CN118064604A

CN118064604A - 一种鸡“心形镶边羽”表型的分子鉴定引物组及该表型鸡的选育方法

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Publication number: CN118064604A
Application number: CN202410263816.7A
Authority: CN
Inventors: 李竞一; 张苗爽; 郭屹凡; 郭焕杰; 王兵辉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2024-03-08
Filing date: 2024-03-08
Publication date: 2024-05-24
Anticipated expiration: 2044-03-08
Also published as: CN118064604B

Abstract

本发明涉及“心形镶边羽”羽毛表型鸡的分子鉴定引物组及分子选育方法，具体包含对GJA5突变基因、MC1R基因突变位点的检测，以及利用两者基因型互作而设计的分子选育方案；本方法包括“心形镶边羽”性状分离资源家系和商品代母鸡共323只的血液样本，进行DNA提取；设计GJA5基因上游结构变异的PCR引物；进行PCR扩增；进行琼脂糖凝胶电泳后判断GJA5基因上游是否发生突变；设计MC1R两个位点的KASP引物；进行荧光PCR；基于荧光信号强度将判别MC1R两个位点的基因型。利用本检测方法可以从江汉鸡中分离出具有“心形镶边羽”的纯系，再通过杂交配套选育出既高产又具有独特黄麻羽花纹的商品鸡。

Description

一种鸡“心形镶边羽”表型的分子鉴定引物组及该表型鸡的选育方法

技术领域

本发明涉及动物育种技术领域，更具体的说是定义了一种鸡的“心形镶边”羽毛表型，并通过引物组和等位基因特异性聚合酶链式反应的分子鉴定方法开发了此表型的分子选育方法。

背景技术

江汉鸡因为其羽色又被称为麻鸡，是湖北省的优良地方品种，属蛋肉兼用型鸡种。江汉鸡具有适应性广，抗逆性强，耐粗粮，产蛋量高，肉质好等有点，因此广泛分布于江汉平原。江汉鸡在现代育种开发过程中也扮演了重要的角色，是湖北省首个获得国家认定的蛋鸡新品种“欣华2号蛋鸡“配套系的血统来源之一。现代规模化养鸡生产要求商品鸡高产、稳产、性能整齐一致，饲料报酬率高，而传统地方鸡品种达不到这个要求，这就要求采用现代育种方法，培育现代商品杂交鸡，为了开发利用江汉鸡，开始引进国外生长速度较快的血缘，对江汉鸡进行改良，也取得了很好的经济效益。但同时江汉鸡这一原始种质资源必须得到很好的保护，避免受到外来鸡血缘的侵入，因此亟需一种快速、准确而又易于操作的技术鉴别江汉鸡和含有外来血缘杂种江汉鸡，保障江汉鸡血缘的纯正性。

在消费者喜欢的黄麻羽鸡市场中，并未出现明确的羽毛表型划分，而且在市场中的黄麻羽群体羽毛花纹变异程度高，缺乏辨识度。为了充分发挥黄麻羽作为鸡品种鉴别的作用，我们在江汉鸡中发现了一种特异的黄麻羽表型，具体表现为羽毛末端边缘表现出真黑色素沉着，形似心形，其余部位为褐黑色素沉着，故命名为“心形镶边羽”。

目前关于家鸡的羽色以及花纹的分布模式研究大多集中在国外的观赏鸡种中，国内本地鸡种的同类研究较少。根据L.Andersson等的总结，影响家鸡羽毛内花纹的突变主要有E、Pg、Ml、Db和Co。而E的因果突变是MC1R，Pg也是MC1R，Ml是GJA5，Db是SOX10，而Co尚未被定位。由于此表型为首次发现，我们利用上述与家鸡羽毛内花纹相关的三个候选基因进行基因型与表型的关联分析，即MC1R、GJA5、SOX10基因的相关突变。

但是在构建的资源家系中，发现该表型在公母鸡之间有着明显的区别：“心形镶边羽”在公鸡中表现为完全显性，杂合子公鸡全部表现为“心形镶边羽”，通过表型无法区分杂合与纯合，这对构建纯系群体非常不利；该表型在母鸡中是不完全显性，杂合子母鸡则仅有部分表现出该表型，同样存在杂合子后代不能稳定表达该性状的问题。除此以外，该性状只有成年才能表现，通过分子检测可以起到早选的作用，节约育种成本。利用已定位的GJA5基因和MC1R基因，可以在鸡群中通过分子方法准确筛选出“心形镶边羽”种鸡并将其保留，构建核心育种群，使种鸡群与“心形镶边羽”相关联的等位基因达到固定(即基因频率达到100％)，保证商品鸡群个体均为“心形镶边羽”，提高辨识度，满足市场需求。

因此，提供一种鸡“心形镶边羽”分子鉴定引物组及其方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种鸡“心形镶边羽”分子鉴定引物组及其方法，该方法不受年龄、性别差异限制，准确鉴定鸡的羽毛花纹基因是否符合“心形镶边羽”的要求，从而减少表型鉴定的误差，降低时间、成本的投入。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鉴定鸡“心形镶边羽”表型的分子引物组，包括：GJA5基因野生型特异性引物和突变后的特异性引物，MC1R基因274G>A(Glu92Lys)位点和427A>G(Ala143Thr)位点的KASP引物，具体的核苷酸序列如下：

(1)GJA5基因野生型特异性引物组由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成：F：5’GAGGGTCAAAGAGAGTGCATGA3’；

R1：5’GTATAAATTGAATGCAAATGCAAGG3’；

GJA5基因突变后特异性引物组由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3组成：

F：5’GAGGGTCAAAGAGAGTGCATGA3’；

R2：5’10NCAGGTTAGATGCTTATTAAACTACTGCTTA3’；

(2)MC1R基因274G>A(Glu92Lys)KASP引物组由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6组成：

F1：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCAGCAGCATGAAGAGCGTCTC3’；

F2：5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATCAGCAGCATGAAGAGCGTCTT 3’；

R：5’GACATGCTGGTGAGCGTCAGCAA 3’；

MC1R基因427A>G(Ala143Thr)KASP引物组由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9组成：

F1：5’GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGCCGTGGACCGCTACATCA 3’；

F2：5’GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCGTGGACCGCTACATCG 3’；

R：5’TAGCGCAGCGCATAGAAGATGG 3’。

本发明还提供了含有上述的引物组的检测试剂盒。

本发明还提供了基于上述引物组或上述试剂盒的鉴定“心形镶边羽”表型鸡的方法，包括以下步骤：

(1)提取待鉴定鸡血样中的基因组DNA；

(2)对所提取的鸡血样中的基因组DNA的MC1R基因两个突变位点，使用实时荧光定量PCR仪进行KASP检测，根据荧光信号聚类颜色进行基因型确定，当MC1R:274G>A的KASP结果为强HEX荧光信号或HEX与FAM荧光信号均较强的时候，且MC1R:427A>G的KASP结果为强FAM荧光信号的时候，初步确定该个体为“心形镶边羽”个体；

步骤(2)中RT-PCR扩增体系：Master mix 2.5μL、F1(36pm/μL)0.023μL、F2(36pm/μL)0.023μL、R(90pm/μL)0.023μL、dd-H2O 1.5μL、DNA 1μL；扩增程序为95℃5min；94℃20s，61℃1min，×9循环，每次循环降低0.6℃；94℃20s，55℃1min，×33循环；37℃1min，进行荧光信号读取。

(3)在步骤(2)的基础上，对初步判定可能是“心形镶边羽”的个体，利用GJA5基因野生型特异性引物和突变后的特异性引物对所提取的鸡血样中的基因组DNA进行双重PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，根据是否扩增出的DNA片段和扩增出DNA片段的大小来初步判定鸡的“心形镶边羽”；挑选出扩增出一条133bp的带个体，判定该个体为“心形镶边羽”，且该个体的GJA5为突变型，

步骤(3)中PCR扩增体系：mix 5μL、F1(10pm/μL)0.5μL、R1(10pm/μL)

0.5μL、R2(10pm/μL)0.5μL、dd-H2O 2.5μL、DNA 1μL；扩增程序为95℃5min；

94℃15s，68℃15s，72℃30s，每个循环退火温度降低1℃，；94℃15s，55℃15s，72℃30s，×25循环；72℃终延伸5min，15℃3min；

鉴定的标准：当只能扩增出一条133bp的带时，初步判定该个体可能为“心形镶边羽”个体；当出现扩增大小为108bp的带时，判定该个体不是“心形镶边羽”。

本发明还提供了一种基于上述引物组、试剂盒以及选育方法在培育表型为“心形镶边羽”的家鸡育种群的养殖业中的应用。

相比与现有技术，本发明的有益效果是：

1、本发明公开提供了一种鸡“心形镶边羽”分子鉴定引物组及其方法，取得的技术效果为利用鸡的DNA血样建立分子标记鉴定鸡“心形镶边羽”的方法，使鸡“心形镶边羽”表型鉴定不受时间限制，准确的鉴定。

2、培育“心形镶边羽”资源群体进行分子选育好处：一是根据本研究大群检测的结果，该表型的表达不稳定，表型相似的个体其基因型不一定相同，通过本方法可以避免通过表型选择所得到的后代可能会出现性状分离；二是因为GJA5突变为部分显性，特别是公鸡中几乎是完全显性，利用分子选育淘汰其中的杂合子，能够比表型选育，更迅速地提高群体整齐度。

3、此外，分子选育可以实现早期选择，这对于仅在成年个体中表达的黄麻羽表型的选育尤为重要，能通过早检测早淘汰大幅降低育种成本。

4、本研究的分子选育方法为培育“心形镶边羽”育种群，发挥羽毛性状的包装作用，提高其经济价值，促进地方优质黄麻羽鸡产业发展有着重要的作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的“心形镶边羽”的表型示意图。

图2为本发明提供的流程示意图。

图3为本发明提供的GJA5基因在1号染色体上位置及其相关突变序列(红色竖线)的示意图。

图4为本发明提供的MC1R基因在11号染色体上位置及其相关突变序列(红色竖线)的示意图。

图5为本发明提供的GJA5基因型检测的PCR电泳图：图中第1泳道是Maker DNA分子量标记(100bp～2000bp ladder)；0泳道表示阴性对照；2、3、5、7、13、15、17-19、21、23有两条带，为杂合型；1、10、12、14、16、20、22只有108bp一条带，为野生型。

图6为本发明提供的MC1R基因Glu92Lys(274G>A)突变位点基因型检测的荧光信号图：图中横坐标为FAM荧光信号强度，代表野生型等位基因；纵坐标为HEX荧光信号强度，代表突变型等位基因；蓝色聚类为突变型、绿色聚类为杂合型、黄色聚类为野生型、黑色聚类为阴性对照。

图7为本发明提供的MC1R基因Ala143Thr(427A>G)突变位点基因型检测的荧光信号图：图中横坐标为FAM荧光信号强度，代表野生型等位基因；纵坐标为HEX荧光信号强度，代表突变型等位基因；蓝色聚类为突变型、绿色聚类为杂合型、黄色聚类为野生型、黑色聚类为阴性对照。。

图8为鸡的羽毛表型分类。

图9为294羽母鸡GJA5基因与表型统计图。

图10为资源家系GJA5基因与表型统计图。

图11为资源家系GJA5杂合时公母表型统计图。

图12为SOX10上游突变的凝胶电泳检测。

图13为大群体SOX10基因与表型统计图。

图14为大群MC1R基因71号氨基酸位点基因型与表型统计图。

图15为大群MC1R基因92号氨基酸位点基因型与表型统计图。

图16为大群MC1R基因143号氨基酸位点基因型与表型统计图。

图17为大群MC1R基因215号氨基酸位点基因型与表型统计图。

图18为250羽母鸡MC1R基因单倍型与表型统计图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种鸡“心形镶边羽”表型的分子鉴定引物组及其方法。实施例的流程示意见图2。

实施例1

1、表型分类与血样DNA提取

从湖北欣华生态畜禽开发有限公司的江汉鸡保种群中随机选择298羽母鸡个体与4羽公鸡个体，其中的4羽母鸡用于建立资源家系，剩下的294羽母鸡用于大群检测，并对所有母鸡血液样品进行采集与拍照记录。根据胸部羽毛是否有真黑色素沉积，以及有真黑色素沉积的羽毛中真黑色素是否分布于羽毛边缘，将个体分为“无真黑色素沉着”(见图8中的A)、“边缘真黑色素沉着(即心形镶边羽)”(见图8中的B)、“非边缘真黑色素沉着”三类(见图8中的C)。

提取每个鸡个体血样中的DNA，并使用TE缓冲液溶解，测定DNA浓度后，用TE缓冲液将其稀释到100ng/μL，待用。

实施例2

利用分子标记GJA5野生基因和突变基因对母鸡个体进行基因分型

1、引物设计

根据在NCBI上获得GJA5基因的序列信息，根据文献找到上游结构突变位点，其位于chr1:93852277-93852317(图3)，然后利用Primer3plus引物设计网页设计其引物。

其中：用于三引物体系PCR扩增的引物序列如下：

(1)GJA5基因野生型特异性引物：

SEQ ID NO：1F：5’GAGGGTCAAAGAGAGTGCATGA3’；

SEQ ID NO：2R1：5’GTATAAATTGAATGCAAATGCAAGG3’；

产物大小108bp；

(2)GJA5基因突变后特异性引物：

SEQ ID NO：1F：5’GAGGGTCAAAGAGAGTGCATGA3’；

SEQ ID NO：3R2：5’10N+CAGGTTAGATGCTTATTAAACTACTGCTTA3’；

产物大小133bp；

2、GJA5基因的三引物体系PCR扩增

PCR反应体系为10μL(参见表1，PCR反应体系单位：μL)，利用通用PCR仪进行扩增。

扩增程序：95℃5min；94℃15s，68℃15s，72℃30s，每个循环退火温度降低1℃，；94℃15s，55℃15s，72℃30s，×25循环；72℃终延伸5min，15℃3min。

表1 PCR反应体系

名称	体积
		mix	5μL
正向引物F(10pm/μL)	0.5μL
		反向引物R1(10pm/μL)	0.5μL
反向引物R2(10pm/μL)	0.5μL
		dd-H₂O	2.5μL
DNA样品	1μL

将PCR扩增产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并用BIO-RAD成像系统照像。同时，对扩增产物进行二代测序，即对GJA5突变的凝胶电泳基因分型结果进行验证。

3、GJA5基因突变个体的初步判定

应用上述引物，使用不同类型鸡个体DNA模板进行三引物体系PCR扩增，根据图谱(见图5)中的电泳条带判断GJA5基因型。扩增大小为108bp(chr1:93852278+93852385GAGGGTCAAAGAGAGTGCATGATCTCTGGAAAGGCCTAGGAAACTGCATCTTAAACTTAATCATTTTAAT GTAAATACAACTGCCTTGCATTTGCATTCAATTTATAC)时判定该个体是野生型个体，即不是“心形镶边羽”个体，当扩增大小为133bp的条带时，为突变型，初步判定该个体为突变个体；扩增出两条带，包括108bp和133bp，则为杂合型的。如果扩增不出条带，表明模板DNA质量不好，应重新提取DNA再进行扩增。

图5中，1、10、12、14、16、20、22泳道只有108bp一条带，且该类个体不是“心形镶边羽”表型；而4、6、8、9、11泳道只有133bp一条带，该类个体是突变表型。泳道2、3、5、7、13、15、17-19、21、23有108bp和133bp两条带，对应到该类型是杂合表型。

采用二代测序在实验前期对GJA5突变的凝胶电泳基因分型结果进行验证，测序PCR体系同表1，测序引物如下所示。扩增后样品交于北京擎科生物科技有限公司进行二代测序。

PCR测序引物序列

SEQ ID NO：10 84-GJA5-INDEL1-F：5’AAGCGGGAATGCACAACTAC3’，

SEQ ID NO：11 85-GJA5-INDEL1-R：5’GAGTCCAACAGCGTGAGTGA3’；

产物大小：709bp。

对294羽江汉鸡母鸡进行了检测，如图9所示，发现GJA5与“心形镶边羽”表型高度关联，根据294羽大群体的检测结果，GJA5突变与“心形镶边羽”表型存在显著关联(p<0.01)，故从中挑选个体建立资源家系，即4羽GJA5的突变与杂合母鸡与同一群体的4羽随机公鸡进行交配后，将获得的2羽杂合的F1公鸡和2羽杂合母鸡进行配种，共获得29羽F2后代(6羽GJA5野生型、17羽杂合、6羽突变型)。

对整个资源家系的基因型与表型进行关联，发现所有具有边缘真黑色素沉着，即“心形镶边羽”表型的个体均为GJA5基因的突变型或杂合型，且其他表型中未发现GJA5基因的突变纯合(见图10)，得出GJA5基因为影响羽毛边缘真黑色素沉着的关键基因这一结论，且存在显性效应。进一步分析发现，在17羽GJA5杂合子中公鸡全部表现为边缘黑色素沉着，GJA5杂合子母鸡则表现出不同的表型(见图11)。该现象与国外鸡种中双镶边表型的限性遗传相反，国外品种中公鸡是几乎不表达镶边表型。且具体的边缘真黑色素分布也存在差异，国外鸡种中的黑色镶边包含整个廓羽的边缘，而我们在国内鸡种中所观察到的表型为仅在羽毛末端存在边缘真黑色素沉着。虽然受相同基因的调控，但却因为遗传背景的不同，表现出了不同的表型。

实施例3

利用分子标记SOX10野生基因和突变基因对母鸡个体进行基因分型

1、引物设计

根据在NCBI上获得SOX10基因的序列信息，再根据文献找到上游缺失突变位点，其位于chr1:51035107-51042743，然后利用Primer3plus引物设计网页设计其引物。

其中：用于三引物体系PCR扩增的引物序列如下：

(1)SOX10基因野生型特异性引物：

SEQ ID NO：12F：5’CCTTGTGGAGACCAGGTGTT3’；

SEQ ID NO：13R1：5’CCTTTGTCTTAAGGCTCCTCTTT3’；

产物大小611bp；

(2)SOX10基因突变后特异性引物：

SEQ ID NO：12F：5’CCTTGTGGAGACCAGGTGTT3’；

SEQ ID NO：14R2：5’TGCTGAGACATTTGCTGACA3’；

产物大小1257bp；

2、SOX10基因的三引物体系PCR扩增

表1 PCR反应体系

将PCR扩增产物在3％的琼脂糖凝胶中进行电泳检测，并用BIO-RAD成像系统照像。同时，对扩增产物进行二代测序，即对SOX10突变的凝胶电泳基因分型结果进行验证。

3、SOX10基因突变个体的初步判定

应用上述引物，使用不同类型鸡个体DNA模板进行三引物体系PCR扩增，根据图谱(见图12)中的电泳条带判断SOX10基因型。扩增大小为611bp时判定该个体是野生型个体，即不是“心形镶边羽”个体，当扩增大小为1257bp的条带时，为突变型，初步判定该个体为突变个体；扩增出两条带，包括611bp和1257bp，则为杂合型的。如果扩增不出条带，表明模板DNA质量不好，应重新提取DNA再进行扩增。

图12中，1、4、5、7、11-14、17-21、23泳道只有611bp一条带，且该类个体不是“心形镶边羽”表型；未发现个体是突变表型。泳道2、3、5、6、8、9、10、15、16、22有611bp和1257bp两条带，对应到该类型是杂合表型。

在323羽大群(包含了实施例1的GJA5资源家系29羽)中检测影响羽毛内花纹的SOX10突变，基因型结果显示285羽为野生型，38羽为杂合型，且各基因型均覆盖三种表型，没有检测出突变型个体。未观察到SOX10基因与表型“心形镶边羽”的关联(p>0.05，图13)。SOX10基因突变与此表型无关联，至少其杂合子与野生纯合子相比无显著差异。由于SOX10突变(其上游的一个8.3kb缺失与真黑色素被抑制、褐黑色素合成加强有关)所导致的Db等位基因是不完全显性，因此如果该突变对我们的心形镶边羽表型有影响，理论上应该会观察到杂合子与野生纯合子之间的差异。

实施例4

利用分子标记MC1R野生基因和突变基因对母鸡个体进行基因分型

1、利用二代测序对MC1R基因所有编码区突变位点的筛选，测序PCR体系同表1，测序引物如下所示。扩增后样品交于北京擎科生物科技有限公司进行二代测序。

PCR测序引物序列

SEQ ID NO：15 10_MC1R_F：5’CTTTGTAGGTGCTGCAGTTGTG3’，

SEQ ID NO：16 11_MC1R_R：5’ATCCATCCATCCTCCTGTCTGT3’；

产物大小1049bp；

2、MC1R突变位点KASP引物设计

根据混池二代测序结果，挑选了4个在本研究群体(294羽)中多态性较高的MC1R错义突变，即Met71Thr(212T>C)、Glu92Lys(274G>A)、Ala143Thr(427A>G)和His215Pro(644A>C)，(图4)，利用LGC Genomics公司开发的KASP技术进行单个个体的基因分型，按配制好体系后置于Bio-Rad CFX384实时定量PCR仪中进行扩增。

MC1R四个错义突变SNP的KASP基因分型引物序列如下：

(1)MC1R基因212T>C(Met71Thr)位点的KASP引物组：

SEQ ID NO：17F1：5’gaaggtgaccaagttcatgctACAGGAATCTGCACTCGCCCAT3’；

SEQ ID NO：18F2：5’gaaggtcggagtcaacggattCAGGAATCTGCACTCGCCCAC3’；

SEQ ID NO：19R：5’CGGCCAGGCAGCAGATGAAGTA3’。

(2)MC1R基因274G>A(Glu92Lys)位点的KASP引物组：

SEQ ID NO：4F1：5’gaaggtgaccaagttcatgctCAGCAGCATGAAGAGCGTCTC3’；

SEQ ID NO：5F2：5’gaaggtcggagtcaacggattATCAGCAGCATGAAGAGCGTCTT3’；

SEQ ID NO：6R：5’GACATGCTGGTGAGCGTCAGCAA3’。

(3)MC1R基因427A>G(Ala143Thr)位点的KASP引物组：

SEQ ID NO：7F1：5’gaaggtgaccaagttcatgctGCCGTGGACCGCTACATCA3’；

SEQ ID NO：8F2：5’gaaggtcggagtcaacggattGCCGTGGACCGCTACATCG3’；

SEQ ID NO：9R：5’TAGCGCAGCGCATAGAAGATGG3’。

(4)MC1R基因644A>C(His215Pro)位点的KASP引物组：

SEQ ID NO：20F1：5’gaaggtgaccaagttcatgctGGAGATGCTGCGCACGT3’；

SEQ ID NO：21F2：5’gaaggtcggagtcaacggattCTGGAGATGCTGCGCACGG3’；

SEQ ID NO：22R：5’CTCATGCTGGTGCTCTACATTCACAT3’。

小写碱基序列为荧光基团接头序列，所有F1引物包含FAM荧光探针序列，F2引物包含HEX荧光探针序列。

3、利用三引物荧光PCR扩增进行MC1R基因分型

PCR反应体系为5μL(参见表2，PCR反应体系单位：5μL)，利用通用荧光定量PCR仪进行扩增。

RT-PCR扩增体系：Master mix 2.5μL、F1(36pm/μL)0.023μL、F2(36pm/μL)0.023μL、R(90pm/μL)0.023μL、dd-H2O 1.5μL、DNA 1μL；扩增程序为95℃5min；94℃20s，61℃1min，×9循环，每次循环降低0.6℃；94℃20s，55℃1min，

×33循环；37℃1min，进行荧光信号读取。每个样本每个突变设置两个重复。

表2RT-PCR扩增体系

反应物	体积
		2×KASP Master Mix	2.5μL
36μmol/L正向引物F1	0.023μL
		36μmol/L正向引物F2	0.023μL
90μmol/L通用反向引物R	0.023μL
		ddH₂O	1.5μL
DNA样品	1μL

在323羽个体中，对MC1R基因71号、92号、143号、215号氨基酸突变位点进行KASP基因分型检测，71号氨基酸位点检出率为99.07％，92号氨基酸位点检出率为99.70％，143号和215号氨基酸位点检出率均为100％。发现71号和92号氨基酸位点突变型，以及143号氨基酸位点的野生型个体中无真黑色素沉着的个体较少。通过统计学检验，四个突变位点均显示与羽毛真黑色素沉着相关联(p<0.01，分别见图14、15、16、17，图14中TT代表野生、CC代表突变，图15中GG代表野生、AA代表突变，图16中AA代表野生、GG代表突变，图17中AA代表野生、CC代表突变)，且主要与是否有真黑色素沉着有关，而非真黑色素沉着的位置(边缘或非边缘)。

由于MC1R的4个突变之间存在连锁，因此进一步进行了单倍型分析，其中250羽个体组成了5种主要的单倍型组合(见图18，注：H0为四个位点全部为野生型；H1为只有143号位点为野生型，其余三个位点为突变型；H2为只有143号位点为突变型其余三个位点为野生型；H3为只有215位点为野生型，其余三个位点为突变型)，另外的73羽各自的单倍型频率较低，故不参与分析。结果显示，单倍型H2抑制真黑色素的沉着，且对H1单倍型表现为显性，而其他单倍型(除野生型的H0外)，均与真黑色素的沉着有关(p<0.01)。

4、“心形镶边羽”分子育种方案的建立

对所有结果进行汇总后发现，当MC1R基因92号氨基酸位点为突变型或者杂合型，143号氨基酸位点为野生型，GJA5基因型为突变型时，“心形镶边羽”个体的比例较高。在294个样本中有27个符合该基因型组合，其中23个表现为“心形镶边羽”，比例为85.2％，如表9所示。结合单倍型分析发现71、92、215三个氨基酸突变位点紧密连锁，而与143号氨基酸位点不连锁，因此为了节省成本，从三个连锁突变中选择检测效果最好的两个MC1R突变来制定分子育种方案。且应先检测MC1R突变，符合要求的个体再检测GJA5突变，因为只有MC1R处于功能激活状态时，GJA5突变对边缘黑色素沉着才具有显著效应，即MC1R对GJA5存在上位效应。

表9

MC1R(274G>A)	AA/AG
		MC1R(427A>G)	AA
GJA5基因型	突变
		N(只)	27
“心形镶边羽”比例	85.2％(23只)

在294羽母鸡中有112只表达“心形镶边羽”，其中除了上述27个目标基因型组合的个体，其他个体另有基因型组合。而单看这些基因型组合中的“心形镶边羽”的比例比较低，这些的个体理论上无法让后代稳定表达“心形镶边羽”，因此通过分子检测选留符合上述目标基因型组合个体能快速提高后代“心形镶边羽”的比例。

因此，具体分子育种方案为：如果在成年鸡中挑选种鸡，则先通过表型淘汰不表达“心形镶边羽”的个体，剩下个体进行分子检测后选中目标个体(GJA5突变、MC1R的92号位点突变或者杂合、且143号位点野生)进行配种，公母均可使用这一方案；如果在雏鸡中挑选，则无法通过表型进行筛选，可直接通过分子鉴定进行筛选，即可完成“心形镶边羽”资源群体的构建。

实施例5

一种鸡“心形镶边羽”表型的分子鉴定引物组，包括：

挑选的2个在本研究群体(294羽)中多态性较高的MC1R错义突变，即Glu92Lys(274G>A)、Ala143Thr(427A>G)。

MC1R两个错义突变SNP的KASP基因分型引物序列与实施例4中的引物相同。

以及与实施例2中相同的GJA5基因野生型特异性引物和GJA5基因突变后特异性引物。

一种鸡“心形镶边羽”表型分子鉴定方法，

步骤1、鸡血样DNA提取，提取鸡血样中的DNA，并使用TE缓冲液溶解，测定DNA浓度后，用TE缓冲液将其稀释到100ng/μL。

步骤2.利用MC1R两个错义突变SNP的KASP基因分型引物序列、RT-PCR反应体系和扩增程序(均与实施例4中的引物相同)。在LGC Genomics公司开发的KASP技术下对提取的DNA进行单个个体的基因分型，按配制好体系后置于Bio-Rad CFX384实时定量PCR仪中进行扩增。

待MC1R基因中274G>A(Glu92Lys)位点和MC1R基因427A>G(Ala143Thr)位点分别进行RT-PCR扩增后，再进行荧光信号读取。FAM标记的引物F1与野生型基因特异匹配，HEX标记的引物F2与突变型基因特异匹配，通用引物为反向引物，反向引物结合后，与等位基因特异结合的正向引物得以延伸。

根据荧光信号图谱(见图6和图7，图中横坐标为FAM荧光信号强度，代表野生型等位基因；纵坐标为HEX荧光信号强度，代表突变型等位基因。即蓝色聚类为突变型、绿色聚类为杂合型、黄色聚类为野生型、黑色聚类为阴性对照，当荧光信号除了水(阴性对照)表现出黑色时表示该样本扩增结果失败，需对此种样品使用同样的方式进行重复实验)中的颜色判断MC1R突变位点基因型，274G>A(Glu92Lys)位点中，突变型基因(蓝色)和杂合型基因(绿色)的HEX荧光信号最强，427A>G(Ala143Thr)位点中，野生型基因(黄色)FAM荧光信号最强。

步骤3、利用实施例2中相同的GJA5基因野生型特异性引物和GJA5基因突变后特异性引物、PCR反应体系和扩增程序，对提取的DNA进行扩增，根据电泳条带判断GJA5基因型。

个体中基因型表现为在上述MC1R两个错义突变位点Glu92Lys(274G>A)、Ala143Thr(427A>G)和GJA5基因型中具以下特点：当MC1R:274G>A表现为HEX荧光信号超过阈值、或MC1R:427A>G表现为FAM荧光信号超过阈值时，且GJA5基因型为突变型时，可以确定该个体为“心形镶边羽”个体表型。

如若仍无法检出，需对该样品DNA进行浓度质量测定，必要时需要重新提取。

实施例6

鸡“心形镶边羽”分子鉴定方法可靠性验证

从湖北欣华生态畜禽开发有限公司的一个黄麻羽专门化品系群体中，根据表型挑选了表现出“心形镶边羽的”49羽母鸡与45羽公鸡。采集所有94个个体的血液样品，按实施例5中建立的鸡“心形镶边羽”分子鉴定方法，进行基因型筛选。在94个样本中，MC1R第143号氨基酸位点和GJA5突变位点的检出率为100％，MC1R第92号氨基酸位点的检出率为98.94％(一个个体未检出)，所有3个突变的总检出率为98.94％。其中MC1R第143号氨基酸位点的检测结果为野生型24个，杂合型48个，突变型22个；MC1R第92号氨基酸位点的检测结果为突变型24个，杂合型47个，野生型22个；GJA5突变的检测结果为突变型66个、杂合型26个、野生型2个。93个个体中有16个(5羽公鸡11羽母鸡)符合分子选育的基因型组合，将其留种并组建5个公鸡家系，建立能稳定表达“心形镶边羽”的品系。“心形镶边羽”种鸡选育方法

具体的分子选育方案为：如果在成年鸡中挑选，则先通过表型淘汰不表达“心形镶边羽”的个体，剩下个体进行分子检测后选中目标个体进行配种；如果在雏鸡中挑选，则无法通过表型进行筛选，可直接通过分子鉴定进行筛选，即可完成“心形镶边羽”育种群的构建。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种鉴定鸡“心形镶边羽”表型的分子引物组，其特征在于，包括：GJA5基因野生型特异性引物和突变后的特异性引物，MC1R基因274G>A(Glu92Lys)位点、427A>G(Ala143Thr)位点的KASP引物，引物组的核苷酸序列如下：

GJA5基因野生型特异性引物组由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2组成；

GJA5基因突变后特异性引物组由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3组成：

MC1R基因274G>A(Glu92Lys)KASP引物组由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6组成：

MC1R基因427A>G(Ala143Thr)KASP引物组由SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9组成。

2.一种含有权利要求1所述的引物组的检测试剂盒。

3.一种基于权利要求1所述的引物组或权利要求2所述的试剂盒的鉴定鸡“心形镶边羽”表型的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)提取待鉴定鸡血样中的基因组DNA；

(3)在步骤(2)的基础上，对初步判定可能是“心形镶边羽”的个体，利用GJA5基因野生型特异性引物和突变后的特异性引物对所提取的鸡血样中的基因组DNA进行双重PCR扩增，电泳检测PCR扩增产物，根据是否扩增出的DNA片段和扩增出DNA片段的大小来初步判定鸡的“心形镶边羽”；挑选出扩增出一条133bp的带个体，判定该个体为“心形镶边羽”，且该个体的GJA5为突变型。

4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR扩增体系：mix 5μL、F1(10pm/μL)0.5μL、R1(10pm/μL)0.5μL、R2(10pm/μL)0.5μL、dd-H₂O 2.5μL、DNA 1μL；扩增程序为95℃5min；94℃15s，68℃15s，72℃30s，每个循环退火温度降低1℃，；94℃15s，55℃15s，72℃30s，×25循环；72℃终延伸5min，15℃3min。

5.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(2)中RT-PCR扩增体系：Master mix 2.5μL、F1(36pm/μL)0.023μL、F2(36pm/μL)0.023(90pm/μL)μL、R 0.023μL、dd-H2O 1.5μL、DNA 1μL；扩增程序为95℃5min；94℃20s，61℃1min，×9循环，每次循环降低0.6℃；94℃20s，55℃1min，×33循环；

37℃1min，进行荧光信号读取。

6.权利要求1所述引物组，或权利要求2所述试剂盒，或权利要求3～5任一所述的鉴定方法在培育家鸡“心形镶边羽”育种群的养殖业中的应用。