CN1351668A - 农杆菌介导的棉花转化的改进方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生产转基因棉花植物的改进方法,包括在植物酚类化合物存在下共培养棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞,该农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T－DNA边界上的目标DNA片段。

Description

农杆菌介导的棉花转化的改进方法
本发明涉及植物转化领域，具体地说涉及一种农杆菌(Agrobacterium)介导的棉花转化的改进方法。
棉花是一种重要的农作物，种植棉花主要为了获得棉绒，这为纺织工业提供许多高质量的纤维。棉籽也是一件有价值的商品，因为它提供了油，粗粉和种子外壳的来源。
世界范围种植的棉花的大约90％是陆地棉(Gossypium hirsutumL.)，而海岛棉(Gossypium barbadense)占大约8％。
通过常规育种技术获得了各种品质特性的改进，如对虫害，逆境或者病害的抗性，纤维质量，降低的棉子酚含量，利用分子和遗传技术可以进一步改进这些和其它品质。
有可用于棉花转化的几种方法，包括棉花外植体，如离体的子叶、离体的下胚轴和离体的下胚轴过渡区的农杆菌介导的转化，以及通过对棉花分生组织的微粒轰击的直接基因转化。
Firoozabady等(1987，第10期，植物分子生物学(Plant MolecularBiology)：105-116)描述了通过根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)和转基因植物的再生转化棉花子叶组织的方法。
Umbeck等(1987，第5期，生物/技术(Bio/Technology)：263-266)报告了利用下胚轴作为外植体经由农杆菌在棉花转化上的结果。
PCT出版物(“WO”)89/05344，美国专利(“US”)5,244,802和US 5,583,036提供了通过组织和悬浮培养，用为下胚轴，子叶和不成熟胚的外植体开始再生棉花的方法。也教导了通过选择性生长转化棉花和改良棉花的方法。
WO 89/12102和US 5,164,310涉及一种用于转化和迅速再生植物组织的新方法。该方法使用茎顶端作为目标组织，进而扩大了转化的种的范围和减少体细胞克隆变异的风险。
WO 98/15622提供了用于可育的棉花(Gossypium)植物的体外再生的方法，其中去除和培养来自小苗的过渡区组织的细胞。也描述了用于产生能够向后裔传输外源基因的转基因棉花植物的方法，其中源于小苗的过渡区组织的细胞是转化的目标。
WO 97/12512提供了一种从外植体组织再生棉花植物的方法，它能从不在含外源植物激素的愈伤组织诱导起始培养基上培养的棉花组织外植体，如下胚轴产生胚胎发生愈伤组织。该方法可用于农杆菌介导的棉花植物的转化。
US 5,004,863和US 5,159,135以及欧洲专利出版物“EP”0 270 355都公开了通过把未成熟的棉花组织如下胚轴片段在体外经农杆菌介导的遗传转化，完成棉花植物和品系的遗传转化的方法。
WO 97/43430涉及多用途的从顶端和/或节间分生组织的外植体迅速再生棉花植物的方法，它可与已熟知的转化方法如农杆菌介导的转化结合在一起，快速产生具有农艺重要性的遗传工程棉花品种。
WO 92/15675和EP 0 531 506描述了用于粒子介导的棉花转化的方法，无需组织培养或愈伤组织增殖，包括从发芽种子切去胚轴和用携带外源基因的颗粒轰入胚轴中即可直接对优良棉花品系进行遗传工程改良。
Finer和Mc Mullen(1990，植物细胞报告(Plant Cell Reports)，8：586-589)描述了经由胚胎发生悬浮培养物的粒子轰击转化棉花的方法。
McCabe和Martinell(1993，生物/技术11：596-598)描述了通过从切除的胚轴的棉花分生组织的粒子轰击对优良棉花品种的转化方法。
Hansen等(1994，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.)91.7603-7607)曾描述了一种农杆菌菌株，它包含一个组成型的virG突变体(virGN54D)，导致分离的棉花子叶转化效率的提高。
Veluthambi等(1989，细菌学杂志(Journal of Bacteriology)，第171期：3696-3703)描述了在侵染时同时添加乙酰丁香酮和胭脂氨酸显著地增加棉花茎尖转化的方法。
正如Murray等所指出的(1993，转基因植物，第2卷，Academic出版公司p153-168)，现有技术的棉花的农杆菌介导的转化方法有很大的缺点，即从与农杆菌细胞共培养的外植体再生转基因植物需要的时间太长。
而且，另一个问题起因于这一事实：所有描述的农杆菌介导的棉花转化的方法需要从含转化细胞的外植体产生胚胎发生愈伤组织，作为转基因棉花植物再生的中间步骤。因为外植体的所有转化细胞不一定能诱导胚胎发生愈伤组织的起始，用这些方法使得许多有潜力的转基因细胞发生再生损失，结果导致低的转化效率。可能转化的棉花外植体的起始数量的增加以弥补这一损失，在获得再生的转基因棉花植物过程中导致要投入的劳动量的巨大增加。
WO 89/05344曾一般性地建议胚胎发生愈伤组织可用作农杆菌介导的棉花愈伤组织转化的适当的起始材料。然而，在过去十年期间，尚没有报导用胚胎发生愈伤组织与农杆菌共培养成功地生产转基因棉花植物。
在某种程度上，该问题被分生组织的微粒轰击技术所缓和，这种微粒轰击技术导致更大量的转基因棉花品系。然而，产生种系转化的能够把转基因传递给它们后代的棉花植物的频率太低。
因此，就所要求的时间和转化效率两方面而言，本领域在提供用于获得能够把外源掺入的DNA转移到其后代植物的转基因棉花植物的有效方法上尚有缺陷。
发明概要和目的
鉴于现有技术棉花转化方法所具有的前述缺陷，以及其它在上面没有具体论及的缺点，应该明显的是在本领域中尚需要一种转化棉花的方法，它能达到在此以前难以理解的在较短的时间内实现高转化效率。因此本发明的一个首要目的是通过提供一种通过农杆菌介导的转化产生转基因棉花植物，优选可育的转基因植物的方法来满足这一需要，该转化包括在植物酚类化合物存在的情况下，共培养棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞，该农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段。
本发明的另一个目的是提供用于产生转基因棉花植物的方法，其不需要由包含所转化的细胞的棉花外植体产生胚胎发生愈伤组织的步骤，进而减少源于所转化的植物细胞的转化的棉花品系的潜在损失，该转化的植物细胞不能够产生胚胎发生愈伤组织，并且以这种方式提高转化频率。
在第一个方面，本发明涉及一种用于产生转基因棉花植物的方法，该方法包括在棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞共培养之前或共培养期间，在植物酚类化合物存在下培养该农杆菌细胞，所说的农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段。
在另一方面，本发明涉及用于产生转基因棉花植物的方法，该方法包括：i)在植物酚类化合物的存在下，共培养农杆菌细胞和棉花胚胎发生愈伤组织，优选地是来源于棉花籽苗的下胚轴，该农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段，所说的植物酚类化合物选自下组物质：乙酰丁香酮，α-羟基乙酰丁香酮，芥子酸，丁香酸，阿魏酸，邻苯二酚，对-羟基苯甲酸，β-二羟基苯甲酸，3，4-二羟苯甲酸，邻苯三酚，没食子酸和香草醛，浓度范围优选地从大约50μM到大约400μM，共培养的时间是足以产生包含一种转化的棉花细胞的胚胎发生愈伤组织的一段时间，优选地是大约3至4天；ii)从所说的转化细胞再生出转基因棉花植物；以及任选地iii)使所说的转基因棉花植物与另一种棉花植物杂交。
在另一方面，本发明涉及植物酚类化合物，优选乙酰丁香酮，在农杆菌介导的棉花胚胎发生愈伤组织转化上的用途。发明详述
发明人已开发了一种改进和加速的产生转基因棉花植物的农杆菌介导的转化方法，包括在农杆菌介导的棉花胚胎发生愈伤组织的转化期间，优选地在棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞的共培养阶段，利用植物酚类化合物，如乙酰丁香酮。该方法从共培养到转基因棉花植物发育充分移栽至土壤，优选地在温室条件下，平均减少至少大约2-3个月的时间。
由于本发明的改进方法包括利用胚胎发生愈伤组织作为进行转化的起始组织，由包括所转化细胞的棉花外植体产生胚胎发生愈伤组织的步骤被去掉。因而，可以减少来自不能产生胚胎发生愈伤组织的转化植物细胞的转化棉花品系的潜在损失，同时转化频率得到提高。
此外，胚胎发生愈伤组织一旦被诱导起始，就可以直接被保存(只要体细胞克隆变异不干扰再生植物的表型)，这样有利于管理用于转化实验的起始材料的供给。
确实，发明人惊奇地发现农杆菌介导的棉花胚胎发生愈伤组织的转化，使植物酚类化合物，例如但不限于乙酰丁香酮的添加成为必要，优选地在共培养阶段添加。在现有技术中在任何地方都没有建议在所有可能的变量中，包含这种植物酚类化合物将导致成功的农杆菌介导的棉花胚胎发生愈伤组织的转化。
在一实施方案中，本发明涉及在棉花胚胎发生愈伤组织的农杆菌介导的转化期间使用植物酚类化合物。
适合于本发明的“植物酚类化合物”或者“植物酚类”是那些取代的酚类分子，它们能够诱导一种积极的趋化反应，特别是那些能够在包含农杆菌种的Ti-质粒中诱导增加的vir基因表达的酚类物质，特别是包含根癌农杆菌的Ti-质粒。Ashby等描述过用于测量对植物酚类化合物趋化反应的方法(1988，细菌学杂志，170：4181-4187)，同时测量诱导vir基因表达的方法也是熟知的(Stachel等，1985年第318期，自然：624-629；Bolton等，1986年第232期，科学：983-985)。
优选的植物酚类化合物是在植物细胞的创伤渗出物中所发现的那些。最有名的已知植物酚类化合物之一是乙酰丁香酮，它在各种植物的一些受伤和完整的细胞中存在，尽管它有不同的浓度。然而，乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-羟基苯乙酮)不是唯一的能诱导vir基因表达的植物酚类。其它的例子是α-羟基乙酰丁香酮，芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)，丁香酸(4-羟基-3，5-二甲氧基苯甲酸)，阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)，邻苯二酚(1，2-二羟基苯)，对-羟基苯甲酸(4-羟基-苯甲酸)，β-二羟基苯甲酸(2，4-二羟基-苯甲酸)，3，4-二羟苯甲酸(3，4-二羟基-苯甲酸)，邻苯三酚(2，3，4-三羟基-苯甲酸)，没食子酸(3，4，5-三羟基-苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基-苯甲醛)，并且这些酚类化合物是已知的或者预期能够代替具有类似结果的乙酰丁香酮。如本文所使用的，所论及的分子也被称作植物酚类化合物。
植物酚类化合物可以单独使用，或与其它植物酚类结合起来使用。某些化合物，如渗透保护剂(如L-脯氨酸或甜菜碱)，植物激素(特别是NAA)，冠瘿碱，或糖类，当与植物酚类化合物一起添加时预期会协同起作用。
在一优选的实施方案中，本发明涉及一种用于转化棉花植物，即通过导入目标DNA片段到棉花植物细胞的基因组中产生转基因棉花植物的方法，该方法包括：
a)在植物酚类化合物存在下共培养棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞，共培养时间是足以产生包含一种转化的棉花细胞的胚胎发生愈伤组织的一段时间，所说的农杆菌细胞包含可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段，和
b)从所说的转化细胞再生转基因棉花植物。
本发明所提供的方法使用棉花胚胎发生愈伤组织作为与农杆菌细胞共培养的起始材料。如本文所使用的“棉花胚胎发生愈伤组织”或“源于棉花外植体的胚胎发生愈伤组织”指致密的或实心的愈伤组织，源于棉花外植体、在固体培养基上培养，该愈伤组织通过体细胞胚胎发生可再生出一个完整的棉花植株。胚胎发生棉花愈伤组织的这一定义不包括液体培养基中培养的胚胎发生悬浮细胞。
从棉花外植体诱导胚胎发生愈伤组织的方法在本领域中已被公开，例如，在专利WO 97/12512中。
对技术人员来说清楚的是，得到胚胎发生愈伤组织的棉花外植体的来源对于本发明的方法仅仅具有有限的重要性。胚胎发生愈伤组织可以从任何合适的棉花外植体，如但不限于下胚轴，子叶，未成熟或者成熟胚等等获得。
优选地，本文所描述的转化方法中所使用的棉花胚胎发生愈伤组织可通过在不含激素的愈伤组织诱导培养基上培养棉花下胚轴外植体获得，正如WO97/12512所描述的那样。
本文所使用的“共培养”是指在添加抑菌或者杀菌化合物抑制或者除去农杆菌之前，在胚胎发生棉花愈伤组织和农杆菌细胞之间接触的过程。因此，农杆菌介导的转化方法的“共培养阶段”指农杆菌与植物组织最初接触直到抑菌或者杀菌化合物添加到培养基中以便去除或抑制包含目标DNA片段的农杆菌菌株的时间点之间的时间段。
本文所使用的“目标DNA片段”用来描述任何想导入到棉花植物细胞的基因组中的DNA片段，不管它是否编码一种蛋白质或多肽，是否为RNA。确实，一种DNA片段可以主要地为标记而被导入。对目标DNA片段的唯一的先决条件是它应该是“可操作地与至少一个T-DNA边界连接”。
如本文所使用的，“T-DNA边界”包括含有大约25个核苷酸长的序列的DNA片段，它能够被农杆菌菌株的毒性基因产品所识别，优选根癌农杆菌(A.tumefaciens)或者发根农杆菌(A.rhizogenes)菌株，并且足够把可操作地连接的DNA转移到真核细胞，优选植物细胞，特别是足够把可操作地连接的DNA转移并整合到真核细胞的基因组中，优选植物细胞中。很明显，这一定义包括源于野生型质粒的所有天然存在的T-DNA边界，以及任何其功能衍生物，包括化学合成的T-DNA边界。
优选地，目标DNA位于两条T-DNA边界之间，优选位于在T-DNA载体和辅助Ti-质粒之间通过DNA同源片段的单交换能够形成杂种Ti-质粒的T-DNA上。
根据本发明，利用植物酚类化合物增加棉花胚胎发生愈伤组织的农杆菌介导的DNA转化的转化效率，同时可以预期这一影响不依赖于农杆菌寄主的染色体背景，Ti-质粒的类型，辅助-质粒或者使用的T-DNA载体。
特别优选的细菌染色体背景由根癌农杆菌C58C1(Van Larebeke等，1974年第252期，自然：169-170)，A136(Watson等，1975年第123期，细菌学杂志：255-264)或者LBA4011提供(Klapwijk等，1980年第141期，细菌学杂志：128-136)。
在一优选的实施方案中，用来转化与植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株包含LL-succinamopine类型的Ti-质粒，优选地是去臂的，如pEHA101。
本发明的方法也可以与特殊的农杆菌菌株结合起来使用，进一步增加转化效率，如其中vir基因表达和/或其诱导由于突变体或嵌合的virA或virG基因的存在而改变的农杆菌菌株(例如Hansen等，1994，supra；Chen和Winans，1991，细菌学杂志，173：1139-1144；Scheeren-Groot等，1994，细菌学杂志，176：6418-6246)。
在另一个实施方案中，包括一个额外的virG基因拷贝的农杆菌菌株，特别是所谓的来源于pTiBo542的超级virG基因，优选地与多拷贝质粒连接，可以用来进一步增加转化效率。
植物酚类化合物在共培养培养基中的浓度也被认为对转化效率有影响。然而，在一定的浓度范围之内，影响限度是最小的。植物酚类化合物在共培养培养基中的最佳浓度范围可以变化，取决于棉花胚胎发生愈伤组织所来源的种或者品种，但是可以预期大约100μM对许多目的是一种合适的浓度。最理想的浓度也可以取决于所利用的特定的植物酚类化合物的性质，特别取决于它的细胞分裂促进强度。
例如，发现乙酰丁香酮最理想的浓度是大约100μM，但是低至大约25μM的浓度可以用来对转化效率获得一种好的效果。同样地，可以预期至多大约400μM的更高浓度将产生类似的效果。
类似的浓度适用于其它植物酚类化合物，同时依据本发明最理想的浓度通过实验可以很容易地建立。
产生包括转化细胞的棉花胚胎发生愈伤组织的典型共培养时间是大约3天至大约4天，但是可以预期一天的共培养时间可以足以产生至少某些被转化的细胞。此外，可以预期共培养时间不应该超过大约7天。
技术人员清楚的是，除在棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞的共培养期间包含植物酚类化合物之外，通过与植物酚类化合物一起培养足以诱导农杆菌细胞的毒性基因的一段时间也可以预诱导所使用的农杆菌细胞。
此外，可以预期农杆菌细胞与植物酚类化合物预诱导足以诱导农杆菌细胞的毒性基因的一段时间可以不需要在共培养阶段加入植物酚类化合物。
因此，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于转化棉花植物的方法，即通过把目标DNA片段导入棉花植物细胞的基因组产生转基因棉花植物，其中该方法包括：
a)用植物酚类化合物培养包含可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段的农杆菌细胞培养物一段足以诱导所说的农杆菌细胞的毒性基因的时间；
b)共培养棉花外植体来源的胚胎发生愈伤组织和经上述植物酚类化合物培养的所说农杆菌细胞，以产生包含转化的棉花细胞的胚胎发生愈伤组织；和
c)从所说的转化的细胞再生转基因棉花植物。
与植物酚类化合物培养预诱导农杆菌细胞的毒性基因的方法，以及测定农杆菌菌株的毒性基因是否被诱导的方法，在本领域中也是现成的，例如，如同被Stachel等，1985或者Bolton等，1986所描述的。
优化的用植物酚类化合物，特别是乙酰丁香酮诱导农杆菌的方法，例如，已由Vernade等描述(1988年第170期，细菌学杂志，5822-5829)，该文献并入本文供参考。
在共培养之前，农杆菌细胞与植物酚类化合物一起培养足以诱导毒性基因的时间范围从几小时到大约2天，但是，典型地在共培养之前大约1天的培养即足够。同样地，植物酚类化合物的浓度范围从大约50μM到大约400μM，但是，典型地大约100μM对植物酚类化合物是一种优选的浓度。
在共培养之后，优选将棉花胚胎发生愈伤组织进行选择以从未转化的细胞中分开转化的细胞，或至少富积所转化的细胞。
为了这一目的，在本发明的方法中所使用的外源DNA也优选地包含标记基因，其表达允许从非转化的细胞中分开所转化的细胞。这样一种标记基因一般编码一种蛋白质，它从表型上把未转化的细胞与转化的细胞区分开。在一个可选择的标记基因的情况下，通过那个标记基因的表达，一般地提供给细胞对抗生素或对细胞通常有毒的其他化合物的抗性。在植物中，可选择的标记基因这样也编码种蛋白质，赋予对除草剂的抗性，如包含谷氨酰胺合成酶抑制剂(例如phosphinothricin)作为活性成分的除草剂。这样的基因的例子是编码phosphinothricin乙酰转移酶的基因，如 sfr或者 sfrv基因(EP 0 242 236；EP 0 242 246；DeBlock等，1987，EMBO杂志，6：2513-2518)。然而，也有可能的是，不能选择可区别的表现型，如同通常称为可筛选的标记基因的标记基因的情况一样，包括但是不限于，本领域熟知的绿色荧光蛋白(GFP)或者β-葡糖醛酸酶(GUS)或者是β-内酰胺酶。
此外，利用如基于PCR的DNA扩增方法的方法，任何DNA序列，包含目标DNA的序列的一部分，可以用作为标签检验目标DNA片段的存在。
对所转化的胚胎发生愈伤组织细胞的选择优选地在固体培养基上完成，但是也可由在液体培养基中的选择补充或者代替。
不言而喻在进行选择期间，且如果需要的话，在再生阶段，农杆菌的生长必须被抑制，优选地，农杆菌细胞不得不除去。正如在本领域中熟知的，这一点可以通过向培养基加入对农杆菌有毒的抗生素，例如但不限于头孢噻肟达到。
转化的胚胎发生愈伤组织再生为转基因棉花植物品系可按本领域技术人员技能之内的方法，例如但不限于WO 98/15622中描述的再生方法进行。
在一优选的实施方案中，在再生阶段，小的胚被选择进行发芽和发育为成熟植物，优选地把胚胎发生愈伤组织种植在旋转摇床的液体培养基上，和抑制可通过一个筛子，如茶-筛的胚胎发生愈伤组织或体细胞胚的那部分液体悬浮液的萌芽。
如本文所使用的转基因“棉花植物品系”是由一组转基因棉花植物组成的，源于一种在再生过程期间获得的转化的胚胎发生愈伤组织块。一般来说，一种植物品系中的植物是遗传上同一的，并且起源于一个转化事件，这样包括整合在相同的基因组位置的相同转基因。然而，当利用农杆菌介导的DNA转化时，一种植物品系的单个植物可以起源于独立的转化事件，因此可以是互相不同的。当转化频率由植物品系的数量/100个初始的胚胎发生愈伤组织块来表示时，可能是实际转化频率(转化事件/100个初始的愈伤组织块)甚至更高。
本发明的方法特别适宜于所有棉花植物的转化，胚胎发生愈伤组织来源于这些棉花植物(陆地棉和海岛棉)，特别是Coker 312，Coker310，Coker 5Acala SJ-5，GSC25110，FiberMax 819，Siokra 1-3，T25，GSA75，Acala SJ2，Acala SJ4，Acala SJ5，Acala SJ-C1，Acala B1644，AcalaB1654-26，Acala B1654-43，Acala B3991。Acala GC356，Acala GC510，Acala GAM1，Acala C1，Acala Royale，Acala Maxxa，Acala Prema，Acala B638，Acala B1810，Acala B2724，Acala  B4894，Acala B5002，non Acala“picker”，Siokra，“stripper”品种FC2017，Coker 315，STONEVILLE 506，STONEVILLE 825，DP50，DP61，DP90，DP77，DES119，McN235，HBX87，HBX191，HBX107，FC 3027，CHEMBREDA1，CHEMBRED A2，CHEMBRED A3，CHEMBRED A4，CHEMBRED B1，CHEMBRED B2，CHEMBRED B3，CHEMBRED C1，CHEMBRED C2，CHEMBRED C3，CHEMBRED C4，PAYMASTER145，HS26，HS46，SICALA，PIMA S6和ORO BLANCO PIMA以及具有来源于其基因型的植物。
获得的转化棉花植物可以用于常规育种计划以产生更多具有相同特征的转化的棉花植物，或者把目标DNA片段引入到其它相同的或者相关的棉花品种中，同时，还包括这样的育种活动的方法也包括在本发明的范围之内。
下列实施例详尽地描述本发明的方法。除非在实施例中以其它方式说明，所有重组的DNA技术根据标准的操作程序实行，如Sambrook等(1989)分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A LaboratoryMannul)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，纽约，和在美国Ausubel等(1994)分子生物学的当前操作程序，当前的操作程序(Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols，USA)的第一和二卷中所描述的。用于植物分子工作的标准材料和方法在植物分子生物学Labfax(Plant Molecular Biology Labfax)(1993)中被R.D.DCroy描述，由BIOS Scientific Publications Ltd.(英国)和英国BlackwellScientific Publications联合出版。
实施例实施例I：培养基，质粒以及用于实施例中的细菌菌株1.1培养基Min A-葡萄糖(MAG：农杆菌生长培养基)
K2HPO4.3H2O         13.8克/升H2O
KH2PO4               4.5克/升
(NH4)2SO4           1.0克/升
柠檬酸钠                0.5克/升
MgSO4.7H2O           0.4克/升
硫胺素                  5.0克/升
葡萄糖                  2.0克/升
琼脂                    12.0克/升AB培养基(农杆菌生长培养基)AB缓冲液(20×原液)：        K2HPO4              60克/升
                        NaH2PO4.H2O        22.6克/升AB盐(20×原液)：            NH4Cl                20克/升
                        MgSO4.7H2O          6克/升
                        KCl                    3克/升
                        CaCl2.2H2O          0.26克/升
                        FeSO4.7H2O          50毫克/升
如果合适，1升AB培养基含50毫升AB缓冲液，50毫升AB盐，5克/升葡萄糖和12克/升琼脂。培养基100：Murashige & Skoog盐+
30克/升葡萄糖
10毫克/升硫胺素
100毫克/升肌醇
1毫克/升烟酸
1毫克/升吡哆醇
0.5克/升MES缓冲液
pH＝5.8
当需要固体培养基100时，加1.6克/升gelrite和0.75克/升MgCl2.6H2O。培养基104：
Murashige & Skoog盐+
30克/升葡萄糖
10毫克/升硫胺素
100毫克/升肌醇
1毫克/升烟酸
1毫克/升吡哆醇
1克/升硝酸钾
0.5克/升MES缓冲液
pH＝5.8
当需要固体培养基104时，加2.0克/升gelrite和0.94克/升MgCl2.6H2O。培养基700：Stewards Macro元素：
KNO3               0.506克/升
NH4NO3            0.240克/升
MgSO4.7H2O                0.493克/升
KH2PO4                    0.027克/升
CaCl2.2H2O                0.176克/升Stewards Micro元素：
KI                           0.25毫克/升
MnSO4.H2O                 3.84毫克/升
H3BO3                     1.85毫克/升
ZnSO4.7H2O                2.59毫克/升
Na2MoO4.2H2O             0.22毫克/升
CuSO4.5H2O                0.0075毫克/升
CoCl2.6H2O                0.0071毫克/升
FeEDTA                       0.7毫升/升原液，在100毫升水中含有0.54克
                             FeCl3.6H2O和0.74克Na2EDTA
维生素：                     硫胺素             1.5毫克/升
                             吡哆醇             1.0毫克/升
                             烟酸               0.5毫克/升
蔗糖                         20克/升
pH＝6.8
用1克/升的gelrite加0.47克/升的MgCl2.6H2O和2.25克/升的琼脂凝固培养基。培养基701：
与培养基700的组成相同，但是用30克/升葡萄糖
用20克/升琼脂凝固培养基培养基702：
与培养基700的组成相同，但是用5克/升蔗糖
用1.5克/升gelrite 0.71克/升MgCl2.6H2O和5克/升琼脂凝固培养基。1.2质粒和细菌菌株根癌农杆菌菌株A3311
A3311是根癌农杆菌菌株C58C1RifR，包含辅助Ti-质粒pEHA101(Hood等1986，细菌学杂志，168：1291-1301)和T-DNA载体pTHW136。质粒pTHW 136在WO 98/31822中描述。根癌农杆菌菌株A3784
A3784是根癌农杆菌菌株C58C1RifR，包含辅助Ti-质粒pEHA101(Hood等，1986)和T-DNA载体pTCO192。pTCO192类似于pGSV71(WO 98/37212)，并且与后者的不同仅仅在于存在与位于T-DNA边界外部的pEHA101的nptl基因同源的区域。根癌农杆菌菌株A3724
A3724为根癌农杆菌菌株C58C1RifR，包含辅助Ti-质粒pEHA101(Hood等，1986)和T-DNA载体pTSVH9901。
T-DNA载体pTSVH9901来源于T-DNA克隆载体pGSV5(在WO98/31822中描述)，在它的边界序列之间包含嵌合植物可表达bar基因，在CaMV35S启动子的控制下，紧接着胭脂碱合成酶基因来的3′末端形成信号。在它的边界序列之间，T-DNA载体pTSVH9901也包含嵌合植物可表达Cry9C基因，其中编码可读框的Cry9C插入在CaMV35S启动子和3′末端区之间，其中cab22L引导区插入在不翻译的mRNA编码区域中。T-DNA载体还包含一个与pEHA101的nptl基因同源的区域，位于T-DNA边界的外部。根癌农杆菌菌株A3727
A3311为根癌农杆菌菌株C58C1RifR，包含辅助Ti-质粒pEHA101(Hood等，1986)和T-DNA载体pTSHV0203。
T-DNA载体pTSHV0203基于T-DNA克隆载体pGSVS (WO 98/31822)，在它的边界序列之间包含嵌合植物可表达bar基因，在CaMV35S启动子的控制下，紧接着胭脂碱合成酶基因来的3′末端形成信号。在它的边界序列之间，T-DNA载体pTSHV0203也包含嵌合植物可表达Cry1Ab基因，其中编码可读框的CRY1Ab插入在CaMV35S启动子和章鱼碱合成酶基因的3’末端区之间。T-DNA还包含一个与pEHA101的nptl基因同源的区域，位于T-DNA边界的外部。实施例2：在共培养期间包含植物酚类化合物(如乙酰丁香酮)使得可以进行农杆菌介导的胚胎发生棉花愈伤组织的转化。
以下列方法获得胚胎发生棉花愈伤组织：
品种Coker 312的棉籽利用12％的次氯酸钠溶液消毒，单独地在含有2克/升水的gelrite和0.94克/升的MgCl2.6H2O溶液的试管中发芽。试管在27-28℃于暗处培养，10至14天之后，收集籽苗，籽苗的下胚轴被切割成大约1cm的节段，于培养基104(不含植物激素)上在28℃下经16小时的光照和8小时的黑暗处培养。每三周将节段转移到新鲜培养基，直到形成胚胎发生愈伤组织(通常在大约9周之后)。从外植体上分离这一愈伤组织，进一步在培养基104上培养。
农杆菌菌株A 3311细胞在AB培养基或者在MAG培养基上生长，收集并再悬浮于pH为5.2的M104液体培养基中(加或不加100μM乙酰丁香酮(AS))，或MAG培养基中，密度为大约1×109CFU/毫升。收集小的胚胎发生棉花愈伤组织块，在pH 5.2的液体培养基104中洗涤，并且浸没在农杆菌悬浮液中大约20分钟。感染的胚胎发生愈伤组织然后被转移到pH 5.2的固体培养基104上，补充100μM乙酰丁香酮和0.5克/升的酪蛋白氨基酸或者根本不补充，在暗处大约24℃共培养4天。
在共培养阶段之后，愈伤组织块转移到添加50毫克/升卡那霉素和500毫克/升Claforan的选择性培养基104中。
在共培养之后的不同时间间隔，收集胚胎发生愈伤组织样品和用Jefferson等(1987；植物分子生物学报告(Plant Mol.Biol.Rep.)5：387-405)描述的生色底物进行β-葡糖醛酸酶测定。这些检验的结果总结于表1中，以愈伤组织表达GUS-阳性斑点的百分比表示。
作为对照，包括一些利用与A3311共培养的烟草叶盘，利用模拟接种的烟草叶盘或模拟接种的胚胎发生棉花愈伤组织的实验。
从这些结果清楚地看出，对于瞬时表达和在转化的愈伤组织的延长培养之后，在农杆菌介导的胚胎发生愈伤组织的转化期间需要包含乙酰丁香酮。表1.不同参数对农杆菌介导的棉花胚胎发生愈伤组织(棉花EC)转化的影响结果一览表
  组织 农杆菌菌株 农杆菌再悬浮培养基     共培养培养基    4天    11天    4周    6周 8周
棉花EC     无         -             M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC     无         -     M104+100μM AS     0     0     0     0 死亡
棉花EC     无         -     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC     无         - M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311        MAG             M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311        MAG     M104+100μM AS     90     90     50     50 90
棉花EC   A3311        MAG     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311        MAG  M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     95     90     50     70 70
棉花EC   A3311        M104             M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311     M104+100μM AS     5     50     5     15 20
棉花EC   A3311     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311  M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     5     20     30     10 60
棉花EC   A3311   M104+100μM AS             M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311   M104+100μM AS     M104+100μM AS     10     70     30     0 90
棉花EC   A3311   M104+100μM AS     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311   M104+100μM AS  M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     10     50     5     70 80
棉花EC     无        -             M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC     无        -     M104+100μM AS     0     0     0     0 死亡
棉花EC     无        -     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC     无        - M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311       MAG             M104     0     5     0     0 死亡
棉花EC   A3311       MAG     M104+100μM AS     90     90     50     90 80
棉花EC   A3311       MAG     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311       MAG  M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     90     90     50     50 60
棉花EC   A3311       M104              M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311     M104     M104+100μM AS     50     90     50     25  20
棉花EC   A3311     M104     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311     M104  M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     30     70     30     90  50
棉花EC   A3311   M104+100μM AS            M104     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311   M104+100μM AS     M104+100μM AS     30     90     90     80  50
棉花EC   A3311   M104+100μM AS     M104+0.5g/l酪蛋白氨基酸     0     0     0     0 死亡
棉花EC   A3311   M104+100μM AS  M104+100μM AS和0.5g/l酪蛋白氨基酸     30     70     30     50  20
实施例3：利用胚胎发生愈伤组织的农杆菌介导的棉花转化
棉花胚胎发生愈伤组织(EC)的产生在实施例2中描述过。收集胚胎发生愈伤组织块和在pH为5.2的液体培养基104中洗涤。
农杆菌菌株A3784，A3724和A3727在pH 7.0的AB培养基上生长3至4天，收集并以大约1至5×109个细胞/毫升的密度再悬浮于含有100μM乙酰丁香酮、pH为5.2的液体培养基104中。
胚胎发生愈伤组织块浸没在农杆菌悬浮液中最多大约20分钟，转移至pH 5.2、补充有100μM乙酰丁香酮的固体培养基104上，在暗处于24℃共培养4天。
在这一共培养之后，愈伤组织块转移到pH为5.8、没有乙酰丁香酮或者植物激素的选择性培养基104上，补充500毫克/升Claforan(抑制农杆菌细胞的发育)与5毫克/升的phosphinotricin(PPT)(特异性地选择转基因愈伤组织的生长)。
活跃地生长、看起来健康的胚胎发生愈伤组织块，每3周转移到新鲜选择性培养基104上。
部分愈伤组织(大约200毫克)再悬浮于20毫升的液体培养基100中，补充5毫克/升的PPT，在一旋转摇床上的100毫升烧瓶中震荡(每分钟100-120转)培养。
在液体培养基中培养2周之后，把悬浮液通过一个茶筛，分离大的愈伤组织块。胚胎发生悬浮液的通过部分沉降大约20分钟，之后，去掉用过的培养基，用新鲜培养基100代替。取2毫升的含小胚的这种悬浮液涂布于补充5毫克/升的PPT的固体培养基104上，于28℃下培养。
在大约2周之后，把4至10毫米大的发育胚转移至培养基701上，进一步在暗处于28℃培养，更小的胚转移到其上覆盖有灭菌滤纸(含有或没有5mg毫克/升的PPT)的培养基104上以增加尺寸，大到足以转移到培养基701上。
在大约2周之后，将胚转移至培养基702上(加或者不加选择性压力)萌芽，在28℃，16小时光照/8小时黑暗下培养。
将发育好的小植株(可能需要在培养基702上转移2至3次)转移到包含M700的小容器中，当这些小植株发育两至三片真叶时，将它们转移到更大的盛有培养基700的容器中。
当植物在大约10厘米高度时，将它们转移到温室条件下的土壤中生长。
分子分析(如果合适的话，Phosphinotricin乙酰化检验，Southern杂交以及ELISA检测cry基因表达)在愈伤组织水平上完成。
这些实验的结果总结在表2中。
为了比较，根据在本领域中熟知的方法同步完成了农杆菌介导的棉花子叶的转化实验。表2.用棉花子叶或胚胎发生愈伤组织作为起始材料进行的农杆菌介导的转化试验的结果比较NA：不合适；ND：未测定*实验开始与“植物状态”测定之间的时间(以周表示)
试验号   棉花品种 农杆菌菌株 组织 选择的品系    胚胎发生品系   PAT阳性     Elisa     拷贝数 植物状态     时间*(周)
    1   Coker 312   A3784   子叶     108/246     0/108     NA     NA     NA   无再生     21
    2   Coker 312   A3784   EC     13/25     13/13     6/6     NA   1拷贝：1低拷贝：3多拷贝：9   约2cm的小植株     28
    3  Fibermax 819   A3784   EC     98/125     98/98    15/15     NA   进展中   小于2cm的小植株     18
    4   Coker 312   A3724   子叶     190/237     47/190     ND     2/13   小于2cm的小植株     32
    5   Coker 312   A3724   EC     66/275     66/66     22/22     39/63  1拷贝：14低拷贝：9多拷贝：15   16株大于10cm的植株     31
    7   Coker 312   A3727   子叶     94/97     9/94     ND     ND     ND   无再生     32
    8   Coker 312   A3727   EC     84/460     84/84     39/42     33/76   1拷贝：3低拷贝：8多拷贝：12   2cm的小植株     30

Claims (13)

1.一种用于产生转基因棉花植物的方法，该方法包括在棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞共培养之前或共培养期间，在植物酚类化合物存在下培养该农杆菌细胞的步骤，所说的农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段。
2.一种用于产生转基因棉花植物的方法，所说的方法包括：a)在植物酚类化合物存在下共培养棉花胚胎发生愈伤组织与农杆菌细胞，共培养时间是足以产生包含一种转化的棉花细胞的胚胎发生愈伤组织的一段时间，所说的农杆菌细胞包含可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段，和b)从所说的转化细胞再生转基因棉花植物。
3.权利要求书2的方法，其中所说的植物酚类化合物存在的浓度范围从大约50μM到大约400μM。
4.权利要求书2的方法，其中所说的农杆菌细胞在所述酚类化合物存在下共培养大约3至4天。
5.权利要求书2的方法，其中所说的胚胎发生愈伤组织来源于棉花籽苗的下胚轴。
6.权利要求书2的方法，其中所说的植物酚类化合物选自下组物质：乙酰丁香酮，α-羟基乙酰丁香酮，芥子酸，丁香酸，阿魏酸，邻苯二酚，对-羟基苯甲酸，β-二羟基苯甲酸，3，4-二羟苯甲酸，邻苯三酚，没食子酸和香草醛。
7.权利要求书6的方法，其中所说的植物酚类化合物是乙酰丁香酮。
8.权利要求书2的方法，其中所说的农杆菌细胞是根癌农杆菌菌株C58C1(pEHA101)，其还包含目标DNA片段。
9.权利要求书2的方法，该方法还包括将所说的转基因棉花植物与另一棉花植物杂交的步骤。
10.一种通过农杆菌介导的转化产生转基因棉花植物的方法，该方法包括共培养农杆菌细胞和棉花胚胎发生愈伤组织，该农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段，其特征在于所述共培养在植物酚类化合物的存在下进行。
11.植物酚类化合物在棉花胚胎发生愈伤组织的农杆菌介导的转化上的用途。
12.根据权利要求10的用途，其中所说的植物酚类化合物是乙酰丁香酮。
13.一种通过农杆菌介导的转化产生转基因棉花植物的方法，其特征在于在植物酚类化合物存在下共培养农杆菌细胞与棉花胚胎发生愈伤组织，所说的农杆菌细胞含有可操作地连接到至少一个T-DNA边界上的目标DNA片段。
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