CN104374845B - 一种南瓜果实肌醇类和单、双糖类物质的同时检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种南瓜果实肌醇类和单、双糖类物质的同时检测方法，包括：南瓜果实的前处理：甲醇溶液提取南瓜果实中的肌醇和单糖、双糖物质；硅烷化处理：GC‑MS检测等步骤。本发明方法简单高效、成本低、GC‑MS的进样时间短、出峰完全，可同时分析多个物质，应用性强，可以为南瓜品质育种提供有效可靠的数据。
Description
技术领域
本发明属于化学检测技术领域，涉及一种南瓜果实中同时检测肌醇和单糖、双糖的检测方法，具体涉及一种利用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）对南瓜果实中的两种肌醇（肌-肌醇和D-手性肌醇）和单糖、双糖（葡萄糖、半乳糖、果糖及蔗糖）同时的检测方法。
背景技术
南瓜属葫芦科植物，可药食两用的蔬菜，含有一些其它蔬菜不具有的代谢物如多糖、肌醇、甘露醇、生物碱、葫芦巴碱等营养成分。目前，南瓜正在作为特效保健食品和功能蔬菜进行开发，而且开发前景可观。南瓜的一些成分对糖尿病具有良好食疗效果如多糖和肌醇。肌醇包括肌-肌醇和D-手性-肌醇，它们在胰岛素作用的信号传递中起重要作用。研究发现正常人血液及尿液中含有一定浓度的肌醇，而II型糖尿病人中则几乎检测不到，其中，D-手性肌醇对II型糖尿病具有更加显著疗效，而肌-肌醇除其降糖功能，也是动物重要的生长因子，是国际婴儿配方奶粉的添加物之一，同时也广泛应用于饲料、医药和化妆品等行业。
南瓜含有大量的肌醇类分子，虽然早年已建立了相关方法（Xia et al., 2006），但南瓜的还原糖和蔗糖含量丰富，其中蔗糖和葡萄糖的摄入将增加人体血糖含量，因此从降低血糖角度，筛选低糖和高肌醇南瓜品种是一种需求，能为血糖高的病人提供一种更好的食疗材料。目前对南瓜不同品种的各降糖成分的含量尚不清楚，研发快速测定的方法有利于降糖品种的开发选育，而同时检测这两大类物质的方法仍未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于一种南瓜果实中肌醇类和单、双糖类物质的同时检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种南瓜果实中肌醇类和单、双糖类物质的同时检测方法，包括如下步骤：
（1）南瓜果实的前处理：将南瓜果实切开去除皮、果瓤和种子部分，粉碎、冷冻干燥后研磨；
（2）肌醇和单糖、双糖的提取：将研磨后的南瓜果实样品溶于60%-70%甲醇溶液中，加入标准品松醇0.01g/L，50℃-70℃下水浴至少1h，离心，取上清真空干燥；
（3）硅烷化处理：步骤（2）真空干燥后的样品中加入硅烷化试剂，于80℃水浴下反应至少1 h，并于室温冷却，硅烷化后的样品加入等体积的己烷；
（4）GC-MS检测：GC-MS检测时采用气相毛细色谱柱，设置分流比为80:1，两种扫描方式包括全扫描模式和选择离子扫描，选择离子的特征离子为265和318，检测时间为32min。
作为优选的，步骤（2）将研磨后的南瓜果实样品溶于60%甲醇溶液中，70℃下水浴1h。
作为优选的，步骤（2）取上清干燥后，再次溶解于水中，再次真空干燥。
步骤（2）所述离心是指在12000 r/min下离心10 min。
步骤（4）中气相毛细色谱柱的规格为：30m×0.25mm，0.1μm。
以上所述的方法在瓜类育种中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明利用GC-MS开发出可同时检测与糖尿病相关的两大物质，综合淀粉、另一降糖成分多糖等参数用于开发高附加值的南瓜育种材料以及杂交品种的筛选，并为近一步对品质相关QTL定位提供方法，该方法也可用于瓜类蔬菜作物的肌醇和单、双糖检测，为瓜类品质育种提供技术支持。
本发明方法中的提取步骤简单快速、提取率高、成本低；GC-MS的进样时间短，出峰完全，可同时分析多个物质，重复性好，结果精确稳定。
附图说明
图 1 为南瓜果实气相色谱-质谱（GC-MS）全扫描图，其中，1为果糖，2为D-松醇，3为半乳糖，4为葡萄糖，5为D-手性-肌醇，6为肌-肌醇，7为蔗糖；
图2 为样品中果糖峰离子解析谱与谱库中的对比；
图3 为样品中D-松醇峰离子解析谱与谱库中的对比；
图4 为样品中半乳糖峰离子解析谱与谱库中的对比；
图5 为样品中葡萄糖峰离子解析谱与谱库中的对比；
图6 为样品中D-手性-肌醇峰离子解析谱与谱库中的对比；
图7 为样品中肌-肌醇峰离子解析谱与谱库中的对比；
图8 为样品中蔗糖峰离子解析谱与谱库中的对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
南瓜果实样品检测
本实施例研究了不同提取物浓度、不同提取温度，以及其后是否需要DTT或者水处理对南瓜果实中肌醇类和单、双糖类提取效率的影响，为南瓜果实的肌醇类和单、双糖类物质的测定提供了一种快速、高效的测定方法。步骤如下：
（1）南瓜果实的前处理：香蜜小南瓜的成熟果实，置于榨汁机中粉碎，经冷冻干燥后，研磨完全。
（2）肌醇和单糖、双糖的提取：试验组设计如下：
肌醇类和单、双糖类物质的提取：将粉碎后样品进行研磨至无颗粒物质，按20g干物质加1L溶剂的比例，用水、70%乙醇溶液、60%甲醇溶液或者70%甲醇溶液进行提取，加入标准品松醇0.01 g/L，其中：
①抽取3组60%甲醇溶液和3组70%甲醇溶液处理的提取物分别于温度为50℃、60℃和70℃的水浴处理1 h，样品经充分提取后12000 r/min离心10 min，取100 μl上清液置于真空干燥仪中，12000 r/min干燥完全后样品直接进行硅烷化处理；
②另抽取水、70%乙醇溶液、60%甲醇溶液提取物各一组置于70℃水浴中处理1 h，中间进行若干次混匀；样品经充分提取后12000 r/min离心10 min，取100 μl上清液置于真空干燥仪中12000 r/min干燥完全后重新溶解于水中，再次干燥后进行硅烷化处理；
③另抽取水、70%乙醇溶液、60%甲醇溶液提取物各一组置于70℃水浴中处理1 h，中间进行若干次混匀；样品经充分提取后12000 r/min离心10 min，取100 μl上清液置于真空干燥仪中12000 r/min干燥完全，后重新溶解于水中，再次干燥后经DTT处理，再进行硅烷化处理。
（3）硅烷化处理：干燥后的样品加入硅烷化试剂（吡啶:BSTFA+1%三甲基氯硅烷，1:1），于80℃水浴下反应至少1 h，并于室温冷却，硅烷化后的样品加入等体积的己烷。
（4）GC-MS检测：样品经0.2μm有机溶剂滤膜过滤后置于进样瓶中，所用的GC为Agilent Technologies 7890A，用 HP-5MS毛细管柱（30m×0.25mm，0.1 μm）为固定相。升温程序为初始温度70℃，以6.5℃/min升至274℃；进样口温度为250℃；以氦气作为载气，流速设为9.1 psi；进样量为1μl，设置分流比为80:1；质谱测定中采用全扫描模式和选择离子扫描，选择离子的特征离子为265和318，采集质量数范围为40-800；样品中物质经过电喷射离子化后用Agilent Technologies 5975C MS；每个峰与Agilent谱库中比较结合标准品确定峰物质，化合物样品峰面积/内标峰面积计算各化合物的浓度。
数据统计：每个样品重复3次，用SPSS16.0软件进行ANOVA统计分析，并比较不同提取条件对肌醇类和单、双糖类的含量影响。
用不同的提取方法、提取溶剂和提取步骤提取南瓜果实的肌醇类和单、双糖类物质，其结果见表1。
表1 不同提取条件下各个肌醇类和单、双糖类物质的含量
注：不同字母表示有显著性差异（P≤0.05）。
结果表明，用60%甲醇提取，温度分别为50℃、60℃和70℃下水浴以及70%甲醇提取分别于50℃、60℃和70℃下水浴时，对肌醇类和单、双糖类提取较佳的为60%甲醇于70℃水浴处理，与提取效率较低的70%甲醇于50℃水浴处理相比，除葡萄糖含量无显著差异，其他均有显著差异；而后增加纯化步骤发现，增加水处理能增加肌-肌醇和葡萄糖的提取效率，而其他的显示无显著差异；用水和70%乙醇替代60%甲醇提取，其提取效率总体较低。
另外，同一样品于不同日期提取6种化合物的峰面积/内标面积的相对标准偏差（RSD，%）和保留时间的相对标准偏差分别小于0.02%和5%，证明该方法具有较好的重现性。
由此确定，南瓜果实中肌醇类和单、双糖类物质的最佳提取方法为：60%甲醇于70℃水浴1h。
实施例2
不同南瓜品种的肌醇类和单、双糖类物质的检测：采用实施例1筛选得到的最佳提取方法对不同品种南瓜果实的肌醇类和单、双糖类物质进行提取，然后进行GC-MS检测。
30份不同南瓜品种的商品果期果实采后粉碎保存于-70℃冰箱，待收集完毕进行真空冷冻干燥，完全干燥后样品保存于-70℃冰箱，材料于液氮中研磨完全，置于60%甲醇进行提取（1:20），加入标准品松醇0.01 g/l，于70℃下水浴1 h样品经充分提取后在12000 r/min离心10 min，取100 μl上清液置于真空干燥仪中真空离心干燥，待完全干燥为止，重新溶解于水中，并对处理溶液离心后真空干燥处理。将样品硅烷化和GC-MS检测方法如实例1中所示。
检测结果见表2和图1-8。
表2 30份不同南瓜品种商品期果实的肌醇类和单、双糖类物质的含量
CMO-中国南瓜；CMA-印度南瓜；单位：mg/g DW（干重）。
结果表明，南瓜果实的肌醇类和单、双糖多样性高，并且中国南瓜和印度南瓜两大南瓜品种间差异性明显，这与中国南瓜与印度南瓜无论在外观、口感、甜度等方面均表现显著差异的特性一致。中国南瓜的肌-肌醇和蔗糖含量普偏高于印度南瓜，而葡萄糖则普偏低于印度南瓜，这与中国南瓜的甜度高于印度南瓜结果一致，
以上实施例表明：本发明测定方法简便快捷、应用性强、准确度高、重复性好，可为南瓜品质育种提供详细准确的数据。
Claims (5)
1.一种南瓜果实中肌醇类和单、双糖类物质的同时检测方法，包括如下步骤：
（1）南瓜果实的前处理：将南瓜果实切开去除皮、果瓤和种子部分，粉碎、冷冻干燥后研磨；
（2）肌醇和单糖、双糖的提取：将研磨后的南瓜果实样品溶于60%-70%甲醇溶液中，加入标准品松醇至其终浓度为0.01g/L，50℃-70℃下水浴至少1h，离心，取上清真空干燥；
（3）硅烷化处理：步骤（2）真空干燥后的样品中加入硅烷化试剂，于80℃水浴下反应至少1 h，并于室温冷却，硅烷化后的样品加入等体积的己烷，所述硅烷化试剂由吡啶和BSTFA按体积比1:1组成，所述BSTFA中含有1%体积的三甲基氯硅烷；
（4）GC-MS检测：GC-MS检测时采用HP-5MS毛细管柱为固定相，规格为30m×0.25mm，0.1μm，设置分流比为80:1，升温程序为初始温度70℃，以6.5℃/min升至274℃，进样口温度为250℃，以氦气作为载气，流速设为9.1 psi，进样量为1μl，两种扫描方式包括全扫描模式和选择离子扫描，选择离子的特征离子为265和318，检测时间为32min。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）将研磨后的南瓜果实样品溶于60%甲醇溶液中，70℃下水浴1h。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）取上清干燥后，再次溶解于水中，再次真空干燥。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤（2）所述离心是指在12000 r/min下离心10 min。
5.权利要求1-4任一项所述的方法在瓜类育种中的应用。
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