JP6924181B2 - 植物形質転換におけるメッセンジャーrna安定性の改変 - Google Patents
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Description
N.benthamiana内のALS2遺伝子を完全に不活性化またはノックアウトするために、TALEヌクレアーゼ認識部位を特異的に同定するソフトウェア(例えば、TALE−NT2.0;Doyle et al.,Nucleic Acids Res 40:W117−122,2012)を用いて、ALS2タンパク質コード配列のすぐ下流の配列を標的化する配列特異的ヌクレアーゼを設計した。ALS2遺伝子に関するTALE−ヌクレアーゼ標的部位を図1に示し、以下の表1にも示す;このTALE−ヌクレアーゼペアは、ALS2_T1と指定される。TALE−ヌクレアーゼは、Cellectis Bioresearch(Paris,France)から得られた。
ALS2遺伝子を標的化するTALE−ヌクレアーゼの活性を評価するために、他のどこかに記載のもの(Christian et al.,Genetics 186:757−761,2010)と同様の方法を用いて、酵母において活性アッセイを実施した。これらのアッセイのために、非機能性β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子内にTALE−ヌクレアーゼ認識部位がクローニングされた標的プラスミドを構築した;PEGが介在する形質転換(Sigma;St.Louis,MO)を用いて、プラスミドを酵母に形質転換した。標的部位を含む配列は、レポーター遺伝子が、TALE−ヌクレアーゼペア(翻訳伸長因子EF−1α(TEF1)プロモーターによって発現される)によって切断されたら、組み換えがダイレクトリピート間で生じて、機能がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子に回復されるように、β−ガラクトシダーゼコード配列のダイレクトリピートによって隣接された。β−ガラクトシダーゼ活性は、したがって、TALE−ヌクレアーゼ切断活性の尺度としての役割を果たした。酵母アッセイでは、ALS2_T1 TALE−ヌクレアーゼペアは、切断活性を示した。活性を、ベンチマークのヌクレアーゼ、I−SceIに標準化した。結果を表2に要約する。
標的細胞のゲノムへの外因性DNAの組込みを伴わずに所望のヌクレアーゼの一過性発現を達成するために、At1G09740(配列番号10および11)、At5G28050(配列番号12および13)、アクチン(配列番号14および15)、または、At4G16190(配列番号16および17)のいずれか由来の5’および3’UTRを含むmRNA発現ベクターを合成した(図3)。これらのUTRを発現構築物に加える効果を評価して、NHEJ頻度によって測定されるヌクレアーゼまたはヌクレアーゼmRNAに関する増大した安定性および/または翻訳効率のレベルを決定した。高いmRNA発現プラスミドを構築するために、制限酵素を用いてpSP72プラスミド(Promega;Madison,WI)(図2)を改変して、(i)5’UTR配列、(ii)リンカー配列、および(iii)3’UTR配列を含む、合成カセット(Integrated DNA Technologies;Coralville,IA)を挿入した。このカセットを合成して、付着端制限部位ライゲーションを用いて改変pSP72にライゲーションした。E.coliでの検証後に、このプラスミドを制限酵素消化に供して、その後にTALE−ヌクレアーゼサブユニットのライゲーションをして、所望の産物を得た(図4)。
N.benthamiana内の内因性標的部位におけるTALE−ヌクレアーゼ活性を、プロトプラストにおいて、At1G09740(配列番号10および11)、At5G28050(配列番号12および13)、アクチン(配列番号14および15)、または、At4G16190(配列番号16および17)のいずれか由来の5’および3’UTRに動作可能に連結されたTALE−ヌクレアーゼを発現することによって測定して、その後に、NHEJによって導入された突然変異に関する標的部位を調べた。プロトプラスト調製のための方法は、他のどこかに記載のとおりに行なった(Wright et al.,Plant J.44:693−705,2005)。手短には、種子を、100%エタノール、50%漂白剤およびそれから滅菌蒸留水を用いて連続的にそれらを洗浄することによって滅菌した。滅菌された種子を、鉄で補充されたMSアガロース培地上に植えた。プロトプラストを、Wright et al.(上記)によって記載されるプロトコルを用いて、若い広がった葉から単離した。
ヌクレアーゼ送達に関してDNAよりもmRNAを用いることの利点は、外来DNAを含まない植物が作られる可能性がより高いことであり、このことは、ゲノム操作を通して作られる作物品種に関する規制負荷を減らし得る。この仮定と一致して、454ピロシーケンスデータからの挿入/欠失(インデル)突然変異プロファイルの分析は、mRNAおよびDNA試薬によって作られる突然変異のタイプにおいて大きな不一致を明らかにした。mRNAを用いて形質転換された細胞に関する1.98%の挿入頻度と比較して、DNA構築物を用いて形質転換された細胞は、6.25%の平均挿入頻度を有した。DNA試薬を用いて作られた挿入のうち、88%は>10bpであり、90bpのメジアン挿入サイズであった(図8)。対照的に、mRNA送達によって生じる挿入のたった24%のみが>10bpであり、3bpのメジアン挿入サイズを有した。DNA形質転換実験に関して、挿入≧10bpの大多数(>90%)は、プラスミドベクター;すなわち、TALENをコードするプラスミド由来の挿入された配列に由来した。対照的に、mRNA形質転換実験に起因する挿入のたった1つのみが、TALENコード配列と一致する挿入(131bp)を有した。この挿入は、発現ベクターがインビトロ転写後にDNase処理によって完全に消化されなかった場合、DNA汚染によって生じた可能性がある。
本発明は、その詳細な説明とともに説明されているが、前述の説明は例示することを意図し、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (21)
- (a)レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、構造コード配列;および
(b)5’非翻訳領域(UTR)、3’UTR、または、5’UTRおよび3’UTRの両方、ここで、前記5’UTRは、配列番号10に示す核酸配列、または、配列番号10と少なくとも95%同一性を有し、mRNAの安定性を増大させる核酸配列を含み、前記3’UTRは、配列番号11に示す核酸配列、または、配列番号11と少なくとも95%同一性を有し、mRNAの安定性を増大させる核酸配列を含む、
を含む核酸であって、
前記の5’UTR、3’UTR、または、5’UTRおよび3’UTRは、前記構造コード配列に動作可能に連結される、
核酸。 - 請求項1の核酸であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なRNAガイドエンドヌクレアーゼである、
核酸。 - 請求項1の核酸であって、
前記核酸は、前記構造コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、
核酸。 - 請求項1の核酸であって、
前記核酸は、配列番号10および配列番号11中のTがUであるという条件で、メッセンジャーRNA(mRNA)である、
核酸。 - 請求項1の核酸であって、
前記核酸は、DNAである、
核酸。 - 請求項1の核酸を含む、
発現ベクター。 - 発現ベクターを合成する方法であって、
(a)プロモーター配列;
(b)レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする構造コード配列;および
(c)配列番号10と少なくとも95%同一性をし、mRNAの安定性を増大させる5’UTR核酸配列
を、一緒に、動作可能に連結するステップを含む、
方法。 - 発現ベクターを合成する方法であって、
(a)プロモーター配列;
(b)レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする構造コード配列;および
(c)配列番号11と少なくとも95%同一性を有し、mRNAの安定性を増大させる3’UTR核酸配列
を、一緒に、動作可能に連結するステップを含む、
方法。 - 植物、植物部分、または植物細胞のゲノム材料を改変する方法であって、
前記の植物、植物部分、または植物細胞に、
(a)前記植物細胞内のゲノム配列を標的化するレアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットをコードする、構造コード配列、および
(b)5’UTR、3’UTR、または、5’UTRおよび3’UTRの両方、ここで、前記5’UTRは、配列番号10に示す核酸配列、または、配列番号10と少なくとも95%同一性を有し、mRNAの安定性を増大させる核酸配列を含み、前記3’UTRは、配列番号11に示す核酸配列、または、配列番号11と少なくとも95%同一性を有し、mRNAの安定性を増大させる核酸配列を含む、
を含む核酸を導入するステップを含み、
ここで、前記の5’UTR、3’UTR、または、5’UTRおよび3’UTRは、前記構造コード配列に動作可能に連結される、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼは、転写アクチベーター様エフェクターエンドヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、または、プログラム可能なRNAガイドエンドヌクレアーゼである、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記核酸は、前記構造コード配列に動作可能に連結されたプロモーターをさらに含む、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記の植物、植物部分、または植物細胞は、双子葉の植物、植物部分、または植物細胞である、
方法。 - 請求項12の方法であって、
前記の双子葉の植物、植物部分、または植物細胞は、アブラナ科、ナス科、マメ科、またはバラ科(Roseacaeae)由来である、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記の植物、植物部分、または植物細胞は、単子葉(monocotyledous)の植物、植物部分、または植物細胞である、
方法。 - 請求項14の方法であって、
前記の単子葉の植物、植物部分、または植物細胞は、イネ科またはユリ科由来である、方法。 - 請求項9の方法であって、前記核酸は、配列番号10および配列番号11中のTがUであるという条件で、mRNAである、
方法。 - 請求項16の方法であって、
前記の導入するステップは、前記核酸の、ポリエチレングリコール(PEG)が介在する形質転換、エレクトロポレーションが介在する形質転換、または、微粒子銃が介在する形質転換を含む、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記核酸は、DNAである、
方法。 - 請求項18の方法であって、
前記の導入するステップは、前記核酸の、PEGが介在する形質転換、エレクトロポレーションが介在する形質転換、微粒子銃が介在する形質転換、または、アグロバクテリウムが介在する形質転換を含む、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記レアカットエンドヌクレアーゼまたはレアカットエンドヌクレアーゼサブユニットの一過性発現は、前記の標的化された配列において部位特異的な突然変異誘発をもたらす、
方法。 - 請求項9の方法であって、
前記の植物細胞または植物部分を、植物に再生させるステップをさらに含む、
方法。
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