CN101787370B

CN101787370B - 一种水稻snare蛋白基因的抗病性基因工程应用

Info

Publication number: CN101787370B
Application number: CN2010101082640A
Authority: CN
Inventors: 鲍永美; 张红生; 孙姝璟; 黄骥; 王建飞; 王州飞
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2010-02-10
Filing date: 2010-02-10
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-02-10
Also published as: CN101787370A

Abstract

本发明公开了一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用，属于生物技术领域。该基因的cDNA序列及其编码氨基酸序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.。本发明涉及基因OsSYP71为水稻中首次报道的Qc-SNARE蛋白基因，基因芯片结果和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导。转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病的抗病性。因此，OsSYP71可作为目的基因导入植物，提高植物的抗病性。

Description

一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用

技术领域

本发明涉及一种水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的基因工程应用，属于基因工程领域，具体涉及水稻抗病相关的SNARE蛋白。

背景技术

SNARE(Soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive fusion protein attachment proteinreceptor)蛋白是介导真核生物细胞囊泡运输的一类蛋白，负责囊泡膜和目标膜的融合，这类蛋白的结构在真核生物中是高度保守的。Uemura等(2004，Uemura T，Ueda T，Ohniwa RL，Nakano A，Takeyasu K，Sato MH(2004).Systematic analysis of SNARE molecules in Arabidopsis：dissection of thepost-golgi network in plant cells.Cell Struct Funct，29：49-65)对拟南芥中的68个SNARE蛋白的结构域进行分析，将其划分为四类：Qa-SNAREs、Qb-SNAREs、Qc-SNAREs和R-SNAREs。SNARE蛋白一般以形成SNARE复合体形式参与囊泡运输的膜融合过程，复合体成员通常包括：一个Qa-SNARE蛋白(含有Qa-SNARE结构域)、一个SNAP25类蛋白(含有Qb-和Qc-SNARE结构域)和一个R-SNARE蛋白(含有R-SNARE结构域)，有时复合体中SNAP25类蛋白被两个各含有Qb-和Qc-SNARE结构域的蛋白所替代(Fukudaet al.，2000，Fukuda R，McNew JA，Weber T，Parlati F，Engel T，Nickel W，Rothman JE，TH(2000).Functionalarchitecture of an intracellular membrane t-SNARE.Nature，407：198-202)。研究发现，植物中的SNARE蛋白促进植物细胞板形成，能与离子通道蛋白相互作用，有利于植物的正常生长发育，能提高植物的抗病性及参与植物的向重力性作用。植物SNARE蛋白不仅对植物生长发育起作用，在抵御生物与非生物胁迫过程中也起重要的作用(Pratelli et al.，2004 Pratelli R，Sutter JU，Blatt MR(2004)A new catch inthe SNARE.Trends Plant Sci 9(4)：187-195)。Collins等(2003 CollinsNC，Thordahl-Christensen H，Lipka V，Bau S，Kombrink E，Qiu J，Hückelhoven R，Stein M，Freialdenhoven A，SomervilleSC，Schulze-Lefert P(2003)SNARE-protein-mediated disease resistance at the plant cell wall.Nature 425：973-977)在研究与大麦非寄主抗性相关基因HvSyp121时，发现其突变体叶片被侵染部位聚集大量载着H₂O₂的囊泡，推测突变体细胞中囊泡未能与质膜融合，H₂O₂介导的抗病信号传导途径受阻，使得病原菌分泌的有毒物质进入植物体内致病(Dangl et al.，2001 Dangl JL，Jones JD(2001)Plant pathogens and integrated defence responses to infection.Nature 411：826-833；Tsanko et al.，2005Tsanko SG，Jacques H(2005)Hydrogen peroxide as a signal controlling plant programmed cell death.J Cell Biol 168(1)：17-20)。表明植物中SNARE蛋白与植物的基本抗病性即非寄主抗性相关。

发明内容

技术问题

本发明的目的在于公开水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的抗病性基因工程应用，该基因来自水稻，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，进行植物品种改良。

技术方案

水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的基因工程应用，包括：

1)总RNA的提取选用水稻抗稻瘟病菌品种“黑壳子粳”(太湖流域粳稻地方品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子(5×10⁴ml^-1)接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；

2)水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的克隆以拟南芥基因AtSYP71(Suwastika etal.，2008 Suwastika N，Uemura T，Shiina T，Sato MH，Takeyasu K(2008)SYP71，a plant-specific Qc-SNARE Protein，reveals dual localization to the plasma membrane and the endoplasmic reticulum in Arabidopsis.Cell structure andfunction 33：185-192)序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到1134bp水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的全长序列，并设计两端引物：

P1：5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，

P2：5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3。

将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min。扩增片段大小为1134bp，末端加A后克隆至pGEM-T载体，委托上海生工公司测序获得水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1；

3)植物表达载体的构建根据水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Kpn I和Xba I，P3和P4引物序列为：

P3：5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，

P4：5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3

以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，扩增片段大小为821bp(包含OsSYP71的编码区序列且两端引入了酶切位点)，将该片段克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将OsSYP71克隆到双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；

4)转基因植株的获得将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T₂代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。

有益效果

1、本发明公开了水稻SNARE蛋白基因OsSYP71及其所编码的蛋白质。水稻SNARE蛋白基因OsSYP71为水稻中首次报道，基因芯片和mRNA表达分析表明该基因受稻瘟病菌接种诱导，转基因实验证明该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此有望可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。

2、本发明的OsSYP71基因来自水稻，具有适合于水稻等单子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等之外更加适合于水稻、玉米、小麦等单子叶植物。

3、对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T₂代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为2.1级，发病叶片平均病斑数目为4.2个及病斑平均长度为0.47mm，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为42个及病斑平均长度为5.00mm，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。

4、利用本发明OsSYP71基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括具有抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如β-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。

所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

具体实施方式

1)选用水稻品种“黑壳子粳”(为太湖流域粳稻地方品种，为抗稻瘟病菌品种)，待水稻幼苗长至3-4叶期后，用稻瘟病菌孢子进行接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱。取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mL EP管(TRIzol Reagents，购自Invitrogen，USA)，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量。

以拟南芥基因AtSYP71(Suwastika et al.，2008 Suwastika N，Uemura T，Shiina T，Sato MH，Takeyasu K(2008)SYP71，a plant-specific Qc-SNARE Protein，reveals dual localization to the plasma membrane and the endoplasmic reticulum in Arabidopsis.Cell structure and function 33：185-192)序列为探针，搜索水稻基因组序列和EST序列数据库，拼接得到1134bp水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的全长序列，并设计两端引物P1：5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，P2：5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3，以总RNA反转录合成的cDNA第一链为模板用高保真Pfu酶(购自Roche)进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶(购自天根公司，北京)72℃保温10min。扩增片段大小为1134bp，末端加A后克隆至pGEM-T载体(购自Promega)，委托南京金思特公司测序获得水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列。

分析上述获得的水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1及其编码蛋白SEQ ID NO.2，该基因编码的蛋白序列与拟南芥AtSYP71蛋白序列的一致性为55％，在C端都存在保守结构域Qc-SNARE结构域和跨膜结构域。

2)用步骤1)中设计的引物P1、P2进行半定量RT-PCR分析接种处理后水稻3-4叶期地上部幼苗的表达，结果表明，接种稻瘟病菌孢子3小时后OsSYP71的表达增强，接种处理24h后表达增强最明显，经灰度扫描分析，其mRNA表达量为对照的4倍，表明OsSYP71基因的表达与稻瘟病菌处理有关。

3)根据步骤1)得到的OsSYP71的全长序列(见SEQ ID NO.1)，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Kpn I和Xba I，P3和P4引物序列为：

P3：5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，

P4：5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3

以步骤1)中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，扩增片段大小为821bp(包含OsSYP71的编码区序列且两端引入了酶切位点)，将该片段克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将OsSYP71克隆到双元表达载体pCAMBIA1301(上海二医新生基因科技有限公司)，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，再将其转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”(太湖流域粳稻地方品种)，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价。将生长至3-4叶期的转基因T₂代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的平均病级数为2.1级，发病叶片平均病斑数目为4.2个及病斑平均长度为0.47mm，而对照植株的平均病级数为7级以及发病叶片平均病斑数目为42个及病斑平均长度为5.00mm，结果表明，转基因植株与对照相比表现出对稻瘟病菌的明显抗性。

综上所述，本发明人提供的OsSYP71基因是首次在水稻中分离的新基因，为水稻中首次报道，其功能与水稻抗病性相关，可作为目的基因导入植物，提高植物抗病性，以进行植物品种改良。可利用本发明OsSYP71基因作为目的基因构建植物表达载体，其中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种水稻SNARE蛋白基因的抗病性基因工程应用

<130>说明书

<140>00

<141>2010-01-14

<160>6

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1134

<212>DNA

<213>Oryza sativa(水稻)

<220>

<221>5′UTR

<222>(1)..(90)

<220>

<221>CDS

<222>(91)..(897)

<220>

<221>3′UTR

<222>(898)..(1134)

<400>1

ttgcttgctt cctcccgaat cctcgcctcg atctcgctcg cgggcgggcg gagggatcgt 60

gatcgggatc gggatcgggg gcgcgcgaag atg agc gtg atc gac atc ctc acg 114

Met Ser Val Ile Asp Ile Leu Thr

1 5

cgg gtg gac tcc atc tgc aag aag tac gac aag tac gac gtc gag agg 162

Arg Val Asp Ser Ile Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Tyr Asp Val Glu Arg

10 15 20

ctc aac ggc gcc aac gtc gcc ggc gag gac ccc ttc gcc cgc ctc tac 210

Leu Asn Gly Ala Asn Val Ala Gly Glu Asp Pro Phe Ala Arg Leu Tyr

25 30 35 40

ggc tcc atc gac gcc gac atc aac gaa tgc gtc gag aaa gcg gag gcg 258

Gly Ser Ile Asp Ala Asp Ile Asn Glu Cys Val Glu Lys Ala Glu Ala

45 50 55

gcg aag cag gag aag aac cgc gcc acg gtg gtc gcg ctc aac gcg gag 306

Ala Lys Gln Glu Lys Asn Arg Ala Thr Val Val Ala Leu Asn Ala Glu

60 65 70

atc cgg cga acc aag gcc aag ctc gtc gag gag gac ctg ccc aag ctg 354

Ile Arg Arg Thr Lys Ala Lys Leu Val Glu Glu Asp Leu Pro Lys Leu

75 80 85

cag cgc ctc gcg ctg aag aag gtc aaa ggg ctc aca aaa gag gaa ctc 402

Gln Arg Leu Ala Leu Lys Lys Val Lys Gly Leu Thr Lys Glu Glu Leu

90 95 100

gcg acc cgt agt gat ctg gtt gct gcc tta ccc gat aga ata caa tca 450

Ala Thr Arg Ser Asp Leu Val Ala Ala Leu Pro Asp Arg Ile Gln Ser

105 110 115 120

ata cca gat ggt agt tca agt gca aag aaa aat ggg act tgg ggc gcc 498

Ile Pro Asp Gly Ser Ser Ser Ala Lys Lys Asn Gly Thr Trp Gly Ala

125 130 135

tca gga tcc cgt act ggt gga gcc att aag ttt gac act tct gat ggc 546

Ser Gly Ser Arg Thr Gly Gly Ala Ile Lys Phe Asp Thr Ser Asp Gly

140 145 150

aac ttt gat gat gag tac ttt aag gga aca gaa gaa tca aat cag ttt 594

Asn Phe Asp Asp Glu Tyr Phe Lys Gly Thr Glu Glu Ser Asn Gln Phe

155 160 165

cgt cgg gaa tat gag atg cgc aaa atg aaa cag gat gaa ggt ttg gat 642

Arg Arg Glu Tyr Glu Met Arg Lys Met Lys Gln Asp Glu Gly Leu Asp

170 175 180

att atc ggt gaa ggg ctg gaa act ctg aaa aac atg gca tct gat atg 690

Ile Ile Gly Glu Gly Leu Glu Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser Asp Met

185 190 195 200

aat gag gaa ctg gat agg caa gtt ccc ttg atg gat gaa atg gac gag 738

Asn Glu Glu Leu Asp Arg Gln Val Pro Leu Met Asp Glu Met Asp Glu

205 210 215

aag gtg gat aga gcc aac aca gat ttg aag aat acc aac gtc aga cta 786

Lys Val Asp Arg Ala Asn Thr Asp Leu Lys Asn Thr Asn Val Arg Leu

220 225 230

aaa gag acc gtt ctt cag ctg aga tct agt cgc aac ttc tgc att gat 834

Lys Glu Thr Val Leu Gln Leu Arg Ser Ser Arg Asn Phe Cys Ile Asp

235 240 245

atc gtc ctg ctc tgt gtt att ctt ggt att gcg gct tat ctt tac aat 882

Ile Val Leu Leu Cys Val Ile Leu Gly Ile Ala Ala Tyr Leu Tyr Asn

250 255 260

gtt cta aaa aag tga gaccggactg tgccatggat ctattttcca cgtcttccgg 937

Val Leu Lys Lys

265

tgatggatgg atgagtttcg acgtgtccac gagctgttcc ctttattttt atctcatctg 997

tgtaatagta gtatggtgtt cttccgggac ttgcgaacat ccttgttgaa agttgaaaca 1057

gtgagcattg tgcgtgcgaa aacctgacgt cttctgtaca tctgcgagtt taattcttag 1117

caagagcgta tcaaaca 1134

<210>2

<211>268

<212>PRT

<213>Oryza sativa(水稻)

<400>2

Met Ser Val Ile Asp Ile Leu Thr Arg Val Asp Ser Ile Cys Lys Lys

1 5 10 15

Tyr Asp Lys Tyr Asp Val Glu Arg Leu Asn Gly Ala Asn Val Ala Gly

20 25 30

Glu Asp Pro Phe Ala Arg Leu Tyr Gly Ser Ile Asp Ala Asp Ile Asn

35 40 45

Glu Cys Val Glu Lys Ala Glu Ala Ala Lys Gln Glu Lys Asn Arg Ala

50 55 60

Thr Val Val Ala Leu Asn Ala Glu Ile Arg Arg Thr Lys Ala Lys Leu

65 70 75 80

Val Glu Glu Asp Leu Pro Lys Leu Gln Arg Leu Ala Leu Lys Lys Val

85 90 95

Lys Gly Leu Thr Lys Glu Glu Leu Ala Thr Arg Ser Asp Leu Val Ala

100 105 110

Ala Leu Pro Asp Arg Ile Gln Ser Ile Pro Asp Gly Ser Ser Ser Ala

115 120 125

Lys Lys Asn Gly Thr Trp Gly Ala Ser Gly Ser Arg Thr Gly Gly Ala

130 135 140

Ile Lys Phe Asp Thr Ser Asp Gly Asn Phe Asp Asp Glu Tyr Phe Lys

145 150 155 160

Gly Thr Glu Glu Ser Asn Gln Phe Arg Arg Glu Tyr Glu Met Arg Lys

165 170 175

Met Lys Gln Asp Glu Gly Leu Asp Ile Ile Gly Glu Gly Leu Glu Thr

180 185 190

Leu Lys Asn Met Ala Ser Asp Met Asn Glu Glu Leu Asp Arg Gln Val

195 200 205

Pro Leu Met Asp Glu Met Asp Glu Lys Val Asp Arg Ala Asn Thr Asp

210 215 220

Leu Lys Asn Thr Asn Val Arg Leu Lys Glu Thr Val Leu Gln Leu Arg

225 230 235 240

Ser Ser Arg Asn Phe Cys Ile Asp Ile Val Leu Leu Cys Val Ile Leu

245 250 255

Gly Ile Ala Ala Tyr Leu Tyr Asn Val Leu Lys Lys

260 265

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P1

<222>(1)..(17)

<400>3

ttgcttgctt cctcccg 17

<210>4

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P2

<222>(1)..(21)

<400>4

tgtttgatac gctcttgcta a 21

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P3

<222>(1)..(24)

<400>5

aggtaccatg agcgtgatcg acat 24

<210>6

<211>26

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<221>引物P4

<222>(1)..(26)

<400>6

atctagatca cttttttaga acattg 26

Claims

1.水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的基因工程应用，包括：

1)总RNA的提取

选用水稻抗稻瘟病品种“黑壳子粳”，待水稻幼苗长至3-4叶期，用稻瘟病菌孢子5×10⁴ml^-1接种处理，24小时后立即取叶片液氮冷冻，保存于-80℃冰箱，取部分叶片，用研钵研碎，转移入盛有Trizol裂解液的1.5mLEP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量；

2)水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的克隆

设计两端引物：

P1：5-TTGCTTGCTTCCTCCCG-3，P2：5-TGTTTGATACGCTCTTGCTAA-3

将步骤1)获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真Pfu酶进行PCR扩增，PCR程序如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45s，56℃复性1min，72℃延伸1.5min，35个循环后，72℃延伸5min，最后Tag酶72℃保温10min，末端加A后克隆至pGEM-T载体，测序获得水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1；

3)植物表达载体的构建

根据水稻SNARE蛋白基因OsSYP71的cDNA序列SEQ ID NO.1，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游引物P3和下游引物P4上分别引入限制性内切酶位点Kpn I和Xba I，P3和P4引物序列为：

P3：5-AGGTACCATGAGCGTGATCGACAT-3，

P4：5-ATCTAGATCACTTTTTTAGAACATTG-3

以步骤2)中获得的PCR扩增产物为模板，经PCR扩增后，将OsSYP71的cDNA克隆至中间载体pGEM-T，利用引入的限制性内切酶位点Kpn I和Xba I进一步将OsSYP71克隆到双元表达载体pCAMBIA1301，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确；

4)转基因植株的获得

将步骤3)获得的表达载体pCAMBIA1301转入农杆菌LBA4404，进一步转入水稻感稻瘟病菌品种“苏御糯”，对获得的转基因植株进行PCR，Southern杂交以及RT-PCR验证后进行水稻的抗病性评价，将生长至3-4叶期的转基因T2代植株进行稻瘟病菌孢子接种处理，7天后调查植株的病级数以及发病叶片病斑数目和病斑长度，与对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病菌转基因植株。