JP2018508203A - Ｔ−ｄｎａ組込みを伴わない、アグロバクテリウムが介在するゲノム改変 - Google Patents

Ｔ−ｄｎａ組込みを伴わない、アグロバクテリウムが介在するゲノム改変 Download PDF

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Abstract

改変されたトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）プラスミドを利用したヌクレアーゼの一過性発現を利用した方法を含む、ゲノム工学のための方法が、本明細書において提供される。

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１５年２月２日に出願された米国仮出願第６２／１１０，７３５号からの優先権の利益を主張し、それは、その全体で参照により本明細書中に援用される。
［技術分野］
本発明は、ゲノム工学のための方法に関し、改変されたトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）プラスミドを利用したヌクレアーゼの一過性発現による、ゲノム工学のための方法を含む。
アグロバクテリウムは、大腫瘍誘導（Ｔｉ）または根粒形成（Ｒｉ）プラスミドを介した植物ゲノム中へのトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の導入を介して、遺伝子水平伝播を用いて植物において腫瘍形成を引き起こすグラム陰性細菌属である。病原性であるためには、アグロバクテリウムは、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移行させてそれを染色体ＤＮＡ中に組み込むのに必要な全ての遺伝子およびＴ−ＤＮＡを有するＴｉまたはＲｉプラスミドを含まなければならない。ＴｉおよびＲｉプラスミドの両方の変動が存在するが、いくつかの特徴が、天然起源株の間で共通している：病原性遺伝子、複製起点、オパイン異化作用遺伝子、右境界（ＲＢ）配列、左境界（ＬＢ）配列、および、トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）領域。病原性遺伝子および境界配列は、アグロバクテリウムがＩＶ型分泌システム（ＴＩＶＳＳ）を介してＴ−ＤＮＡを植物細胞中に移行させるのを可能にする。Ｔ−ＤＮＡが植物細胞中に形質転換された時点で、アグロバクテリウム病原性タンパク質の助けにより、宿主ゲノムの中に組み込むことが可能である。組み込まれたＴ−ＤＮＡは、アグロバクテリウムの炭素源および窒素源として作用するオパインの生産増加を可能にする、発癌およびオパイン合成遺伝子を含んでよい。ＴｉおよびＲｉプラスミドは、ヌクレオチドレベルで著しく異なるが、プラスミドは、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓとの間で交換することができ、したがって、バクテリアに、それが含むＴｉまたはＲｉプラスミドを示す新規の病原プロファイルを与える。アグロバクテリウムＴ−ＤＮＡは、改変することができて、別個のプラスミド上に病原性遺伝子およびＴ−ＤＮＡを有する二成分ベクター系で用いることができる。このストラテジーは、新規の遺伝子を植物ゲノム中に導入するのに用いられている（例えば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｇｅｌｖｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １４６：３２５−３３２，２００８を参照）。ＴｉまたはＲｉプラスミド上の病原性遺伝子、および、多くのアグロバクテリウム染色体遺伝子は、組込みのメカニズムに必須であると考えられている。しかしながら、組込みのメカニズムは、完全に解明されていない。
本書類は、アグロバクテリウムが介在する形質転換を植物細胞内での配列特異的ヌクレアーゼの一過性発現に用いて、非トランスジェニックである遺伝子改変植物を産出することができるという知見に一部基づく。例えば、アグロバクテリウムを用いて、所望のヌクレアーゼ遺伝子をコードするＴ−ＤＮＡを植物細胞へ導入することができ、Ｔ−ＤＮＡ組込みを伴わずにヌクレアーゼの発現を可能にする。そのようなヌクレアーゼの一過性発現は、部位特異的なゲノム改変をもたらすことができ、選択された植物種の正確なエンジニアリングを可能にする。これは、伝統的なアグロバクテリウム形質転換によって組み込まれた外来ＤＮＡを取り除くためのその後の戻し交雑の必要性をなくすことができ、規制事項を減らし、市場に出すスピードを速める。
本書類は、とりわけ、植物細胞内でポリペプチドを一時的に発現する方法を特徴とする。当該方法は、植物細胞の中に、（ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および（ｂ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、ポリペプチドコード配列が植物細胞内に一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結される）を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを、導入するステップを含むことができる。例えば、当該方法は、生じるｉｉＴ−ＤＮＡの組込みが低減するように少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界の除去または不活化によって改変されている、Ｔｉ、Ｒｉ、およびＴ−ＤＮＡプラスミドに対応する組込みが阻害されたＴ−ＤＮＡ（ｉｉＴ−ＤＮＡ）プラスミドを、細胞の中に導入するステップを含むことができる。一部の実施態様では、改変されたＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、またはＴ−ＤＮＡプラスミドのＬＢは、植物ゲノム中へのＴ−ＤＮＡ組込みが減じられるように除去または不活化される。改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、機能性でないＴ−ＤＮＡ境界配列を少なくとも１つ有してよい（例えば、ただ１つのみの機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列を有してよく、または、機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列を有さなくてよい）。一部の実施態様では、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドのＲＢ（ＬＢを含まない、または、不活化ＬＢを含む）は、Ｔ−ＤＮＡ組込みがさらに減じられるように、ｉｉＴ−ＤＮＡが植物細胞に入った時点で、除去可能にされて、または不活性にされる。そのような実施態様では、プラスミドは、本明細書において、除去可能な右境界ｉｉＴ−ＤＮＡ（ＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡ）プラスミドと指定される。本明細書に記載されるＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡは、レアカットエンドヌクレアーゼによるＲＢ配列の除去によって得ることができる。一般に、レアカットエンドヌクレアーゼは、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡ配列内に含まれる構造コード配列の１つによってコードされ得る。
また、本書類は、本明細書に記載の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを用いて、Ｔ−ＤＮＡ組込みを伴わずに植物細胞内で遺伝子編集を行なう方法を特徴とし、ここで、レアカットエンドヌクレアーゼは、プラスミドによって一時的に発現される。レアカットエンドヌクレアーゼは、植物ゲノム内の特定の遺伝子座に対して向けることができ、その作用は、その特定の遺伝子座において、遺伝子配列の修復、改変、または突然変異をもたらすことができる。
一部の実施態様では、当該方法は、遺伝子水平伝播が可能な生物を、細胞に導入するステップ（または、細胞と接触させるステップ）を含むことができ、当該生物は、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む。本明細書において提供される方法での遺伝子水平伝播が可能な生物は、バクテリア（例えば、アグロバクテリウム）であってよい。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、アグロバクテリウム由来であってよい。上記でいうｉｉＴ−ＤＮＡ境界配列は、Ｔ−ＤＮＡ ＲＢ配列（例えば、オクトピンＴｉプラスミド、ノパリンＴｉプラスミド、または、アグロピンＴｉプラスミド由来の、ＲＢ配列）であってよい。ｉｉＴ−ＤＮＡ境界配列は、ＴｉまたはＲｉプラスミド内のポリペプチドコード配列の５’であってよい。５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよい。５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含んでよく、または、５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含んでよく、当該方法は、プロモーターを誘導するステップをさらに含んでよい。ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよい。レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼまたはＴＡＬＥＮ（登録商標）とも呼ばれる）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらすことができる。改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、構造コード配列とともに一時的に発現されるレポーター遺伝子を含んでよい。レポーター遺伝子の発現は、視覚的シグナルまたは抗生物質耐性をもたらすことができる。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ドナー配列をさらに含むことができる。細胞へのドナー配列の一過的な送達は、遺伝子ターゲッティングをもたらすことができる。
Ｔ−ＤＮＡ領域は、５’プロモーター領域、第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を有する、第二のポリペプチドコード配列をさらに含むことができ、ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、第二のポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結される。第二のポリペプチドコード配列の５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよい。５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含むことができ、または、５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含むことができ、そして、当該方法は、プロモーターを誘導するステップをさらに含むことができる。ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）またはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよく、第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよい。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらすことができる。
Ｔ−ＤＮＡは、重複および逆位配列をさらに含むことができる。例えば、Ｔ−ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の約１０００ヌクレオチド以内、例えば、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の約５００〜１０００ヌクレオチド以内、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の約２５０〜５００ヌクレオチド以内、または、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の約１〜５００ヌクレオチド以内である、重複および逆位配列を含むことができる。一部の実施態様では、重複および逆位配列は、重複配列が境界（例えば、突然変異に起因して非機能性にされた境界）およびさらなるＴ−ＤＮＡを含むように、境界配列にあってよい。一部の実施態様では、重複および逆位配列は、境界配列に隣接してよいが、境界配列を含まない。両方の場合において、重複および逆位配列は、線状Ｔ−ＤＮＡ分子の一方の末端においてステムループ構造の形成を促進することができる。
別の態様では、本書類は、植物を生産する方法を特徴とする。当該方法は、（ａ）感受性植物細胞を遺伝子水平伝播が可能な生物に導入するステップを含む方法によって得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、当該生物は、（ｉ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および（ｉｉ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列、を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含み、ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、ポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結され、およびここで、ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、および、（ｂ）植物細胞を植物中に再生するステップを含むことができる。再生された植物は、レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含むことができる。
別の態様では、本書類は、植物を生産する方法を特徴とする。当該方法は、（ａ）感受性植物細胞を遺伝子水平伝播が可能な生物に導入するステップを含む方法に従って得られた植物細胞を提供するステップ（ここで、当該生物は、（ｉ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、（ｉｉ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、構造コード配列に動作可能に連結される）、および、（ｉｉｉ）５’プロモーター領域、第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、ポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結され、およびここで、ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよい）、を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む）、および（ｂ）植物細胞を植物中に再生するステップを含むことができる。再生された植物は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含むことができる。
別の態様では、本書類は、植物細胞内でポリペプチドを一時的に発現する方法を特徴とし、当該方法は、植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物に導入するステップを含み、当該生物は、（ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、（ｂ）レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位、および（ｃ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、ポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結される）、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む。遺伝子水平伝播が可能な生物は、バクテリア（例えば、アグロバクテリウム）であってよい。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、アグロバクテリウム由来であってよい。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列であってよい。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、オクトピンＴｉプラスミド、ノパリンＴｉプラスミド、または、アグロピンＴｉプラスミド由来であってよい。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ＴｉまたはＲｉプラスミド内のポリペプチドコード配列の５’であってよい。５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよい。５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含んでよく、または、５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含んでよく、そして、当該方法は、プロモーターを誘導するステップをさらに含んでよい。ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニット（例えば、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）をコードしてよい。レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらすことができる。
別の態様では、本書類は、植物細胞内でポリペプチドを一時的に発現する方法を特徴とし、当該方法は、植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物と接触させるステップを含み、ここで、当該生物は、（ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および（ｂ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造配列、および、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、構造コード配列に動作可能に連結される）、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む。また、Ｔ−ＤＮＡは、（ｃ）レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位を含んでもよい。ポリペプチドコード配列は、その標的部位（例えば、Ｔ−ＤＮＡ内に含まれる標的部位）でＤＮＡを特異的に認識および切断する、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよい。例えば、レアカットエンドヌクレアーゼの発現は、レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の二本鎖切断をもたらすことができ、Ｔ−ＤＮＡ境界を取り除く。特定の理論に拘束されずに、Ｔ−ＤＮＡ境界の除去は、標的部位に共有結合しているタンパク質の除去も伴い得て、Ｔ−ＤＮＡを、植物染色体ＤＮＡ中への無作為な挿入に向かわせ得る。
また、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、構造コード配列とともに一時的に発現されるレポーター遺伝子を含んでもよい。レポーター遺伝子の発現は、視覚的シグナルまたは抗生物質耐性をもたらすことができる。一部の実施態様では、Ｔ−ＤＮＡ内に含まれるポリペプチドコード配列によってコードされる同一のレアカットエンドヌクレアーゼは、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内に位置するレアカットエンドヌクレアーゼ標的配列、および、植物ゲノム内のゲノム標的ＤＮＡの両方を切断することができる。
Ｔ−ＤＮＡ領域は、５’プロモーター領域、第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を有する、第二のポリペプチドコード配列をさらに含むことができ、ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、第二のポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結される。第二のポリペプチドコード配列の５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよい。５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含むことができ、または、５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含むことができ、当該方法は、プロモーターを誘導するステップをさらに含むことができる。ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードすることができ、第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードすることができる。レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらすことができる。
当該方法は、植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な第二の生物に導入するステップをさらに含むことができ、ここで、第二の生物は、５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、第二のポリペプチドコード配列が植物細胞内に一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結される）、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む。第二の生物は、第一の生物の５日以内に、植物細胞に導入することができる。ポリペプチドコード配列の５’プロモーター領域および第二のポリペプチドコード配列の５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在してよく、または、植物細胞に自然に入ることが可能であってよい。５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含んでよく、または、５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含んでよく、そして、当該方法は、プロモーターを誘導するステップをさらに含んでよい。ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよく、第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードしてよい。レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過的発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらすことができる。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの発現は、レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の二本鎖切断をもたらすことができ、第一のＴ−ＤＮＡ境界および共有結合されたタンパク質を取り除く。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ドナー配列をさらに含んでよい。細胞へのドナー配列の一過的な送達は、遺伝子ターゲッティングをもたらすことができる。
当該方法は、植物細胞に、遺伝子水平伝播が可能な第二の生物を導入するステップをさらに含むことができ、ここで、第二の生物は、５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、構造コード配列に動作可能に連結される）；および、５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第三のポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、第二および第三のポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結される）、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む。第二の生物は、第一の生物の５日以内に、植物細胞に導入することができる。第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードすることができ、第三のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする。レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼであってよい。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらすことができる。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ドナー配列をさらに含んでよい。ドナー配列の一過的な送達は、遺伝子ターゲッティングをもたらすことができる。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの発現は、レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の二本鎖切断をもたらすことができ、第一のＴ−ＤＮＡ境界および共有結合されたタンパク質を取り除く。
別の態様では、本書類は、植物を生産する方法を特徴とし、当該方法は、（ａ）植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物に導入するステップを含む方法に従って得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、当該生物は、（ｉ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、（ｉｉ）レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位、および、（ｉｉｉ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、ポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結され、およびここで、ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む）、および、（ｂ）植物細胞を植物中に再生するステップを含む。再生された植物は、レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含むことができる。
さらに別の態様では、本書類は、植物を生産する方法を特徴とし、ここで、当該方法は、（ａ）植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物に導入するステップを含む方法に従って得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、当該生物は、（ｉ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列、（ｉｉ）レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位、（ｉｉｉ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、構造コード配列に動作可能に連結される）、および、（ｉｖ）５’プロモーター領域、第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、およびポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列（ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、ポリペプチドコード配列が植物細胞内で一時的に発現されて、そして、植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、構造コード配列に動作可能に連結されて、およびここで、ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む）、および、（ｂ）植物細胞を植物中に再生するステップ、を含む。再生された植物は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含むことができる。
また、本書類は、（ａ）１つのＴ−ＤＮＡ境界配列、および（ｂ）植物細胞内で誘導されるプロモーターに動作可能に連結された、レアカットエンドヌクレアーゼまたは１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードするポリヌクレオチド配列、を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを特徴とする。Ｔ−ＤＮＡは、重複および逆位配列を含むことができる（例えば、重複および逆位配列は、境界配列に隣接する）。レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ由来であってよい。改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位をさらに含むことができ、ここで、標的部位は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の下流である。
加えて、本書類は、本明細書において提供される改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む製品を特徴とする。
また、本書類は、本明細書において提供される改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む組成物を特徴とする。
さらに、本書類は、本明細書において提供される改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドによって形質転換された、単離された宿主細胞を特徴とする。
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が関連する分野における通常の技術を有する者によって共通して理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を用いて本発明を実施することができるが、適切な方法および材料を以下に説明する。本明細書において言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。加えて、材料、方法、および実施例は、単なる例示であり、限定であることを意図しない。
本発明の１つまたは複数の実施態様の詳細は、以下の説明および付随する図面に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、および特許請求の範囲から、明らかであろう。
ｐＣＡＭＢＩＡ−１３００ベクターの図解である。 合成されたカセットの図解である。 ２つのＡＬＳ２＿Ｔ１ ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットを含む、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドの図解である。 Ｔ−ＤＮＡ境界に重複および逆位配列を有するｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドの図である。予測されたヘアピン構造を有する一本鎖および二本鎖の線形Ｔ−ＤＮＡ分子も示される。 アグロインフィルトレーションによってベンサミアナタバコの葉に送達された後の、ＡＬＳ２＿Ｔ１ ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットの突然変異誘発の頻度を示すゲル画像である。ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットは、ｉｉＴ−ＤＮＡまたは従来のＴ−ＤＮＡを用いて植物細胞に送達された。 ２つのＡＬＳ２＿Ｔ１ ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニット、およびＲＢ配列の近くのＡＬＳ２ ＴＡＬＥＮ標的部位を含む、ＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドの図解である。
遺伝子改変作物は、環境上および農業上の制約の下で生長することが可能な新規の植物変種を開発する道を提供し、投資に対して返還されるエネルギーを最適化する。トランスジェニック植物は、典型的に、外来遺伝物質の挿入を介して生産されるが、そのような方法は、公共利用が承認される前に、長くて骨の折れる規制ステップを必要とし得る。本明細書において提供される材料および方法を用いて、非トランスジェニックである遺伝子改変植物を産生することができ、したがって、公共利用のための承認に必要な規制ステップの少なくとも一部を避けることができる。概して、本明細書に記載の方法は、アグロバクテリウムを介した所望の核酸（例えば、ヌクレアーゼまたはそのサブユニットをコードする核酸）の一過性発現を伴い、外来核酸の組込みをせずにゲノム工学を可能にすることができる送達システムを提供する
植物細胞中に移行されるために、Ｔ−ＤＮＡは一般に、円形のＴｉまたはＲｉプラスミドから最初の処理がされる。ＶｉｒＤ１／Ｄ２複合体は、Ｔ−ＤＮＡのＬＢおよびＲＢ配列においてＴｉまたはＲｉＤＮＡに結合してニックを入れる。これらの境界配列は、通常、約２５ｂｐの長さであり、直列方位で繰り返されて、ＴｉまたはＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ領域の横に位置する（例えば、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３８：４５５−４６２，１９８４を参照）。Ｔ−ＤＮＡ領域を描く右および左境界は、天然に見つかった次亜種の間で低度のホモロジーを共有し、最も異なる境界は約５０％配列同一性を共有するが、一部は約８０％またはそれよりも多い（例えば、約９０％または約９５％）配列同一性を共有する。概して、Ｔ−ＤＮＡ境界は、１０〜１３個のヌクレオチドを含み、一部は、表１に示される保存されたＣＡＧＧＡＴＡＴＡＴ（配列番号１３）コンセンサス配列を含む（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ４（１２）：３０６９−３０７７，１９８５も参照）。
特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列識別番号によって参照される配列との間の、配列同一性パーセントは、以下のように決定される。最初に、核酸またはアミノ酸配列は、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンによるＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、特定の配列識別番号で示された配列と比較される。このＢＬＡＳＴＺの独立型バージョンは、ｆｒ．ｃｏｍ／ｂｌａｓｔまたはｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてオンラインで得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使い方を説明するインストラクションは、ＢＬＡＳＴＺに付随するリードミー・ファイルに見つけることができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、２つの配列間の比較を、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて行なう。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために用いられ、一方で、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために用いられる。２つの核酸配列を比較するためには、オプションは以下のように設定される：−ｉは、比較される第一の核酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二の核酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｎに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定され（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは、−１に設定され；−ｒは、２に設定され；および、全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを用いて、２つの配列間の比較を含む出力ファイルを作り出すことができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｎ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ −ｑ −１ −ｒ ２。２つのアミノ酸配列を比較するためには、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のように設定される：−ｉは、比較される第一のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは、比較される第二のアミノ酸配列を含むファイルに設定され（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐは、ｂｌａｓｔｐに設定され；−ｏは、任意の所望のファイル名に設定され（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；および、全ての他のオプションは、それらのデフォルト設定のままである。例えば、以下のコマンドを用いて、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを作り出すことができる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｐ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較される配列がホモロジーを共有する場合は、その結果、指定の出力ファイルは、並べられた配列として、ホモロジーのこれらの領域を示す。２つの比較される配列がホモロジーを共有しない場合は、その結果、指定の出力ファイルは、並べられた配列を示さない。
並べられた時点で、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を数えることにより、マッチ数を決定する。配列同一性パーセントは、同定された配列（例えば、配列番号１）に示される配列の長さで、または、連結された（ａｒｔｉｃｕｌａｔｅｄ）長さ（例えば、同定された配列に示される配列由来の１００の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで、マッチ数を割って、その後、生じた値に１００を掛けることにより決定される。例えば、配列番号１に示される配列と並べた場合に２３マッチを有する核酸配列は、配列番号１に示される配列と９２％同一である（すなわち、２３÷２５×１００＝９２）。配列同一性パーセント値は、小数第一位に四捨五入することに注意すべきである。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は、７５．１に切り捨てて、一方で、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は、７５．２に切り上げる。長さの値は常に整数であることにも注意すべきである。
本明細書に記載のＴｉまたはＲｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡをバクテリアから植物細胞に移行するのに必要な病原性遺伝子およびＴ−領域を含む、単一のプラスミドであってよい。一部の実施態様では、ＴｉまたはＲｉプラスミドは、２つのプラスミド：（ｉ）Ｔ−ＤＮＡの処理および植物細胞への移行に必要な病原性遺伝子を含むヘルパープラスミド、および、（ｉｉ）Ｔ−領域を含む二成分ベクターを含む、Ｔ−ＤＮＡ二成分ベクター系であってよい。Ｔ−ＤＮＡ二成分ベクターは、本明細書においてＴ−ＤＮＡプラスミドと呼ばれる。一部の実施態様では、Ｔｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、アグロバクテリウム染色体ＤＮＡへの、必要な病原性遺伝子およびＴ−領域の片方または両方の組込みであってよい。
本明細書に記載のＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、片方のＴ−ＤＮＡ境界のみが機能性であるように、Ｔ−ＤＮＡ境界（例えば、左のＴ−ＤＮＡ境界）の除去または突然変異によって、一過性発現プラスミドに変換することができる。そのようなＴ−ＤＮＡ境界の除去または突然変異は、２つのＶｉｒＤ１／ＶｉｒＤ２エンドヌクレアーゼ標的部位のうちの１つを取り除き、したがって、正常なＴ−鎖形成を阻害し、植物細胞への、プラスミド主鎖全体の送達をもたらすことができる。
本明細書において用いられる用語「組込みが阻害されたＴ−ＤＮＡ（ｉｉＴ−ＤＮＡ）プラスミド」は、Ｔ−ＤＮＡ組込みが阻害されるようにＴ−ＤＮＡ境界の除去または突然変異によって改変されている、Ｔｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを指す。用語ｉｉＴ−ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡ境界の除去または突然変異によって改変されているＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内のＴ−ＤＮＡ配列を指す。一部の実施態様では、例えば、ｉｉＴ−ＤＮＡのＬＢは、除去することができる。
本明細書において用いられる用語「除去可能な右境界ｉｉＴ−ＤＮＡ（ＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡ）プラスミド」は、第一のＴ−ＤＮＡ境界（例えば、ＬＢ）の除去または突然変異によって改変されていて、そして、第二の境界（例えば、ＲＢ）を除去する目的のためのレアカットエンドヌクレアーゼ標的配列の付加によってさらに改変されている、Ｔｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを指す。本明細書において提供される材料および方法の一部の実施態様では、植物細胞へ送達されるＴ−ＤＮＡ領域は、単一の機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列、ならびに、目的の１つまたは複数のポリペプチドをコードする、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、または、５つよりも多い）配列を含むことができる。したがって、Ｔ−ＤＮＡ領域は、ＶｉｒＤ１／Ｄ２複合体によってニックを入れることのできる、１つの、およびたった１つの、Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含み得る。Ｔ−ＤＮＡ領域は、ＶｉｒＤ１／Ｄ２複合体によってニックを入れることが不可能であるように非機能性である、１つまたは複数のさらなるＴ−ＤＮＡ境界配列を含み得ることに、注意すべきである。そのような非機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、例えば、天然起源Ｔ−ＤＮＡ境界配列の突然変異によって（例えば、表１に示される保存領域内の配列を置換または破壊することによって）、生産することができる。非機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ＶｉｒＤ１／Ｄ２複合体によってなお結合され得ることに、さらに注意すべきである。特定のメカニズムによって拘束されずに、ＶｉｒＤ１／Ｄ２複合体によって結合することのできる多数のＴ−ＤＮＡ境界配列を含むＴ−ＤＮＡ領域は、より効率的に核へ移行され得ることがあり得る。
機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ポリペプチドコード配列（単数または複数）の５’または、ポリペプチドコード配列（単数または複数）の３’に位置することができる。一部の実施態様では、Ｔ−ＤＮＡ境界およびポリペプチドコード配列は、互いにすぐ隣接することができる。あるいは、Ｔ−ＤＮＡ境界およびポリペプチドコード配列は、約３〜約２０００個のヌクレオチド（例えば、約１０〜約１０００個のヌクレオチド、約１０〜約２００個のヌクレオチド、または、約２０〜約１００個のヌクレオチド）のスペーサー配列によって分離していてよい。一部の実施態様では、多数のＴ−ＤＮＡ境界配列（例えば、多数のＲＢ配列）が含まれる場合は、それらは、全てがポリペプチドコード配列（単数または複数）の５’または、全てが３’であるように、クラスター化することができる。しかしながら、一部の実施態様では、Ｔ−ＤＮＡ領域は、ポリペプチドコード配列（単数または複数）の片側（例えば、５’）上に機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および、ポリペプチドコード配列（単数または複数）の他方側（例えば、３’）に非機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含むことができることに注意すべきである。
一部の実施態様では、本明細書において提供される、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内に含まれるＴ−ＤＮＡ境界配列は、ＲＢ配列であってよい。例えば、Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ由来のＲＢ配列であってよい。一部の実施態様では、Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトピンＴｉプラスミド由来のＲＢ配列、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓノパリンＴｉプラスミド由来のＲＢ配列、または、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓアグロピンＴｉプラスミド由来のＲＢ配列であってよい。代表的なＴ−ＤＮＡ境界配列のリストを表１に提供する。一部の実施態様では、機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列が表１内の対応する配列に関して５個以下（例えば、５、４、３、２、または１個）の付加、削減、または置換を有するような、表１に示される配列の変異であってよい。特定の位置のヌクレオチドは、表１に示されるＴ−ＤＮＡ配列内で保存されていて、したがって、これらの位置のヌクレオチドは、典型的に、本明細書において提供される構築物の機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列内で保持されていることに、再度注意すべきである。一部の実施態様では、しかしながら、機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、保存された位置のヌクレオチドの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８０％または少なくとも９０％）が保持されるように、保存された位置の１または２つにおいて突然変異を有することができる。さらに、非機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ＶｉｒＤ１／Ｄ２複合体によりニックを入れられる能力の欠損をもたらす保存領域内の突然変異を含んでよい。そのような境界配列は、保存された位置の、例えば、３個以上（例えば、３、４、５、６、７、または７個よりも多い）において、突然変異を含み得る。
ポリペプチドコード配列は、目的のポリペプチドをコードする構造コード配列、ならびに、５’プロモーター領域およびポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含むことができ、そのそれぞれが、構造コード配列に動作可能に連結され得る。プロモーターは、細胞内で転写を制御する（開始する）ことが可能なＤＮＡ配列である。一部の実施態様では、５’プロモーター領域は、植物に内因性の、または、植物細胞へ自然に入ることが可能な、プロモーター配列（例えば、植物細胞へ自然に入ることが可能な５’ＵＴＲ由来の配列）を含むことができる。例えば、プロモーターは、植物細胞内で転写を制御することが可能な、「植物−発現可能なプロモーター」であってよい。これは、植物起源のプロモーター［例えば、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子プロモーター、発達−特異的なプロモーター、組織特異的なプロモーター（例えば、葉肉−特異的なプロモーター）、種子−特異的なプロモーター、構成的に活性のプロモーター（例えば、Ｕｂｉ１、Ｕｅｐ１、またはＡｃｔ１）、または、器官−特異的なプロモーター（例えば、茎−、葉−、根−、塊茎−、ほふく枝−、毛状突起−、胚珠−、葯−、花粉−、花粉管−、萼片−、または、雌ずい−特異的なプロモーター）］、ならびに、植物細胞における転写を指示することが可能な非植物起源のプロモーター（例えば、ウイルスまたは細菌性起源のプロモーター、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）を含む。構造コード配列に「動作可能に連結され」たプロモーターは、構造コード配列の発現を効率的に制御することができる。したがって、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をＲＮＡへ転写することが可能である場合、構造コード配列は、細胞内のプロモーターの「制御下」であり、「動作可能に連結され」る。
一部の実施態様では、構造コード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼ、または、レアカットエンドヌクレアーゼの一部（例えば、サブユニット）をコードすることができる。用語「レアカットエンドヌクレアーゼ」は、典型的に約１２〜４０ｂｐの長さである認識配列（標的配列）（例えば、１４〜４０ｂｐの長さ；例えば、Ｂａｋｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：２３−２６，２０１２を参照）を含む核酸配列に関するエンドヌクレアーゼ活性を有する天然または操作されたタンパク質を指す。レアカットエンドヌクレアーゼは、一般に、それらの認識部位の内側で切断を生じさせて、３’ＯＨまたは５’ＯＨの突出を有する２〜４ｎｔのスタガードカットを残す。さらに、活性のレアカットエンドヌクレアーゼは、多量体であってよく、または、アクセサリー分子と関連してよい。したがって、レアカットエンドヌクレアーゼは、モノマーのサブユニット、アクセサリー分子、または、標的核酸配列においてエンドヌクレアーゼ活性を与えるのに必要なそれらの組み合わせで構成されてよい。
レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、野生型または変異型ホーミングエンドヌクレアーゼ［例えば、ドデカペプチドファミリー（ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１０）に属するもの；ＷＯ２００４／０６７７３６を参照］のような、メガヌクレアーゼを含む。また、レアカットエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ結合ドメインおよび切断活性を有する触媒ドメインを含む、融合タンパク質も含む。例えば、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）エンドヌクレアーゼおよびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインとＤＮＡ結合ドメインの融合である。カスタマイズされたＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼは、商品名ＴＡＬＥＮ（商標）（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）の下で市販されている。したがって、本明細書において提供される方法は、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ＺＦＮ、およびメガヌクレアーゼの使用を含むことができる。
内因性標的配列を選択する方法、および、そのような配列を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼ）を生産する方法は、他のどこかに記載されるように行なうことができる。例えば、ＰＣＴ文献ＷＯ２０１１／０７２２４６を参照（その全体で参照により本明細書に援用される）。ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属内の植物病原細菌に見られる。これらのタンパク質は、疾患において重要な役割を果たし、または、宿主ＤＮＡに結合してエフェクター特異的な宿主遺伝子を活性化することによって、防御を引き起こす（例えば、Ｇｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４３５：１１２２−１１２５，２００５；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０３：１０５０３−１０５０８，２００６；Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４８−６５１，２００７；Ｓｕｇｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０４：１０７２０−１０７２５，２００７；および、Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１８：６４５−６４８，２００７を参照）。特異性は、エフェクター−典型的に３４アミノ酸の不完全反復数（ｖａｒｉａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔ， ｔｙｐｉｃａｌｌｙ ３４ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｐｅａｔｓ）に依存する（Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １６３：２５６−２７２，２００６；および、ＷＯ２０１１／０７２２４６）。多様性は、主にリピートの１２位および１３位に存在し、それらは本明細書において、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、１つのＲＶＤが１つのヌクレオチドに、直接的な直線状でそれらの標的部位内のヌクレオチドに対応し、一部が縮重していて、明らかなコンテキスト依存性はない。タンパク質−ＤＮＡ認識に関するこのメカニズムは、新たな標的特異的なＴＡＬエフェクターに関する標的部位の予測、ならびに、標的部位の選択および選択部位に関して結合特異性を有する新たなＴＡＬエフェクターの工学を可能にする。
ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、エンドヌクレアーゼ配列に融合することができ、特異的な、選択されたＤＮＡ配列を標的化するキメラエンドヌクレアーゼをもたらし、そして、標的化された配列において、またはその近くで、ＤＮＡのその後の切断をもたらす。一部のエンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）がダイマーとして機能するという事実を用いて、ＴＡＬＥエンドヌクレアーゼの標的特異性を高めることができる。例えば、ある場合には、異なるＤＮＡ配列に対して標的化されたＴＡＬＥエンドヌクレアーゼモノマーのペアを用いることができる。２つのＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ認識部位が極めて接近している場合は、不活性のモノマーが一緒になって、ＤＮＡを切断する機能性酵素を作ることができる。ヌクレアーゼを活性化するためにＤＮＡ結合を要求することによって、高度に部位−特異的な制限酵素を作ることができる。
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法は、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、またはその一部（例えば、サブユニット）の一過性発現を含んでよい。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、ＩＩ型原核生物ＣＲＩＳＰＲ適応免疫系由来の、ＲＮＡガイドＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）−関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ９）に基づいて開発されている新規のゲノム工学ツールである（例えば、Ｂｅｌａｈｊ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：３９，２０１３を参照）。このシステムは、プロト−スペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）として知られる短い配列モチーフが隣接したＤＮＡ配列を切断することができる。切断は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと関連する標的配列に相補である特異的なＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を設計することによって達成される。この複合体では、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）：ｃｒＲＮＡ複合体は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを同起源の標的配列に向かわせるガイドＲＮＡとして作用する。また、それ自体でＣａｓ９エンドヌクレアーゼを標的することが可能な、合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も開発されている。このツールは、本明細書に記載のＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドから遺伝子操作植物細胞へ発現することができる。したがって、一部の実施態様では、ｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼのコード配列は、本明細書に記載のＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドから一時的に発現することができる。一部の実施態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼコード配列およびｓｇＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列は、ＲＢ配列の後に、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミド中にクローン化することができる。一部の実施態様では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ配列およびｓｇＲＮＡ配列またはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列は、ＲＢ配列およびレアカットエンドヌクレアーゼ標的配列の後に、ＲＲＢ−ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミド中にクローン化することができる。すなわち、ＲＢ配列は５’→３’の方向なので、コード配列は、ＲＢ：５’−コード配列−ＲＢ−３’または５’−コード配列−レアカットエンドヌクレアーゼ標的−ＲＢ−３’の上流に位置することができる。本明細書において用いられる、「レアカットエンドヌクレアーゼ標的配列」は、レアカットエンドヌクレアーゼによって特異的に認識されて切断される、ヌクレオチド配列である。
Ｃａｓ９の発現は、制限されないが、構成的プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、またはオクトピンシンターゼプロモーター）、または、組織特異的または誘導性プロモーター（例えば、ｎａｐｉｎプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＰＴＡ２９プロモーター、ＰＴＡ２６プロモーター、ＰＴＡ１３プロモーター、ＸＶＥエストラジオール−誘導性プロモーター、または、エタノール−誘導性プロモーター）を含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターによって制御され得る。ｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡ配列の発現は、例えば、制限されないが、Ｕ６、Ｕ３および７ＳＬを含む、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターによって制御され得る。
一部の実施態様では、ｉｉＴ−ＤＮＡまたはＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡ配列は、植物、植物部位、または植物細胞に移行され得る。植物は、制限されずに、ライ麦、モロコシ、小麦、キャノーラ、綿、カラシナ、ヒマワリ、アルファルファ、クローバー、エンドウ、ピーナッツ、キマメ、アカツメクサ、ダイズ、テパリービーン、タロイモ、キュウリ、ナス、レタス、トマト、ニンジン、キャッサバ、イモ、サツマイモ、ヤマノイモ、バミューダグラス、ペレニアルライグラス、スイッチグラス、トールフェスク、芝草、アメリカニレ、コルクガシ、ユーカリの木、マツ、ポプラ、ゴムノキ、バナナ、柑橘類、コーヒー、パパイヤ、パイナップル、ヒヨコマメ、サトウキビ、アメリカグリ、キャベツ、リンゴ、ブルーベリー、ブドウのつる、イチゴ、クルミ、カーネーション、菊、蘭、ペチュニア、バラ、朝鮮人参、大麻、ケシ、シロイヌナズナ、オート麦、タバコ、および大麦であってよい（または、植物部位または植物細胞は、それら由来であってよい）。
ｉｉＴ−ＤＮＡまたはＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡ配列を、植物、植物部位、または植物細胞へ移行させる適切な方法は、例えば、アグロバクテリウムが介在する形質転換方法を含み、葉外植片、子葉外植片、小板、胚、カルス、および根外植片を形質転換する方法、および、フローラルディップ形質転換を含む（制限されない）。
一部の実施態様では、アグロバクテリウムと接触されている細胞は、植物全体へ再生することができる。植物全体は、それから、レアカットエンドヌクレアーゼのための標的配列における突然変異について、スクリーニングすることができる。再生は、他のどこかに記載される確立された方法を用いて達成することができる（例えば、Ｓｈｒａｗａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｊ ４：５７５−６０３，２００６；Ｓｏｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １３１（３）：８９２−８９９，２００３；Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３５：２０５−２１８，１９９７；Ｖａｓｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ １１１：３４９−３５８，１９９９；および、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：５，２００５を参照）。
しかしながら、本明細書において提供される改変されたＴｉ、Ｒｉ、およびＴ−ＤＮＡプラスミド内の構造コード配列は、ヌクレアーゼコード配列に制限されないことに注意すべきである。実際に、感受性植物細胞（本明細書に記載の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを受け入れ可能な植物細胞）内で一時的に発現されることが求められる任意の導入遺伝子を用いることができる。
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法は、植物細胞中に、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、目的の第一のポリペプチドをコードする第一の配列、および、目的の第二のポリペプチドをコードする第二の配列、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを導入するステップを含むことができる。第一および第二のポリペプチドコード配列は、それぞれ、５’プロモーター領域およびポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域、ならびに、目的のポリペプチドをコードする構造コード配列を含むことができる。Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、ポリペプチドコード配列の５’または３’に位置することができる。第一および第二のポリペプチドコード配列内のプロモーターは、同一であってよく、または互いに異なってよい。同様に、第一および第二のポリペプチドコード配列内の３’非翻訳領域は、同一であってよく、または互いに異なってよい。第一のポリペプチドコード配列内のプロモーター領域および３’非翻訳領域は、目的の第一のポリペプチドをコードする構造コード配列に動作可能に連結されてよく、第二のポリペプチドコード配列内のプロモーター領域および３’非翻訳領域は、目的の第二のポリペプチドをコードする構造コード配列に動作可能に連結されてよい。
一部の実施態様では、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内のＴ−ＤＮＡ領域が、第一および第二のポリペプチドコード配列を含む場合、それぞれのポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼ、または、レアカットエンドヌクレアーゼの一部（例えば、サブユニット）をコードすることができる。例えば、第一および第二のポリペプチドコード配列は、それぞれ、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、またはそれらの一部をコードする、構造コード配列を含むことができる。ある場合には、第一および第二のポリペプチドコード配列によってコードされるレアカットエンドヌクレアーゼ（またはその一部）は、互いに異なってよく、植物細胞における発現の際に、一緒に作用して、標的配列で内因性植物ＤＮＡを切断することができる。
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法は、感受性植物細胞に、遺伝子水平伝播が可能であって、本明細書に記載のＴ−ＤＮＡ領域を有する改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む生物を、導入するステップを含むことができる。植物細胞は、本明細書において提供されるＴ−ＤＮＡ配列によって形質転換することができる場合は、感受性であると考えられる。パターンによって引き起こされる免疫性、エフェクターによって引き起こされる免疫性、または非宿主耐性のような因子のせいで、一部の植物細胞は、うまく形質転換され得ないことに注意すべきである。生物は、例えば、バクテリア（例えば、アグロバクテリウム、エンシファー、または根粒菌）であってよい。
本明細書に記載のように、目的のヌクレアーゼをコードする組込みが阻害されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを保有するアグロバクテリウムを用いた植物組織のインフィルトレーションを用いて、転写および翻訳することのできる転写的に有能なＴ−ＤＮＡを導入することができ、ヌクレアーゼが目的の部位を標的化するのを可能にする。成功的な事象を考えるためには、目的の部位は、Ｔ−ＤＮＡ組込みをせずに、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組み換え（ＨＲ）を通して改変しなければならない。再生された組織由来のゲノムＤＮＡをシーケンスして、部位特異的な突然変異およびＴ−ＤＮＡ組込みの欠如を確認することができる。また、Ｔ−ＤＮＡ組込みの欠如は、プラスミド主鎖をプローブとして用いてサザンブロッティングのような技術を用いて評価することもできる。
一部の実施態様では、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、遺伝子ターゲッティングのための試薬を含むことができる。本明細書において用いられる用語「遺伝子ターゲッティング」は、相同組み換えを用いたゲノムＤＮＡ（例えば、真核生物ゲノムＤＮＡ）の改変を指す。改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、ドナー分子配列、または、ドナー分子配列および染色体配列を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼをコードする配列を含むことができる。ドナー分子は、染色体ＤＮＡ内のレアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の配列またはその近くの配列と、少なくとも約９０％相同（例えば、約９０〜９５％、約９５〜９９％、または１００％相同）である配列を含むことができる。また、ドナーは、染色体ＤＮＡと相同ではない配列を含んでもよいが、染色体ＤＮＡ内のレアカットエンドヌクレアーゼの標的部位における配列またはその近くの配列と少なくとも約９０％相同である配列が隣接している。成功的な遺伝子ターゲッティングの後に、非相同配列を、宿主ゲノム中に組み込むことができる。
別の実施態様では、レアカットエンドヌクレアーゼ、または、レアカットエンドヌクレアーゼおよびドナー分子によって導入される、遺伝子改変は、選択可能またはスクリーニング可能な表現型を、植物、植物部位、または植物細胞に与えることができる。選択可能な表現型は、制限されずに、除草剤耐性または抗生物質耐性であってよい。スクリーニング可能な表現型は、例えば、蛍光タンパク質の発現、β−グルクロニダーゼの発現、または、特定の遺伝子改変であってよい。一部の実施態様では、選択可能な表現型は、改変された細胞が植物全体に再生するのを助けることができる。
一部の実施態様では、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、構造コード配列とともに一時的に発現することのできるレポーター配列を含むことができ、したがって、形質転換が成功であったかどうかを決定するのを容易にさせて、Ｔ−ＤＮＡ配列がゲノムＤＮＡに組み込まれていないことを確認するためのスクリーニングツールを提供する。有用なレポーターは、制限されずに、視覚的レポーター［例えば、ＹＦＰおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）］、および抗生物質耐性遺伝子（例えば、ｂａｒ、ｐｍｉ、ｎｐｔＩＩ、ａｌｓ、ｅｐｓｐｓ、およびｈｐｈ）を含む。
一部の実施態様では、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ境界配列において、またはそれに隣接して、重複および逆位配列を含むことができる。重複および逆位の標的配列は、一本鎖および二本鎖ＤＮＡにおけるステムループ構造の形成を促進することができる。例えば、Ｔ−ＤＮＡプラスミドからのリリース後、重複および逆位配列は、ステムループの形成を促進することができる。このステムループは、フリーのＤＮＡ末端の立体障害に起因して、Ｔ−ＤＮＡ組込みにとって不都合であり得る。宿主ポリメラーゼによって一本鎖ＤＮＡが二本鎖Ｔ−ＤＮＡ分子に変換された時点で、重複および逆位配列は、二本鎖ステムループの形成を促進することができる。一本鎖ＤＮＡ内のステムループと同様に、二本鎖ステムループは、フリーのＤＮＡ末端の立体障害を通してＤＮＡ組込みを減らし得て、それにより、Ｔ−ＤＮＡ末端を組込みにとって不都合にさせる。
一部の実施態様では、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の下流に、レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位を含むことができる。この標的部位は、Ｔ−鎖境界配列がＶｉｒＤ１／ＶｉｒＤ２複合体によってニックを入れられるのを可能にすることができ、その後に境界配列へのＶｉｒＤ２の共有結合が続き、それは、新生のＴ−鎖を植物細胞の核へ向かわせる。Ｔ−鎖が核に入った時点で、植物組織は、転写されるのが可能であるようにＴ−鎖二本鎖を作ることができる。コードされるレアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、植物のゲノムＤＮＡの部位特異的な突然変異誘発を可能にすることができ、ならびに、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の下流のレアカットエンドヌクレアーゼの標的部位で二本鎖切断を作る。そのような切断は、境界配列および共有結合されたＶｉｒＤ２をＴ−鎖から解離させて、組込みの可能性をさらに低減させることができる（Ｍｙｓｏｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｌａｎｔ−Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，１１（７）：６６８−６８３，１９９８）。
したがって、本書類は、遺伝子水平伝播が可能であって、そして、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位、および、ポリペプチドコード配列を含む、Ｔ−ＤＮＡ領域（ここで、レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位はＴ−ＤＮＡ境界の下流である）を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む生物に、植物細胞を導入することによって、植物細胞内でポリペプチドを一時的に発現するための方法も提供する。本明細書に記載されるように、ポリペプチドコード配列は、５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、およびポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含むことができ、ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、構造コード配列に動作可能に連結される。
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法は、遺伝子改変植物細胞を生産するために、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを用いるステップを含むことができる。そのような方法は、（ｉ）Ｔ−ＤＮＡ領域が植物細胞ゲノム中に組み込まれないように（例えば、突然変異または欠損によって）突然変異されている、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および（ｉｉ）レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、ポリヌクレオチド配列（ここで、ポリヌクレオチド配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットが植物細胞内で一時的に発現されるように、植物細胞内で誘導されるプロモーターに動作可能に連結される）、を含むＴ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを、感受性植物細胞中に導入するステップを含むことができる。また、当該方法は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現が、特異的な切断活性によってゲノム改変をもたらしている植物細胞を選択するステップも含むことができる。一部の実施態様では、当該方法は、ゲノム改変を有するとして特定された植物細胞から、植物全体を再生するステップをさらに含むことができる。
したがって、本開示は、遺伝子編集の一般的な方法を提供し、ここで、植物細胞ゲノムは、Ｔ−ＤＮＡを用いて改変することができるが、植物細胞ゲノム中へのＴ−ＤＮＡの組込みを伴わない。当該方法は一般に、（ａ）レアカットエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼサブユニットをコードして境界機能性配列をたった１つ有するまたは有さないＴ−ＤＮＡを、植物細胞中に導入するステップ、（ｂ）植物細胞内で、レアカットエンドヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼサブユニットを一時的に発現するステップ、（ｃ）レアカットエンドヌクレアーゼによって標的化された遺伝子座において遺伝子改変が観察される植物細胞を選択するステップ、および場合により、（ｄ）選択された植物細胞から、植物全体を再生するステップ、を含む。
本明細書に記載の、新規の植物形質は、アグロバクテリウムのような遺伝子水平伝播が可能な生物を用いて、導入遺伝子、具体的にはＴ−ＤＮＡ導入遺伝子の挿入をせずに生じ得る。本明細書に記載の方法を用いて再生される植物は、レアカットエンドヌクレアーゼによって誘導された突然変異を有することができ、それは、安定的に遺伝性であって、適応した価値ある新たな作物変種を得るための他の生殖質との雑種であってよい。遺伝子編集が外来ＤＮＡ配列を組み込まない場合（例えば、標的化された遺伝子座が単に突然変異され、または修復された場合）、生じる植物は、それらのゲノム内に外来ＤＮＡを含まないので、非ＧＭＯと考えられ得る。
一部の実施態様では、本明細書において提供される方法は、遺伝子水平伝播が可能であって、そして、第一のＴ−ＤＮＡ境界配列と同一または異なってよい第二のＴ−ＤＮＡ境界配列、および第二のポリペプチドコード配列、または、第二のＴ−ＤＮＡ境界配列、第二のポリペプチドコード配列、および第三のポリペプチドコード配列を含む、Ｔ−ＤＮＡ領域を有する、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む、第二の生物に、植物細胞を導入するステップをさらに含むことができる。そのような実施態様では、第二および／または第三のポリペプチドコード配列（単数または複数）は、５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、およびポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含むことができ、ここで、５’プロモーター領域および３’非翻訳領域は、構造コード配列に動作可能に連結される。第二の（または、第二および第三の）ポリペプチドコード配列は、第一の生物の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内に含まれるポリペプチドコード配列と同一または異なってよい。そのような方法が用いられる場合、第一および第二の生物は、植物細胞に、同時に（例えば、第一および第二の生物を、細胞へそれらを導入する前に、混合または共培養することによって）、または、連続して、導入することができる。例えば、第一の生物を植物細胞に導入することができ、１〜５（例えば、１、２、３、４または５）日のインキュベーションが後に続いて、それから、第二の生物を導入することができる。
本明細書に記載の方法に加えて、本書類は、本明細書に記載の、改変されたＴｉおよびＲｉプラスミド、およびＴ−ＤＮＡプラスミドも提供する。例えば、本書類は、Ｔ−ＤＮＡ境界配列および目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉおよびＲｉプラスミド、およびＴ−ＤＮＡプラスミドを提供し、ここで、ポリペプチドコード配列は、植物細胞内で誘導されるプロモーターに動作可能に連結される。一部の実施態様では、目的のポリペプチドは、レアカットエンドヌクレアーゼ（例えば、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ＺＦＮ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）、または、レアカットエンドヌクレアーゼサブユニットであることができる。加えて、一部の実施態様では、本明細書において提供される、ＴｉおよびＲｉプラスミド、およびＴ−ＤＮＡプラスミドは、レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位をさらに含むことができる。標的部位は、例えば、Ｔ−ＤＮＡ境界配列の下流であってよい。
また、本書類は、本明細書において提供される改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを用いて形質転換された、単離された宿主細胞も提供する。宿主細胞は、例えば、アグロバクテリウム細胞であってよい。
さらに、本書類は、本明細書に記載の、１つまたは複数のＴｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、および／またはＴ−ＤＮＡプラスミドを、場合により、本明細書に記載の方法において用いるための、パッケージング材料および１つまたは複数のさらなる構成要素（例えば、バッファーまたは他の試薬）と組み合わせて含む、組成物および製品を提供する。一部の実施態様では、組成物または製品は、本明細書において提供される改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドによって形質転換された宿主細胞を含むことができる。前記の１つまたは複数のプラスミドおよび／または宿主細胞は、組成物および製品に関して当技術分野で知られているパッケージング材料を用いてパッケージすることができる。さらに、組成物および製品は、ラベル（例えば、パッケージング材料に固定されたタグまたはラベル、パッケージング材料上に印刷されたラベル、または、パッケージ内に挿入されたラベル）を有してよい。ラベルは、パッケージ内に含まれる、組成物（単数または複数）、プラスミド（単数または複数）および／または、宿主細胞を用いて、例えば、遺伝子改変植物、植物部位、または植物細胞を生産することができることを示すことができる。
本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、それは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を制限しない。
実施例１−ＡＬＳ２遺伝子を突然変異誘発するための、配列特異的ヌクレアーゼの設計
ベンサミアナタバコにおいてＡＬＳ２遺伝子を完全に不活化またはノックアウトするために、ＴＡＬＥ−ＮＴ ２．０（Ｄｏｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０：Ｗ１１７−１２２，２０１２）のような、ＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を特異的に特定するソフトウェアを用いて、配列特異的ヌクレアーゼを、タンパク質コード配列のすぐ下流に設計した。ＡＬＳ２遺伝子に関するＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を表２にリスト化する；このＴＡＬＥヌクレアーゼは、ＡＬＳ２＿Ｔ１と指定される。ＴＡＬＥヌクレアーゼは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から得た。
実施例２−酵母における、ＡＬＳ２−Ｔ１ ＴＡＬＥヌクレアーゼ活性
ＡＬＳ２遺伝子を標的化するＴＡＬＥヌクレアーゼの活性を評価するために、他のどこかに記載されるもの（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １８６：７５７−７６１，２０１０）と同様の方法によって、酵母において活性分析を行なった。これらの分析のために、非機能性β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子内にクローン化されたＴＡＬＥヌクレアーゼ認識部位を有する標的プラスミドを構築した。標的部位は、レポーター遺伝子がＴＡＬＥヌクレアーゼによって切断されたらダイレクトリピート間で組み換えが生じて、機能がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に回復するように、β−ガラクトシダーゼコード配列のダイレクトリピートによって隣接させた。β−ガラクトシダーゼ活性は、したがって、ＴＡＬＥヌクレアーゼ切断活性の尺度としての役割を果たした。酵母アッセイでは、ＡＬＳ２＿Ｔ１ ＴＡＬＥヌクレアーゼのペアは、切断活性を示した。切断活性を、ベンチマークのヌクレアーゼ、Ｉ−ＳｃｅＩに標準化した。結果を表３に要約する。
実施例３−組込みが阻害されたＴ−ＤＮＡプラスミドの構築
トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の組込みなしで、所望のヌクレアーゼの一過性発現を達成するために、ＬＢを欠く新規のベクターを合成した。この改変は、ＶｉｒＤ１／ＶｉｒＤ２境界−特異的なエンドヌクレアーゼがＬＢにニックを入れるのを阻害して、効率的な組込みに必要な適切なプロセッシングなしに、Ｔ−ＤＮＡカセットをもたらす。組込みが阻害されたＴ−ＤＮＡ（ｉｉＴ−ＤＮＡ）プラスミドを構築するために、ｐＣＡＭＢＩＡ−１３００（Ｃａｍｂｉａ，Ｃａｎｂｅｒｒａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）プラスミド（図１）を、制限酵素を用いて改変して、左境界を取り除き、以下を含む合成されたカセットを挿入した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）：（ｉ）右境界、（ｉｉ）Ｎｏｓプロモーター、（ｉｉｉ）指向性ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットＡクローニングのための２２個の制限部位を含む、リンカー配列、（ｉｖ）Ｎｏｓターミネーター、（ｖ）ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットＢ（ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットＢカセットは、ＮｏｓプロモーターおよびＮｏｓターミネーターを含む）クローニング目的のための、制限部位、（ｖｉ）Ｎｏｓプロモーター、（ｖｉｉ）核局在化シグナルを有する、黄色蛍光タンパク質、および、（ｖｉｉｉ）Ｎｏｓターミネーター（図２）。このカセットは、ＩＮ−ＦＵＳＩＯＮ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を利用した、改変されたｐＣＡＭＢＩＡ−１３００中へのライゲーションのために合成した。Ｅ．ｃｏｌｉでの検証後、このプラスミドを、制限酵素消化に供して、その後に、ＴＡＬＥヌクレアーゼサブユニットのライゲーションを続けて、所望の産物を産出し（図３）、その時点で、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中に形質転換された。
実施例４−ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを介したＹＦＰの一過性発現
組込みをせずに所望のタンパク質を一時的に発現するｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドの能力を示すために、ＹＦＰを、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ中に形質転換して、２０日にわたる期間、監視する。ｉｉＴｉ処理における蛍光の加速された低下は、一過性発現を示す。この証明は、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉全体への、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（２つの前述の構築物を含む）の針無しシリンジのインフィルトレーションによって達成される。形質転換された葉の蛍光発現レベルを、２０日の時間経過にわたって追う。これらの画像は、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ（Ｂｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ソフトウェアを用いて定量化されて、それは、相対的蛍光ユニット（ＲＦＵ）がｉｉＴ−ＤＮＡおよびコントロールプラスミドの間で比較されるのを可能にする。組込みの低減は、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを接種された細胞における、時間経過全体を通じたＹＦＰ蛍光のより急勾配な低減、ならびに、およそ９区画（ｄｐｔ）でのＹＦＰ蛍光の安定的な発現の欠如によって確認される。
実施例５−ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを介した、ＡＬＳ２ ＴＡＬＥヌクレアーゼの一過性発現
組込みなしで部位特異的な突然変異誘発をもたらすヌクレアーゼの一過性発現を示すために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉全体を、針無しシリンジを用いて、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによってインフィルトレーションした。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの２つの株を試験した：一方は、ＡＬＳ２ ＴＡＬＥヌクレアーゼをコードするｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを含み、他方は、同一のＴＡＬＥヌクレアーゼをコードする従来のＴ−ＤＮＡプラスミドを含む。異なるＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株間でＮＨＥＪ頻度を直接的に比較することにより、相対的なＴ−ＤＮＡ移行効率を間接的に測定することが可能であった。Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉のインフィルトレーションの２日後に、ゲノムＤＮＡを単離して、ＰＣＲによってＡＬＳ遺伝子を増幅させた。生じたＰＣＲ産物を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ消化に供した。ＮＨＥＪ頻度は、計算ＮＨＥＪ頻度＝１００×（１−（１−（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｌｅａｖｅｄ）１／２）を用いて、バンド強度に基づいて定量化した。驚くべきことに、同様の突然変異頻度が、ｉｉＴ−ＤＮＡを含むサンプルおよび従来のＴ−ＤＮＡを含むサンプルに関して観察された（図４）。これらのデータは、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを用いた場合に移行は減じられないことを示した。
実施例６−右境界の近くのステムループ構造を利用した、組込みが阻害されたＴｉプラスミドを介したＡＬＳ２ ＴＡＬＥＮの一過性発現
右境界の近くのステムループ構造（例えば、右境界の約１０００ヌクレオチド以内；図５）を利用して、ヌクレアーゼの一過性発現が、組込みなしで部位特異的な突然変異誘発をもたらすことを示すために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉全体を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（上述）を用いて針無しシリンジを介してインフィルトレーションして、ＮＨＥＪおよび組込み頻度を、ステムループｉｉＴ−ＤＮＡとコントロールプラスミドとの間で比較する。これらのデータは、４５４ディープシーケンシングを介してＮＨＥＪ頻度を、および、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＴ−ＤＮＡ組込みを調査するために、葉全体の７区画（ｄｐｔ）のインフィルトレーションされた領域から葉片を取った後に得られる。
実施例７−従来のＴ−ＤＮＡプラスミドと比較した、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドによる低減された組込みの検証
ＬＢの除去が、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドと比較して、安定した組込みの頻度を低減させることを示すために、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの子葉を、フローラルディップ法（Ｃｌｏｕｇｈ ａｎｄ Ｂｅｎｔ，Ｐｌａｎｔ Ｊ，１６：７３５−７４３，１９９８）を用いてアグロバクテリウムによって形質転換した。Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの２株を試験した：一方は、カナマイシン選択可能なマーカーをコードするｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを含み、他方は、同一のカナマイシン選択可能なマーカーをコードする従来のＴ−ＤＮＡプラスミドを含む。しかしながら、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドとは異なり、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドは、カナマイシンストップコドンの下流に独特なＫｐｎＩ制限部位を含み、それにより、従来のＴ−ＤＮＡ配列の同定を、植物ゲノム中への組込み後に可能にした。２つの異なるアグロバクテリウム株は、ＯＤ６００＝０．６まで生育させて、その時点で、再懸濁された培養物を１：１比で混合した。それから、この混合物を用いて、標準的な形質転換プロトコル（Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９−１２３１，１９８５）を用いて、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍの子葉を形質転換した。形質転換された子葉は、シュートが再生されるまで、カナマイシン選択の下で６〜８週間、選択再生培地上で生育させて、その時点で、シュート組織を破壊してＤＮＡ抽出に供した。それから、抽出されたＤＮＡを、ＮｐｔＩＩ耐性遺伝子を増幅するように設計されたＰＣＲで用いた。生じたアンプリコンを、ＫｐｎＩ制限酵素消化に供して、どのＴ−ＤＮＡが宿主ゲノム中に組み込まれたかを決定するための、個々の形質転換事象のハイスループットスクリーニングを可能にした。この方法を用いて、従来のＴ−ＤＮＡと比較して約１０倍低い組込み事象がｉｉＴ−ＤＮＡで観察されて、ＬＢ配列の除去が、Ｔ−ＤＮＡ組込みを効率的に阻害することが示された。結果を表４に要約する。
実施例８−除去可能な右境界を利用した、ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドを介したＡＬＳ２ ＴＡＬＥＮの一過的発現
ヌクレアーゼの一過性発現が、除去可能なＲＢ（図６）を利用して、組込みなしで部位特異的な突然変異誘発をもたらすことを示すために、Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉全体を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（上述）を用いて、針無しシリンジを介してインフィルトレーションして、そして、ＮＨＥＪおよび組込み頻度を、除去可能な右境界（ＲＲＢ）−ｉｉＴ−ＤＮＡとコントロールプラスミドとの間で比較する。これらのデータは、４５４ディープシーケンスを介してＮＨＥＪ頻度を、およびｑＲＴ−ＰＣＲによってＴ−ＤＮＡ組込みを調査するために、葉全体の７区画（ｄｐｔ）のインフィルトレーションされた領域から葉片を取った後に得られる。
実施例９−ｉｉＴ−ＤＮＡの低減された組込み
ＬＢの除去が、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドと比較して、安定した組込みの頻度を低減させることを示すために、アグロバクテリウムのフローラルディップ方法を用いて、シロイヌナズナを形質転換する。組込み頻度を決定するために、２つの異なるアグロバクテリウム株を、ＯＤ６００＝０．６まで生育させて、その時点で、再懸濁された培養物を１：１比で混合する。この混合物を用いて、フローラルディップ方法を介してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａを形質転換する。植物を、長角果が乾くまでさらに３〜５週生育させて、この時点で、種を採取して、形質転換されている種のみを選択するために、カナマイシンを含む寒天中で生育させる。それから、耐性の種を生育させて遺伝子型を同定して、ｉｉＴ−ＤＮＡまたは従来のＴ−ＤＮＡのどちらのプラスミドが、耐性の要因となっているかを決定する。ｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドは、従来の−Ｔ−ＤＮＡプラスミドよりも低い組込み頻度を示すはずである。
実施例１０−右境界に隣接するステムループ構造を利用した、組込みが阻害されたｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドの低減された組込み
ＲＢ配列の近く（例えば、ＲＢの約１０００ヌクレオチド以内）のステムループ構造が、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドと比較して、安定した組込みの頻度を低減させることを示すために、アグロバクテリウムのフローラルディップ方法を用いて、シロイヌナズナを形質転換する。組込み頻度を決定するために、２つの異なるアグロバクテリウム株をＯＤ６００＝０．６まで生育させて、その時点で、再懸濁された培養物を１：１比で混合する。この混合物を用いて、フローラルディップ方法を介してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａを形質転換する。植物を、長角果が乾くまでさらに３〜５週間生育させて、この時点で、種を採取して、形質転換されている種のみ選択するために、カナマイシンを含む寒天中で生育させる。それから、耐性の種を生育させて遺伝子型同定して、ステムループｉｉＴ−ＤＮＡまたは従来のＴ−ＤＮＡのどちらのプラスミドが、耐性の要因となっているかを決定する。ステムループｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドは、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドよりも低い組込み頻度を示すはずである。
実施例１１−除去可能な右境界を利用した、ｉｉＴ−ＤＮＡの低減された組込み
配列特異的なヌクレアーゼによるｉｉＴ−ＤＮＡの切断を通したＲＢの除去が、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドと比較して、安定した組込みの頻度を低減させることを示すために、アグロバクテリウムのフローラルディップ方法を用いて、シロイヌナズナを形質転換した。除去可能なＲＢ ｉｉＴ−ＤＮＡは、ＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡと指定される。組込み頻度を決定するために、２つの異なるアグロバクテリウム株を試験した：一方は、ＴＡＬＥヌクレアーゼおよびカナマイシン選択可能なマーカーをコードする、ＲＲＢ ｉｉＴ−ＤＮＡを含み、他方は、同一のカナマイシン選択可能なマーカーをコードする従来のＴ−ＤＮＡプラスミドを含むが、独特なＫｐｎＩ制限消化配列を有する。アグロバクテリウム株をＯＤ６００＝０．６まで生育させて、その時点で、再懸濁された培養物を１：１比で混合した。この混合物を用いて、フローラルディップ方法を介してシロイヌナズナを形質転換した。植物を、長角果が乾くまでさらに３〜５週間生育させて、その時点で、種を採取して、形質転換されている種のみ選択するために、カナマイシンを含む寒天中で生育させた。それから、耐性の種を生育させて遺伝子型を同定して、ＲＲＢ ｉｉＴｉまたは従来のＴ−ＤＮＡプラスミドのどちらの５プラスミドが、耐性の要因となっているかを決定した。９つの非依存性事象のうち、９つの植物が、従来のＴ−ＤＮＡを含み、ＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡを含む植物はなかった。したがって、ＲＲＢｉｉＴ−ＤＮＡプラスミドは、従来のＴ−ＤＮＡプラスミドよりも低い組込み頻度を示した。
［他の実施態様］
本発明は、その詳細な説明とともに説明されているが、前述の説明は例示を目的とし、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (89)

  1. 植物細胞内でポリペプチドを一時的に発現する方法であって、
    前記方法は、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを、前記植物細胞に導入するステップを含み、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、
    （ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列；および
    （ｂ）５’プロモーター領域、前記ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記ポリペプチドコード配列が前記植物細胞内で一時的に発現されて、そして、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、前記構造コード配列に動作可能に連結される）、
    を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、
    方法。
  2. 請求項１の方法であって、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、機能性でないＴ−ＤＮＡ境界配列を少なくとも１つ含む、
    方法。
  3. 請求項１の方法であって、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、ただ１つのみの、機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列を含む、
    方法。
  4. 請求項１の方法であって、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、いかなる機能性Ｔ−ＤＮＡ境界配列も含まない、
    方法。
  5. 請求項１から４のいずれか一項の方法であって、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、右境界配列を含まない、
    方法。
  6. 請求項１の方法であって、
    前記の導入するステップは、感受性植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物と接触させるステップを含む、
    方法。
  7. 請求項６の方法であって、
    前記の遺伝子水平伝播が可能な生物は、バクテリアである、
    方法。
  8. 請求項２の方法であって、
    前記バクテリアは、アグロバクテリウムである、
    方法。
  9. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、アグロバクテリウム由来である、
    方法。
  10. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列である、
    方法。
  11. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、オクトピンＴｉプラスミド、ノパリンＴｉプラスミド、または、アグロピンＴｉプラスミド由来である、
    方法。
  12. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡは、重複および逆位配列を含む、
    方法。
  13. 請求項１２の方法であって、
    前記の重複および逆位配列は、前記境界配列に隣接する、
    方法。
  14. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内の、前記ポリペプチドコード配列の５’である、
    方法。
  15. 請求項１の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在し、または、植物細胞へ自然に入ることが可能である、
    方法。
  16. 請求項１の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含む、
    方法。
  17. 請求項１の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含み、
    前記方法は、前記プロモーターを誘導するステップをさらに含む、
    方法。
  18. 請求項１の方法であって、
    前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、
    方法。
  19. 請求項１８の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
    方法。
  20. 請求項１８の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
    方法。
  21. 請求項１の方法であって、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、前記構造コード配列とともに一時的に発現されるレポーター遺伝子を含む、
    方法。
  22. 請求項２１の方法であって、
    前記レポーター遺伝子の発現は、視覚的シグナルまたは抗生物質耐性をもたらす、
    方法。
  23. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ領域は、ドナー配列をさらに含む、
    方法。
  24. 請求項２３の方法であって、
    前記ドナー配列の一過的な送達は、遺伝子ターゲッティングをもたらす、
    方法。
  25. 請求項１の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ領域は、５’プロモーター領域、第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列をさらに含み、
    ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記の第二のポリペプチドコード配列が前記植物細胞内で一時的に発現されて、そして、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、前記構造コード配列に動作可能に連結される、
    方法。
  26. 請求項２５の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在する、または、植物細胞へ自然に入ることが可能である、
    方法。
  27. 請求項２５の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含む、
    方法。
  28. 請求項２５の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含み、
    前記方法は、前記プロモーターを誘導するステップをさらに含む、
    方法。
  29. 請求項２５の方法であって、
    前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、
    前記の第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、
    方法。
  30. 請求項２９の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
    方法。
  31. 請求項２９の方法であって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
    方法。
  32. 植物を生産する方法であって、
    請求項１の方法に従って得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、および、
    前記植物細胞を植物中に再生するステップ、を含む、
    方法。
  33. 請求項３２の方法であって、
    前記の再生された植物は、前記レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含む、
    方法。
  34. 植物を生産する方法であって、
    請求項２５の方法に従って得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、前記の第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、および、
    前記植物細胞を植物中に再生するステップ、を含む、
    方法。
  35. 請求項３４の方法であって、
    前記の再生された植物は、前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含む、
    方法。
  36. 植物細胞内でポリペプチドを一時的に発現する方法であって、
    前記方法は、植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な生物に導入するステップを含み、
    前記生物は、
    （ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列；
    （ｂ）レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位；および
    （ｃ）５’プロモーター領域、前記ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域を含む、ポリペプチドコード配列（ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記ポリペプチドコード配列が前記植物細胞内で一時的に発現されて、そして、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、前記構造コード配列に動作可能に連結される）、
    を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む、
    方法。
  37. 請求項３６の方法であって、
    前記遺伝子水平伝播が可能な生物は、バクテリアである、
    方法。
  38. 請求項３７の方法であって、
    前記バクテリアは、アグロバクテリウムである、
    方法。
  39. 請求項３６の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、アグロバクテリウム由来である、
    方法。
  40. 請求項３６の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、Ｔ−ＤＮＡ右境界配列である、
    方法。
  41. 請求項３６の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、オクトピンＴｉプラスミド、ノパリンＴｉプラスミド、または、アグロピンＴｉプラスミド由来である、
    方法。
  42. 請求項３６の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド内の前記ポリペプチドコード配列の５’である、
    方法。
  43. 請求項３６の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在する、または、植物細胞へ自然に入ることが可能である、
    方法。
  44. 請求項３６の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含む、
    方法。
  45. 請求項３６の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含み、
    前記方法は、誘導する前記プロモーターを誘導するステップをさらに含む、
    方法。
  46. 請求項３６の方法であって、
    前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、
    方法。
  47. 請求項４６の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
    方法。
  48. 請求項４６の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
    方法。
  49. 請求項３６の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ領域は、ドナー配列をさらに含む、
    方法。
  50. 請求項４９の方法であって、
    前記ドナー配列の一過的な送達は、遺伝子ターゲッティングをもたらす、
    方法。
  51. 請求項４６の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼの発現は、前記のレアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の二本鎖切断をもたらし、前記Ｔ−ＤＮＡ境界および共有結合されたタンパク質を取り除く、
    方法。
  52. 請求項３６の方法であって、
    前記の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドは、前記構造コード配列とともに一時的に発現されるレポーター遺伝子を含む、
    方法。
  53. 請求項５２の方法であって、
    前記レポーター遺伝子の発現は、視覚的シグナルまたは抗生物質耐性をもたらす、
    方法。
  54. 請求項３６の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ領域は、５’プロモーター領域、第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列をさらに含み、
    ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記の第二のポリペプチドコード配列が前記植物細胞内で一時的に発現されて、そして、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、前記構造コード配列に動作可能に連結される、
    方法。
  55. 請求項５４の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在する、または、植物細胞へ自然に入ることが可能である、
    方法。
  56. 請求項５４の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含む、
    方法。
  57. 請求項５４の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含み、
    前記方法は、前記プロモーターを誘導するステップをさらに含む、
    方法。
  58. 請求項５４の方法であって、
    前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、
    前記の第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、
    方法。
  59. 請求項５８の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
    方法。
  60. 請求項５８の方法であって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
    方法。
  61. 請求項３６の方法であって、
    前記植物細胞を、遺伝子水平伝播が可能な第二の生物に導入するステップをさらに含み、
    前記の第二の生物は、
    （ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列；
    （ｂ）５’プロモーター領域、ポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列（ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記の第二のポリペプチドコード配列が前記植物細胞内で一時的に発現されて、そして、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、前記構造コード配列に動作可能に連結される）
    を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、第二の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む、
    方法。
  62. 請求項６１の方法であって、
    前記の第二の生物は、前記植物細胞に、前記の第一の生物の５日以内に導入される、
    方法。
  63. 請求項６１の方法であって、
    前記ポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域および第二のポリペプチドコード配列の前記５’プロモーター領域は、植物細胞内に天然に存在する、または、植物細胞に自然に入ることが可能である、
    方法。
  64. 請求項６１の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、構成的プロモーターを含む、
    方法。
  65. 請求項６１の方法であって、
    前記５’プロモーター領域は、誘導性プロモーターを含み、
    前記方法は、前記プロモーターを誘導するステップをさらに含む、
    方法。
  66. 請求項６１の方法であって、
    前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、
    前記の第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、
    方法。
  67. 請求項６６の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
    方法。
  68. 請求項６６の方法であって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
    方法。
  69. 請求項６６の方法であって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの発現は、前記レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の二本鎖切断をもたらし、前記の第一のＴ−ＤＮＡ境界および共有結合されたタンパク質を取り除く、
    方法。
  70. 請求項３６の方法であって、
    前記植物細胞に、遺伝子水平伝播が可能な第二の生物を導入するステップをさらに含み、
    前記の第二の生物は、
    （ａ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列；
    （ｂ）５’プロモーター領域、前記の第二のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルを含む３’非翻訳領域を含む、第二のポリペプチドコード配列（ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記構造コード配列に動作可能に連結される）；および
    （ｃ）５’プロモーター領域、前記の第三のポリペプチドをコードする構造コード配列、および、ポリアデニル化シグナルをコードする３’非翻訳領域を含む、第三のポリペプチドコード配列（ここで、前記５’プロモーター領域および前記３’非翻訳領域は、前記の第二および第三のポリペプチドコード配列が前記植物細胞内で一時的に発現されて、そして、前記植物細胞のゲノム中に組み込まれないように、前記構造コード配列に動作可能に連結される）
    を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む、
    方法。
  71. 請求項７０の方法であって、
    前記の第二の生物は、前記植物細胞に、前記の第一の生物の５日以内に導入される、
    方法。
  72. 請求項７０の方法であって、
    前記の第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、
    前記の第三のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、
    方法。
  73. 請求項７２の方法であって、
    前記レアカットエンドヌクレアーゼは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、
    方法。
  74. 請求項７２の方法であって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
    方法。
  75. 請求項７０の方法であって、
    前記Ｔ−ＤＮＡ領域は、ドナー配列をさらに含む、
    方法。
  76. 請求項７５の方法であって、
    前記ドナー配列の一過的な送達は、遺伝子ターゲッティングをもたらす、
    方法。
  77. 請求項７２の方法であって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの発現は、前記レアカットエンドヌクレアーゼの標的部位の二本鎖切断をもたらし、前記の第一のＴ−ＤＮＡ境界および共有結合されたタンパク質を取り除く、
    方法。
  78. 植物を生産する方法であって、
    請求項３６の方法に従って得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、および、
    前記植物細胞を植物中に再生するステップ、
    を含む、
    方法。
  79. 請求項７８の方法であって、
    前記の再生された植物は、前記レアカットエンドヌクレアーゼの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含む、
    方法。
  80. 植物を生産する方法であって、
    請求項５４の方法に従って得られる植物細胞を提供するステップ（ここで、前記ポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードし、前記の第二のポリペプチドコード配列は、レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする）、および、
    前記植物細胞を植物中に再生するステップ、
    を含む、
    方法。
  81. 請求項８０の方法であって、
    前記の再生された植物は、前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現によって生じた１つまたは複数の突然変異を含む、
    方法。
  82. 改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドであって、
    ｉ）ただ１つのみの、Ｔ−ＤＮＡ境界配列；および
    ｉｉ）植物細胞内で誘導されるプロモーターに動作可能に連結された、レアカットエンドヌクレアーゼまたは１つまたは複数のレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、ポリヌクレオチド配列
    を含むＴ−ＤＮＡ領域を含む、
    改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド。
  83. 請求項８２の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドであって、
    前記Ｔ−ＤＮＡは、重複および逆位配列を含む、
    改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド。
  84. 請求項８３の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドであって、
    前記の重複および逆位配列は、前記境界配列に隣接する、
    改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド。
  85. 請求項８２の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドであって、
    前記のレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットは、ＴＡＬエフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ由来である、
    改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド。
  86. 請求項８２の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドであって、
    前記プラスミドは、前記レアカットエンドヌクレアーゼのための標的部位をさらに含み、
    前記標的部位は、前記Ｔ−ＤＮＡ境界配列の下流である、
    改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミド。
  87. 請求項８２の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む、
    製品。
  88. 請求項８２の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを含む、
    組成物。
  89. 請求項８２の改変されたＴｉ、Ｒｉ、または、Ｔ−ＤＮＡプラスミドを用いて形質転換された、
    単離された宿主細胞。
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