家系间种子原始活力高低对耐储性评价的影响，本研究采用各表型性状的相对值为耐储评价指标。各表型性状的相对值=老化发芽试验的性状值/标准发芽试验的性状值，所有指标取3次重复平均值。
利用软件Microsoft Excel 2010和SPSS19.0对表型数据进行变幅、均值、平均值、标准差、变异系数、系统聚类等进行分析。根据表型数据采用加权隶属函数法计算D值，算法参照陈新等（2014年）的计算公式，并根据加权隶属函数值（D值）采用瓦尔德法进行聚类分析，建立群体不同耐储等级表型数据库。
加权隶属函数法计算公式如下：
式中Xi为各供试材料在经过热水浴老化（HW）后的各测量指标与正常标准发芽试验下各测量指标的比值，Ximax、Ximin分别为供试材料中Xi的最大值和最小值，μ（Xi）为各供试材料Xi的隶属函数值，CVi为各供试材料μ(Xi)的变异系数，Wi表示CVi在总变异中所占比率。
（3）QTL分析
利用Icimapping 4.2软件对InDel基因型数据库进行遗传连锁图的构建，先用“group”命令对部分标记分组，再用“order”命令确定各连锁群标记排列顺序（LOD=2.5），选用“Kosambi”函数将重组值转换成图距（cM）。
结合表型数据库和基因型数据库，运行Icimapping 4.2软件，采用复合区间作图法对耐储相关性状进行QTL分析，以LOD>2.5作为可检测QTL位点存在的阈值。
3 主要结果
（1）BC4F2群体的创制和分子标记辅助选择
利用耐储性差异极显著的一对亲本东156（耐储）和东237（不耐储）杂交，之后以东237作为轮回亲本进行连续回交，构建了包含360个单株的BC3F1回交群体。
在BC3F1群体中使用耐储性主效QTLqRGE-7两侧分子标记umc1671和phi328175进行前景选择，筛选携带耐储性主效QTLqRGE-7的单株。部分检测结果见图3，目标区段呈杂合的单株即为入选单株。从BC3F1群体中共筛选出25个入选单株。
根据玉米基因组数据库（http://www.maizegdb.org/data_center/map）公布的标记遗传位置，选取了均匀分布于10条染色体的40对多态性SSR标记，对25个入选单株进行背景选择。背景回复率最低的为93.75%，回复率最高的为96.25%，BC3F1群体的理论背景回复率为93.75%，25个入选单株的背景回复率均大于回交群体的理论值，因此将25个单株继续与轮回亲本东237回交，创建了包含750个单株的BC4F1群体。
对BC4F1群体单株种子自交构建了包含750个家系的BC4F2群体，以BC4F2群体为试材，采取热水浴老化法进行耐储性相关表型检测，根据表型指标数值进行方差分析。从表9中可知，参试单株在3个耐储性相关指标中均表现出较大的变异幅度，其中3个耐储性相关指标的变异系数均大于70%，相对发芽势的变异系数最大，达到78.12%。
采用加权隶属函数函数法，根据RGP、RGE、RGI共3个指标为依据，对玉米耐储性进行评价。BC4F2群体各家系D值的变化范围在0.01-0.84之间，采用聚类分析法按D值将材料的耐储性分为三个等级，D1类别与亲本东156耐储性相近，D值变化范围在0.56-0.84之间；D2类别耐储性介于亲本东156与东237之间，D值变化范围在0.16-0.55之间；D3类别与东237耐储性相近，D值变化范围在0.01-0.14。D值与RGP、RGE、RGI共3个指标均呈极显著正相关关系，表明D值可以用来综合评价玉米自耐储性，值越大耐储藏能力越强，相关性分析见表10。
注：**表示在0.01水平显著相关。
根据表型检测结果，共筛选到20个耐储性较高的单株，结合在双亲间具有多态性的30对InDel标记对其进行基因型检测，筛选出9个关键单株，耐储性等级均为D1级别，即与亲本东156耐储性相近，其中1262-12和1153-13均检测到8个杂合位点，1142-3检测到9个杂合位点，941-2和941-3均检测到10个杂合位点，1044-2、1262-15和1170-7均检测到12个杂合位点，1044-7检测到15个杂合位点。
（2）BC4F3群体的创建和耐储性表型检测
根据玉米基因组数据库（http://www.maizegdb.org/data_Center/map）公布的标记遗传位置，选取了均匀分布于10条染色体的40对多态性SSR标记，用于对9个单株进行背景选择，背景回复率在96.25%-98.75%之间，其中高于理论值96.87%的单株共有6个。
根据对回交群体BC4F2的表型检测和背景检测结果，共筛选出老化处理后耐储能力与东156相近、背景回复率较高且目标区段杂合的3个单株1044-02、1044-07和1170-07，自交后构建了包含219个单株的BC4F3群体。
对BC4F3群体采取热水浴老化法检测种子耐储性相关表型，对表型值进行方差分析。从表11中可知，材料在6个耐储性相关指标表现出连续变异，符合数量性状遗传特性。各指标均表现出较大的变异幅度，变异系数均大于40%，其中相对发芽势的变异系数最大，达到74.79%，6个耐储性相关指标偏度和峰度绝对值均小于1。
根据RGP、RGE、RGI、RSL、RVI和RSVI等6个指标采用加权隶属函数法计算D值，对材料的耐储性表型进行评价。以包含219个单株的NIL群体为试材，D值的变化范围在0.03-0.79，采用聚类分析法，将NIL群体的耐储性表型按D值分为三个等级，D1类别与亲本东156耐储性相近，D值变化范围在0.59-0.79之间；D2类别耐储性介于亲本东156与东237之间，D值变化范围在0.28-0.56之间；D3类别与东237耐储性相近，D值变化范围在0.03-0.18。D值与RGP、RGE、RGI、RSL、RVI和RSVI共6个指标均呈极显著正相关关系，表明D值可以用来综合评价玉米自耐储性，值越大耐储藏能力越强，相关性分析见表12。
注：**表示在0.01水平显著相关。
（3）主效QTL qRGE-7目标区段定位分析
利用在耐储性主效QTL区段内开发并筛选出具有多态性的30对InDel标记，对NIL群体进行基因型检测。根据基因型检测结果，利用IciMapping4.2软件构建了覆盖整个目标区段的遗传连锁图谱（见图4），图谱总长423.2cM，两个标记最短间距为1.7cM，最长为52.1cM，标记间的平均遗传距离为14.11cM，物理距离为9.19Mb（物理位置参考B73 RefGenV4版本）。
将基因型检测结果与耐储性表型数据相结合，采用复合区间作图法对耐储性主效QTLqRGE-7进行精细定位，定位结果见图4。在目标区段内共检测到21个QTL，表型贡献率在0.1627%-19.5442%之间，大于10%的主效QTL共有8个。其中有16个QTL的加性效应值为正值，亲本东156的等位基因起到增效作用，占总QTL数的76.19%；5个QTL的加性效应为负值，亲本东237的等位基因起到增效作用，占总QTL数的23.81%。
影响相对发芽势的qRGE-7-1、影响相对发芽率的qRGP-7-3、影响相对发芽指数的qRGI-7-3、影响相对活力指数的qRVI-7-2、影响相对简易活力指数的qRSVI-7-2和影响D值的qD-7-3均位于区段ID128-ID136之间，表型贡献率分别为11.7731%、16.2811%、16.0067%、13.7139%、12.6493%和19.5442%，加性效应均为正值。因此将qRGE-7定位于标记ID128-ID136之间，物理位置为170228614-170561554（参考B73 RefGen V4），大小为0.33Mb。
实施例4 分子标记ID128以及ID136的育种应用
以玉米自交系东237为改良受体自交系，以东156为供体自交系，采用回交结合分子标记辅助选择方法将东156中耐储性相关主效位点QTLqRGE-7转入东237中，创制耐储性提高的玉米新种质。
东237和东156杂交获得F1杂交种，以东156为轮回亲本进行回交获得包含600个单株的BC1F1群体。利用本发明研发的与耐储性相关主效位点QTLqRGE-7紧密连锁的ID128以及ID136分子标记对回交后代进行前景选择，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQID No:3和SEQ ID No:4所示。根据表8所述均匀分布于10条染色体的40对多态性SSR标记，对入选单株进行背景选择。保留背景回复率高且同时含有ID128以及ID136分子标记的单株，继续与东237进行回交。在BC3F1世代中，获得7个背景回复率大于98.75%且包含ID128以及ID136分子标记的改良单株。
采用人工老化方法检测相对发芽势（RGP）、相对发芽率（RGE）、发芽指数（RGI）、相对活力指数（RVI）和相对简易活力指数（RSVI）等耐储性相关表型指标，进而采用加权隶属函数法计算D值，对材料的耐储性表型进行评价，结果见表13。与受体自交系东237相比，创制的7个NIL家系的耐储能力提升率在44.14%-70.98%之间，平均为51.22%，改良效果显著，可用于玉米耐储新品种的选育。
/>
Claims (5)
1.一种与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记，其特征在于，所述分子标记与位于玉米第7号染色体Bin7.05区域内玉米种子耐储性相关主效QTLqRGE-7紧密连锁，所述的InDel分子标记为ID128以及ID136，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。
2.权利要求1所述的与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记在玉米种子耐储新品种选育中的应用。
3.用于扩增权利要求1所述的与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记的引物对，其特征在于，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示。
4.权利要求3所述的引物对在玉米种子耐储新品种选育中的应用。
5.一种玉米耐储新品种的选育方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）获得东237和东156杂交获得F1杂交种，以东156为轮回亲本进行回交获得BC1F1群体；
（2）利用权利要求1中所述的与玉米种子耐储性相关主效QTL qRGE-7紧密连锁的InDel分子标记ID128以及ID136分子标记对回交后代进行前景选择，其中，用于扩增分子标记ID128的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示；用于扩增分子标记ID136的引物的核苷酸序列为SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示；
（3）根据均匀分布于10条染色体的40对多态性SSR标记P01-P40，对入选单株进行背景选择，用于扩增背景选择的SSR标记的引物如SEQ ID No:5-SEQ ID No:84所示；
（4）保留背景回复率高且同时含有ID128以及ID136分子标记的单株，继续与东237进行回交，在BC3F1世代中，获得背景回复率为98.75%-99.60%且包含ID128以及ID136分子标记的改良单株。
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