CZ138897A3 - Vektor pro zavedení genu do rostliny a způsob pro produkci transgeních rostlin a mnohonásobné zavedení genů do rostliny za použití vektoru - Google Patents

Vektor pro zavedení genu do rostliny a způsob pro produkci transgeních rostlin a mnohonásobné zavedení genů do rostliny za použití vektoru Download PDF

Info

Publication number
CZ138897A3
CZ138897A3 CZ971388A CZ138897A CZ138897A3 CZ 138897 A3 CZ138897 A3 CZ 138897A3 CZ 971388 A CZ971388 A CZ 971388A CZ 138897 A CZ138897 A CZ 138897A CZ 138897 A3 CZ138897 A3 CZ 138897A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
gene
vector
plant
tissue
interest
Prior art date
Application number
CZ971388A
Other languages
English (en)
Inventor
Hiroyasu Ebinuma
Koichi Sugita
Etsuko Matsunaga
Mikiko Vesugi
Original Assignee
Nippon Paper Industries Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Paper Industries Co., Ltd. filed Critical Nippon Paper Industries Co., Ltd.
Publication of CZ138897A3 publication Critical patent/CZ138897A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C12N15/821—Non-antibiotic resistance markers, e.g. morphogenetic, metabolic markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Vektor pro zavedení genu do rostliny a způsoby pro produkci transgeních rostlin a mnohonásobné zavedení genů do rostliny za použití vektoru
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nového vektoru pro zavedení požadovaného genu do rostliny za použití metod genetického inženýrství pro získání transgení rostliny; způsobu pro produkci transgení rostliny neovlivněné markerovým genem za použití tohoto vektoru; a způsobu pro zavedení alespoň dvou požadovaných genů do rostliny za použití tohoto vektoru.
Dosavadní stav techniky
Transformace mikroorganismů a kultivovaných buněk za použití genetického inženýrství je nyní používána pro produkci fyziologicky aktivních substancí využitelných jako léky a tak významně přispívá v průmyslu. V oblasti křížení rostlin je průmyslová aplikace genetického inženýrství pozadu, protože životní cyklus rostlin je o mnoho delší než životní cyklus mikroorganismů. Nicméně, protože tato technologie umožňuje zavedení požadovaného genu přímo do rostliny, které má být šlechtěna, byly následující výhody srovnávány s klasickým šlechtěním, které vyžaduje mnohotné křížení.
a) Je možné zavést pouze tu charakteristiku, která má být vylepšena.
b) Je možné zavést charakteristiku druhů jiných než rostliných (jako jsou mikroorganismy a podobně).
c) Je možné o mnoho zkrátit periodu šlechtění.
Tak jsou způsoby genetického inženýrství pro šlechtění rostlin intenzivně zkoumány.
Produkce transgeních rostlin vyžaduje následující tři kroky.
1) Zavedení požadovaného genu do rostlině buňky (včetně zavedení požadovaného genu do chromosomů, jader a podobně).
2) Vybrání rostlinné tkáně tvořené pouze buňkami, do nichž byl zaveden požadovaný gen.
3) Regeneraci rostliny z vybrané rostlině tkáně.
Pro vybrání transgení tkáně, do které byl zaveden požadovaný gen je třeba visuální identifikace tkáně, ve které je požadovaný gen exprivován bez regenerace nové rostliny. Pro dosažení tohoto je požadovaný gen typicky zaveden do rostlině buňky spolu s markerovým genem, jehož exprese může být snadno detekována ve stadiu kultivace buněk. To znamená, že exprese markerového genu je použita jako znamení zavedení požadovaného genu. Příklady běžných markerových genů zahrnují geny pro antibiotickou resistenci, jako je
gen resistence na kanamycin (t.j. NPTII;
neomycin fosfotransferasový gen), gen resistence na hygromycin (t.j. HPT; hygromycin fosfotransferasový gen), syntetasové geny aminokyselin, jako je nopalin syntetasový gen (NOS), octopin syntetasový gen (OCS) a sulfonylurea - resistence gen (t.j., ALS; acetoactate syntetasový gen), které udílejí resistenci na zemědělské chemikálie.
Nicméně, exprese markerového genu může způsobit vážné problémy, pokud je transgenní rostlina použita k jídlu.To znamená, že je dosti obtížné zajistit, aby genový produkt produkovaný expresí markerového genu byl bezpečný pro lidské tělo. Následně, pokud je transgenní rostlina obsahujíc markerový gen prodávána jako jídlo, pak musí být proveden podrobný výzkum vlivu markerového genu na lidské tělo. Například, NPTII gen je používán jako markerový gen na laboratorní úrovni od roku 1980. V roce 1994 byl produkt tohoto genu konečně akceptován jako potravinový doplněk U.S. Food and Drug Administration (FDA). Od té doby mohou být transgení rostliny obsahující NPTII gen jako markerový gen používány jako potrava. Nicméně, někteří konzumenti produktů obsahujících NPTII gen se stále obávají těchto genových účinků.
Kromě toho, markerovými geny, které jsou prakticky používány, jsou pouze ty geny, jako je NPTII gen, které udílejí detoxifikační vlastnosti pro substance inhibující růst rostlině buňky. Proto, pro vybrání transgenní rostlinné tkáně, do které • ·
byl požadovaný gen zaveden, je tkáň kultivována v kultivačním mediu obsahujícím substanci inhibující růst a exprese markerového genu, jmenovitě resistence tkáně na substanci inhibující růst, je hodnocena a použita jako index. Nicméně, i když má tkáň takovou resistenci, může kultivace za přítomnosti inhibiční substance vést k nežádoucím vedlejším účinkům na rostlině buňky, jako je snížení proliferace a rediferenciace transgenní tkáně.
Dále, exprese markerového genu v rostlině buňce po selekci transgenní tkáně vážně brání šlechtění rostliny následujícím zavedením genu. To znamená, že pokud je jiný gen zaveden do transgenní rostliny obsahující markerový gen, pak zavedení genu musí být monitorováno jiným markerovým genem. Nicméně, účinnost markerového genu se liší podle druhu rostlin. Proto je vyžadován předběžný test pro zadání podmínek pro každý markerový gen (například, je popsáno, že HPT gen je účinější než NPTII gen u rýže (K. Shimamoto et al., nátuře (London), svazek 338, str. 274, 1989)). Ještě dále, jelikož varianty markerových genů jsou omezené, mnohonásobné zavedení genu nemůže být donekonečna opakováno změnou markerového genu. To znamená, počet zavedení genu do rostliny je omezen škálou markerových genů, které mohou být použity v této rostlině. Kromě toho, typ markerového genu, který může být • · · · · · · použit, je omezen jak bylo uvedeno výše. V souladu s tím je Žádoucí nalézt způsob pro odstranění markerového genu z chromosomu po selekci transgenní rostlině tkáně pro vyloučení vlivu markerového genu na buňku, tkáň a rostlinu.
Pro eliminaci vlivu markerového genu byly popsány dva způsoby. V jednom způsobu je markerový gen a transposon rostliny zaveden na chromosom rostliny a následně je z něj odstraněn spolu s transposonem (International Laid-Open č. WO 92/01370). Ve druhém způsobu je místo transposonu použit místně specifický rekombinantní systém PÍ fágu (International Laid-Open č. WO 93/01283). Za použití těchto způsobů je možné získat buňku, ve které byl markerový gen odstraněn z chromosomu v daném stupni po zavedení genu. Naneštěstí je pravděpodobnost toho, že markerový gen bude odstraněn, velmi nízká.
Dále, rostlině buňky, ze kterých byl markerový gen odstraněn z chromosomu za použití těchto způsobů jsou rozptýleny mezi buňkami, ve kterých jsou markerové geny stále přítomny a exprivovány. Tyto dva druhy buněk nemohou být odlišeny visuálně.
Rostlině buňky obsahující markerové geny a požadovaný gen mohou být selektovány na základě jejich chemické resistence, nutričních požadavků a podobně. Nicméně, v době selekce, buňky postrádající markerové geny vykazují vážnou • · · · inhibici růstu a v mnoha případech jsou zničeny. V souladu s tím nemůže být selekce použita pro získání buněk postrádajících markerové geny.
Pro získání rostlin, které postrádají markerové geny a které obsahují požadovaný gen za použití výše uvedených způsobů je tkáň rostliny, ve které jsou smíseny buňky postrádající markerový gen a buňky obsahující markerové geny proliferovány, regenerovány a potom analyzovány pro selekci, za použití metod jako je Southern hybridizace nebo polymerasová řetězová reakce. Tato metoda je založena na předpokladu, že regenerace jednotlivce je odvozena od jedné buňky a proto by všechny buňky rostliny měly mít stejné charakteristiky. Tak, jednotlivec odvozený od buňky postrádající markerový gen je tvořen pouze takovými buňkami. Naneštěstí, buňky vytvářející takové regenerované jednotlivce nemusí nezbytně být uniformní. Buňky postrádající chromosom markerového genu a buňky obsahující markerový gen jsou koexistující a jsou dosti nepravidelně distribuovány v jedné jednotlivé regenerované rostlině a její tkáni. Tak je extrémně obtížné získat jednotlivce tvořeného pouze buňkami postrádajícími markerový gen ve stadiu, kdy je kultivovaná tkáň rediferencována pro regeneraci jednotlivce.
Kromě toho, známé analytické metody selekce využívají tkáň, jako je list, jako testovací vzorek (nikoliv celé individuum nebo jednu buňku). Z toho vyplývá, že že jakákoliv celková tendence je analyzována s ohledem na stav markerového • · · · « · genu v jednom listu.
Kromě toho, v tomto případě, je běžné, že buňky bez markerového genu a buňky obsahující markerový gen byly přítomny ve stejném jednotlivci nebo tkáni. Tak, ačkoliv jedinec vytvořený pouze z buněk postrádajících markerový gen může být vytvořen, je obtížné ho vybrat. Ačkoliv přítomnost markerového genu není detekována v této tkáni, tkáně nebo jiná místa jedince mohou obsahovat markerový gen, nebo to pouze ukazuje, že přítomnost markerového genu je pod detekovatelnou hranicí. Proto není možné určit, zda je testovaný vzorek úplně prostý buněk obsahujících markerový gen.
Za použití výše uvedených způsobů je jednotlivec postrádající markerový gen získán pouze ze zárodečné buňky, jako je pyl, vaječná buňka a podobně. Pokud je provedeno samoopylení za použití vaječné buňky postrádající markerový gen, pak je získáno ferti 1 izované vajíčko postrádající markerový gen ve fixním poměru daném klasickými zákony dědičnosti a z tohoto ferti 1 izovaného vajíčka je vytvořen jednotlivec mající pouze buňky mající stejné charakteristiky jako fartilizované vajíčko. Běžné analytické metody jako je Souther hybridizace mohou být provedeny za použití tohoto jednotlivce. Jmenovitě, i když je předkládanou metodou produkována buňka postrádající markerový gen, jednotlivec tvořený pouze takovými buňkami je je získán nejprve rediferenciací rostliny z kultivované tkáně obsahující takovou buňku, provedením křížení regenerované rostliny a • · získání F1 potomstva nebo dalších generací. Takto získaný jednotlivec může být selektován jako jednotlivec postrádající markerový gen.
Pro odstranění markerového genu z transgenní rostliny popisuje JP-A-6-276872 techniku pro zavedení genu, ve které je markerový gen insertován do separátního plasmidového vektoru obsahujícího požadovaný gen. Plasmid obsahující markerový gen je odstraněn z buňky po dokončení zavedení genu (termín JP-A jak je zde použit znamená japonskou publikovanou patentovou přihlášku). Nicméně, tato technika vyžaduje krok křížení pro odstranění markerového genu. V tomto ohledu je technika stejná jako výše uvedené dvě zprávy.
Výše uvedené metody je obtížné aplikovat na dřeviny, vzhledem k jejich dlouhé růstové periodě, na sterilní jedince nebo na hybridní jedince, u kterých je F1 sama hodnotná. Dále, pokud jsou použity odstranitelné DNA elementy, jako je transposon a podobně, pak poměr, ve kterém jsou tyto elementy odstraněny z chromosomální DNA, DNA virového vektoru a dalšími, kde jsou tyto elementy přítomny a fungují, je typicky extrémně nízký. V souladu s tím, je nezbytné, aby odstranění těchto elementů (jmenovitě markerového genu) mohlo být snadno aktuálně detekováno nejméně ve stadiu kultivované tkáně. Pokud toto nemůže být detekováno před rediferenciací kultivované tkáně a tvorbou dalších generací • · cestou křížení regenerovaného jednotlivce, pak je tato metoda neprakt i cká.
Podstata vynálezu
V souladu s tím je jedním předmětem vynálezu poskytnutí vektoru obsahujícího gen, který má být zaveden do rostliny a markerový gen, kde rostlina, která obsahuje tento gen, nemá nežádoucí účinky na lidské tělo, pokud je trávena, i když je markerový gen exprivován.
Jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí vektoru pro zavedení požadovaného genu do rostliny, kde vektor obsahuje markerový gen, který umožňuje selekci transgenní tkáně bez použití inhibičních substancí růstu rostliných buněk, které snižují aktivitu rostliných buněk.
Ještě jiným předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí vektoru pro zavedení požadovaného genu do rostliny, kde vektor obsahuje markerový gen, a účinkuje tak, že vylučuje vliv markerového genu odstraněním markerového genu z DNA, kde je markerový gen přítomen a účinkuje. Za použití tohoto vektoru může být požadovaný gen opakovaně účinně zaveden.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí metody pro produkci transgenních rostlin za použití takového vektoru, který vylučuje vliv markerového genu, bez nutnosti kroku produkce F1 nebo pozdějších generací křížením a metodu pro mnohotné zavádění genů do rostlin za použití výše uvedené metody.
Tyto a jiné předměty předkládaného vynálezu mohou být dosaženy za použití vektoru, který obsahuje požadovaný gen a alespoň jeden gen pro indukci morfologické abnormality (zde označený jako MAI) jako markerový gen.
Dále, tyto a jiné předměty předkládaného vynálezu mohou být dosaženy za použití vektoru, ve kterém je markerový gen odstraněn z DNA po své expresi. Exprese markerového genu a zmizení jeho účinku je možné detekovat morfologickými změnami tkání, do kterých byl markerový gen zaveden.
Kromě toho, tyto a jiné předměty předkládaného vynálezu mohou být dosaženy za použití vektoru, který obsahuje požadovaný gen, alespoň jeden MAI gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element. MAI gen je umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem. Požadovaný gen je umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem.
Ještě dále, tyto a jiné předměty předkládaného vynálezu mohou být dosaženy za použití metody pro produkci transgenních rostlin prostých ovlivnění markerovým genem, kde tato metoda obsahuje následující kroky:
A) zavedení vektoru do rostlině buňky, kde uvedený vektor obsahuje požadovaný gen, alespoň jeden MAI gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, kde uvedený MAI gen je umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a kde požadovaný gen je umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem,
B) kultivaci rostlině buňky získané v A), detekci morfologicky abnormální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selekci uvedené morfologicky abnormální tkáně, a
C) kultivaci uvedené morfologicky abnormální tkáně selektované v B), detekci detekci morfologicky normální tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selekci uvedené morfologicky normální tkáně.
Ještě dále, tyto a jiné předměty předkládaného vynálezu mohou být dosaženy za použití metody pro zavedení alespoň dvou požadovaných genů do rostliny, kde tato metoda obsahuje provedení následujících kroků alespoň dvakrát:
A) zavedení vektoru do rostlině buňky, kde uvedený vektor obsahuje požadovaný gen, alespoň jeden MAI gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, kde uvedený MAI gen je umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a kde požadovaný gen je umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem.
B) kultivaci rostlině buňky získané v A), detekci morfologicky abnormální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a • · • · · · • · · • · · · • · • 9 9 selekci uvedené morfologicky abnormální tkáně, a
C) kultivaci uvedené morfologicky abnormální tkáně selektované v B), detekci detekci morfologicky normální tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selekci uvedené morfologicky normální tkáně.
Kromě toho, tyto a jiné předměty předkládaného vynálezu mohou být dosaženy za použití rostliny regenerované kultivací výše uvedené morfologicky normální tkáně.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obrázek 1 je diagram Ti plasmidu a mapa restrikčních endonukleas Pstl fragmentu na T-DNA regionu A. tumefaciens kmene PO22.
Obrázek 2 je diagram konstrukce pIPT2.
Obrázek 3 je diagram konstrukce pIPT3 z pIPT2.
Obrázek 4 je diagram konstrukce pIPT4 z pIPT3.
Obrázek 5 je mapa restrikčních endonukleas T-DNA regionu ve struktuře pIPT4.
Obrázek 6 jsou výsledky PCR analýz extremních fenotypů výhonků tabáku, do kterých byl zaveden gen za použití pIPT4.
Obrázek 7 je diagram konstrukce pNPI102.
·· ···· • · · · ···· ·· · ···· ··· ··· • ·· · · ·· · · · · · · • · · · ··· ·· • · ·· · « · · · ·« ·
Obrázek 8 je diagram konstrukce pNPI103 z pIPT4 a pNPI102.
Obrázek 9 je diagram konstrukce pNPI106 z pNPI103.
Obrázek 10 je mapa restrikčních endonukleas T-DNA regionu ve struktuře pNPIlOó.
Obrázek 11 je fotografie výhonku č. 2 po jednom měsíci kultivace v příkladu 2.
Obrázek 12 je fotografie výhonku č. 8 po jednom měsíci kultivace v příkladu 2.
Obrázek 13 ukazuje výsledky PCR analýzy výhonku č. 8 v příkladu 2.
Obrázek 14 ukazuje výsledky PCR analýzy normálních jedinců získaných z výhonků č. 13-1 a 14-1 v příkladu 3.
Obrázek extremního
Obrázek které byly je fotografie normálních výhonků diferencovaných fenotypu tabáku v příkladu 3.
ukazuje výsledky PCR analýzy normálních jedinců získány z listu tvořeného z výhonku č. 7 v příkladu 2
Obrázek
Obrázek je diagram konstrukce je diagram konstrukce
PNPI128.
PNPI129 z pNPI128
Obrázek 19 je diagram konstrukce pNPI132 z pNPIlOl a pNPI129.
·· ·· • · · · • · ·· • · · · • · · · ·· ·· ·· ···· • ·· ·· « · · · · • · · · · · • · · · ··· · • · · · · ··· ·· »· ·
Obrázek 20 je mapa restrikčních endonukleas T-DNA regionu ve struktuře pNPI132.
Obrázek 21 ukazuje výsledky PCR analýzy normálních jedinců získaných z výhonků č. 15 až 21 v příkladu 5 za použití primerú, ve kterých byla detekována existence ipt genu.
Obrázek 22 ukazuje výsledky PCR analýzy normálních jedinců získaných z výhonků č. 15 až 21 v příkladu 5 za použití primerů, ve kterých byla detekována eliminace regionu udržovaného spojením Rs obsahujícího ipt gen.
Obrázek 23 ukazuje výsledky PCR analýzy normálních jedinců získaných z výhonků č. 15 až 21 v příkladu 5 za použití primerů, ve kterých byla detekována existence GUS genu.
Obrázek 24 ukazuje výsledky PCR analýzy normálních jedinců získaných z linie, která nemohla tvořit extremní fenotyp výhonků v příkladu 5.
Obrázek 25 je diagram konstrukce pNPI702.
Obrázek 26 je mapa restrikčních endonukleas T-DNA regionu ve struktuře pNPI702.
Obrázek 27 je fotografie normálních výhonků diferencovaných z extremního fenotypu výhonků hybridní osiky v příkladu 7.
Obrázek 28 je mapa restrikčních endonukleas T-DNA regionu ve struktuře pNPI140.
Obrázek 29 ukazuje výsledky PCR analýzy normálního výhonku diferencovaného z výhonku s extremním fenotypem po mnohotném zavedení genů v příkladu 8.
Jak je zde použito, MAI gen je gen, který indukuje v rostlině tkáni morfologické abnormality jako je zakrslost, destrukce apikální dominance, změna pigmentace, tvorba vroubkovaných hálek, tvorba plstnatých kořenů, vlnění listů a podobně. S ohledem na preferovaný MAI gen, tyto geny izolováné z rodu Agrobacterium nebo podobného, který indukuje tumor nebo teratom (např. tvoří vedlejší výhonky nebo vedlejší kořeny) u různých rostlin mohou být použity. Příklady těchto různých genů zahrnují geny pro syntesu cytokininu (např. ipt (isopentenyltransferasa) gen (A.C. Smigocki, L. D. Owens, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, svazek 85, str 5131, 1988)), iaaM (tryptofan monooxygenasa) gen (H. J. Klee et al., GENES and DEVELOPMENT, svazek 1, str. 86, 1987), gen 5 (H. Kórber et al., EMBO Journal, svazek 10, str. 3983, 1991), gen 6b (P. J. J. Hoyaas et al., Plant. Mol. Biol., svazek 11, str. 791, 1988) a rol geny jako je rolA, rolB, rolC a rolD (F. F. White et al., J. Bacteriol., svazek 164, str. 33, 1985). kromě toho, jejich příklady zahrnují iaaL (kyselina indoloctová-lysin syntetasa) gen v Pseudomonas syringae subsp. savastanoi (A. Spěna et al., Mol. Gen. Genet., svazek 227, str. 205, 1991), homeo box geny a phytochrom geny v různých rostlinách. Preferovaně jsou použity ipt gen nebo alespoň jeden gen vybraný z rol genů (lépe, rol genů obsahujících geny rolA, rolB a rolC). ipt gen ···· ···· · · · ···· · · · · · · • ·· · · · · ·· ···· ···· ··· · · • · · » ····· ·· 9 je přítomen v T-DNA Agrobacterium tumefaciens a indukuje destrukci apikální dominance, rol geny obsahující geny rolA, rolB a rolC jsou přítomny v T-DNA Agrobacterium rhizogenes a alespoň jeden z nich indukuje tvorbu vlasatých kořenů, zakrslosti, kroucení listů a podobně u rostlin regenerovaných z vlasových kořínků.
Za použití technik podle předkládaného vynálezu je možné naprojektovat kombinaci těchto markerových genů tak, že jsou rediferencovány specifické struktury, jako jsou vedlejší výhonky nebo vedlejší kořeny a podobně, ve specifické rostlině, do které byl markerový gen zaveden. V předkládaném vynálezu může být taková kombinace MAI genů použita, v souladu s podmínkami produkce transgenních rostlin, jako je druh rostliny, do které jsou geny zavedeny.
Morfologicky abnormální tkáň produkovaná zavedením MAI genu do buňky je tvořena pouze buňkami obsahujícími tento gen. Proto, za použití tohoto genu jako markerového genu je konstruován vektor spolu s požadovaným genem. Pokud je vektor zaveden do rostlině buňky a transgenní rostlina je kultivována, pak může být tkáň tvořená pouze těmi buňkami, do kterých byl zaveden markerový gen a požadovaný gen, selektována visuální selekcí morfologicky abnormální tkáně tvořené těmito buňkami.
Vhodné vektory použitelné podle předkládaného vynálezu mají DNA sekvenci, která zavádí cizorodý gen • · • · • · · · · · • · · · · • · · · t · · · · · • · · · · · * do hostitelské buňky a která exprivuje cizorodý gen v hostitelské buňce.
Pokud je gen zaveden za použití vektoru podle předkládaného vynálezu, pak rostlinná tkáň vytvořená pouze transformovanými buňkami může být visuálně selektována jenom kultivováním buňky po operaci zavedení genu v běžném kultivačním mediu jako je MS (Murashige - Skoog) kultivační medium za řádných kultivačních podmínek. Protože zde neexistuje potřeba použití speciálních substancí pro selekci transformované tkáně, jako jsou inhibiční substance růstu rostliných buněk, je tato procedura nejenom zjednodušena, ale také není snížena aktivita rostlině buňky takovou substancí. Kromě toho, rostlina má zděděný MAI gen, nebo je MAI gen spontáně zaveden do rostliny prostřednictvím infekce bakterií a podobně. V souladu s tím, rostlina získaná za použití vektoru podle předkládaného vynálezu se neliší od přirozeně se vyskytujících rostlin, které mají tyto morfologické abnormality.
Vhodné vektory podle předkládaného vynálezu zahrnují vektor, ve kterém je uvedený MAI gen umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a kde požadovaný gen je umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem.
Jak je zde použito, odstranitelný DNA element je element DNA sekvence, který je sám o sobě odstranitelný z DNA, kde je DNA element přítomen a kde působí. U rostlin je transposon přítomný v • · • · • · · · ···· ··· · · •· ·· ····· ·· · chromosomu známý jako tento element. Struktura, aktivita a chování transposonů byly již téměř úplně identifikovány. Pro funkci transposonů jsou nezbytné v zásadě dvě složky: (1) enzym, který je exprivován genem zde přítomným a který katalyzuje excisi a transpozici transposonů samotného (transposasa) a (2) DNA vazebné sekvence, které jsou přítomné v terminálním regionu transposonů a pod kterými je transposon účinný. Těmito elementy je transposon excidován z chromosomu, ve kterém existuje, a potom je obyčejně přenesen do nové pozice v DNA. Nicméně, v jisté míře, transposony také mizí, bez toho, že by byly někam přeneseny. Předkládaný vynález poskytuje použití takových transpozičních chyb transposonů.
Transposon může být jedním ze dvou typů, bud autonomní transposon, nebo neautonomní transposon. Autonomní transposonsi udržuje dva elementy, transposasu a DNA vazebnou sekvenci. V autonomním transposonů je transposasa exprivována a váže se při svém účinku na DNA vazebnou sekvenci, kde je transposon autonomně excidován z chromosomu. Neautonomní transposon si uchovává terminální DNA vazebnou sekvenci, na kterou se při svém účinku váže transposasa. V neautonomním transposonů podléhá gen pro transposasu mutaci, takže transposasa není exprivována; proto nemůže být transposon excidován z chromosomu autonomně. Nicméně,
• · ·· · ·· ·· · pokud je transposasa dodána k neautonomnímu transposonu od autonomního transposonu nebo od nezávislého genu pro transposasu, pak se neautonomní transposon chová podobně jako autonomní transposon.
Příklady autonomních transposonu zahrnují Ac a Spm izolované z kukuřice (A. Gieri a H. Saedler, Plant. Mol. Biol., svazek 19, str. 39, 1992). Ac může být získán trávením wx-m7 genového lokusu v chromosomu kukuřice restrikční endonukleasou Sau3A (U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet., svazek 194, str. 346, 1984). Tento autonomní transposon je nejčastěji analyzován ze všech rostliných transposonů. DNA sekvence byla již určena (M. Mul 1er-Neumann et al., Mol. Gen. Genet., svazek 198, str. 19, 1984).
Příklady neautonomních transposonů zahrnují Ds a dSpm získané delecí vnitřních regionů Ac a Spm, v příslušném pořadí (H.-P.
Doring a P. Starlinger, Ann. Pev. Genet., svazek 20, str. 175,
1986) a ty, které jsou izolovány z mnoha rostlin, jiných než je kukuřice, jako je svlačec, hledík větší, a podobně (například, Y. inagaki et al., Plant Cell, svazek 6, str. 375, 1994). Pokud jsou tyto transposony zavedeny do chromosomů exogeních rostlin, pak jsou tyto transposony také excidovány z chromosomu a transponovány za vykázání aktivity (například, B. Baker et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, svazek 83, str. 4844, 1986).
V předkládaném vynálezu mohou být použity jak autonomní transposony, tak neautonomní transposony. Neautonomní transposony mohou být použity po inserci do funkčního genu pro transposasu.
Jiným odstranitelným DNA elementem, který není přítomen v rostlinách, ale který může být použit podle předkládaného vynálezu, je element odvozený od místně specifického rekombinantního systému. Místně specifický rekombinantní systém se skládá ze dvou elementů, (1) rekombinantního místa (korespondujícího odstranitelnému DNA elementu podle předkládaného vynálezu), které má charakteristickou DNA sekvenci, a (2) enzymu, který se specificky váže na DNA sekvenci a katalyzuje rekombinaci mezi DNA sekvencemi, pokud existují dvě nebo více sekvencí (rekombinasa). Pokud jsou dvě DNA orientovány ve stejném směru v daném intervalu na stejné molekule DNA, pak je region vymezený těmito dvěma molekulami excidován z molekuly DNA, jako je plasmid, chromosom a podobně. Pokud jsou dvě molekuly DNA orientovány v opačných směrech na stejné molekule DNA, pak je region vymezený těmito dvěma molekulami invertován.
Předkládaný vynález preferovaně používá dřívější excize. Jak excise, tak inverse uvnitř rekombinantního místa se vyskytují jako výsledek homologní rekombinace díky místně specifickému rekombinačnímu systému, který je odlišný od mechanismu využívaného pro transposony. Je známo, že gen pro rekombinasu nemusí být nutně přítomen ve stejné DNA molekule, ve které je umístěno rekombinační místo. Gen pro rekombinasu pouze musí být přítomen ve stejné buňce a musí být exprivován pro excidování nebo invertování regionu vymezeného dvěma DNA sekvencemi (N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., svazek 22, str. 77, 1988).
Nyní byly identifikovány místně specifické rekombinační systémy v mikroorganismech jako jsou fágy, bakterie (jako například E. coli), kvasinky a podobně. Jejich příklady zahrnují Cre/lox systém, pSRl systém, FLP systém, cer systém a fim systém (například N. L. Craig, Annu. Rev. Genet., svazek 22, str. 17, 1988). Pokud je místně specifický rekombinační systém separovaný z těchto mikroorganismů za použití Cre/lox systému odvozeného od PÍ fágu (WO 93/01283) zaveden do organismu (včetně rostlin) odlišných od organismů, ze kterých byl systém odvozen, potom se chová stejným způsobem jako v původním organismu. Místně specifický rekombinační systém kvasinky (Zygosacchromyces rouxii) (pSRl systém (H. Matsuzaki et al., J. Bacteriology, svazek 172, str. 610, 1990)) může být také použit podle předkládaného vynálezu. Tento pSRl systém si také udržuje svou zděděnou funkci ve vyšších rostlinách (H. Onouchi et al., Nucleic Acid Res., svazek 19, str. 6373, 1991).
V předkládaném vynálezu mohou být geny pro indukci morfologických abnormalit (MAI) insertovány do místa, kde je gen excidován spolu s odstranitelným DNA elementem. Například, pokud je použit jako odstranitelný DNA element transposon, pak může být MAI gen insertován do pozice, která neovlivňuje excisi transposonu a která je upstream od promotorového regionu genu pro transposasu, ale které je downstream od terminálního regionu, na který se transposasa váže. Pokud je použit pSRl systém, pak může být MAI gen insertován do jakékoliv pozice uvnitř regionu vymezeného charakteristickými DNA sekvencemi, které neinhibují expresi rekombinasy.
V předkládaném vynálezu je MAI gen preferovaně přítomen uvnitř odstranitelného DNA elementu. Na druhou stranu, umístění požadovaného genu není přesněji omezeno; nicméně, je preferováno, aby byl požadovaný gen mimo odstranitelný DNA element.
Za použití vektoru takové struktury po zavedení požadovaného genu může být MAI gen odstraněn v určité frekvenci, spolu s odstranitelným DNA elementem, z DNA, do které je zaveden a ve které účinkuje. Požadovaný gen, který se nechová integrálně s markerovým genem, zůstává ve stejné DNA. Vektor může být použit pro mnohonásobné zavedení požadovaného genu do určité rostliny. Kromě toho, protože ztráta funkce tohoto MAI genu může být visuálně detekována jako morfologická změna transgenní tkáně v průběhu kultivace, může být tkáň tvořená pouze buňkami s požadovaným genem, ale bez markerového genu, selektována snadno a bez nutnosti speciálních postupů. Z toho vyplývá, ža ačkoliv je taková buňka aktuálně tvořena v nízkém stupni, může být taková buňka dostatečně selektována pro vytvoření prakticky použitelných postupů. Dále, nejenom že může být mnohonásobné zavedení genu za použití tohoto vektoru mnohokrát opakováno ale také může být opakováno před tím, než je zralá rostlina regenerována. Tak může být mnohonásobné zavedení genu provedeno účinně. Pro získání jednotlivé transgenní rostliny tvořené pouze takovými buňkami může být rostlina regenerována z takto vybrané tkáně bez toho, že by musel proběhnout krok křížení. Takto získaná jednotlivá transgenní rostlina je zcela prostá jakýchkoliv vedlejších účinků na lidské tělo způsobených markerovým genem, které byly uvedeny výše. Kromě toho, použití tohoto vektoru nevyžaduje substance inhibující růst buněk, které mohou snižovat aktivitu buňky v kroku selekce transgenní tkáně.
Vektor podle předkládaného vynálezu může být použit v jakékoliv rostlině, do které může být gen zaveden metodami genetického inženýrství. Požadovaný gen podle předkládaného vynálezu může být jakýkoliv gen, kterým mohou být vylepšeny hlavní zemědělské charakteristiky a jakýkoliv gen, který umožňuje studium mechanismů genové exprese a podobně, ačkoliv hlavní zemědělské charakteristiky nemusí být nezbytně vylepšeny.
Pro produkci proteinu jako je enzym z genu jsou obecně vyžadovány sekvence strukturálního genu kódující informace o polypeptidu a regulační sekvence strukturálního genu, jako je promotorové sekvence (expresní iniciační sekvence), terminační sekvence (expresní terminační sekvence) a podobně. Příklady vhodných promotorových sekvencí, které účinkují v rostlinách, zahrnují 35S promotor viru květákové mozaiky (J. T. Oděli et al., Nátuře, (London), svazek 313, str. 810, 1985), promotor nopalin syntetasy (W. H. R. Langridge et al., Plant Cell Rep. „ svazek 4, str. 355, 1985) a promotor malé podjednotky ribulosa difosfát karboxylasa/oxygenasy (R. Fluher et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, svazek 83, str. 2358, 1986). Příklady vhodných terminátorových sekvencí zahrnují polyadenylační signál nopalin syntetasy (A. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., svazek 1, str. 561, 1982) a polyadenylační signál octopin syntetasy (J. Gielen et al., EMBO J., svazek 3, str. 835, 1984). V souladu s tím, pokud je to nutné, obsahuje gen na vektoru podle předkládaného vynálezu strukturální gen a gen jeho expresní regulační sekvence. Gen, nebo geny a regulační sekvence, mohou být získány chemickou syntesou nebo klonováním cDNA nebo genomové DNA.
Vektor podle předkládaného vynálezu může být nepřímo zaveden do rostlině buňky prostřednictvím virů nebo bakterií, kterými jsou rostliny infikovány (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., svazek 42, str. 205, 1991). Příklady vhodných virů zahrnují virus květákové mozaiky, geminivirus, virus tabákové mozaiky a virus brome mozaiky. Příklady vhodných bakterií zahrnují Agrobacterium tumefaciens (zde označováno jako A. tumefaciens) a Agrobacterium rhizogenes (zde označováno jako A. rhizogenes). O dvouděložných rostlinách je obecně známo, že jsou infikovány bakteriemi rodu Agrobacterium. Nově, ·· ···· ··· ·· ·· · zavedení genu do jednoděložných rostlin infikováním těchto rostlin těmito bakteriemi bylo také popsáno (například International Laid-Open č. WO 94/00977).
Vektor podle předkládaného vynálezu pmúže být přímo zaveden do rostliny fyzikálními a chemickými metodami jako je mikroinjekce, elektroporace, polyethylenglykolová metoda, fúsní metoda a vysokorychlostní balistická penetrace (I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., svazek 42, str. 205, 1991). Protože obecná nepřímá metoda zavedení genu za použití rodu Agrobacterium nemůže být aplikována na mnoho jednoděložných rostlin a dvouděložných rostlin, které jsou resistentní na infekci Agrobacterium, jsou výše uvedené metody přímého zavedení účinné pro tyto rostliny.
Vektor pro použití podle předkládaného vynálezu není jednotlivě omezen podle toho, jak jsou požadavky předkládaného vynálezu uspokojeny. Například, pokud je vektor nepřímo zaveden do rostlinné buňky, pak může být vektorem Ti vektor nebo virový vektor. Příklady Ti vektoru pro použití podle předkládaného vynálezu zahrnují Binl9 (M. Bevan et al., Nucleic Acids Res., svazek 12, str. 8771, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema et al., Plant Mol. Biol., svazek 5, str. 85, 1985), pGA492 a pGA482 (G. An et al., Plant physiol., svazek 81, str. 86, 1986), pL22 (C. Simoens et al., Nucleic Acids Res., svazek 14, str. 8075, 1986), pAGSlll (P. Van den Elzen et al., Plant Mol. Biol., svazek 149, str. 5, 1985), pEND4K (H. J. Klee et al., Bi o/Techno1ogy, ·· ···· ·· ·· ··· ·· ·· · svazek 3, str 637, 1985), pGV831 (R. De Blaere et al., Nucleic Acids Res., svazek 13, str. 4777, 1985) a pMON200 (R. T. Fraley et al., Bio/Technology, svazek 3, str. 629, 1985). Příklady virových vektorů pro použití podle předkládaného vynálezu zahrnují vektor viru květákové mozaiky (N. Brisson et al., Nátuře (London), svazek 310, str. 511, 1984), geminivirový vektor (R. J. Hayes et al., Nátuře (London), svazek 334, str. 179, 1988), vektor brome mozaikového viru (R. French et al., Science (svazek 231, str. 1294, 1986), vektor viru tabákové mozaiky (N. Takamatsu et al., EMBO J., svazek 6, str. 307, 1987) a agroinfekční vektor (N. Grimsley et al., Nátuře (London), svazek 325, str. 177,
1987). Nicméně, vektory pro použití podle předkládaného vynálezu nejsou omezeny na tyto vektory.
Kromě toho, požadovaný gen pro použití podle předkládaného vynálezu není jednotlivě omezen. Charakter požadovaného genu samotného není pro předkládaný vynález zásadní. Příklady požadovaného genu pro použití podle předkládaného vynálezu zahrnují geny pro resistenci na choroby (např. gen pro endotoxin Bacillus thuringiensis, WO 92/20802)), pro resistenci na herbicidy (mutantní gen pro acetolaktát syntetasu, WO 92/08794)), semenný zásobní protein (např. gen pro glutelin, WO 93/18643)), syntesu mastných kyselin (např. gen pro acyl-ACP thioesterasu, WO 92/20236)), hydrolýzu buněčné stěny (např. gen pro polygalakturonasu (D. Grierson et al., Nucl. Acids Res., svazek 14, str. 8595, 1986)), biosyntesu anthocyaninu (např. gen pro chalcon syntetasu (H. J. Reif et al., Mol. Gen. Genet., svazek 199, str. 208, 1985)), biosyntesu ethylenu ·· ·· · ·· ······ • · · · ···· ·· · ···· · ♦ · ·· · • ·· · · ·· · · ···· • · · · ··· ·· ·· ·· ··· ·· ·· · (např. ACC oxidasový gen (A. SLater et al. , Plant. Mol. Biol., svazek 5, str. 137, 1985)), aktivní kyslík vychytávající systém (např. gen pro glutathion reduktasu (S. Greer and K. N. Perham, Biochemistry, svazek 25, str. 2736, 1986)) a biosyntesu ligninu (např. gen pro fenylalaninamonium-lyasu, gen pro cinnamyl alkohol dehydrogenasu, gen pro o-methyltransferasu, gen pro cinnamate
4-hydroxylasu, gen pro 4-kumarát-CoA ligasu, gen pro cinnamoyl CoA reduktasu (A. M. Boudet et al., New Phytol., svazek 129, str. 203, 1995)). Nicméně, požadované geny pro použití podle předkládaného vynálezu nejsou omezeny na tyto geny.
Kromě toho, hostitelská rostlina pro použití podle předkládaného vynálezu není jednotlivě omezena. Příklady roslin použitelných jako hostitelská rostlina zahrnují tabák (Tobacum), rajče (Lycopersicom), bataty (Impoea), brambor (Solanum), mrkev (Dacus), hlávkový salát (Lactuca), květák (Brassica), zelí (Brassica), lnice (Brassica), slunečnice (Helianthus), cukrová řepa (Bela), chřest (Asparagus), banán (Musa), bavlna (Gossypium), arabidopsis (Arabidopsis), vojtěška (Medicago), hrách (Pisum), sojové bohy (Glycine), rýže (Oryza), kukuřice (Zea) a žito (Secale). Příklady dřevnatých rostlin použitých jako hostitelská rostlina zahrnují topol (Populus), eukalyptus (Eucalyptus), akácii (Acacia), hrušeň (Pyrus), jabloň (Malus), vinnou révu (Vitis), ořešák (Juglans), švestku (Prunus), růži (Rosa) a smrk (Picea). Nicméně, hostitelské rostliny pro použití podle předkládaného vynálezu nejsou omezeny na uvedené rošt 1iny.
• ·
V předkládaném vynálezu je MAI gen exprivován tak, aby tvořil v buňkách fyziologické abnormality. Fyziologické abnormality obsahují produkci rostliného růstového hormonu v rostliných buňkách, který vede k proliferaci a diferenciaci buněk obsahujících MAI gen a v nich jsou indukovány různé morfologické abnormality. Například, soubor onemocnění výhonků s porušenou apikální dominancí (fenotyp extremních výhonků, ESP), vlasaté kořeny a podobně, může být odvozen od buňky, do které byl zaveden takový gen jako je MAI gen. Tento fenotyp je tvořen abnormální proliferaci a diferenciací výše uvedených buněk, tak je morfologicky abnormální tkáň vytvořena pouze z buněk, které obsahují tento gen. V souladu s tím, pokud je konstruován vektor za použití tohoto genu jako markerového genu spolu s požadovaným genem a je zaveden do rostlině buňky a buňka je kultivována, pak může být tkáň tvořená pouze buňkami, do kterých byl zaveden markerový gen a požadovaný gen selektována pouze vizuální selekcí morfologicky abnormální tkáně tvořené rostlinou buňkou. Tak je možné vizuálně selektovat transgenní tkáň bez provedení jakýchkoliv speciálních postupů jako je přidání substance inhibující růst rostliných buněk a podobných substancí do kultivačního media.
Zatímco běžné markerové geny, jako je NPTII gen, nejsou zaváděny do rostlin bez zpracování genetickým inženýrstvím, je MAI gen podle předkládaného vynálezu genem, který rostliny dědičně
obsahují nebo který je přirozeně zaveden do rostlin infekcí bakterií a podobně. Z tohoto důvodu je považována bezpečnost tohoto genového produktu pro lidské tělo za dosti vysokou.
Dále, v předkládaném vynálezu je MAI gen insertován do pozice, kde se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem. Poté, co je vektor mající takovouto strukturu zaveden do rostliny, je MAI gen použitý jako markerový gen odstraněn z DNA spolu s odstranitelným DNA elementem v dané frekvenci, což vede ke ztrátě jeho funkce. Oproti tomu požadovaný gen, který se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem zůstává ve stejné DNA a uchovává si svou funkci. Tak exprese stejného markerového genu může být použita jako index pro zavedení požadovaného genu znovu a znovu. V souladu s tím, tento vektor způsobuje mnohonásobné zavedení genu do určité rostliny snadnou změnou struktury týkající se požadovaného genu, který má být zaveden bez nutnosti jakékoliv změny ve struktuře markerového genu nebo jiných struktur. Z tohoto důvodu může být vektor opakovaně použit po neomezenou dobu.
Protože ztráta funkce markerového genu, t.j. ztráta funkce MAI genu, může být vizuálně detekována, může být tkáň tvořená buňkami markerového genu a obsahující požadovaný gen získána snadno a jistě, to znamená, kultivace, vizuální selekce a separace mohou být opakovány bez potřeby jakýchkoliv speciálních • ·
4· ·· · postupů pro získání takové tkáně. Dále, rostliny tvořené pouze výše uvedenými buňkami mohou být získány pouhou regenerací rostliny ze získané tkáně, bez nutnosti provedení kroku křížení. Ještě dále, ačkoliv je obtížné zcela odstranit transposon z DNA, protože tento element mů vysokou transposabi1itu, může být vynález dostatečný pro praktické použití, protože selekce je vysoce účinná.
Příklady provedení vynálezu
Předkládaný vynález bude nyní ilustrován následujícími příklady, které neslouží jako omezení rozsahu vynálezu.
V následujících příkladech byly pokusy provedeny podle instrukcí v Molecular Cloning, 2. vydání (Sambrook et al, vyd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) nebo podle návodu výrobce, pokud není jinak uvedeno.
Příklad 1
I. Konstrukce vektoru
Ipt gen přítomný v T-DNA patogeního kmene A. tumefaciens P022 (H. Wabiko, Chemical Regulation of Plants, svazek 24, str. 35, 1989 (viz obrázek 1)) byl nastříhán restrikční endonukleasou Pstl a byl získán plasmid pIPTl ligací ipt genu do Pstl místa pro restrikční endonukleasu plasmidu pUC7 (Molecular Cloning, 2. vydání, svazek 1, 4.10). Z tohoto plasmidu byl ipt gen obsahující nativní • · · ·
promotor a nativní polyadenylační signál vystřižen restrikčními endonukleasami BamHI a Pstl a byl získán plasmid pIPT2 ligací ipt genu do BamHI-Pstl místa pro restrikční endonukleasu plasmidu pUC119 (získán od Takara Shuzo Co., Ltd.). Z tohoto plasmidu byly strukturální gen a nativní polyadenylační signál ipt genu vystřiženy restrikční endonukleasou Rsal a byl získán plasmid pIPT3 ligací ipt genu do Smál místa pro restrikční endonukleasu plasmidu pUC119. Dále, ipt gen insertovaný do pIPT3 byl vystřižen restrikčními endonukleasami BamHI a Sací a byl získán plasmid pIPT4 ligací fragmentu do BamHI-SacI místa pro restrikční endonukleasu plasmidového vektoru pBI121 (získán od Clontech Co.), který je použitelný pro zavedení genu do rostliny. Pokud je rostlina infikována A. tumefaciens nesoucí plasmid pIPT4, pak se T-DNA region, který existuje mezi LB místem a RB místem, zde region o přibližně 5 kb mající NPTII gen a ipt gen, stane integrovaným do chromosomu rostliny.
Tento plasmid byl zaveden do kmene JM109 E. coli (Escherichia coli) a byl uložen podle Budapešťské smlouvy jako E. coli JM109 (pIPT4) pod přírůskovým číslem FERM BP-5063.
Strategie pro konstrukci plasmidu pIPT4 je schematicky znázorněna na obrázcích 2 až 4. Mapa restrikčních endonukleas jeho T-DNA regionu je ukázána na obrázku 5. Na obrázcích 2 až 4 a 5 ukazují zakroužkovaná P a T.
·· ····
• · · · • · · · • · · · • · · · ·· ·· nativní promotor a nativní polyadenylační signál ipt genu samotného, v příslušném pořadí. 35S-P ukazuje 35S promotor viru květákové mozaiky a Nos-P ukazuje promotor genu pro nopalin syntetasu. T (obrázek 4) nebo Nos-T (obrázek 5) ukazuje polyadenylační signál genu pro nopalin syntetasu.
V tomto příkladu, jak je ukázáno na obrázku 5, pro MAI gen jako markerový gen, byl použit ipt gen, který udílí tvorbu ESP indukcí destrukce apikální dominance, a NPTII gen byl použit jako modelový požadovaný gen. ipt gen je členem onkogenú, které obsahuje patogeni A. tumefaciens. U rosliné buňky, do které je zaveden ipt gen, se vyvíjí diferenciace, která vede ke tvorbě ESP díky nadprodukci cytokininu, který je rostliným hormonem.
V tomto příkladu byl použit 35S promotor viru květákové mozaiky pro promotorovou sekvenci ipt genu a nativní polyadenylační signál ipt genu samotného byl použit pro terminační sekvenci.
II. Zavedení pIPT4 do Agrobacterium
A. tumefaciens kmen LBA4404 (získán od Clontech Co.) byl inokulován do 10 ml YEB kapalného kultivačního media (obsahujícího 5 g/litr hovězího extraktu, 1 g/litr kvasinkového extraktu, 1 g/litr peptonu, 5 g/litr sacharozy a 2 mM MgSCU, pH
7,2 při 22 °C (dále je používáno pH při 22 °C, pokuyd není jinak uvedeno)), a byl kultivován při • · · · · • · ·· • · · · » • · · · ·· ·· · ·· ···· • · · · · • · · · · • · · ··· · • · · · ·* ·· · °C dokud nebyla hodnota OD630 v rozmezí od 0,4 do 0,6. Potom byla kultura centrifugována při 6900 x g po 10 minut při 4 °C pro odběr buněk. Buňky byly suspendovány ve 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) a suspense byla centrifugována při 6900 x g po 10 minut při 4 °C. Potom byly odebrané buňky resuspendovány ve 200 μΐ YEB kapalného kultivačního media a tato suspenze byla použita jako roztok buněk pro zavedení plasmidu.
V 15 mililitrové trubičce (vyrobené Falcon) bylo 200 μΐ buněčného roztoku pro zavedení plasmidu smíseno s 6 pg plasmidu pIPT4 získaného ve výše popsaném kroku I a směs byla ochlazena namočením na 5 minut v ethanolu, který byl ochlazen kapalným dusíkem na asi 30 až 40 minut. Takto ochlazený roztok byl spolu s trubičkou postaven do vodní lázně o 29 °C po 25 minut. Potom bylo k němu přidáno 750 pl YEB kapalného kultivačního media a smísený roztok byl inkuhován při 29 °C po 1 hodinu za třepání. Tento roztok buněk byl umístěn na YEB agarové kultivační medium (obsahující 1,2 hmotnost/objem% agar a stejné přísady jako výše uvedené kultivační medium), ke kterému bylo přidáno 50 mg/litr kanamycinu a tento byl kultivován při 28 °C po 2 dny. Takto získané kolonie buněk byly inokulovány na YEB kapalné kultivační medium a byly dále kultivovány. Potom byl plasmid extrahován z buněk alkalickou metodou a byl štěpen restrikčními endonukleasami Pstl, BamHI a EcoRI. Takto získané fragmenty plasmidu byly analyzovány ·· ·· · ·· »····· • · · · · · · · ·· · ···· · · · ·· · • · · · · · · ·· ···· ···· · · · * · •· ·· ····· ·· · agarosovou gelovou elektroforesou a byly potvrzeno, že plasmid pIPT4 byl zaveden do A. tumefaciens kmen LBA4404.
III. Zavedení pIPT4 z Agrobacterium do tabáku
Zralé listy tabáku (Nicotiana tabacum cv. xanthi, jak je zde uvedeno znamená tabák tuto variantu, pokud není jinak uvedeno) kultivované ve skleníku byly ponořeny do 1% objem/objem vodného roztoku hypochloritu sodného pro sterilizaci a byly třikrát promyty sterilní vodou. Potom bylo střední žebro listu odstraněno pro vytvoření listových disků o přibližně 8 mm čtverečních. Takto získané listové disky byly ponořeny do buněčné suspenze A. tumefaciens kmene LBA4404, do kterého byl ve výše popsaném kroku II zaveden pITP4 na asi 1 minutu, a byly jím infikovány (kde suspenze byla ředěna sterilizovanou vodou na OD630 = 0,25 po kultivaci přes noc v YEB kapalném kultivačním mediu), a byly jím infikovány. Infikované listové disky byly umístěny na sterilizovaný filtrační papír pro odstranění jakýchkoliv extracelulárních buněčných suspenzí. Potom byly umístěny na hormonů prosté MS agarové kultivační medium (T. Murashige a F. Skoog, Physiol. Plant., svazek 15, str. 473, 1962 (vyrobený tak, že 0,8 % hmotnost/objem agar byl k němu přidán)) obsahující 50 mg/litr acetosyringonu tak, že zadní strana listu byla nahoře a byly kultivovány po 3 dny, při 25 °C při plném světle (kultivace explantátu, rostlině tkáně a rostliny byly provedeny za této teploty a světelných podmínek, pokud není uvedeno jinak). Takto kultivovaný listový disk byl potom
transplantován do hormonů prostého MS agarového kultivačního media obsahujícího pouze 500 mg/litr karbencilinu a kultivace pokračovala, nakonec bylo rediferencováno 22 vedlejších výhonků. Tyto vedlejší výhonky byly separovány a dále kultivovány v kultivačním mediu majícím výše uvedené složení za získání 6 ESP linií. Tyto ESP linie byly subkultivovány ve stejném kultivačním mediu každý měsíc a byly subkultivovány v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu neobsahujícím karbencilin několikrát 3 měsíce po infekci. Po proliferaci nebylo Agrobacterium pozorováno a byl proveden test na resistenci na kanamycin a PCR analýzy.
IV. Analýzy tabáku, do kterého byl gen zaveden
A. Test pro resistenci na kanamycin
ESP linií získaných ve výše uvedeném kroku III bylo kultivováno bez subkultivace. Listy vytvořené těmito ESP liniemi byly vystřiženy za tvorby listových disků o ploše přibližně 3 mm čtvereční. Takto získané listové disky byly umístěny na MS agarové kultivační medium (k němu byl přidán 1 mg/litr benzyl adeninu a 0,2 mg/litr kyseliny α-naftalenoctové) obsahující 200 mg/litr kanamycinu. Po kultivaci v tomto kultivačním mediu obsahujícím kanamycin po 1 měsíc byla tvorba ESP linií také pozorována na listových discích získaných od těchto ESP linií.
• ·
B. PCR analýzy
Chromozomální DNA byly získány od všech 6 ESP linií získaných ve výše uvedeném kroku III a geny do nich zavedené byly analyzovány PCR metodou.
Chromosomální DNA byla extrahována za použití následujícím způsobem modifikované CTAB metody.
Nejprve, přibližně 1 g listů vyvinutých z ESP byl rozmělněn za použití hmoždíře a paličky a byl suspendován v 5 ml pufru (obsahující 2% hmotnost/objem CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromid), 1,4 M NaCl, 0,2 % objem/objem β-merkaptoethanol, 20 mM EDTA a 100 mM Tris-HCl (pH 8,0)), který byl zahřátý na 60 °C.
Tato suspenze byla zahřáta na 60 °C po od 30 do 60 minut za mírného třepání a potom byla ochlazena na pokojovou teplotu. K této suspenzi byla přidána směs chloroformu a isoamyl alkoholu ve stejném objemu a suspenze byla jemně promíchána. Potom byla směs centrifugována při 1600 x g po 5 minut pro získání supernatantu. Potom byly přidány 2/3 objemu isopropyl alkoholu k supernatantu a toto bylo znovu jemně promícháno. Směs byla umístěna na ledu po 10 minut pro precipitací chromosomální DNA. Tato chromosomální DNA byla shromážděna centrifugaci při 1600 x g po 10 minut, takto získaná chromosomální DNA byla promyta 70% objem/objem ethanolem, potom sušena vakuem a rozpuštěna ve 300 μΐ TE (obsahujícím 10 mM Tris-HCl a 1 mM EDTA).
• · ···· ···· · · · • · · · · · · · · · • ·· ·· · · · · · ·» · ···· · · · ·· ·· ·· ··· ·· ·· *
Mezitím, pro detekci ipt genu PCR metodou byly použity páry primerů (oligonukletidy) pro syntesu za použití DNA syntezátoru (vyrobeného Applied Biosystems Co.). Pokud byly navázány na ipt gen, pak byla vzdálenost mezi dvěma primery přibližně 800 bp. Pro amplifikaci ipt genu byl 1 pg extrahované chromosomální DNA rozpuštěn v 50 μΐ smíšeného roztoku obsahujícího 0,2 μΜ těchto primerů, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8 při 25 °C), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCL2, 1% hmotnost/objem Triton X-100, 0,1 mM dNTP a 1,25 jednotek Taq polymerasy (získané od Cetus CO.). Potom byla směs zahřáta na 94 °C po 1 minutu a potom byly opakovány zahřívací cykly, konkrétně 94 °C po 1 minutu, 55 °C po 2 minuty a 72 °C po 3 minuty celkem 30-krát pro provedení reakce. Získaná reakční směs byla analyzována agarosovou gelovou elektroforesou pro detekci přítomnosti ipt genu v chromosomální DNA amplifikaci genu o přibližně 800 bp.
Výsledky jsou ukázány na obrázku 6. Jak je zřejmé z obrázku 6, amplifikace genu o přibližně 800 bp byla pozorována ve všech 6 ESP. Na obrázku 6, hodnoty ukázané na levé straně ukazují délku basí, které byly detekovány na přidaných proužcích (zde označovaných jako proužky) v e1ektroforese markéru DNA velikosti.
Srovnávací příklad 1
Analýza byla povedena s ohledem na 16 výhonků, které neměly schopnost tvorby ESP a byly získány od vedlejších výhonků
rediferencovaných z A. tumefaciens-infikovaných listů v kroku III příkladu 1. To znamená, že v době, kdy bylo 22 vedlejších výhonků kultivováno a bylo selektováno 6 ESP linií v kroku III příkladu 1, byly ty, které vykazovaly morfologicky normální výhonky (zde označované jako non-ESP) také zbaveny A. tumefaciens a podrobeny testu resistence na kanamycin stejným způsobem, jako v krocích III a IV příkladu 1. Dále, 9 non-ESP linií bylo podrobeno PCR analýze. Nicméně, s ohledem na tyto non-ESP linie, listové disky umístěné do kultivačního media obsahujícího kanamycin všechny zhnědly a zvadly po přibližně 3 měsících. Dále, v PCR analýze, amplifikace DNA fragmentu o přibližně 800 bp, který určival přítomnost ipt genu, nebyla detekována v žádné z analyzovaných devíti buněčných linií.
Výsledky PCR analýz jsou ukázány na obrázku 6.
Příklad 2
I. Konstrukce vektoru
Plasmid pHSG398 (získaný od Takara Shuzo Co., Ltd.) byl tráven restrikční endonukleasou BamHI. Lepivé konce produkované trávením byly pozměněny na tupě zakončené konce T4 DNA polymerasou I (velkou podjednotkou) a ligací těchto konců byl získán plasmid pNPHOO. To znamená, že plasmid pNPHOO byl pHSG398 bez BamHI místa pro restrikční endonukleasu. Mezitím, plasmid pCKR97 (T. Izawa et al., Mol. Gen. Genet., svazek 227, str. 391, 1991) byl • · • · · · · · · • · · t • · · ·· * tráven restrikční endonukleasou Pstl. Transposon Ac kukuřice byl vystřižen a insertován do Pstl místa pro restrikční endonukleasu pNPHOO za získání plasmidu pNPI102.
Potom, z plasmidu pIPT4 zkonstruovaného v příkladu 1 byl vystřižen 35S promotor viru květákové mozaiky a na něj navázaný ipt gen restrikční endonukleasou HindlII a Sací. Lepivé konce takto získaného fragmentu byly pozměněny na tupě zakončené konce T4 DNA polymerasou I a fragment byl insertován do HincII místa pro restrikční endonukleasu plasmidu pUC119 za získání plasmidu pNPHOl. Z tohoto plasmidu pNPIlOl byl znovu vystřižen 35S promotor viru květákové mozaiky a ipt gen restrikční endonukleasou Pstl a EcoRI a lepivé konce fragmentu byly pozměněny na tupě zakončené konce T4 DNA polymerasou I. Dále plasmid pNPI103 byl získán ligací fragmentu do tupě zakončeného místa pro restrikční endonukleasu BamHI pNPI102. To znamená, že v plasmidu pNPI103 existuje 35S promotor a ipt gen na něj navázaný ve starém BamHI místě pro restrikční endonukleasu bez transposonu Ac.
Požadovaný vektor byl získán roztřižením transposonu Ac obsahujícího 35S promotor viru květákové mozaiky a ipt gen z plasmidu pNPI103 s restrikční endonukleasou Pstl a insercí tohoto transposonu Ac do místa pro restrikční endonukleasu Ssel vektorového plasmidu pBI121. Tento byl označen jako plasmid PNPI106.
Tento plasmid byl také zaveden do kmene JM109 E. coli a byl uskladněn podle Budapešťské smlouvy jako E. coli JM109 (pNPI106) pod přírůstkovým číslem FERM BP-5064.
Strategie pro konstrukci plasmidu pNPI106 je schematicky znázorněna na obrázcích 7až 9. Mapa restrikčních endonukleas jeho T-DNA regionu je ukázána na obrázku 10. Na obrázcích 7 až 9 a 10 je terminální region transposonu Ac ukázán obrácenými černými trojúhelníčky, podle příslušnosti. Na obrázku 10 je Ac-P nativní promotor přítomný v Ac. Ostatní symboly jsou stejné jako na obrázcích 2 až 5.
Jak je jasné z obrázku 10 má tento plasmid ipt gen jako markerový gen a NPTII gen a GUS (β-galaktosidasa) gen jako model požadovaného genu v T-DNA regionu, konkrétně v regionu, který je integrován do chromosomu rostliny. Dále, ipt gen je přítomen jak insert v transposonu Ac. Protože buňky mající GUS gen metabolizují speciální substrát za produkce modrého pigmentu, může být exprese genu identifikována detekováním tohoto pigmentu Tak je GUS gen často používán pro expresi genu v rostlině.
II. Zavedení pNPI106 do tabáku a analýza tabáku, do kterého byl gen zaveden.
A. Zavedení pNPI106 do tabáku a testování na expresi zavedeného genu
Stejným způsobem jako v krocích II a III příkladu 1 byl pNPI106 zaveden do A. tumefaciens kmene LBA4404, a • · · · · · listové disky tabáku byly infikovány A. tumefaciens. Takto infikované tabákové listy byly inkubovány hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu obsahujícím 50 mg/litr acetosyringonu a potom v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu, do kterého bylo přidáno 500 mg/litr karbenci1 inu. Po dvou měsících takové kultivace bylo separováno 63 ESP linií.
Tyto ESP linie byly transplantovány v kultivačním mediu o stejné složení (hormonů prosté MS agarové kultivační medium obsahující 500 mg/litr karbenci1 inu). O jeden měsíc později byo mezi malými výhonky ESP vizuálně selektováno 9 výhonků (ty, které jsou generovány z ESP jsou zde nazývány jednoduše výhonky), které narostly dvakrát nebo vícekrát více ve srovnání s ostatními výhonky, u kterých nebyl růst postraních výhonků pozorován a u kterých se zdálo být ovlivnění ipt genem sníženo. Listy těchto výhonků byly podrobeny stejnému testu na resistenci na kanamycin jako byl proveden v kroku IV-A příkladu 1 a testu na expresi GUS genu (test na GUS aktivitu) založený na metodě podle Jefferson et al. Výhonky získané po odstřižení listů byly transplantovány do hormonů prostého MS agarového kultivačního media a byly kultivovány. O jeden měsíc pozzději byl pozorován tvar pro zjištění schopnosti tvořit ESP výhonků, což ukazuje na expresi ipt genu.
Výsledky jsou ukázány v Tabulce 1
Tabulka 1
Výsledky testu na expresi genu zavedeného do tabáku vektorem pNPIlOó
Výhonek Resistence na č. kanamycin
GUS akt ivi ta
Morfologie 1 měsíc po kultivaci příklad 2
9 +
+ +
+ +
+ +
+ +
ESP
ESP
ESP
ESP
ESP
ESP
ESP normální
ESP srovnávací příklad 2
- - normální
- - normální
- - normální
Poznámky: 1. Pro resistenci na kanamycin, + je resistentní a - je neres i s t entní
2. Pro GUS aktivitu + je aktivní a - je inaktivní
3. normální znamená jedinec, u kterého se vyvíjí dominantní růst apikálního výhonku a tvorba kořenů.
• · • · · · • · · · · ·« · · · · · · • · · · · · · · φ • · · · ····· ·<Jak je zřejmé z tabulky 1, ačkoliv má list výhonku č. 8 resistenci na kanamycin a GUS aktivitu, ESP není tvořen ani když je list kultivován po dobu 1 měsíce. To je pravděpodobně způsobeno tím, že ipt gen, který způsobuje tvorbu ESP je přítomen v insertované formě v transposonu Ac v plasmidu pNPI106. To znamená, ipt gen, který je zaveden do chromosomu v tabáku infekcí A. tumefaciens obsahujícím tento plasmid do tkáně a je exprivován v počátečním stadiu kultivace tkáně ihned po infekci je odstraněn spolu s Ac účinkem Ac v průběhu následující kultivace. Pokud jsou ve stejném vektoru NPTII gen a GUS gen insertovány do pozice, kde se nechovají integrálně s Ac, pak zůstávají tyto geny stále v chromosomu rostliny a jsou exprivovány.
Ačkoliv v tabulce 1 u výhonků č. 3, 5 a 6 je pozorována resistence na kanamycin a tvorba ESP, je pouze GUS aktivita negativní. To znamená, že u těchto výhonků není pouze GUS gen z genů zavedených za použití pNPI106 exprivován. Toto je považováno za následek chybné integrace, která proběhla, když byly tyto geny integrovány do chromosomu rostliny obsahujícho plasmid, který měl strukturu pNPI106 nebo podobnou. To znamená, pokud je gen zaveden prostřednictvím A. tumefaciensT-DNA region, jmenovitě, celý vnitřní region mezi RB a LB místem musí být normálně integrován do chromosomu rostliny.
Nicméně, tento region není někdy zcela integrován, ale je roztržen a je integrována deficitní část postrádající určitou část LB konců. V T-DNA regionu pNPI106 je GUS gen přítomen v nejbližší pozici k LB místu. V souladu s tím se soudí, že díky chybné integraci při zavedení genu je GUS gen integrován do chromosomu ve stavu, ve kterém je GUS gen roztrhán na kousky a jeho funkce je ztracena, nebo že GUS není plně insertován do svého místa, takže GUS gen není exprivován v těchto výhoncích a jeho aktivita není pozorována.
Fotografie výhonků č. 2 a č. 8 po jednoměsíční kultivaci jsou ukázány na obrázcích 11 a 12.
S ohledem na růst listu z výhonku č. 8 a na podrobení se testu resistence na kanamycin pokračovala kultivace dále po testu. Bylo získáno pět vedlejších výhonků z tohoto listu a všechny tyto byly non-ESP.
B. PCR analýzy
Na výhoncích č. 1 až 9 podle tabulky 1, po pozorování schopnosti tvořit ESP, byly provedeny PCR analýzy stejným způsobem jako v krkoku IV-B příkladu 1 pro další vyšetření přítomnosti ipt genu v chromosomu, což bylo provedeno.tak, že páry primerů, které byly projektovány pro navázání na NPTII gen a GUS gen v příslušném pořadí byly použity spolu s primery použitými v kroku IV-B příkladu 1. V případě, že tyto primery • · ·· ···· ···· · · · 9 ·· · ···· ··· ·· · • ·· · · ·· ·· ···· • · · · ··· · · «· ·· ····· ·· * byly použity, pak když je Ac a ipt gen do něj insertovaný (Ac-ipt genový komplex) excidován z T-DNA regionu pNPI106, je amplifikován DNA fragment o přibližně 3 kb v PCR. V souladu s tím, excise Ac-ipt genového komplexu z DNA může být detekována za použití této amplifikace jako indexu.
Výsledky PCR analýzy výhonku č. 8 jsou ukázány na obrázku 13, ve kterém jsou hodnoty ukázané na levé straně tytéž jako hodnoty na obrázku 6.
Z výsledků je zřejmé, že v chromosomální DNA extrahované z výhonku č. 8 je pozorována amplifikace DNA fragmentu o přibližně 3 kb, který označuje excisi Ac-ipt genového komplexu, zatímco amplifikace DNA fragmentu o přibližně 800 bp, který označuje přítomnost ipt genu pozorována není. Toto znamená, že ipt gen je excidován z chromosomální DNA tohoto výhonku spolu s Ac a že mizí.
Na druhé straně, s ohledem na výhonky č. 1 až 7 a 9, amplifikace DNA fragmentu o přibližně 3 kb nebyla detekována v žádných vzorcích chromosomální DNA z těchto výhonků, zatímco amplifikace DNA fragmentu o přibližně 800 bp byla detekována ve všech vzorcích chromosomální DNA z těchto výhonků. V souladu s tím se soudí, že v těchto výhoncích je ipt gen stále přítomen v chromosomální DNA spolu s Ac.
·· ···· • ·
Srovnávací příklad 2
Kultivace A. tumefaciens infikovaných listů v kroku II-A příkladu 2 byly separovány 3 non-ESP rediferencované listy spolu s ESP a byly podrobeny testu resistence na kanamycin, testu GUS aktivity a vizuálnímu pozorování po 1 měsíc kultivace a PCR analýze stejným způsobem jako v II příkladu 2.
Výsledky jsou ukázány v tabulce 1. Výhonky získané z těchto non-ESP neměly jakoukoliv resistenci na kanamycin, GUS aktivitu ani ESP vytvářející schopnost. Kromě toho, amplifikace DNA fragmentů o přibližně 800 bp a přibližně 3 kb nebyla detekována v PCR analýze.
Příklad 3
Dále, kultivace 63 ESP linií separovaných v příkladu 2 pokračovala v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu. Asi o dva měsíce později po separaci bylo ze 2 ESP linií získáno celkem sedm výhonků č. 13 - 1 až 13 - 3 a 14 - 1 až 14 - 4, což byly normální výhonky, které bylo možné identifikovat visuálně, to zmámená, že vykazovaly apikální dominanci. Tyto výhonky byly separovány pro transplantaci do kultivačního media majícího výše uvedené složení a potom byly normálně kultivovány a zakořeněny. Z těchto byly jedinci získaní z výhonků č. 13 - 1 a 14 - 1 podrobeny PCR analýze stejným způsobem jako v kroku II-B příkladu 2. Výsledkem bylo, že amplifikace DNA fragmentu o přibližně 800 bp nebyla pozorována ani v jednom z výhonků č. 13 - 1 a 14 - 1.
·· ····
Kromě toho, amplifikace DNA fragmentu o přibližně 3 kb byla pozorována v obou těchto výhoncích. Tak bylo určeno, že ipt gen byl excidován z chromosomální DNA těchto jedinců spolu s Ac a že není přítomen. Výsledky jsou ukázány na obrázku 14, ve kterém jsou hodnoty ukázané na levé straně tytéž jako hodnoty na obrázku 6. Dále, exprese GUS genu byla detekována u všech jedinců získaných ze sedmi výhonků.
Obrázek 15 ukazuje stav normálního výhonku diferencovaného z ESP.
Příklad 4
List získaný z výhonku, který je ukázán jako výhonek č. 7 v tabulce 1 spolu s 9 výhonky vybranými v příkladu 6 byl kultivován v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu po dobu asi 1 měsíce.Jeden normální výhonek byl vizuálně separován ze 6 vedlejších výhonků, které byly rediferencovány z kulivovaného listu. Tento výhonek byl transplantován do kultivačního media majícího výše uvedené složení a potom byl normálně kultivovány a zakořeněn. Dále, tento jedinec byl podroben PCR analýze stejným způsobem jako v kroku II-B příkladu 2 a na základě toho, že nebyl objeven DNA fragment o přibližně 800 bp a amplifikace DNA fragmentu o přibližně 3 kb bylo určeno, že ipt gen byl excidován z chromosomální DNA těchto jedinců spolu s Ac a ·· ·· · ·· ······ • · · · · · · · · · · ···· ··· ·· · • ·· · · ·· · · ···· ···· ··· ·· ·· ·· ··· ·· ·· · že není přítomen. Výsledky jsou ukázány na obrázku 16, ve kterém jsou hodnoty ukázané na levé straně tytéž jako hodnoty na obrázku 6. Dále, exprese GUS genu byla také detekována u stejného jedince.
Příklad 5
I. Separace místně specifického rekombinačního systému (pSRl systému) z kvasinky
Kvasinka (Zygosaccharomysces rouxii (získaná od Institute for Fermentation)) byla inokulována do 5 ml YPAD kapalného kultivačního media (obsahujícího 10 g/litr kvasinkového extraktu, 20 g/litr polypeptonu, 0,4 g/1 adeninu a 20 g/litr glukosy) a byla kultivována při 30 °C po 24 hodin. Kultivační roztok byl centrifugován při 6900 x g po 3 minuty při 20 °C pro odběr buněk (dále byly buňky odebírány za stejných podmínek). Získané buňky byly suspendovány ve 2 ml roztoku obsahujícího 0,2 m Tris-HCl (pH 8,0) a 5% objem/objemmercaptoethanol. Buněčná suspenze byla umístěna na 30 minut do 25 °C a občas byla jemně promíchána a potom byly buňky odebrány. Dále, odebrané buňky byly suspendovány v roztoku (pH 6,8) obsahujícím 2,5 mg/ml Zaimolyeis-20T (získán od SEIKAGAKU CORPORATION), 10% hmotnost/ohjem sorbitol a 5% hmotnost/objem KPO4 . Suspense byla umístěna v 30 °C po 90 minut a recentrifugována pro opětovné získání buněk. Získané buňky byly resuspendovány v 1 ml roztoku obsahujícího 0,2 M NaCl, 0,1 M EDTA, 5% hmotnost/objem SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) a bylo přidáno 20 Proteinasy K • · *·· · do koncentrace 20 mg/ml. Smíšený roztok byl umístěn do 60 °C po 1 hodinu, potom vrácen do pokojové teploty a extrahován směsí fenolu a chloroformu a potom chloroformem do čistoty. Takto získaný supernatant byl přidán ke stejnému objemu isopropanolu pro precipitaci chromosomální DNA a plasmidu pSRl. Směs byla centr ifugována při 6900 x g po 10 minut při 4 °C pro odběr DNA a odebraná DNA byla promyta 70% objem/objem ethanolem, potom sušena vakuem a rozpuštěna ve 100 μΐ TE.
Za použití takto extrahované DNA (směsi chromosomální DNA a plasmidu pSRl) jako templátu byl pouze místně specifický rekombinační systém, který byl přítomen v plasmidu pSRl (zde označovaný jako pSRl systém amplifikován PCR metodou. pSRl systém se skládá z R genu, což je rekombinasový gen a rekombinační sekvence, Rs, a jejich DNA sekvence, která již byla určena (H. Araki et al., J. Mol. Biol., svazek 182, str. 191, 1985). V předkládaném vynálezu byl pro amplifikaci R genu syntetizován primer, ve kterém bylo přidáno Xbal místo pro restrikční endonukleasu na 5'-polohu 22 baží, konkrétně 5596.
- 5617. basí v sekvenci plasmidu pSRl (5'-CCTCTAGAATGCAATTGACCAAGGATACTG-3') a primer, ve kterém bylo přidáno Sací místo pro restrikční endonukleasu na 5'-polohu 22 baží, konkrétně 4126. - 4147. bází v sekvenci plasmidu pSRl (5'-CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3'). Na druhé strapě, pro • · ·· · ·· ······ ···· ···· · · · ···· ··· ··· • · · ·· ·· ·· ···· ···· ··· ·· ·· ·· ··· ·· ·· · amplifikaci Rs byly syntetizovány dva páry primerů každý obsahující 30 bází (celkem čtyř typů). To znamená, že jeden pár byl složen z primeru, ve kterém tři z bází 287 - 316 sekvence plasmidu pSRl byly odstraněny a bylo zavedeno Ssel místo pro restrikční endonuklaesu (5'- AGGATTGAGCTACTGGACGGGAATCCTGCA-3') a primeru, ve kterém čtyři z basí 690 - 719 sekvence plasmidu pSRl byly odstraněny a bylo zavedeno HindlII místo pro restrikční endonuklesu a Xhol místo pro restrikční endonuklaesu (5' — CAACTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3'). Rs, který byl amplifikován s touto sadou primerů byl nazván Rsl. Druhý pár byl složen z primeru, ve kterém tři z basí 287 - 316 sekvence plasmidu pSRl byly odstraněny a bylo zavedeno Xhol místo pro restrikční endonukleasu a EcoRI místo pro restrikční endonukleasu (5'— AGGATTGAGCTACTCGAGGGGAATTCTGGA-3') a primeru, ve kterém pět z basí 688 - 717 sekvence plasmidu pSRl bylo odstraněno a bylo zavedeno Ssel místo pro restrikční endonukleasu (5'— ACTGGACCAATCCCTGCAGGTCGTAGTCAA-3').Rs, který byl amplifikován s touto sadou primerů byl nazván Rs2.
Pro amplifikaci R genu a Rs byl 1 μΐ extrahovaného roztoku DNA přidán ke každým 50 pl smíšeného roztoku použitého v kroku IV-B příkladu 1, který obsahoval 0,2 μΜ každé sady primerů v příslušném pořadí. Cyklus zahřívání o třech složkách, jmenovitě, při 95 °C po 30 sekund, při 55 °C po 30 sekund a při 72 °C po 1,5 minuty byl se směsí opakován celkem 30-krát. Takto získaná • · ·
·· ·· reakční směs byla analyzována agarosovou gelovou elektrolysou pro potvrzení amplifikace R genu a Rs.
II. Konstrukce vektoru
Rsl amplifikovaný PCR metodou byl tráven restrikčními endonukleasami Pstl a Xhol a plasmid pNPI126 byl získán insercí tohoto Rsl do Pstl-Xhol místa pro restrikční endonuklaesu pSL1180 (získán od Pharmacia Biotech Co.).
Potom, pro eliminaci EcoRI místa pro restrikční endonukleasu a HindlII místa pro restrikční endonukleasu pHSG398 bylo v sekvenci opakováno trávení těmito restrikčními endonukleasami, změna trávených konců na tupě zakončené konce T4 polymerasou I (velkou podjednotkou) a ligace tupě zakončených konců. Tímto způsobem byl získán plasmid pNPI121, ve které byla tato místa pro restrikční endonukleasy eliminována. Plasmid pNPI127 byl produkován trávením Rs2 amplifikovaného PCR metodou restrikční endonukleasou Xhol a Pstl a insercí tohoto Rs2 do Sall-Pstl místa pro restrikční endonukleasu plasmidu pNPI121.
Plasmid pNPI128 byl získán vystřižením Rsl z pNPI126 restrikčními endonukleasami Smál a Spěl a insercí tohoto fragmentu do Smal-Xbal místa pro restrikční endonukleasu pNPI127.
• · · · ·· ··
R gen amplifikovaný PCR metodou byl tráven restrikčními endonukleasami Xbal a Sací a byl insertován do Xbal-SacI místa pro restrikční endonukleasu pHSG398. Takto získaný plasmid byl označen pNPI124.
Potom byl pBI221 (získaný od Clontech Co.) tráven restrikční endonukleasou Pstl. Trávené konce byly pozměněny na tupě zakončené konce a potom ligovány výše uvedeným způsobem. Tak byl získán plasmid pNPIlll, ve kterém byla eliminována Ssel a Pstl místa pro restrikční endonukleasu. Potom byl R gen vystřižený z pNPI124 restrikčními endonukleasami Xbal a Sací insertován do Xbal-SacI místa pro restrikční endonukleasu pNPIlll nahrazujícího GUS gen za produkce plasmidu pNPI125. Dále, 35S promotor viru květákové mozaiky, R gen navázaný na promotor a polyadenylační signál nopalin syntetasy byly vystřiženy restrikčními endonukleasami HindlII a EcoRl a byly insertovány do HindlII-EcoRI místa pro restrikční endonukleasy pNPI128 za získání plasmidu pNPI129.
pNPHOl byl tráven restrikční endonukl easou Smál a 5'-fosforylovaný HindlII linker (získaný od Takara Shuzo Co., Ltd.) byl insertován do místa trávení a byl získán plasmid pNPI122. To znamená, že tento pNPI122 je plasmidem, ve kterém bylo Smál místo pro restrikční endonukleasu pNPIlOl nahrazeno HindlII místem pro restrikční endonukleasu. Dále, pNPI122 byl tráven restrikční endonukleasou Pstl a trávené konce byly pozměněny na tupě zakončené konce • 4
·· · · · · · • · · · · ·
4 · 4 4 4 4 4 • · · · · ··· 44 ·· 4 a potom ligovány za produkce plasmidu pNPI123, ve kterém byla eliminována Ssel a Pstl místa pro restrikční endonukleasu. Z tohoto plasmidu byl 35S promotor viru květákové mozaiky a ipt gen na něj navázaný vystřižen restrikční endonukleasou HindlII a byl insertován do HindlII místa pro restrikční endonukleasu pNPI129 za získání plasmidu pNPI130.
Požadovaný vektor byl získán vystřižením fragmentu obsahujícho ipt gen a R gen, na ně navázaný 35S promotor viru květákové mozaiky, v příslušném pořadí a Rs přítomné na obou koncových částech těchto genů restrikční endonukleasou Pstl a insercí tohoto fragmentu do Ssel místa pro restrikční endonukleasu v pBI121. Takto získaný plasmid byl označen pNPI132.
Tento plasmid byl také zaveden do kmene JM109 E. coli (Escherichia coli) a byl uložen podle Budapešťské smlouvy jako E. coli JM109 (pNPI132) pod přírůskovým číslem FERM BP-5065.
Strategie pro konstrukci plasmidu pNPI132 je schematicky znázorněna na obrázcích 17-19. Mapa restrikčních endonukleas jeho T-DNA regionu je ukázána na obrázku 20. Na obrázcích 17 až 19 a 20 ukazují šrafované trojúhelníčky rekombinační sekvenci Rs odvozenou od plasmidu pSRl kvasinky a orientaci této sekvence. Ostatní symboly jsou stejné jako na obrázcích 2 až 5..
Jak je jasné z obrázku 20, plasmid pNPI132, stejně jako plasmid pNPI106, má ipt gen jako markerový gen a NPTII gen a GUS • · · · · • · · · · • · « ··· · • · · · • ·« ·· t gen jako model požadovaného genu v T-DNA regionu. Nicméně, v tomto případě, region mezi dvěma rekombinačními sekvencemi Rs pSRl systému se chová jako odstranitelný DNA element. Proto, ipt gen je insertován tak, aby byl udržován dvěma stejně směřovanými sekvencemi.
III. Zavedení pNPI132 do tabáku a analýza tabáku, do kterého byl gen zaveden
Stejným způsobem jako v krocích II a III příkladu 1 byl plasmid pNPI132 zaveden do A. tumefaciens kmene LBA4404, a listové disky tabáku (Nicotiana tabacum cv. SRÍ) byly infikovány A. tumefaciens. Takto infikované tabákové listy byly inkubovány hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu obsahujícím 50 mg/litr acetosyringonu a potom v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu, do kterého bylo přidáno 500 mg/litr karbenci1 inu.
O měsíc později byly kultivované listy transplantovány do kultivačního media stejného složení a kultivace pokračovala po dobu 1 měsíce. Potom bylo separováno 48 ESP linií.
Tyto ESP linie byly znovu transplantovány v kultivačním mediu stejného složení a kultivace pokračovala. Přibližně o.jeden měsíc později (jmenovitě, přibližně 3 měsíce po infekci A. tumefaciens) byly výhonky, u kterých bylo vizuálně detekováno, že mají normální morfologii, generovány ze sedmi z 48 ESP linií. Tyto ·· ·· • · · · • · ·· • · · · ·· ·· • · · • · • ·· ·· ···· • · · • · · ··· · • · ·· · výhonky byly separovány a transplantovány do kultivačního media o stejném složení a potom mohly být získáni normální jedinci.
Tito jedinci byly podrobeni PCR analýze stejným způsobem jako v kroku II-B příkladu 2, za použití páru primerů pro detekci GUS genu spolu s primery použitými v kroku II-B příkladu 2.
Provedením PCR za použití těchto primerů byl DNA fragment o přibližně 800 bp amplifikován, pokud byl ipt gen přítomen; DNA fragment o přibližně 3 kb byl amplifikován, pokud byl ipt gen excidován z T-DNA regionu plasmidu pNPI132 díky excisi části vymezené Rs (tyto výsledky jsou stejné jako v analýze kroku II-B v příkladu 2); a DNA fragment o přibližně 1,7 kb byl amplifikován, pokud byl přítomen GUS gen. Výsledky jsou ukázány na obrázcích 21 - 23 a tabulce 2. V obrázcích 21 - 23 jsou hodnoty ukázané na levé straně tytéž jako hodnoty na obrázku 6.
Tabulka 2
Výsledky analýzy transgenního genu v tabáku, do kterého byl gen zaveden vektorem pNPI132
ESP linie Jednotí ivá
č. rostlina č
15 1
2
16 1
17 1
18 1
19 1
2
20 1
2
21 1
re ipt re GUS
800 bp 3 kb 1,7 kb
- + +
- + +
- + +
- + +
- + +
- + +
- + +
- + +
- + +
- + +
Poznámky: + ukazuje, že je amplifikován korespondující fragment a - ukazuje, že není amplifikován korespondující fragment.
Jak je jasné z tabulky 2, přítomnost ipt genu, který byl markerovým genem, nebyla detekována v žádném chromosomu od jednotlivců, kteří byly vybráni pouze vizuálním pozorováním jejich morfologie a místo toho byla detekována amplifikace DNA fragmentu, který ukazuje excisi ipt genu. Kromě toho, přítomnost GUS genu použitého jako požadovaný gen byla detekována u všech j ednot1 ivcú.
Na druhé straně byla vyšetřována resistence na kanamycin za použití koncových pupenů od jednotlivců, kteří byly zísáni z non ESP diferenciace simultáně se 48 ESP liniemi a vykazovali normální prodlužování a zakořeňování, kdy toto vyšetření bylo provedeno za použití hormonů prostého MS agarového media obsahujícího 200 mg/1 kanamycinu. Bylo zjištěno, že dvě z těchto 16 jedinců mají resistenci na kanamycin.
Dále, tyto na kanamycin resistentní jedinci byly dále vyšetřováni podrobením PCR analýze spolu se třemi jedinci vybranými ze 14 na kanamycin citlivých jedinců stejným způsobem jako byl použit pro jedince získané z ESP. Obr. 24 ukazuje výsledky, kde jsou hodnoty ukázané na levé straně tytéž jako hodnoty na obrázku 6.
Jak obrázek 24 jasně ukazuje, každý z těchto dvou na kanamycin resistentních jedinců vykazoval amplifikaci DNA fragmentu, který ukazoval excisi regionu obsahujícího ipt gen a vymezeného Rs a přítomnost GUS ···· · · · ··· • ·· · · ·· ·· · · · · • · · · · · · · · • · · · ·· · ·· it · genu. Tak bylo ověřeno, že geny pocházející z pNPI132 byly integrovány do chromosomu. Oproti tomu, žádná taková amplifikace nebyla pozorována u tří na kanamycin citlivých jedinců. Dále, žádný z těchto jedinců (jmenovitě, ani na kanamycin resistentní jedinci, ani na kanamycin citlivý jedinci) nevykazoval amplifikaci DNA fragmentu ukazujícího přítomnost ipt genu.
Je předpokládáno, že tito na kanamycin resistentní jedinci získaní ze kmene postrádajícího schopnost tvořit ESP, stejně jako na kanamycin citlivý jedinci, pocházejí z buněk, do jejichž chromosomu nebyl zaveden pNPI132 infekcí A. tumefaciens. Na základě tohoto předpokladu, není možné, aby pocházející z tohoto vektoru byly obsaženy v chromosomu. Kromě toho, je nesmyslné, aby se jedinci, kteří namají ipt gen, ale obsahují NPTII gen (jak je ukázáno skutečností, že tito jedinci byly resistentní na kanamycin) a GUS gen, oba v úplné formě v chromosomu, objevovali v takové frekvenci s ohledem na tyto geny pocházející ze stejného vektoru.
Je možné soudit, že u těchto na kanamycin resistentních jedinců byl pNPI132 někdy zaveden do chromosomů. To znamená, je míněno, že T-DNA region pNPI132 byl někdy zaveden do chromosomu infekcí A. tumefaciens, ale že excesivně účinná funkce pSRl systému použitého pro tento vektor indukovala excisi ipt genu
před tvorbou ESP po infekci A. tumefaciens. Výsledkem je, že NPTII gen a GUS gen exklusivně zůstávají v chromosomu. Fakt, že na kanamycin resistentní jedinci vykazovali v PCR analýze excisi regionu obsahujícího ipt gen a vymezeného Rs také podporuje tento závěr.
Příklad 6
I. Konstrukce vektoru
Rol geny (S. Kiokawa, Plant Physiol., svazek 104, str. 801, 1994) obsahující rolA, rolB a rolC a mající celkovou velikost 7,6 kb, které byly insertovány do EcoRI místa pro restrikční endonukleasu pBluescriptlI SK+ (vyrobeného Toyobo Co., Ltd.), byly vystřiženy restrikční endonukleasou EcoRI. Tento fragment byl insertován do místa pro restrikční endonukleasu EcoRI pNPI129 za vzniku pNPI700.
Z tohoto plasmidu pNPI700 byly rol geny, 35S promotor viru květákové mozaiky, R gen navázaný na promotor a Rs přítomný na obou koncích těchto genů vystřiženy restrikční endonukleasou Ssel a byly insertovány do místa pro restrikční endonukleasu Ssel pBI121 za získání požadovaného plasmidu pNPI702.
Plasmid pNPI702 byl také zaveden do kmene JM109 E. coli (Escherichia coli) a byl uložen podle Budapešťské smlouvy jako E. coli JM109 (pNPI702) pod přírúskovým číslem FERM BP-5066.
• · · ·· ··
Strategie pro konstrukci plasmidu pNPI702 je schematicky znázorněna na obrázku 25. Mapa restrikčních endonukleas jeho T-DNA regionu je ukázána na obrázku 26. Symboly na obrázcích 25 a 26 jsou stejné jako symboly na obrázcích 2 až 5.
Jak je jasné z obrázku 26 je plasmid pNPI702 podobný plasmidu pNPI132, pouze markerový gen byl zaměněn z ipt genu na rol geny. Rol geny použité pro tento vektor jsou přirozeně přítomny v T-DNA A. rhizogenes. Je známo, že pokud jsou rol geny zavedeny do rostlině buňky, pak jsou generovány vlasaté kořeny v rostlině tkáni a že rostliny regenerované z těchto vlasových kořínků vykazují morfologické abnormality jako je zakrslost a podobně.
II. Zavedení pNPI702 do tabáku a analýza tabáku, do kterého byl gen zaveden
Stejným způsobem jako v krocích II a III příkladu 1 byl plasmid pNPI702 zaveden do A. tumefaciens kmene LBA4404, a listové disky tabáku byly infikovány A. tumefaciens.
Takto infikované tabákové listy byly inkubovány hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu obsahujícím 50 mg/litr acetosyringonu na tmavém místě po 3 dny a potom v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu, do kterého bylo přidáno 400 mg/litr ticarcilinu. Po asi 15 dnech od počátku kultivace byla pozorována diferenciace vlasových kořenů. Vlasové kořínky byly separovány jeden za druhým,
umístěny do výhonky indukujícího kultivačního media (MS agarové kultivační medium obsahující 0,1 mg/litr α-naftalenacetoctové kyseliny, 2,0 mg/litr henzyladeninu a 400 mg/litr ticarci1 inu). Mezi rediferencovanými výhonky byly vizuálně vybráno 18, o kterých se soudilo, že mají normální morfologii, a byly podrobeny PCR analýze stejným způsobem jako v kroku II-B příkladu 2, za použití primerů pro detekci excise regionu obsahujícího rol geny a vymezeného Rs prostřednictvím amplifikace DNA fragmentuo přibližně 3 kb (se stejnými primery jako byly použity v příkladech 2 až 5 a ve srovnávacím příkladu 2) a primerů pro detekci přítomnosti rol genů prostřednictvím amplifikace DNA fragmentu o přibližně 1,1 kb. Výsledkem bylo potvrzeno, že region obsahující rol geny a vymezený Rs byl excidován z chromosomu 9 výhonků.
Příklad 7
Za použití vektoru pNPI106 konstruovaného ve výše uvedeném příkladu 2 byla hybridní osika (Populus Sieboldii x Populus grandidentata; dřevina) podrobena zavedení genu.
Kmen hybridní osiky kmene Y63 (získáné z pokusného lesa Akita Jujo Chemicals Co., Ltd.) kultivovaný ve sterilní nádobce byl naříznut bezchybným řezem délky 5 mm. Potom byl dále vertikálně naříznut na dva kusy pro použití jako vzorků a vzorky byly infikovány A. tumefacens kmene LBA4404 se zavedeným pNPI106 stejným
způsobem jako v kroku příkladu 1. Po infekci byl řez kmene umístěn v hormonů prostém MS agarovém kultivačním mediu (obsahujícím 2 % hmotnost/objem sukrosu a 0,8 % hmotnost/objera agar), ke kterému bylo přidáno 40 mg/litr acetosyringonu a zde byl kultivován po 3 dny. Potom byl transplantován do stejného media, které obsahovalo 500 mg karbencilinu místo acetosyrigonu a zde byl dále kultivován. Modifikované MS kultivační medium zde použité je připravené změnou koncentrací amoniakového dusíku dusičnanového dusíku, které jsou obvyklé pro MS kultivační medium v příslušném pořadí na 10 mM a 30 mM, v příslušném pořadí,.
Po asi dvou měsících byla náhodná očka rostoucí z tohoto řezu separována a dále kultivována po 2 měsíce. Tak bylo získáno 6 ESP linií. Tyto kmeny byly dále subkultivovány a o asi 4 měsíce později (t.j. asi 8 měsíců po infekci A. tumefaciens) byly poprvé pozorovány morfologicky normální výhonky rostoucí z ESP. Potom byly tyto výhonky transplantovány do 2/3 ředěného MS gellan gum media (obsahuje 2 % hmotnost/objem sacharozu a 0,3 % hmotnost/objem gellanová guma), do kterého bylo přidáno 0,05 mg/litr IBA (kyselina indolmáselná) a zde byly kultivovány. Tak bylo získáno celkem sedm normálních jednotlivě rostoucích oddenků ze 2 ESP linií během 10 měsíců po infekci A. tumefaciens.
Tito jedinci byly potom podrobeni PCR analýze stejným způsobem jako v kroku III příkladu 5.
Výsledkem bylo, že ipt gen nebyl detekován u ani jednoho z nich. Na druhou stranu, přítomnost GUS genu byla detekována u dvou z těchto jedinců. Tak bylo potvrzeno, že vektor podle předkládaného vynálezu bude účine fungovat také u dřevin.
Mimochodem, u zbývajících pěti normálních jedinců byla detekována pouze čáwst GUS genu. Zdá se, že u takových jedinců, když byl transposon Ac zavedený vektorem pNPI106 excidován z chromosomu spolu s ipt genem, byl GUS gen lokalizovaný v jejich sousedství zahrnut do excise a tak byl roztržen.
Obrázek 27 ukazuje stav normálního výhonku diferencovaného z ESP.
Příklad 8
Normální jedinci (získaní cestou ESP) mající geny zavedené pNPI132 v příkladu 5 byli dále podrobeni zavedení genu za použití vektoru podle předkládaného vynálezu.
GUS gen pNPI132 byl nahrazen HPT genem (gen resistence na hygromycin). Za použití takto získaného vektoru (pNPI140, obrázek 28) byly výše uvedení normální jedinci podrobeni zavedení genu stejným způsobem jako v kroku II a III příkladu l.Tak bylo získáno 10 ESP linií 40 dní po infekci A. tumefaciens, které měly zavedený tento vektor. Tyto ESP linie byly separovány, transplantovány do kultivačního media stejného
složení (hormonu prosté MS agarové kultivační medium obsahující 500 mg/litr karbenci 1 inu) a zde byly dále kultivovány. Výsledkem bylo, že diferenciace výhonků, které měly vizuálně normální morfologii, byla pozorována v jedné z těchto linií za 20 dní (jmenovitě, asi 2 měsíce po infekci A. tumefaciens).
Jeden z takto diferencovaných normálních výhonků byl podroben PCR analýze stejným způsobem jako v kroku IV-B příkladu 1.
Obrázek 29 ukazuje výsledky. Je třeba zaznamenat, že zde bylo využito páru primerů projektovaných pro vazbu na na NPTII gen a HPT gen, v příslušném pořadí, pro detekování excise regionu obsahujícího ipt gen a vymezeného Rs, z chromosomální DNA a jiného páru primerů pro detekování přítomnosti HPT genu (detekovaného prostřednictvím amplifikace DNA fragmentů o přibližně 4 kb a přibližně 1 kb, v příslušném pořadí), kromě primerů použitých v kroku IV-B příkladu l.Na obrázku 29 jsou hodnoty ukázané na levé straně stejné jako hodnoty ukázané na obrázku 6.
Jak je na obrázku 29 jasně ukázáno, v PCR analýze vykazovala chromosomální DNA extrahovaná z výhonků amplifikaci DNA fragmentu o přibližně 4 kb, který ukazuje, že ipt gen byl excidován díky excisi regionu vymezeného Rs a amplifikace DNA fragmentu o přibližně 1 kb, který ukazuje na přítomnost HPT genu. Na druhé straně, amplifikace
• · · · · ·
DNA fragmentu o přibližně 800 bp, který ukazuje na přítomnost ipt genu, nebyla v této DNA detekována. Tyto výsledky naznačují, že ipt gen, který byl zaveden do chromosomální DNA tohoto výhonku, byl excidován díky excisi regionu vymezeného Rs a tak zmizel, zatímco HPT gen stále zůstal v DNA.To znamená, že do jednotlivce se zavedenými požadovanými geny (t.j. HPT genem a GUS genem) prostřednictvím pNPI132 byl dále zaveden nový požadovaný gen (t.j. HPT gen), za použití vektoru, kde konstrukce týkající se požadovaného genu byla jedinečná (t.j. stejný ipt gen použitý jako markerový gen) s opakováním kultivace, vizuální selekce a separace. Kromě toho, výsledky ukázaly, že je možné zavedení třetího, čtvrtého nebo dalších požadovaných genů za použití stejného markerového genu.
Jak je jasné z výše popsaných příkladů, získané ESP linie už měly ipt gen ve svých chromosomech jak je ukázáno na obrázku 6. Dále, ESP, které vykazovaly značné morfologické abnormality, takže mohly být vizuálně identifikovány, vykazovaly resistenci na kanamycin, bez vyjímky, při expresi NPTII genu, který byl modelovým požadovaným genem a který byl zaveden spolu s ipt genem. Toto dokazuje, že takový MAI gen je plně dostupný jako markerový gen pro zavedení genu do rostliny, a že vektor podle předkládaného vynálezu obsahující tento MAI gen jako markerový gen je také použitelný jako vektor pro zavedení genu do rostliny.
Pokud je gen zavedený do rostliny za použití vektoru pNPI106, ve kterém byl ipt gen integrován v transposonu Ac, pak byly získány výhonky, které ztratily svou ESP vytvářející schopnost v důsledku chybění ipt genu v chromosomu, zatímco si uchovávaly charakteristiky dané požadovaným genem (NPTII gen a/nebo GUS gen), z tkáně, která tvořila ESP v počáteční stadiu kultivace ihned po zavedení genu, jak je ukázáno v tabulce 1 a obrázcích 13, 14 a 16. Mimoto, morfologie této získané tkáně (t.j. výhonků a podobně, které ztratily schopnost tvořit ESP) může být vizuálně identifikována jak je ukázáno na obrázcích 15 a 27. Dále, pokud byly tyto selektovány, separovány a kultivovány, pak byly získáni zakořenění jedinci s normální morfologií. Dále, tkáně, které byly rediferencovány ze tkáně získané z výhonků, které ztratily schopnost vytvářet ESP také vykazovaly normální morfologie bez schopnosti tvořit ESP. Toto potvrzuje, že takové výhonky a podobně se skládají z uniformních buněk.
Stejné výsledky byly také pozorovány, pokud bylo použito odstranitelného DNA eementu odvozeného od místně specifického rekombinačního systému a pokud byly použity rol geny jako MAI geny. To znamená, že pokud byl gen zaveden do rostliny za použití vektoru, ve kterém byla konstrukce vektorů, týkajících se transposonu nebo transposonů a ipt genu
« · · ·
• · · · · · použitých v příkladech 1 až 4 a 7 nahrazena tímto příbuzným výše uvedeným rekombinačním systémem a/nebo rol geny jak je popsáno v příkladech 5 a 6, pak byly získány morfologicky normální tkáně a rostliny, ve kterých nebyl MAI gen přítomen v jejich chromosomu, zatímco požadovaný gen byl zachován, ze tkáně, která vykazovala abnormální morfologii ihned po zavedení genu (obrázky 21 - 23, tabulka 2). Dále, je také možné mnohonásobné zavedení požadovaných genů do stejného jedince opakováním kroků zavedení genu, kultivace a vizuální selekce za použití vektoru, ve kterém je konstrukce týkající se požadovaného genu jedinečně změněna, zatímco je použit stejný morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen (příklad 8, obrázek 29).
V souladu s tím, pokud je takový vektor použit, ve kterém je MAI gen použit jako markerový gen a je insertován do pozice, kde se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem, pak je získána tkáň tvořená pouze buňkami, ve kterých požadovaný gen sám zůstává v chromosomu a podobně a uchovává si svou funkci, za provedení následujících kroků: (1) kultivace buněk ihned po zavedení genu a vizuální selekce morfologicky abnormální tkáně, která se objeví během kultivace, (2) další kultivace morfologicky abnormální tkáně a vizuální selekce morfologicky normální tkáně, která se objeví během kultivace. Dále, rostlina tvořená pouze ·· ··
I · · 4 » · ·· » · · 4 » · · 4 ·· ·· ·» · ·· ·· ···· • · · • · · ·· · · • · takovými buňkami může být také získána z morfologicky normální tkáně.
Kromě toho, pokud byl použit odstranitelný DNA element odvozený od místně specifického rekombinačního systému, pak protože se jeho excise vyskytovala rychle a v dosti vysoké frekvenci, mohla být morfologicky normální tkáň, která vzešla z morfologicky abnormální tkáně detekována rychle a bylo z ní získáno mnoho normálních jedinců s dobrou účinností.
Tabulka 3 ukazuje účinnost, s jakou byly získáni normální jedinci z morfologicky abnormální tkáně, pokud byl použit transposon nebo odstranitelný DNA element odvozený od místně specifického rekombinačního systému ve vektoru podle předkládaného vynálezu.
Tabulka 3
Rozdíly v účinnosti získání normálních jedinců v závislosti na typu odstranitelného DNA elementu.
vektor odstranitelný DNA element počet ESP linií počet linií, ve kterých regenerují normální j edinci
příklad 3 pNPI106 Ac(transposon) 63 2 (7 jedinců)
příklad 5 pNPI132 region vymezený Rs pSRl systému (mí s tně specif ický rekombinační systém) 48 7 (10 jedinců)
Pozn. 1. ESP byla separována 2 měsíce po kultivaci.
2. Normální výhonky mohly být detekovány po 4 měsících kultivace v příkladu 3 a po 3 měsících kultivace v příkladu 5.
3. Každý z výše uvedených normálních jedinců obsahoval GUS gen jako model požadovaného genu.
· · · · ·
V příkladech 1 až 5, za nepřítomnosti hormonů, tkáň obsahující transgenní buňky proliferovala, diferencovala náhodné výhonky a regenerovala rostlinu. Toto je pravděpodobně možné připsat účinku ipt genu, který byl zaveden do chromosomu v transgenní buňce jako markerový gen. To znamená, že při expresi tohoto genu je rostliný hormon nadprodukován v buňce.Nás 1edkem toho, rostliný hormon produkovaný v buňce obsahující ipt gen ovlivňuje nejen buňku samotnou k diferenciaci tkáně jako je ESP a podobně, ale také tkáně sousedící s buňkou ve stejném rozsahu, stejným způsobem, jako když je do kultivačního media přidán arteficiálně rostliný hormon.
Ve vektoru podle předkládaného vynálezu je MAI gen použit jako markerový gen. Proto, pokud je provedeno zavedení genu do rostliny za použití tohoto vektoru, pak může být tkáň, do které je požadovaný gen zaveden, selektována kultivováním buněk podrobených zavedení genu v běžném kultivačním mediu za běžných kultivačních podmínek bez přidání jakýchkoliv chemických substancí pro selekci, a je možná vizuální identifikace vzniklé morfologicky abnormální tkáně. V souladu s tím, postup je zjednodušen a aktivita rostlině buňky se nesnižuje během selekce.
Dále, takový MAI gen je v rostlině děděný nebo je zaveden do rostliny přirozenou infekcí bakterií a podobně.
• · · · ♦ · · ······ ···· ···· ·· · ···· ··· ·· · • · · · · · · · · · · · · ···· ··· · · «· · · ····· · · »
Z tohoto důvodu, ačkoliv je MAI gen exprivován v rostlině buňce, do které byl gen zaveden, je jeho bezpečnost významně vysoká, pokud je rostlina trávena v lidském těle.
Ještě dále, pokud je ipt gen použit jako MAI gen, pak tkáň obsahující transgenní buňky proliferuje a diferencuje náhodné výhonky působením tohoto genu, což umožňuje eliminovat potřebu přidání rostliných hormonů do kultivačního media, které je obecně považováno za nedostačující pro proliferaci a diferenciaci při kultivaci rostliných buněk.
Kromě toho, v tomto vektoru, MAI gen použitý jako markerový gen je insertován v pozici tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem, kde markerový gen je odstraněn z DNA, kde je tento gen umístěn a kde účinkuje, excisi DNA elementu v daném poměru po zavedení genu do rostlině buňky, a toto způsobí ztrátu jeho vlasní funkce. Tak pouze požadovaný gen přítomný v pozici vektoru tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem, zbývá v této DNA a uchovává si schopnost exprivovať svou funkci. V souladu s tím, v této struktuře, vektor způsobuje mnohonásobné zavedení genu do jisté rostliny pouze změnou části požadovaného genu, který má být zaveden bez jakékoliv změny struktur markerového genu a jiných. Tak může být mnohonásobné zavedení provedeno neomezeně krát.
Kromě toho, v tomto případě, ztráta funkce MAI genu jako markerového genu může být vizuálně detekováno díky morfologickým změnám transgenní tkáně při zavedení tohoto genu. Proto, tkáň vytvořená pouze buňkami, ve kterých zůstává požadovaný gen sám v chromosomu a podobně a uchovává si svou funkci může být snadno a jistě selektována. V důsledku toho může být provedeno mnohonásobné zavedení genu s vysokou účinností a transgenní rostlina vytvořená z pouze takových buněk, konkrétně, jedinec prostý ovlivnění markerového genu a zcela prostý jakýchkoliv zdravotních rizik nesených produktem markerového genu může být získán bez nutnosti kroku křížení.
Poznámky:
S ohledem na indikace týkající se deponovaných mikroorganismů uvedených ve specifikaci následovně:
1) FERM BP-5063 na str. 31 , řádek 20
2) FERM BP-5064 na str. 40, řádek 3
3) FERM BP-5065 na str. 53, řádek 17
4) FERM BP-5066 na str. 59, řádek 28
Čtyři mikroorganismy výše identifikované přírůstkovým číslem byly simultáně deponovány v následujících depozitních institucích.
Jméno depozitní instituce:
National Institute of Bioscience and Human technology
Agency of Industrial Science and Technology (Osamu Suzuki, Dr., Generální ředitel)
Adresa depozitní instituce
1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 JAPAN
Datum deponování: 5.5.1995

Claims (36)

  1. Patentové nároky
    1. Vektor pro zavedení požadovaného genu do rostliny, který obsahuje požadovaný gen a alespoň jeden morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen.
  2. 2. Vektor podle nároku í, kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je získán z mikroorganismu rodu Agrobacterium.
  3. 3. Vektor podle nároku 1, kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je gen pro syntesu cytokininu.
  4. 4. Vektor podle nároku 3, kde uvedený gen pro syntesu cytokininu je ipt, isopentenyltransferasový, gen, který je přítomen v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.
  5. 5. Vektor podle nároku 1, kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je alespoň jeden gen vybraný z rol genů.
  6. 6. Vektor podle nároku 5, kde uvedené rol geny jsou rol geny obsahující rolA, rolB a rolC, které jsou přítomny v T-DNA Agrobacterium rhizogenes.
  7. 7. Vektor pro zavedení požadovaného genu do rostliny spolu s markerovým genem, kde uvedený markerový gen je odstraněn z DNA, ve které je přítomen a kde účinkuje pro odstranění jeho funkce po jeho expresi, a kde exprese uvedeného markerového genu a odstranění jeho účinku je detekovatelné morfologickou změnou tkáně odvozené od rostlině buňky, do které je uvedený markerový gen zaveden.
  8. 8. Vektor pro zavedení požadovaného genu do rostliny, který obsahuje uvedený požadovaný gen, alespoň jeden morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, ve kterém je uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a ve kterém je uvedený požadovaný gen umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem.
  9. 9. Vektor podle nároku 8, kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je přítomen v uvedeném odstranitelném DNA elementu.
  10. 10. Vektor podle nároku 8, kde uvedený odstranitelný DNA element je transposon.
  11. 11. Vektor podle nároku 8, kde je uvedený odstranitelný DNA element odvozen od místně specifického rekombinačního systému.
  12. 12. Vektor podle nároku 8, kde je uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen získán z mikroorganismu rodu Agrobacterium.
  13. 13. Vektor podle nároku 8, kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je gen pro syntesu cytokininu.
  14. 14. Vektor podle nároku 13, kde uvedený gen pro syntesu cytokininu je ipt, isopentenyltransferasový, gen, který je přítomen v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.
  15. 15. Vektor podle nároku 8, kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je alespoň jeden gen vybraný z rol genů.
  16. 16. Vektor podle nároku 15, kde uvedené rol geny jsou rol geny obsahující rolA, rolB a rolC, které jsou přítomny v T-DNA Agrobacterium rhizogenes.
  17. 17. Způsob pro produkci transgenní rostliny neovlivněné markerovým genem vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
    A) zavedení vektoru do rostlině buňky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gen, alespoň jeden morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, ve kterém je uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a ve kterém je uvedený požadovaný gen umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA e1ementem,
    B) kultivování rostlině buňky získané v kroku (A), detekování morfologicky abnormální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky abnormální tkáně, a
    C) kultivování uvedené morfologicky abnormální tkáně selektované v (B), detekování morfologicky normální rostlině ··· ··· · · • · · · ····· ·· · tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky normální tkáně.
  18. 18. Způsob podle nároku 17 vyznačují se tím, že uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je přítomen v uvedeném odstranitelném DNA elementu.
  19. 19. Způsob podle nároku 17 vyznaču jící se tím, že uvedený odstranitelný DNA element je transposon.
  20. 20. .Způsob podle nároku 17 vyznaču jící se tím, že uvedený odstranitelný DNA element je odvozen od místně specifického rekombinačního systému.
  21. 21. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je získán z mikroorganismu rodu Agrobacterium.
  22. 22. Způsob podle nároku 17 vyznaču jící se tím, že uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je gen pro syntesu cytokininu.
  23. 23. Způsob podle nároku 22 vyznaču jící s e tím že uvedený gen pro syntesu cytokininu je ipt, isopentenyltransferasový, gen, který je přítomen v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.
  24. 24. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je alespoň jeden gen vybraný z rol genů.
    ·· ·· ····
  25. 25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedené rol geny jsou rol geny obsahující rolA, rolB a rolC, které jsou přítomny v T-DNA Agrobacterium rhizogenes.
  26. 26. Způsob pro zavedení alespoň dvou požadovaných genů do rostliny vyznačující se tím, že obsahuje provedení následujících kroků:
    A) zavedení vektoru do rostlině buňky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gen, alespoň jeden morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, ve kterém je uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a ve kterém je uvedený požadovaný gen umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA e1ement em,
    B) kultivování rostlině buňky získané v kroku (A), detekování morfologicky abnormální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky abnormální tkáně, a
    C) kultivování uvedené morfologicky abnormální tkáně selektované v (B) , detekování morfologicky normální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky normální tkáně.
  27. 27. Způsob podle nároku 26 v y z n a č u j í se t í m, že uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je přítomen v uvedeném odstranitelném DNA elementu.
  28. 28. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, • · · · · · · ·· ·· 9·9 · · že uvedený odstranitelný DNA element je transposon.
  29. 29. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že uvedený odstranitelný DNA element je odvozen od místně specifického rekombinačního systému.
  30. 30. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je získán z mikroorganismu rodu Agrobacterium.
  31. 31.. Způsob podle nároku 26 vyznačuj ící se tím, že uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je gen pro syntesu cytokininu.
  32. 32. Způsob podle nároku 31 vyznačující s e tím že uvedený gen pro syntesu cytokininu je ipt, isopentenyltransferasový, gen, který je přítomen v T-DNA Agrobacterium tumefaciens.
  33. 33. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že kde uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen je alespoň jeden gen vybraný z rol genů.
  34. 34. Způsob podle nároku 33 vyznačuj ící se tím, že uvedené rol geny jsou rol geny obsahující rolA, rolB a rolC, které jsou přítomny v T-DNA Agrobacterium rhizogenes.
  35. 35. Transgenní rostlina prostá vlivu markerového genu produkovaná způsobem obsahujícím následující kroky:
    A) zavedení vektoru do rostlině buňky, kde uvedený vektor • ·· ·· * obsahuje uvedený požadovaný gen, alespoň jeden morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, ve kterém je uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a ve kterém je uvedený požadovaný gen umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem,
    B) kultivování rostlině buňky získané v kroku (A), detekování morfologicky abnormální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky abnormální tkáně, a
    C) kultivování uvedené morfologicky abnormální tkáně selektované v (B), detekování morfologicky normální tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky normální tkáně, a
    D) kultivování uvedené morfologicky normální tkáně pro regeneraci rostliny.
  36. 36. Rostlina obsahující dva nebo více požadovaných genů produkovaná způsobem obsahujícím následující kroky:
    A) zavedení vektoru do rostlině buňky, kde uvedený vektor obsahuje uvedený požadovaný gen, alespoň jeden morfologickou abnormalitu indukující gen jako markerový gen a odstranitelný DNA element, ve kterém je uvedený morfologickou abnormalitu indukující gen umístěn tak, že se chová integrálně s odstranitelným DNA elementem a ve kterém je uvedený požadovaný gen umístěn tak, že se nechová integrálně s odstranitelným DNA elementem, ·· ·· · ·· ·· ··*> · ···· ···· · · · • · · · ······ • ·· ·· ·· ·» · · · · ···· ··· · · • * ·· · · · · · · · ·
    B) kultivování rostlině buňky získané v kroku (A), detekování morfologicky abnormální rostlině tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky abnormální tkáně, a
    C) kultivování uvedené morfologicky abnormální tkáně selektované v (Β) , detekování morfologicky normální tkáně, která se objeví v průběhu kultivace a selektování uvedené morfologicky normální tkáně,
    D) provedení kroků A) a C) alespoň jedenkrát, a
    E) kultivování uvedené morfologicky normální tkáně pro regeneraci rostliny.
CZ971388A 1994-11-09 1995-11-08 Vektor pro zavedení genu do rostliny a způsob pro produkci transgeních rostlin a mnohonásobné zavedení genů do rostliny za použití vektoru CZ138897A3 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP31139994 1994-11-09
JP17012395 1995-05-31
JP29325495 1995-10-04
JP31343295A JP3256952B2 (ja) 1994-11-09 1995-10-25 植物への遺伝子導入用ベクター、並びにこれを用いた遺伝子導入植物の作成方法及び植物への遣伝子多重導入方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ138897A3 true CZ138897A3 (cs) 1998-02-18

Family

ID=27474306

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ971388A CZ138897A3 (cs) 1994-11-09 1995-11-08 Vektor pro zavedení genu do rostliny a způsob pro produkci transgeních rostlin a mnohonásobné zavedení genů do rostliny za použití vektoru

Country Status (25)

Country Link
US (1) US5965791A (cs)
EP (2) EP1602729A3 (cs)
JP (1) JP3256952B2 (cs)
KR (1) KR100343759B1 (cs)
CN (1) CN1073624C (cs)
AP (1) AP9700980A0 (cs)
AR (1) AR000479A1 (cs)
AT (1) ATE307211T1 (cs)
AU (1) AU703485B2 (cs)
BG (1) BG62892B1 (cs)
BR (1) BR9509715B1 (cs)
CA (1) CA2162449C (cs)
CZ (1) CZ138897A3 (cs)
DE (1) DE69534525D1 (cs)
DK (1) DK0716147T3 (cs)
ES (1) ES2248795T3 (cs)
FI (1) FI971961A (cs)
HU (1) HUT77074A (cs)
NO (1) NO972108L (cs)
NZ (1) NZ295256A (cs)
OA (1) OA10607A (cs)
PL (1) PL184707B1 (cs)
SK (1) SK56997A3 (cs)
UA (1) UA40661C2 (cs)
WO (1) WO1996015252A2 (cs)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AUPN903196A0 (en) * 1996-03-29 1996-04-26 Australian National University, The Single-step excision means
AU728915B2 (en) * 1996-05-09 2001-01-18 Nippon Paper Industries Co. Ltd. Vector for introducing a gene into a plant from which a selectable marker gene can be optionally removed
US6410718B1 (en) 1996-09-11 2002-06-25 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Materials and methods for the modification of plant lignin content
US6204434B1 (en) 1996-09-11 2001-03-20 Genesis Research & Development Corporation Limited Materials and methods for the modification of plant lignin content
US5850020A (en) * 1996-09-11 1998-12-15 Genesis Research & Development Corporation, Ltd. Materials and method for the modification of plant lignin content
FR2759857B1 (fr) 1997-02-27 1999-04-30 Biocem Nouvelles utilisations de la sterilite male chez les plantes
US6632980B1 (en) 1997-10-24 2003-10-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Binary viral expression system in plants
JP2000083680A (ja) * 1998-07-16 2000-03-28 Nippon Paper Industries Co Ltd 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
FR2784393B1 (fr) * 1998-10-09 2002-02-22 Biogemma Fr Procede d'obtention de plantes transgeniques exprimant une proteine a activite productrice de peroxyde d'hydrogene par transformation par agrobacterium rhizogenes
WO2000022099A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Genesis Research And Development Corporation Limited Materials and methods for the modification of plant lignin content
CA2292798A1 (en) * 1999-01-06 2000-07-06 Nippon Paper Industries Co., Ltd. Novel vector for introducing a gene into a plant using a selectable marker
BR0010647A (pt) * 1999-05-17 2002-02-19 Icon Genetics Inc Método para a introdução de material genético para dentro de plantas, planta inteira, semente ou partes de semente, progênie, e, célula fundida ou protoplasto fundido
US6231561B1 (en) 1999-09-20 2001-05-15 Appriva Medical, Inc. Method and apparatus for closing a body lumen
US6723896B1 (en) * 1999-11-12 2004-04-20 The Rockefeller University Inducible site-specific recombination for the activation and removal of transgenes in transgenic plants
US7112721B2 (en) 2000-02-08 2006-09-26 Sakata Seed Corporation Methods and constructs for plant transformation
AU784571B2 (en) * 2000-02-08 2006-05-04 Sakata Seed Corporation Novel methods and constructs for plant transformation
US6750379B2 (en) 2000-03-09 2004-06-15 Dekalb Genetics Corporation Homologous recombination-mediated transgene alterations in plants
US6512165B1 (en) * 2000-07-10 2003-01-28 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for enhancing plant transformation frequencies
US7560622B2 (en) * 2000-10-06 2009-07-14 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions relating to the generation of partially transgenic organisms
US6927322B2 (en) 2001-03-30 2005-08-09 Cornell Research Foundation, Inc. Cabbage proteinase inhibitor gene confers resistance against plant pests
EP1264891A1 (en) * 2001-05-31 2002-12-11 Plant Research International B.V. Modification of plant genomes by inducible site-specific recombination of transgenes
JP3985474B2 (ja) * 2001-07-24 2007-10-03 日本製紙株式会社 遺伝子導入効率を向上させたユーカリ属の植物への遺伝子導入方法
EP1279737A1 (en) 2001-07-27 2003-01-29 Coöperatieve Verkoop- en Productievereniging, van Aardappelmeel en Derivaten AVEBE B.A. Transformation method for obtaining marker-free plants
KR100616369B1 (ko) * 2001-11-08 2006-08-28 도꾸리쯔교세이호징 가가꾸 기쥬쯔 신꼬 기꼬 벼의 트랜스포존 유전자
US7534934B2 (en) 2002-02-20 2009-05-19 J.R. Simplot Company Precise breeding
NZ571718A (en) 2002-02-20 2010-09-30 Simplot Co J R Precise breeding by modification of an R1, phosphorylase-L and polyphenol oxidase genes in a plant
EP1527183B1 (de) * 2002-07-26 2008-08-20 BASF Plant Science GmbH Neue selektionsverfahren
JP4102921B2 (ja) 2002-07-26 2008-06-18 日本製紙株式会社 オーキシン前駆体を利用した遺伝子組換え植物の効率的作成方法
WO2004076625A2 (en) * 2003-02-21 2004-09-10 Vector Tobacco Ltd. Method of identifying plant cells transformed with a gene
US7847063B2 (en) 2003-03-28 2010-12-07 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. GLP-1 derivative
US7575917B2 (en) * 2003-04-09 2009-08-18 Monsanto Technology Llc DNA constructs and methods to enhance the production of commercially viable transgenic plants
WO2005060664A2 (en) 2003-12-10 2005-07-07 Monsanto Technology Llc Stress tolerant plants and methods thereof
CA2653231C (en) 2006-05-12 2016-04-12 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for obtaining marker-free transgenic plants
EP1949785A1 (en) 2007-01-26 2008-07-30 Coöperatie AVEBE U.A. Use of R-genes as a selection marker in plant transformation and use of cisgenes in plant transformation
EP3023499A1 (en) 2008-07-16 2016-05-25 Monsanto Technology LLC Methods and vectors for producing transgenic plants
US7868688B2 (en) * 2008-12-30 2011-01-11 Cosmic Circuits Private Limited Leakage independent very low bandwith current filter
CA3083443A1 (en) 2017-11-27 2019-05-31 Riken Genome-edited plant production method
CN108753813B (zh) * 2018-06-08 2021-08-24 中国水稻研究所 获得无标记转基因植物的方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3810286A1 (de) * 1988-03-25 1989-10-12 Max Planck Gesellschaft Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung
US5512482A (en) 1990-04-26 1996-04-30 Calgene, Inc. Plant thioesterases
US5225341A (en) * 1990-07-19 1993-07-06 The Regents Of The University Of California Biologically safe plant transformation system using a ds transposon
GB9024728D0 (en) 1990-11-14 1991-01-02 Ici Plc Herbicide resistant plants
CA2103248C (en) 1991-05-22 2010-10-19 Jewel M. Payne Novel bacillus thuringiensis isolates active against hymenopteran pests and genes encoding hymenopteran-active toxins
WO1993001283A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Selection-gene-free transgenic plants
AU667301B2 (en) 1992-03-24 1996-03-21 Japan Tobacco Inc. Process for reducing seed storage proteins and process for transforming plants
ATE398679T1 (de) 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5527695A (en) * 1993-01-29 1996-06-18 Purdue Research Foundation Controlled modification of eukaryotic genomes
JPH06276872A (ja) 1993-03-31 1994-10-04 Mitsubishi Corp マーカー遺伝子の除去方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1602729A3 (en) 2005-12-14
KR100343759B1 (ko) 2002-11-13
NO972108D0 (no) 1997-05-07
US5965791A (en) 1999-10-12
AU3855795A (en) 1996-06-06
FI971961A (fi) 1997-07-07
DK0716147T3 (da) 2006-02-20
PL184707B1 (pl) 2002-12-31
JP3256952B2 (ja) 2002-02-18
AP9700980A0 (en) 1997-07-31
OA10607A (en) 2002-09-10
PL320201A1 (en) 1997-09-15
EP0716147A2 (en) 1996-06-12
ATE307211T1 (de) 2005-11-15
HUT77074A (hu) 1998-03-02
UA40661C2 (uk) 2001-08-15
BG101524A (en) 1998-01-30
CA2162449A1 (en) 1996-05-10
NO972108L (no) 1997-07-07
DE69534525D1 (de) 2006-03-02
JPH09154580A (ja) 1997-06-17
CN1137565A (zh) 1996-12-11
WO1996015252A2 (en) 1996-05-23
WO1996015252A3 (en) 1996-07-18
BG62892B1 (bg) 2000-10-31
AR000479A1 (es) 1997-07-10
SK56997A3 (en) 1998-05-06
AU703485B2 (en) 1999-03-25
MX9703440A (es) 1998-07-31
BR9509715A (pt) 1997-10-28
EP1602729A2 (en) 2005-12-07
EP0716147B1 (en) 2005-10-19
FI971961A0 (fi) 1997-05-07
CA2162449C (en) 2008-01-22
BR9509715B1 (pt) 2010-08-10
EP0716147A3 (en) 1996-10-16
KR960017851A (ko) 1996-06-17
NZ295256A (en) 1999-04-29
ES2248795T3 (es) 2006-03-16
CN1073624C (zh) 2001-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ138897A3 (cs) Vektor pro zavedení genu do rostliny a způsob pro produkci transgeních rostlin a mnohonásobné zavedení genů do rostliny za použití vektoru
US20230242926A1 (en) Methods and hybrids for targeted nucleic acid editing in plants using crispr/cas systems
AU727849B2 (en) Methods for (agrobacterium)-mediated transformation
JP2000083680A (ja) 光誘導型プロモ―タ―の制御下に置かれた不定芽再分化遺伝子を選抜マ―カ―遺伝子とする植物への遺伝子導入方法及びこれに用いる植物への遺伝子導入用ベクタ―
US6316694B1 (en) Transformed embryogenic microspores for the generation of fertile homozygous plants
US6326192B1 (en) Vector for gene transfer into plant allowing optional deletion of marker gene
JP2003521940A (ja) 植物形質転換のための新規方法および構築物
US10941412B2 (en) Citrus varieties resistant to Xanthomonas citri infection
BR112020002321A2 (pt) novas estirpes de agrobacterium tumefaciens reivindicação de prioridade
US7112721B2 (en) Methods and constructs for plant transformation
Kudo et al. TRANSFORMATION OF CHRYSANTHEMUM (DENDRANTHEMA GRANDI-FLORUM (RAMAT.) KITAMURA) VIA AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
RU2149187C1 (ru) Вектор для введения желаемого гена в растение (варианты), способ получения трансгенного растения и способ введения, по крайней мере, двух желаемых генов в растение
JP4595631B2 (ja) 選抜マーカー遺伝子の影響が排除された遺伝子導入細胞、組織又は植物の作成方法
JPH03187381A (ja) グルタミンシンテターゼインヒビター耐性に関するダイズ植物の遺伝子操作方法
CA2215763C (en) Transformed embryogenic microspores for the generation of fertile homozygous plants
JP3584924B2 (ja) 新規ベクターにより作成される遺伝子導入植物
MXPA97003440A (es) Vector y metodos para introducir por lo menos dosgenes en una planta
JP2011505806A (ja) マーカーフリーのトランスジェニック植物を作る方法
AU2004245837A1 (en) Novel vector

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic