CN101600802B

CN101600802B - 病原体诱导型植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因启动子和调控元件

Info

Publication number: CN101600802B
Application number: CN2007800511984A
Authority: CN
Inventors: A·威格; R·阿申齐; 黄翔; S·乔杜里; R-G·甄; Y·韩
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2006-12-12
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2027-12-12
Also published as: US20090271891A1; WO2008071726A2; AR065227A1; WO2008071726A3; EP2099918A2; CA2672083A1; MX2009006148A; BRPI0720194A2; US8546647B2; CN101600802A; WO2008071726A9

Abstract

本发明提供了根特异性和/或寄生性线虫诱导型植物基因启动子和调控元件。本发明的启动子可以用于控制目的核酸在植物根中的表达。

Description

病原体诱导型植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因启动子和调控元件

发明领域

本发明涉及调控与海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)相似的基因转录的启动子和调控元件。本发明的TPP-样基因的启动子可以用于控制任何目的核酸在植物根中的转录。尤其是，本发明的启动子可以用于控制核酸的转录，所述核酸编码赋予植物抗病原体抗性的活性剂。

背景技术

植物生物技术学的一个主要目的是产生具有有利的新特性(例如，增加农业生产力、在食品的情况下提高质量或产生特殊的化学物质或药物)的植物。植物对抗病原体的天然防御机制常常不足。仅真菌疾病就导致数十亿美元的年产量损失。来自植物、动物或微生物来源的外源基因的导入可增强该防御。实例是通过表达在35S CaMV启动子控制下的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素在烟草中产生的抗昆虫摄食损伤的保护作用或通过表达在CaMV启动子控制下的甜菜几丁质酶(chitinase)在烟草中产生的抗真菌感染的保护作用。然而，所述的大多数方法只提供对单一病原体或窄谱病原体的抗性。

具有巨大的农业经济重要性的一大植物活体营养病原体群体是线虫。线虫是以2,000多种中耕农作物(row crop)、蔬菜、水果和观赏植物的根、叶和茎为食的微小圆虫(roundworm)，其在世界范围造成估计一千亿美元的农作物损失。许多寄生性线虫种感染农作物植物，包括根结线虫(RKN)、胞囊线虫和根斑线虫(lesion-forming nematode)。特征在于在摄食位置(feeding site)引起根瘿形成的根结线虫具有相对广的宿主范围，从而在众多农作物种中是致病性的。胞囊-和根斑-线虫种具有较有限的宿主范围，但仍然在易感农作物中造成相当大的损失。

病原性线虫目前遍布美国，在南部和西部的温暖、潮湿区域和沙壤土中最为密集。大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)，大豆植物最严重的害虫，最早于1954年在美国的North Carolina发现。一些区域受到大豆胞囊线虫(SCN)严重侵害以致在无控制措施的情况下大豆的经济生产不再具有可能性。虽然大豆是受SCN攻击的主要经济农作物，但SCN寄生总共大约50种宿主，包括大田农作物、蔬菜、观赏植物和杂草。

线虫损伤的标志包括矮化及叶黄化以及在炎热时期植物的萎蔫。然而，线虫感染可在无任何明显的地上疾病症状的情况下造成重大的产量损失。产量减少的主要原因在于地下根的损伤。被SCN感染的根会变短或生长受阻。线虫感染还可减少根上固氮根瘤的数目，并且可使根更易被其他土壤传播的植物病原体攻击。

线虫的生活周期具有3个主要阶段：卵、幼虫(juvenile)和成虫。该生活周期在线虫的种间是变化的。例如，SCN生活周期通常在最适宜条件下可在24至30天完成，然而其他物种可花费长达1年或更长时间来完成生活周期。当在春天温度和湿度水平变得有利时，蠕虫状的幼虫从土壤中的卵孵出。只有处于幼虫发育期的线虫才能够感染大豆根。

SCN的生活周期已成为许多研究的主题，并由此可用作理解线虫生活周期的有用实例。在穿刺入大豆根后，SCN幼虫在根中移动直至它们接触维管组织，这时，它们停止迁移并且开始摄食。利用口针，线虫注射分泌物改变某些根细胞并且将它们转化成专门的摄食位置。这些根细胞在形态学上被转化成巨大的多核合胞体(或在RKN的情况下转化成巨细胞)，其用作线虫的营养物来源。活跃摄食的线虫由此从植物偷取必需营养物，从而导致产量损失。当雌性线虫摄食时，它们膨胀，最终变得如此巨大以至它们的身体冲破根组织而暴露在根的表面。

在摄食期后，作为成虫不发生膨胀的雄性SCN线虫迁移出根进入土壤并且使膨大的成年雌虫受精。然后雄虫死亡，然而雌虫保持附着于根系统并且继续摄食。膨胀的雌虫中的卵开始发育，最初在身体外的团块或卵囊中，后来在线虫体腔中。最后整个成年雌虫体腔充满卵，线虫死亡。死亡的雌虫的充满卵的身体称为胞囊。胞囊最后脱离根，在土壤中游离存在。胞囊的壁变得非常坚硬，这为内部包含的大约200至400粒卵提供了优良的保护作用。SCN的卵可在胞囊中存活直至合适的孵化条件出现。虽然许多卵可在第一年内孵化，但还有许多卵将在该保护性胞囊内生存数年。

线虫靠其自己的能力每年只可在土壤中移动数英寸。然而，线虫感染可通过许多方式传播相当远的距离。可移动感染的土壤的任何事物都能够传播感染，包括农业机械、运载工具和工具、风、水、动物和农人。种子颗粒大小的土壤通常污染收获的种子。结果，当来自感染的田地的污染的种子被种植在未感染的田地中时，线虫感染可获得传播。甚至有证据表明，某些线虫种类可通过鸟类传播。这些原因中只有一些可被防止。

控制线虫感染的常规实践包括：在线虫感染的土地中保持适当的土壤养分和土壤pH水平；控制其他植物疾病以及昆虫和杂草害；使用卫生措施例如只在完成非感染的田间工作后才耕犁、种植和栽培线虫感染的田地；在完成感染的田间工作后使用高压水或蒸气彻底清洁装备；除非已适当地清洁种子，否则不使用感染的田地中生长的种子来种植未感染的田地；轮作感染的田地并且用非宿主农作物轮替宿主农作物；使用杀线虫剂；和种植抗性植物品种。

已提出用于植物的遗传转化以提供对植物寄生性线虫的增加的抗性的方法。美国专利5,589,622和5,824,876涉及鉴定在线虫附着后特异性地在植物的摄食位置或与之相邻的位置中表达的植物基因。美国专利5,589,622和5,824,876公开了从马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)感染的马铃薯根分离的8个启动子：未公开来自其他植物物种的线虫诱导型启动子。这些启动子据称可以用于指导毒性蛋白或酶的特异性表达，或用于指导针对靶基因或一般细胞基因的反义RNA的表达。

美国专利5,023,179公开了称为ASF-1的从CaMV启动子分离的启动子增强子元件，其据称增强植物基因在根中的表达。

美国专利5,750,386公开了烟草(Nicotiana tabacum)的RB7根特异性启动子的缺失片段，其据称是对线虫起反应的。

美国专利5,837,876公开了从烟草分离并且称为TobRD2的根皮层特异性基因启动子。

美国专利5,866,777公开了延迟线虫摄食结构(feeding structure)形成的两基因法。第一基因芽孢杆菌RNA酶(barnase)位于至少在摄食结构中驱动表达的启动子的控制之下。第二基因芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)在于除了摄食结构外的所有植物细胞中驱动表达的启动子的控制之下。公开于美国专利5,866,777中的摄食位置特异性启动子包括Δ0.3TobRB7和rolC启动子的截短形式。

美国专利5,955,646公开了基于从根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露碱合酶和章鱼碱合酶基因衍生的启动子的嵌合调控区域，其据称是线虫诱导型的。

美国专利6,005,092公开了烟草1，4-β-葡聚糖内切酶(Ntce17)的启动子。

美国专利6,262,344和6,395,963公开了从拟南芥(Arabidopsisthaliana)分离的启动子，其据称是线虫诱导型的。

美国专利6,448,471公开了来自拟南芥的启动子，其是线虫摄食位置特异性的。

美国专利6,703,541公开了玉米过氧化物酶P7X基因和其启动子的克隆和分离，所述启动子据称是线虫诱导型的。

美国专利6,593,513公开了使用在拟南芥1，4-β-葡聚糖内切酶基因(cel1)的启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶转化植物，从而产生能够破坏线虫攻击的植物。

美国专利6,906,241公开了Ntce17启动子与编码杀线虫或杀昆虫蛋白的异源核酸的组合应用。

美国专利7,078,589公开了大豆Pyk20基因和其启动子的克隆和分离，所述启动子据称由SCN感染诱导并且在维管组织中显示强活性。

美国专利申请公开号2003/0167507公开了大豆异黄酮合酶I的启动子，其据称是根特异性的并且在营养组织中可由寄生虫的攻击而被诱导。

美国专利申请公开号2004/0078841公开了拟南芥的TUB-1、RPL16A和ARSK1启动子和来自豌豆(Pisum sativum)的PSMT_A启动子的启动子区域，其全都据称是根特异性的。

美国专利申请公开号2004/0029167公开了来自烟草的II类咖啡酸O-甲基转移酶基因的启动子序列，其据称可响应机械或化学损伤或病源体攻击而被诱导。

美国专利申请公开号2005/0262585公开了来自大豆磷酸核糖基甲酰基甘氨脒核糖核苷酸合酶的启动子和其缺失片段，其据称响应线虫感染。

WO 94/10320公开了来自烟草的Δ0.3TobRB7启动子片段和其用于多种基因的线虫摄食细胞特异性表达的用途。

WO 03/033651公开了称为SCP1、UCP3和SUP的合成的线虫调控的启动子序列。

WO 2004/029222和其美国对应申请美国专利申请公开号2005/0070697公开了来自大豆腺苷-5’-磷酸脱氨酶和肌醇-5-磷酸酶基因的调控区域，用于提高植物中的线虫抗性。

上述根或摄食位置特异性启动子目前没有一个用于包含抗病原体转基因的商业种子。虽然对此类产品的需求很久以来已被公认，但迄今无人通过重组DNA技术成功地开发抗病原体植物。持继需要根特异性和/或线虫摄食位置偏爱性的启动子与编码针对植物寄生性病原体的毒性剂的转基因的组合。

发明概述

本发明提供了适合用于在易于受病原体攻击的植物根中驱动第二多核苷酸表达的启动子多核苷酸。本发明的启动子多核苷酸特别可以用于产生抗病原体侵袭的农业农作物植物。

本发明人已发现，当植物基因启动子包含彼此之间具有特定取向的某些已知调控元件时，这些启动子将共有能被病原体诱导的特征。因此，本发明提供了适合用于在对病体的攻击易感的植物中驱动核酸表达的启动子。病原体优选是线虫。本发明的启动子特别适合用于产生抗病原体侵染的农业农作物植物。

在一个实施方案中，本发明提供了能够介导根偏爱性(root-preferred)或病原体诱导型表达的分离的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸具有启动子构型1，其中启动子多核苷酸具有正链和负链并且包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：20中所示序列的多核苷酸的U$SCN2类元件，其离在正链上包含具有SEQ ID NO：29中所示序列的多核苷酸的U$SCN16类元件大约215个核苷酸之内；在正链上包含具有SEQ ID NO：22中所示序列的多核苷酸的U$SCN13类元件，其离在正链上包含具有SEQ ID NO：21中所示序列的多核苷酸的U$SCN7类元件大约80个核苷酸之内；和在正链上包含具有SEQ ID NO：23中所示序列的多核苷酸的U$SCN6类元件，其离在正链上具有SEQ ID NO：24中所示序列的U$SCN30类元件大约80个核苷酸之内。

在另一个实施方案中，本发明提供了能够介导根偏爱性或病原体诱导型表达的分离的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸具有启动子构型2，其中启动子多核苷酸具有正链和负链，并且以5’至3’的顺序组合地包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：21中所示的序列的多核苷酸的U$SCN7类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：25中所示的序列的多核苷酸的P$OPAQ类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：23中所示的序列的多核苷酸的U$SCN6类元件，其中P$OPAQ类元件离U$SCN7类元件大约200个核苷酸之内，U$SCN6类元件离P$OPAQ类元件大约200个核苷酸之内，以及U$SCN7类元件离U$SCN6类元件大约400个核苷酸之内。

在另一个实施方案中，本发明涉及能够介导根偏爱性或病原体诱导型表达的分离的启动子多核苷酸，所述启动子多核苷酸具有启动子构型3，其中启动子多核苷酸具有正链和负链，并且以5′至3′的顺序组合地包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：20中所示的序列的多核苷酸的U$SCN2类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：26中所示的序列的多核苷酸的U$SCN14类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：22中所示的序列的多核苷酸的U$SCN13类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：25中所示的序列的多核苷酸的P$OPAQ类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：24中所示的序列的多核苷酸的U$SCN30类元件，其中U$SCN14类元件离U$SCN2类元件大约200个核苷酸之内，U$SCN13类元件离U$SCN14类元件大约200个核苷酸之内，P$OPAQ类元件离U$SCN13类元件大约200个核苷酸之内，U$SCN30类元件离第二P$OPAQ类元件大约200个核苷酸之内，以及U$SCN2类元件离U$SCN30类元件大约800个核苷酸之内。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含能够介导根偏爱性或病原体诱导型表达的分离启动子多核苷酸的启动子，其中启动子多核苷酸选自a)具有SEQ ID NO：1、2或3中所示的序列的多核苷酸；b)包含具有SEQ IDNO：1中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1557至1907或核苷酸1498至1999或核苷酸1349至199的多核苷酸；c)包含具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1650至2000或1460至2110的多核苷酸；d)包含具有SEQ ID NO：3中所示的序列的多核苷酸的核苷酸491至841或350至1000的多核苷酸；e)与a)至d)的任一个多核苷酸具有至少70％的序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)至d)的任一个多核苷酸杂交的多核苷酸；g)包含a)至d)的任一个多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和h)包含具有SEQ ID NO：1、2或3中所示的序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。

本发明还涉及包含本发明的启动子多核苷酸的表达盒和转基因植物，以及产生病原体抗性植物或控制农作物中寄生性病原体侵染(infestation)的方法，其中该方法使用包含与编码如下活性剂的核酸有效连接的本发明启动子的重组核酸构建体，所述活性剂破坏植物寄生性病原体的新陈代谢、生长和/或生殖，提供或提高植物对植物寄生性病原体的抗性或对植物寄生性病原体有毒性，从而可以减少农作物损害。

附图概述

图1：拟南芥基因座At1g35910的启动子区域(pAW284)的序列(SEQID NO：1；TATA框核苷酸1871-1877以小写字母、粗体和斜体标示)，包括包含在SEQ ID NO：1中所示启动子的大约核苷酸1350-1999内的、启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中存在的启动子构型元件种类的表。

图2：拟南芥基因座At5g10100的启动子区域(pAW281)的序列(SEQ IDNO：2)，包括包含在SEQ ID NO：2中所示启动子的大约核苷酸1461-2110内的、启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中存在的启动子构型元件种类的表。

图3：大豆(Glycine max)cDNA克隆48986355的启动子区域(RAW403)的序列(SEQ ID NO：3；TATA框核苷酸808-814以小写字母、粗体和斜体标示)，包括包含在SEQ ID NO：3中所示启动子的大约核苷酸351-1000内的、启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中存在的启动子构型元件种类的表。

图4：大豆cDNA克隆48986355的序列。

图5：pAW260基因组步移衍生序列的序列(SEQ ID NO：5)。

图6：质粒AW284qcz图谱。

图7：质粒AW281qcz图谱。

图8：质粒RAW403图谱。

图9：二元载体pAW284qcz、pAW281qcz和RAW403在实施例4中所示的大豆毛根(hairy root)测定试验中的β-葡糖醛酸酶表达模式。在SCN接种后12天对大豆胞囊线虫感染的毛根和对照未感染的毛根进行染色。使用下列评分指标：“-”表示无GUS染色，“+”表示弱GUS染色，“++”表示强GUS染色。

图10：质粒RAW450图谱。

图11：质粒RAW451图谱。

图12：二元载体pAW284qcz、RAW450和RAW451在实施例7中所示的大豆毛根测定试验中的β-葡糖醛酸酶表达模式。在SCN接种后12天对大豆胞囊线虫感染的毛根和对照未感染的毛根进行染色。使用下列评分指标：“-”表示无GUS染色，“+”表示弱GUS染色，“++”表示强GUS染色。

图13：启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3的启动子元件种类在拟南芥基因座At1g35910的启动子(SEQ ID NO：1)、拟南芥基因座At5g10100的启动子(SEQ ID NO：2)和大豆cDNA克隆48986355启动子(SEQ ID NO：3)中的定位。

图14：用于获得SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3的启动子、基因座At1g35910的拟南芥启动子(SEQ ID NO：1)的986bp缺失和基因座At1g35910的拟南芥启动子(SEQ ID NO：1)的502bp缺失的PCR引物。

图15a-c：大豆cDNA克隆48986355(SEQ ID NO：4)和靶向cDNA克隆48986355的pAW260中包含的基因组步移产生的大豆序列(SEQ IDNO：5)的序列比对。大豆cDNA克隆48986355(SEQ ID NO：4)的ATG起始密码子始于核苷酸位置102。1000bp的推定的启动子区域由SEQ ID NO：3描述并且来源于pAW260序列(SEQ ID NO：5)的核苷酸位置32至1031。

图16a-c：比较SEQ ID NO：1的核苷酸1350至1999(相应于At1g35910pr650bp的核苷酸位置1至650)、SEQ ID NO：2的核苷酸1461至2110(相应于At5g10100pr650bp的核苷酸位置1至650)和SEQ ID NO：3的核苷酸351至1000(相应于48986355pr650bp的核苷酸位置1至650)的Genomatix DiAlign结果。星号(＊)标示输入序列之间相对的局部相似性程度。最大可能相似性用10个‘＊’符号表示。

图17：启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3中发现的启动子元件种类的空间图示(未按确切比例)，包括启动子元件种类共有序列。在标题为“元件IUPAC字符串共有序列”的栏中，使用下列缩写：A＝腺嘌呤，C＝胞嘧啶，G＝鸟嘌呤，T＝胸腺嘧啶，R＝A或G，Y＝C或T，M＝A或C，K＝G或T，W＝A或T，S＝C或G，以及N＝A，C，G或T。

优选实施方案的详述

通过参考以下本发明优选实施方案的详细描述和其中包括的实施例可更容易地理解本发明。除非另外指出，本文中使用的术语按照相关领域内的普通技术人员的常规用法理解。除了下面提供的术语的定义外，分子生物学中的常用术语的定义还可见于Rieger等人，1991 Glossary of genetics：classical and molecular，第5版，Berlin：Springer-Verlag；和见于CurrentProtocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人，Eds.，CurrentProtocols，a joint venture between Greene Publishing Associates，Inc.andJohn Wiley & Sons，Inc.，(1998 Supplement)。

应理解，如本说明书中和权利要求中所使用的，“a”或“an”可表示一个或多个，这取决于使用其的上下文。因而，例如，“a”细胞可指可利用至少一个细胞。应理解，本发明不限定于特定的核酸、特定的细胞类型、特定的宿主细胞、特定的条件或特定的方法等，由此其当然可变化，并且其中众多的修饰和变化对于本领域技术人员来说是显然的。也应理解，本文中使用的术语仅旨在描述特定实施方案，而不旨在为限制性的。

在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物及其中引用的出版物的公开内容以其全文通过引用合并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的状况。用于克隆、DNA分离、扩增和纯化，用于涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的标准技术和各种分离技术是本领域技术人员已知的和通常使用的技术。许多标准技术描述于Sambrook和Russell，2001 Molecular Cloning，第3版，Cold SpringHarbor，Plainview，New York；Sambrook等人，1989 Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Maniatis等人，1982 Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，Plainview，New York；Wu(编)1993 Meth.Enzymol.218，Part I；Wu(编)1979MethEnzymol.68；Wu等人，(编)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编)1972Experiments inMolecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Old和Primrose，1981Principles of Gene Manipulation，University of California Press，Berkeley；Schleif和Wensink，1982PracticalMethods in Molecular Biology；Glover(编)1985DNA Cloning第I和II卷，IRL Press，Oxford，UK；Hames和Higgins(Eds.)1985Nucleic AcidHybridization，IRL Press，Oxford，UK；以及Setlow和Hollaender 1979Genetic Engineering：Principles and Methods，第1-4卷，Plenum Press，New York.

本发明的启动子多核苷酸可以从其天然环境中分离和/或纯化，以基本上纯的或同质的形式或以不含或基本上不含来源物种的其他核酸的形式提供。本文中使用的“分离的”核酸也可以在其分离时基本上不含其他细胞材料或培养基(当通过重组技术生产时)，或基本上不含化学物质前体(当化学合成时)。本发明的启动子多核苷酸是分离的多核苷酸。当在本文中使用时，术语“分离”包括所有这些可能性。

术语“大约”在本文中用于表示大致、粗略地、大概或在......区域内。当术语“大约”与数字范围一起使用时，其通过在所述界限数值上下延展该界限来修饰该范围。通常，术语“大约”在本文中用于向上或向下(更高或更低)修饰数值使之高于和低于所述值10％。

本文中使用的术语“启动子”或“启动子多核苷酸”是指DNA序列，所述DNA序列，当连接至目的核苷酸序列时，能够控制目的核苷酸序列至mRNA的转录。启动子通常，虽然不是必须，位于向mRNA的转录受所述启动子控制的目的基因的5’(例如，上游)(例如，靠近结构基因的转录起始位置)，并且提供用于起始转录的RNA聚合酶和其他转录因子的特异性结合位点。“组成型启动子”是指能够在植物的所有或几乎所有发育阶段在所有或几乎所有植物组织中表达其控制的开放阅读框或调控元件的启动子。“调控型启动子”是指非以组成型方式指导基因表达，而是以时间和/或空间的方式指导基因表达的启动子，其包括组织特异性和诱导型启动子。不同的启动子可在不同组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段或在响应不同的环境条件下指导基因或调控元件表达。“组织特异性启动子”是指不在所有植物细胞中表达而是只在特定器官(例如根或种子)、特定组织(例如胚或子叶)或特定细胞类型(例如叶薄壁组织细胞或种子储藏细胞)的一种或多种细胞类型中表达的调控型启动子。“诱导型启动子”是指可在一种或多种细胞类型中由外来刺激物例如化学物质、光、激素、胁迫或病原体开启的调控型启动子。

根据本发明，可将本发明的启动子置于与第二多核苷酸有效连接的位置以用于第二多核苷酸在植物中的根特异性和/或病原体诱导型表达，从而改变该植物的表型。如本文中所使用的，术语“处于有效连接的”、“有效连接的”和“与......有效连接”可互换并且是指启动子多核苷酸与第二多核苷酸在单个核苷酸片段上以使第二核酸的转录受启动子启始和介导的方式功能性连接。通常，处于有效连接中的核酸是邻接的。

可将任何第二多核苷酸置于与本发明的启动子多核苷酸有效连接的位置以实现该第二多核苷酸的根特异性或病原体诱导型表达。第二多核苷酸包括例如开放阅读框、开放阅读框的一部分、编码融合蛋白的多核苷酸、反义多核苷酸、编码双链RNA构建体的多核苷酸、转基因等。第二多核苷酸可编码昆虫抗性基因、细菌疾病抗性基因、真菌疾病抗性基因、病毒疾病抗性基因、线虫疾病抗性基因、除草剂抗性基因、影响籽粒组成或质量的基因、营养物利用基因、霉菌毒素还原基因、雄性不育基因、选择标记基因、筛选标记基因、负选择标记基因(negative selectable marker gene)、正选择标记基因(positive selectable marker gene)、影响植物农艺特征(即，产量)的基因、环境胁迫抗性基因(例如提供对干旱、热、寒冷、冰冻、水分过多、盐胁迫或氧化胁迫的抗性或耐受性的基因)、改良淀粉的质或量、油的量和质、氨基酸或蛋白质组成的基因等。本发明的启动子多核苷酸还可用于豆科(Fabaceae)植物以在根瘤中介导表达。在该实施方案中，第二多核苷酸可以是影响植物农艺特征例如固氮、氮运输、植物蛋白质含量、种子蛋白质含量等的基因。

优选，第二多核苷酸编码在整体或部分上与线虫摄食位置的形成或维持所需的植物基因基本上同一或同源的双链RNA(dsRNA)或反义多核苷酸。第二多核苷酸可备选地编码活性剂，所述活性剂破坏植物寄生性病原体的生长和/或生殖，提供或提高植物对植物寄生性病原体的抗性，或对植物寄生性病原体具毒性从而减少农作物损害。待靶向的病原体优选是植物寄生性线虫。可根据本发明使用编码活性剂(所述活性剂破坏植物寄生性病原体的生长和/或生殖，提供或提高植物对植物寄生性病原体的抗性，或对植物寄生性病原体有毒)的任何第二多核苷酸。当病原体是线虫时，第二多核苷酸还可编码如下活性剂，所述活性剂通过例如破坏或阻碍合胞体细胞的发生或完整性(integrity)来破坏植物根中的摄食位置。第二多核苷酸可备选地编码与寄生性植物线虫的靶基因(所述基因是线虫的新陈代谢、存活、变态或生殖所必需的)基本上同一的的双链RNA。第二多核苷酸可编码与植物根中的摄食位置的植物基因基本上同一的双链RNA，其导致对线虫存活的破坏。

如本文中所使用的，当比较RNA和DNA序列时，考虑到尿嘧啶对胸腺嘧啶的置换，术语“基本上同一的”和“相应于”是指dsRNA的一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或更多个连续核苷酸具至少大约80％-90％同一性，更优选与靶基因的20个或更多个连续核苷酸具至少大约90-95％同一性，和最优选与靶基因的20个或更多个连续核苷酸具至少大约95-99％同一性或完全相同。在例如共同转让的共同待决美国专利申请公开号2005/188438(通过引用合并入本文)中显示了示例性植物寄生性线虫靶基因。

备选地，为了病原体控制，置于与本发明的启动子多核苷酸有效连接的第二多核苷酸可编码病原体毒性蛋白，优选对线虫有毒的蛋白质。例如，编码微生物毒素或其片段、来源于昆虫的多肽毒素或其片段的核酸，例如美国专利5,457,178、5,695,954、5,763,568、5,959,182等中描述的核酸可以用于本发明的该实施方案。

在Index of Plant Diseases in the United States(U.S.Dept.ofAgriculture Handbook No.165，1960)；Distribution of Plant-ParasiticNematode Species in North America(Society of Nematologists，1985)；和Fungi on Plants and Plant Products in the United States(AmericanPhytopathological Society，1989)中列出了农作物植物和相应的病原性线虫。例如，被本发明靶向的植物寄生性线虫包括但不限于胞囊线虫和根结线虫。被本发明靶向的具体植物寄生性线虫包括但不限于，大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)、甜菜胞囊线虫(Heterodera schachtii)、燕麦胞囊线虫(Heterodera avenae)、水稻胞囊线虫(Heterodera oryzae)、木豆胞囊线虫(Heterodera cajani)、三叶草胞囊线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、或烟草球胞囊线虫(Globodera tabacum)、南方根结线虫(Meloidogyneincognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、北方根结线虫(M.hapla)、爪哇根结线虫(M.javanica)、纳西根结线虫(M.naasi)、短小根结线虫(M.exigua)、鳞球茎茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、水稻茎线虫(Ditylenchus angustus)、香蕉穿孔线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫(Helicotylenchusmulticinctus)、咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae)、最短尾短体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)、弯曲针线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米针线虫(Paratylenchus zeae)、肾形线虫(Rotylenchulus reniformis)、银链花类毛刺线虫(Paratrichodorusanemones)、较小类毛刺线虫(Paratrichodorus minor)、Paratrichodoruschristiei、小麦粒线虫(Anguina tritici)、Bidera avenae、根瘤亚粒线虫(Subanguina radicicola)、塞恩斯特纽带线虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(Hoplolaimus Columbus)、帽状纽带线虫(Hoplolaimusgaleatus)，柑橘半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans)、蚤缀鞘线虫(Hemicycliophora arenaria)、椰子红环腐线虫(Rhadinaphelenchuscocophilus)、长尾刺线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛刺线虫(Trichodorus primitivus)、异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳西拟鞘线虫(Hemicriconemoideskanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、有害坏死线虫(Cacopaurus pestsi)等。

在一个实施方案中，被靶向的线虫属于诱导摄食或合胞体细胞的线虫科。诱导摄食或合胞体细胞的线虫科是长针科(Longidoridae)、毛刺科(Trichodoridae)、异皮科(Heterodidae)、根结科(Meloidogynidae)、短体科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)。优选它们属于异皮科或根结科。

因此，在另一个实施方案中，被靶向的线虫属于选自棘皮线虫属(Cactodera)、长异皮线虫属(Dolichodera)、球胞囊线虫属(Globodera)、胞囊线虫属(Heterodera)、斑皮线虫属(Punctodera)、长针线虫属(Longidorus)或根结线虫属(Meloidogyne)的一个或多个属。在优选实施方案中，被靶向的线虫属于选自棘皮线虫属、长异皮线虫属、球胞囊线虫属、胞囊线虫属、斑皮线虫属或根结线虫属的一个或多个属。在更优选实施方案中，被靶向的线虫属于选自球胞囊线虫属、胞囊线虫属或根结线虫属的一个或多个属。在甚至更优选实施方案中，被靶向的线虫属于选自球胞囊线虫属或胞囊线虫属的一个或两个属。在另一个实施方案中，被靶向的线虫属于根结线虫属。

球胞囊线虫属和胞囊线虫属是线虫异皮科中的优选属。因此在一个实施方案中，被靶向的线虫属于选自蓍草球胞囊线虫(Globodera achilleae)、蒿球胞囊线虫(Globodera artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(Globoderahypolysi)、墨西哥球胞囊线虫(Globodera mexicana)、欧蓍草球胞囊线虫(Globodera millefolii)、Globodera mali、马铃薯白线虫(Globoderapallida)、马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(Globodera tabacum)和弗吉亚球胞囊线虫(Globodera virginia)的一个或多个种。在优选实施方案中，被靶向的线虫属于物种马铃薯白线虫、烟草球球胞囊线虫或马铃薯金线虫中的至少一个。因此，在一个实施方案中，被靶向的线虫属于选自燕麦胞囊线虫、胡萝卜胞囊线虫(Heteroderacarotae)、鹰嘴豆胞囊线虫(Heterodera ciceri)、十字花科胞囊线虫(Heterodera cruciferae)、龙爪稷胞囊线虫(Heterodera delvii)、微褐藻胞囊线虫(Heterodera elachista)、菲氏胞囊线虫(Heterodera filipjevi)、冈比亚胞囊线虫(Heterodera gambiensis)、大豆胞囊线虫、豌豆胞囊线虫(Heteroderagoettingiana)、荞麦胞囊线虫(Heterodera graduni)、啤酒花胞囊线虫(Heterodera humuli)、大麦胞囊线虫(Heterodera hordecalis)、麦类胞囊线虫(Heterodera latipons)、燕麦胞囊线虫(Heterodera major)、苜蓿胞囊线虫(Heterodera medicaginis)、水稻同居胞囊线虫(Heterodera oryzicola)、巴基斯坦胞囊线虫(Heterodera pakistanensis)、玫瑰胞囊线虫(Heteroderarosii)、甘蔗胞囊线虫(Heterodera sacchari)、甜菜胞囊线虫(Heteroderaschachtii)、蜀黍胞囊线虫(Heterodera sorghi)、三叶草胞囊线虫(Heteroderatrifolii)、荨麻胞囊线虫(Heterodera urticae)、Heterodera vigni和玉米胞囊线虫的一个或多个种。在优选实施方案中，被靶向的线虫属于大豆胞囊线虫、燕麦胞囊线虫、木豆胞囊线虫、豌豆胞囊线虫、三叶草胞囊线虫、玉米胞囊线虫或甜菜胞囊线虫中的至少一个物种。在更优选实施方案中，被靶向的线虫为物种大豆胞囊线虫或甜菜胞囊线虫或两者。在最优选实施方案中，被靶向的线虫属于物种大豆胞囊线虫。

根结属是线虫根结科中优选的属。因此，在一个实施方案中，被靶向的线虫属于选自高粱根结线虫(Meloidogyne acronea)、Meloidogynearabica、花生根结线虫(Meloidogyne arenaria)、甘蓝根结线虫(Meloidogyne artiellia)、短尾根结线虫(Meloidogyne brevicauda)、山茶根结线虫(Meloidogyne camelliae)、奇氏根结线虫(Meloidogynechitwoodi)、咖啡根结线虫(Meloidogyne cofeicola)、Meloidogyne esigua、禾草科根结线虫(Meloidogyne graminicola)、北方根结线虫、南方根结线虫、印度根结线虫(Meloidogyne indica)、Meloidogyne inornata、爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)、Meloidogyne lini、苹果根结线虫(Meloidogynemali)、小头根结线虫(Meloidogyne microcephala)、小突根结线虫(Meloidogyne microtyla)、纳西根结线虫、萨拉斯根结线虫(Meloidogynesalasi)和Meloidogyne thamesi的一个或多个种。在优选实施方案中，被靶向的线虫属于物种爪哇根结线虫、南方根结线虫、北方根结线虫、花生根结线虫或奇氏根结线虫中的至少一个种。

任何植物物种均可用本发明的启动子多核苷酸转化。例如，可用包含本发明的启动子多核苷酸的核酸构建体转化的植物包括，但不限于选自下列的属的植物：苜蓿属(Medicago)、番茄属(Lycopersicon)、芸苔属(Brassica)、香瓜属(Cucumis)、茄属(Solanum)、核桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、小黑麦属(Triticale)、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、伽蓝菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)，苜蓿属(Medicago)、驴食豆属(Onobrychis)、车轴草属(trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑橘属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、烟草属(Nicotiana)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、菊苣属(Ciahorium)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)，毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)Salpiglossis、Browaalia、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)。

启动子多核苷酸的一些衍生物和变体优选用于特定的植物进化枝、科、属或植物种。可从一个植物物种分离的启动子多核苷酸的衍生物和变体优选用在与用于分离启动子多核苷酸的衍生物和变体的植物属于相同的植物进化枝、科、属或种的植物中。因此在一个实施方案中，植物是单子叶植物，优选禾本科(Poaceae)、芭蕉科(Musaceae)、百合科(Liliaceae)或凤梨科(Bromeliaceae)的植物，优选禾本科的植物。因此，在另一个实施方案中，植物是玉蜀黍属(Zea)、小麦属、稻属、大麦属、黑麦属、燕麦属、甘蔗属(Saccharum)、高粱属(Sorghum)、狼尾草属、狗尾草属(Setaria)、黍属、蟋蟀草属(Eleusine)、芒属(Miscanthus)、短柄草属(Brachypodiam)、羊茅属(Festuca)或黑麦草属(Lolium)属的禾本科植物。因此在另一个实施方案中，植物是玉蜀黍属的植物，特别是物种玉蜀黍(Zea mays)的植物。因此，在一个实施方案中，植物是小麦属，优选是物种普通小麦(Triticum aestivum)、斯佩尔特小麦(Triticum speltae)或硬粒小麦(Triticum durum)。因此，在一个实施方案中，植物是稻属，优选是物种稻(Oryza sativa)。因此，在一个实施方案中，植物是大麦属，优选是物种大麦(Hordeum vulgare)。因此，在一个实施方案中，植物是黑麦属(Secale)，优选是物种黑麦(Secale cereale)。因此，在一个实施方案中，植物是燕麦属(Avena)，优选物种是燕麦(Avenasativa)。因此，在一个实施方案中，植物是甘蔗属，优选物种甘蔗(Saccharum officinarum)。因此，在一个实施方案中，植物是高梁属，优选物种高粱(Sorghum vulgare)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)或苏丹草(Sorghum sudanense)。因此，在一个实施方案中，植物是狼尾草属，优选物种珍珠粟(Pennisetum glaucum)。在一个实施方案中，植物是狗尾草属，优选物种谷子(Setaria italica)。因此，在一个实施方案中，植物是黍属，优选物种黍(Panicum miliaceum)或柳枝稷(Panicum Virgatum)。因此，在一个实施方案中，植物是蟋蟀草属，优选物种龙爪稷(Eleusinecoracana)。因此，在一个实施方案中，植物是芒属，优选物种芒(Miscanthussinensis)。因此，在一个实施方案中，植物是短柄草属，优选物种紫短柄草(Brachypodium distachyon)。因此，在一个实施方案中，植物是羊茅属，优选是物种苇状羊茅(Festuca arundinaria)、紫羊茅(Festuca rubra)或牛尾草(Festuca pratensis)。因此，在一个实施方案中，植物是黑麦草属，优选物种黑麦草(Lolium perenne)或多花黑麦草(Loliummultiflorum)。因此，在一个实施方案中植物是Triticosecale。

因此，在一个实施方案中植物是双子叶植物，优选豆科(Fabaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、菊科(Asteraceae)、锦葵科(Malvaceae)、亚麻科(Linacea)、大戟科(Euphorbiaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、山茶科(Theaceae)、茜草科(Rubiaceae)、梧桐科(Sterculiaceae)或柑橘属(Citrus)的植物。在一个实施方案中植物是豆科、茄科或十字花科的植物。因此，在一个实施方案中植物是豆科，优选是大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、落花生属(Arachis)、鹰嘴豆属(Cicer)、野豌豆属(Vicia)、菜豆属(Phaseolus)、羽扇豆属(Lupinus)、苜蓿属(Medicago)或兵豆属(Len)。豆科的优选物种是大豆(Glycine max)，豌豆(Pisum sativum)，花生(Arachis hypogea)，鹰嘴豆(Cicer arietinum)，蚕豆(Vicia faba)，菜豆(Phaseolus vulgaris)，白羽扇豆(Lupinus albus)，黄羽扇豆(Lupinusluteus)，狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)，紫花苜蓿(Medicago sativa)或兵豆(Lens culinaris)。更优选是物种大豆。因此，在一个实施方案中植物是茄科，优选是茄属、番茄属、烟草属或辣椒属。茄科的优选物种是马铃薯(Solanum tuberosum)，番茄(Lycopersion esculentum)，烟草(Nicotianatabaccum)，或中国辣椒(Capsicum chinense)。更优选是马铃薯。因此，在一个实施方案中植物是十字花科，优选是拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属或萝卜属。十字花科的优选物种是拟南芥、欧洲油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芥菜(Brassica juncea)或芜青(Brassica rapa)。更优选是物种欧洲油菜。因此，在一个实施方案中植物是藜科，优选是甜菜属。甜菜属的优选物种是甜菜(Beta vulgaris)。因此，在一个实施方案中植物是菊科，优选是向日葵属(Helianthus)或万寿菊属(Tagetes)。向日葵属的优选物种是向日葵(Helianthus annuus)，万寿菊属的优选物种是万寿菊(Tagetes erecta)。因此，在一个实施方案中植物是锦葵科，优选是棉属(Gossypium)或秋葵属(Abelmoschus)，棉属的优选物种是陆地棉(Gossypium hirsutum)或海岛棉(Gossypium barbadense)。更优选是陆地棉。秋葵属的优选物种是咖啡黄葵(Abelmoschus esculentus)。因此，在一个实施方案中植物是亚麻科，优选是亚麻属(Linum)。亚麻属的优选物种是亚麻(Linum usitatissimum)。因此，在一个实施方案中植物是大戟科，优选是木薯属、麻风树属(Jatropa)、Rhizinus或甘薯属(Ipomea)。木薯属的优选物种是木薯(Manihot esculenta)。麻风树属的优选物种是麻疯树(Jatropa curca)。Rhizinus属的优选物种是Rhizinus comunis。甘薯属的优选物种是甘薯(Ipomea batatas)。因此，在一个实施方案中植物是蔷薇科，优选是蔷薇属、苹果属(Malus)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、悬钩子属(Rubus)、茶藨属(Ribes)、越橘属(Vaccinium)或草莓属(Fragaria)。草莓属的优选物种是草莓(Fragaria x ananassa)。因此，在一个实施方案中植物是葫芦科，优选是香瓜属、西瓜属(Citrullus)或南瓜属。香瓜属的优选物种是黄瓜(Cucumis sativus)。西瓜属的优选物种是西瓜(Citrulluslanatus)。南瓜属的优选物种是西葫芦(Cucurbita pepo)。因此，在一个实施方案中植物是山茶科，优选是山茶(Camellia)属。山茶属的优选物种是茶(Camellia sinensis)。因此，在一个实施方案中植物是茜草科，优选是咖啡属(Coffea)。咖啡属的优选物种是小果咖啡(Coffea arabica)或中果咖啡(Coffea canephora)。因此，在一个实施方案中植物是梧桐科，优选是可可树属(Theobroma)。可可树属的优选物种是可可树(Theobroma cacao)。因此，在一个实施方案中植物是柑桔属，优选柑桔属物种和密植的杂种或栽培作物(plantations)，如甜橙(Citrus sinensis)、柠檬(Citrus limon)、桔(Citrus reticulata)、柚(Citrus maxima)等。

本发明的拟南芥启动子(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)是编码注释为海藻糖-6-磷酸磷酸酶样(TPP-样)蛋白的多肽的大豆cDNA克隆48986355(SEQ ID NO：4)的拟南芥属同源物的启动子区域。如实施例2中所公开的，从拟南芥基因组DNA分离了这些拟南芥启动子。如实施例1中所公开的，从大豆基因组DNA分离了本发明的大豆TPP样启动子。如实施例中所证明的，当本发明的拟南芥和大豆启动子置于与GUS报告基因有效连接时，GUS基因的表达在被线虫感染的大豆根中上调。

因此本发明体现在启动子上，所述启动子包含具有SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：3中所示的序列的分离启动子多核苷酸，或来源于具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示的序列的分离启动子多核苷酸的最小启动子多核苷酸片段，所述最小启动子片段能够驱动第二多核苷酸的根特异性或线虫诱导型表达。本文中公开的方法可用于分离能够介导第二核酸的根特异性或线虫诱导型表达的、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的额外最小启动子多核苷酸片段。

备选地，本发明的启动子多核苷酸包含分离的多核苷酸，其在严格条件下与具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸、或来源于具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示序列的分离的启动子多核苷酸的最小启动子多核苷酸片段杂交。本文中使用的严格杂交条件是熟知的，包括例如，在400mM NaCl，40mMPIPES pH6.4，1mM EDTA中于60℃杂交12至16小时；然后在0.1％SDS，0.1％SSC中在大约65℃洗涤大约15至60分钟。本发明还体现于分离的启动子多核苷酸，该启动子多核苷酸在严格条件下与包含SEQ ID NO：1中所示序列的核苷酸748至998或500至998或573至922的多核苷酸杂交；或在严格条件下与包含SEQ ID NO：2中所示序列的核苷酸651至1000的启动子多核苷酸杂交；或在严格条件下与包含SEQ ID NO：3中所示序列的核苷酸400至609或260至609或200至609的多核苷酸杂交；其中该启动子多核苷酸在被植物寄生性病原体感染的植物的根中被诱导。

本发明的启动子多核苷酸还包含分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸与具有SEQ ID NO；1、2或3中所示序列的启动子多核苷酸、或源于具有SEQ ID NO：1、2或3中所示序列的启动子多核苷酸的最小启动子多核苷酸片段有至少50-60％，或至少60-70％，或至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％，或至少95％、96％、97％、98％、99％或更多的同一性或相似性。多核苷酸的序列比较的长度是至少50个连续核苷酸，或至少100个连续核苷酸，或至少200个连续核苷酸直至序列的整个长度。

术语“序列同一性”或“同一性”在两个多核苷酸或多肽序列情况下指当在指定的比较窗口上，例如，整个序列(如在全局比对中)或相似的区域(在局部比对中)上就最大对应性比对这两个序列时，两个序列中一起出现相同的符号的那些位置。当序列同一性百分数用于多肽时，可以意识到，残基不同的位置常常区别在于保守氨基酸置换，即，氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基置换，从而不改变分子的功能特性。当序列相异在于保守置换时，可将序列同一性百分数向上调整以针对置换的保守性质进行校正。差异在于这样的保守置换的序列被称作具有“序列相似性”或“相似性”。用于实施该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。通常，这涉及将保守置换评分为部分匹配而不是错配，从而增加序列相似性百分数

如本文中所使用的，“序列同一性百分数”或“百分数序列同一性”指通过如下方式确定的值：首先在两个最佳比对的序列中在比较窗口(全局或局部地)上在每一个组成位置上就相同核酸碱基或氨基酸残基在两条链上是否出现还是不出现进行记录，出现则记为匹配，不出现则记为错配。当通过使匹配的碱基的数目最优化(并同时允许在任何位置上错配和允许任何大小的缺口或空位或空区域导入，由此增加比对的意义或质量)来构建所述比对时，确定出现匹配的位置的总数目，然后将该数目除以比较窗口中的位置的总数目，最后将结果乘以100，得到序列同一性百分数。可以使用相同的原理计算蛋白质序列的“序列相似性百分数”，其中将保守置换计算为部分错配而非完全错配。从而，例如，当相同氨基酸被赋予分值1且非保守置换被赋予分值0时，保守置换被赋予0和1之间的分值。保守置换的评分可从本领域内已知的氨基酸矩阵例如Blosum或PAM矩阵获得。

用于比较的序列的比对方法在本领域内是熟知的。两个序列之间的百分数同一性或百分数相似性(对于蛋白质)的测定可使用数学算法来完成。优选，此类数学算法的非限定性实例是Myers和Miller的算法(Bioinformatics，4(1)：11-17，1988)、Needleman-Wunsch全局比对(J.Mol.Biol.，48(3)：443-53，1970)、Smith-Waterman局部比对(J.Mol.Biol.，147：195-197，1981)、Pearson和Lipman的相似性搜索方法(PNAS，85(8)：2444-2448，1988)、Karlin和Altschul的算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；PNAS，90：5873-5877，1993)。这些数学算法的计算机执行程序可用于序列的比较以测定序列的同一性或鉴定同源物。

除了包含SEQ ID NO：1、2或3所示的特定分离序列或其中所含的最小启动子区域的启动子、以及在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、2或3中所示的特定序列的启动子多核苷酸杂交的启动子多核苷酸外，本发明还涵盖包含本文中描述的启动子构型1、启动子构型2或启动子构型3的任何启动子多核苷酸。术语“启动子构型”在本文中用于描述启动子序列内以5’至3’方向排列的多个启动子元件种类的特定组合，其中各启动子元件种类彼此之间取特定的空间取向。可以以对于本领域技术人员来说法是熟悉的许多方法来鉴定启动子元件。一个这样的方法利用GenomatixCoreSearch^TM算法(Genomatix Software GmbH，Munich，Germany)。CoreSearch命名约定利用“P”表示基于植物的启动子元件，“U”标识用户定义的启动子元件。这些宽泛的标识符通过“$”与元件类型分开。元件种类跟在“$”之后。本发明中的种类包括：“OPAQ”，表示由几个Opaque-2样转录激活因子结合以激活转录的代表性启动子元件序列；和“SCN#”，表示在多个SCN诱导的启动子之间保守的序列，表明对于SCN诱导的启动子活性的重要性。所述启动子元件种类在由两个互补脱氧核糖核酸组成的启动子DNA序列内以5’至3’方向排列。一条链称为“正”链，而互补DNA链称为“负”链。由SEQ ID NO：1-3显示的DNA序列以5’至3’方向示出双链DNA序列的正链。

如图12中所示的，称为“元件1”的U$SCN16启动子元件种类具有共有序列RTNGGTTTAKK(SEQ ID NO：19)(使用Genomatix CoreSearch算法测定的)。图12中称为“元件2”的U$SCN2启动子元件种类具有共有序列WAMATGATTAKTYWN(SEQ ID NO：20)(使用GenomatixCoreSearch算法测定的)。图12中称为“元件3”的U$SCN7启动子元件种类具有共有序列NTANNNGWWKNTTATAWATTGNYCN(SEQ IDNO：21)(使用Genomatix CoreSearch算法测定的)。图12中称为“元件4”的U$SCN13启动子元件种类具有共有序列WCWYATWTAGTMTANTWKYMKNAMN(SEQ ID NO：22)(使用Genomatix CoreSearch算法测定的)。图12中称为“元件5”的U$SCN6启动子元件种类具有共有序列TTNWYTTTCTCAMAMMWAW(SEQ IDNO：23)(使用Genomatix CoreSearch算法测定的)。图12中称为“元件6”的U$SCN30启动子元件种类具有共有序列NWTNTNCTCTNTTNTWYWTTN(SEQ ID NO：24)(使用GenomatixCoreSearch算法测定的)。P$OPAQ元件种类的例子为元件描述符(element descriptor)P$O2GCN4.01，其具有共有序列NAKWTSACRTGNMTRAN(SEQ ID NO：25)，并且在图12中被称为“元件7”，参见Lohmer S.等人(1991)EMBO J.10：617-624；Yunes J.A.等人(1998)Plant Cell 10：1941-1955；Lara P.等人(2003)J.Biol.Chem.278：21003-21011；Muth J.R.等人(1996)Mol.Gen.Genet.252：723-732；Onodera Y.等人(2001)J.Biol.Chem.276：14139-14152；Schmidt R.J.等人(1992)Plant Cell 4：689-700。图12中称为“元件8”的U$SCN14启动子元件种类具有共有序列NARWTRKTGKCAAAWWNKTMN(SEQ IDNO：26)(使用Genomatix CoreSearch算法测定的)。

包含启动子构型1的启动子多核苷酸是分离的核酸，所述分离的核酸具有正链和负链并且包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：20中所示的序列的多核苷酸的U$SCN2类元件，其离在正链上包含具有SEQ ID NO：19中所示的序列的多核苷酸的U$SCN16类元件大约215个核苷酸之内；在正链上包含具有SEQ ID NO：22中所示的序列的多核苷酸的U$SCN13类元件，其离在正链上包含具有SEQ ID NO：21中所示的序列的多核苷酸的U$SCN7类元件大约80个核苷酸之内；和在正链上包含具有SEQ IDNO：23中所示的序列的多核苷酸的U$SCN6类元件，其离在正链上包含具有SEQ ID NO：24中所示的序列的多核苷酸的U$SCN30类元件大约80个核苷酸之内。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有正链和负链的核酸的植物启动子多核苷酸，所述核酸包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：20中所示的序列的多核苷酸的U$SCN2类元件、在正链上包含具有SEQ IDNO：19中所示的序列的多核苷酸的U$SCN16类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：22中所示的序列的多核苷酸的U$SCN13类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：21中所示的序列的多核苷酸的U$SCN7类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：23中所示的序列的多核苷酸的U$SCN6类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：24中所示的序列的多核苷酸的U$SCN30类元件，其中启动子在被植物寄生性线虫或真菌感染的植物的根中被诱导。

包含启动子构型2的启动子多核苷酸是分离的核酸，所述分离的核酸具有正链和负链并且以5’至3’的顺序组合地包含：在正链上包含具有SEQID NO：21中所示的序列的多核苷酸的U$SCN7类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：25中所示的序列的多核苷酸的P$OPAQ类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：23中所示的序列的多核苷酸的U$SCN6类元件，其中P$OPAQ类元件离U$SCN7类元件大约200个核苷酸之内，U$SCN6类元件离P$OPAQ类元件大约200个核苷酸之内，以及U$SCN7类元件离U$SCN6类元件大约400个核苷酸之内.

在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有正链和负链的核酸的植物启动子多核苷酸，所述核酸以5’至3’的顺序组合地包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：21中所示的序列的多核苷酸的U$SCN7类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：25中所示的序列的多核苷酸的P$OPAQ类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：23中所示的序列的多核苷酸的U$SCN6类元件，其中启动子在被植物寄生性线虫或真菌感染的植物的根中被诱导。

包含启动子构型3的启动子多核苷酸是分离的核酸，所述核酸具有正链和负链并且以5’至3’的顺序组合地包含：在正链上包含具有SEQ IDNO：20中所示的序列的多核苷酸的U$SCN2类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：26中所示的序列的多核苷酸的U$SCN14类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：22中所示的序列的多核苷酸的U$SCN13类元件、在正链上包含具有SEQ ID NO：25中所示的序列的多核苷酸的P$OPAQ类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：24中所示的序列的多核苷酸的U$SCN30类元件，其中U$SCN14类元件离U$SCN2类元件大约200个核苷酸之内，U$SCN13类元件离U$SCN14类元件大约200个核苷酸之内，P$OPAQ类元件离U$SCN13类元件大约200个核苷酸之内，U$SCN30类元件离此第二P$OPAQ类元件大约200个核苷酸之内，以及U$SCN2类元件离U$SCN30类元件大约800个核苷酸之内。

在另一个实施方案中，本发明提供了包含具有正链和负链的核酸的植物启动子多核苷酸，所述核酸以5’至3’的顺序组合地包含：在正链上包含具有SEQ ID NO：20中所示的序列的多核苷酸的U$SCN2类元件，在正链上包含具有SEQ ID NO：26中所示的序列的多核苷酸的U$SCN14类元件，在正链上包含具有SEQ ID NO：22中所示的序列的多核苷酸的U$SCN13类元件，在正链上包含具有SEQ ID NO：25中所示的序列的多核苷酸的P$OPAQ类元件和在正链上包含具有SEQ ID NO：24中所示的序列的多核苷酸的U$SCN30类元件，其中启动子在植物的根中被植物寄生性线虫或真菌诱导。.

本发明还包括本发明的启动子的“变体”或“衍生物”。特定启动子多核苷酸和它们的特定元件的衍生物可包括但不限于序列的缺失、单个或多个点突变、特定限制性内切酶位置的改变、功能性元件的添加、或分子修饰的其他方式。该修饰可以增强或改变或可以不增强或改变所述序列的转录调控活性。

例如，本领域技术人员可以确定序列内的功能性元件或生物活性部分的界限并缺失任何非必需元件。可修饰或组合功能性元件或生物活性部分来增加本发明序列在任何特定用途中的功效或表达。本发明的启动子多核苷酸的功能等价片段还可通过除去或缺失非必需序列而不缺失必需序列来获得。将启动子多核苷酸序列缩至其必需的转录介导元件可在体外通过试错缺失突变或在芯片上(in silico)使用启动子元件查找程序实现。启动子活性所必需的区域通常表现为成簇的某些已知启动子元件。可使用可获得的计算机算法例如PLACE(“Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements”；Higo 1999)、BIOBASE数据库“Transfac”(Biologische DatenbankenGmbH，Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PlantCARE(Lescot2002)来进行这样的分析。特别优选的是转录调控核苷酸序列的等价片段，其可以通过缺失编码mRNA的5’非翻译区的区域，从而只提供(非转录的)启动子区域来获得。5’非翻译区可通过本领域内已知的方法(例如5’-RACE分析)来容易地确定。因此，一些本发明的转录调控核苷酸序列是其他序列的等价片段。本文中使用的术语“最小启动子”是指启动子多核苷酸中能够介导第二核酸的根特异性和/或线虫诱导型表达的生物活性部分。特定的本发明最小启动子片段包括，但不限于，包含SEQ ID NO：1中所示序列的核苷酸1557至1907或核苷酸1498至1999或核苷酸1349至1999的启动子多核苷酸、包含SEQ ID NO：2中所示的序列的核苷酸1650至2000或核苷酸1460至2110的启动子多核苷酸，和包含SEQ ID NO：3中所示序列的核苷酸491至841或核苷酸350至1000的启动子多核苷酸，包含具有SEQ IDNO：1、2或3中所示序列的启动子多核苷酸的至少50个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的启动子多核苷酸。

如上面所述的，还可随机制备，然后测定本发明的启动子多核苷酸的缺失突变。利用该策略，制备一系列构建体，各构建体包含该克隆的不同部分(亚克隆)，然后就活性来筛选这些构建体。用于活性筛选的适当方法是将包含经缺失区段的缺失启动子构建体连接至选择或筛选标记，并且只分离表达标记基因的那些细胞。这样，可以鉴定仍然保持期望的或甚至增强的活性的许多不同的缺失启动子构建体。通过比较所选的这些构建体可以鉴定活性所需的最小区段。然后可使用该区段构建用于外源基因表达的载体。

用于在编码任何启动子序列的DNA区段中诱变或产生缺失的方法对于本领域技术人员来说是熟知的并且公开于例如US 6,583,338，以其全文通过引用合并入本文。调控序列变体的一个实例是自较大的启动子通过一个或多个缺失而形成的启动子。启动子中至不超过靠近转录起始位置的TATA框的5′部分有时可进行缺失而不会消除启动子的活性，如由Zhu等人，(1995)The Plant Cell 7：1681-1689所描述的。除去DNA序列的一部分的常规方法是使用外切核酸酶结合DNA扩增来产生双链DNA克隆的单方向嵌套缺失。用于该目的的商业试剂盒在商品名称Exo-Size^TM.(NewEngland Biolabs，Beverly，Mass.)下出售。生物活性变体还包括，例如，具有一个或多个核苷酸置换、缺失或插入的本发明天然启动子序列。

衍生物和变体还包括来自其他物种(包括但不限于细菌、真菌和植物)的同源物、旁系同源物和直系同源物。“同源物”是本领域内使用的一般术语，表示与参照序列具有高度的序列相关性的多核苷酸或多肽序列。这样的相关性可通过测定上文中定义的两个序列之间的同一性和/或相似性的程度来定量。术语“直系同源物”和“旁系同源物”落在该一般性术语中。“旁系同源物”是指相同物种中功能相似的多核苷酸或多肽。“直系同源物”是指作为多核苷酸或多肽在另一个物种中的功能等价物的多核苷酸或多肽。直系同源基因优选指编码直系同源蛋白质的基因。更特别地，术语“直系同源物”表示从一个物种获得的多肽或蛋白质，其为来自不同物种的多肽或蛋白质的功能对应物。直系同源物之间的序列差异是物种形成的结果。

一个实施方案包括能够介导根偏爱性和/或病原体诱导型表达的启动子多核苷酸的等位基因变体，其中所述启动子多核苷酸选自a)具有SEQ IDNO：1、2或3中所示的序列的多核苷酸；b)包含具有SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1557至1907或核苷酸1498至1999或核苷酸1349至1999的多核苷酸；c)包含具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1650至2000或核苷酸1460至2110的多核苷酸；d)包含具有SEQ ID NO：3中所示的序列的多核苷酸的核苷酸491至841或核苷酸350至1000的多核苷酸；e)具有与a)至d)的任一个多核苷酸至少70％的序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)至d)的任一个多核苷酸杂交的多核苷酸；g)包含a)至d)的任一个多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；和h)包含具有SEQ ID NO：1、2或3所示的序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸。如本文中使用的，术语“等位基因变体”是指包含存在于天然群体(例如，植物物种或品种)中的多态性的启动子多核苷酸，所述多态性导致多核苷酸发生核苷酸的变化。术语“等位基因变体”还指包含存在于天然群体中的如下多态性的多核苷酸，其中所述多态性导致由该核苷酸编码的蛋白质的氨基酸序列发生变化。此类天然等位基因变异典型地可在多核苷酸中导致1-5％的变异性，或在编码的蛋白质中导致1-5％的变异性。可通过测定许多不同植物中目的核酸的序列来鉴定等位基因变体，这可通过使用例如杂交探针鉴定这些植物中相同的基因座来容易地进行。多核苷酸中作为天然等位基因变异的结果并且不改变多核苷酸的功能活性的任何和所有此类核酸变异均旨在本发明的范围之内。

在另一个实施方案中，启动子在暴露于病原体刺激的植物的根中被诱导。当植物被植物寄生性线虫感染或处在被其感染的过程中时，该病原体刺激可存在。响应病原体刺激而介导表达的启动子也称为病原体诱导型启动子。就本发明的启动子、分离的核酸或多核苷酸而言，术语根偏爱性表达是指在根组织，特别是在根维管组织中的表达。在豆科植物的情况下，其也可指在根瘤中的表达。在另一个实施方案中，启动子在豆科植物的根瘤中，例如在大豆的根瘤中被诱导。

本发明还涉及包含本发明的启动子多核苷酸的表达盒。在本说明书中“表达盒”应广义地理解为涵盖包含在盒中的可影响目的多核苷酸的转录和如适用，其翻译的所有序列。除了本发明的启动子多核苷酸外，本发明的表达盒还可包含改善启动子多核苷酸的功能的调控元件、允许在原核和/或真核生物中转录和/或翻译的遗传元件以及下游(在3’-方向)调控元件例如转录终止序列和多腺苷酸化序列。本发明的表达盒的不同组件顺序地且有效地连接在一起

因此，本发明的表达盒可包含能够介导根偏爱性或病原体诱导型表达的启动子多核苷酸，其选自a)具有SEQ ID NO：1、2或3中所示的序列的多核苷酸；b)包含具有SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1557至1907或核苷酸1498至1999或核苷酸1349至1999的多核苷酸；c)包含具有SEQ ID NO：2中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1650至2000或核苷酸1460至2110的多核苷酸；d)包含具有SEQ ID NO：3中所示的序列的多核苷酸的核苷酸491至841或核苷酸350至1000的多核苷酸；e)具有与a)至d)的任一个多核苷酸至少70％的序列同一性的多核苷酸；f)在严格条件下与a)至d)的任一个多核苷酸杂交的多核苷酸；g)包含a)至d)的任一个多核苷酸的生物活性部分的多核苷酸；h)包含具有SEQ ID NO：1、2或3所示的序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；i)包含启动子构型1的多核苷酸；j)包含启动子构型2的多核苷酸；和k)包含启动子构型3的多核苷酸。

可任选地包含在本发明的表达盒中的特定的遗传元件包括但不限于允许在细菌中复制的复制起始，例如来自pBR322的ORI区或P15A ori；或农杆菌(Agrobacterium)T-DNA转移所需的元件例如T-DNA的左和/或右边界。本发明的表达盒的其他组件可包括但不限于另外的调控元件例如增强子、内含子、多接头、多克隆位点、操纵基因、阻抑物结合位点、转录因子结合位点等。示例性增强子包括来自CaMV 35S启动子、章鱼碱合酶基因(Ellis等人，1987)、稻肌动蛋白I基因、玉米醇脱氢酶基因(Callis1987)、玉米shrunken I基因(Vasil 1989)、TMVω元件(Gallie 1989)和非植物真核生物启动子(例如，酵母；Ma 1988)的元件。示例性植物内含子序列包括来自Adh1、bronze1、肌动蛋白1、肌动蛋白2的内含子(WO00/760067)或蔗糖合酶内含子；参见：The Maize Handbook，Chapter 116，Freeling和Walbot，Eds.，Springer，New York(1994)。

病毒前导序列也可增强本发明的表达盒对目的核酸的转录。例如，来自烟草花叶病毒(TMV)、玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)和苜蓿花叶病毒(AMV)的前导序列已显示有效地增加表达。本领域内已知的其他前导序列包括但不限于：小RNA病毒前导序列，例如，(脑心肌炎病毒(EMCV)前导序列；马铃薯Y病毒组前导序列、烟草蚀斑病毒(TEV)前导序列；MDMV前导序列(玉米矮化花叶病毒)；人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)前导序列、来自苜蓿花叶病毒衣壳蛋白mRNA(AMV RNA4)的非翻译前导序列。

本发明的表达盒还包含转录终止元件或多聚苷酸化信号。示例性转录终止元件包括来自根癌农杆菌的胭脂碱合酶的转录终止元件(Bevan 1983)、来自根癌农杆菌的章鱼碱合酶基因的T7转录物的终止子以及来自马铃薯或番茄的蛋白酶抑制剂I或II基因的3’末端。

将待转录成RNA和任选地表达为蛋白质的第二多核苷酸插入本发明的表达盒以用于转化入生物。根据本发明，将第二多核苷酸以共价连接的方式置于本发明的启动子的下游(即，3’-方向)和转录终子元件的上游。优选，第二多核苷酸与本发明的启动子之间的距离不超过200个碱基对，更优选不超过100个碱基对，最优选不超过50个碱基对。

还可通过将本发明的启动子插入植物基因组来装配本发明的表达盒。这样的插入将导致与该基因组天然的目的核酸序列的有效连接。由于本发明的启动子的调控转录的性质，这样的插入允许目的核酸，在被线虫诱导后，优先地在根组织中表达或过表达。插入可以是定向的或随机的。优选，例如通过同源重组来实现定向插入。通过该方法，可用本发明的启动子替换天然启动子，从而改变内源基因的表达特征。

可将本发明的表达盒插入重组载体、质粒、粘粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)，或适合用于转化宿主细胞的任何其他载体。优选宿主细胞是细菌细胞，特别地大肠杆菌(Escherichia coli)、根癌农杆菌和毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)细胞以及植物细胞。当宿主细胞是植物细胞时，可使表达盒或载体插入转化的植物细胞的基因组。备选地，可以以染色体外的方式保持表达盒或载体。本发明的表达盒或载体可存在于植物细胞的细胞核、叶绿体、线粒体和/或质体中。优选，将本发明的表达盒或载体插入植物细胞核的染色体DNA。

可将本发明的表达盒转化入植物以提供包含与本发明的启动子多核苷酸有效连接的一个或多个多核苷酸的转基因植物。该实施方案的转基因植物包括包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中所示的多核苷酸序列、SEQ ID NO：1的最小启动子片段、SEQ ID NO：2的最小启动子片段或SEQ ID NO：3的最小启动子片段的启动子。备选地，本发明的转基因植物包含启动子多核苷酸，其在严格条件下与包含SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3中所示的核酸序列、SEQ ID NO：1的最小启动子片段、SEQ ID NO：2的最小启动子片段或SEQ ID NO：3的最小启动子片段的启动子杂交。此外，本发明的转基因植物可以含有：与具有SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3中所示序列的多核苷酸、SEQ ID NO：1的最小启动子片段、SEQ ID NO：2的最小启动子片段或SEQ ID NO：3的最小启动子片段有至少70％序列同一性的启动子多核苷酸；包含具有SEQID NO：1、2或3中所示序列的多核苷酸的至少50个连续核苷酸或至少100个连续核苷酸或至少200个连续核苷酸的片段的多核苷酸；包含启动子构型1的多核苷酸；包含启动子构型2的多核苷酸；和k)包含启动子构型3的多核苷酸。

使用植物生物技术学领域内的技术人员已知的转化方法产生本发明的转基因植物。可使用任何方法将重组表达载体转化入植物细胞来产生本发明的转基因植物。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的适当的方法可见于例如WO2006/024509(PCT/EP2005/009366；USSN60/6060789)和Sambrook等人(同上引文)以及其他实验室手册例如Methods inMolecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，Ed：Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。

用于转化双子叶植物的一般方法还公开于例如美国专利4,940,838、5,464,763等。用于转化特定双子叶植物例如棉花的方法示于美国专利5,004,863、5,159,135和5,846,797中。大豆转化方法示于美国专利4,992,375、5,416,011、5,569,834、5,824,877、6,384,301和EP 0301749B1中。其他植物转化方法公开于例如美国专利4,945,050、5,188,958、5,596,131、5,981,840等中。

本文中使用的术语“植物”，取决于上下文，可以理解为指完整的植物、植物细胞、植物器官、植物种子和其后代。单词“植物”还指任何植物，特别地指种子植物，并可以包括但不限于农作物植物。植物部分包括但不限于茎、根、枝、果实、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小胞子、下胚轴、子叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。植物可来自选自如下的属：玉米、小麦、大麦、高梁、黑麦、小黑麦、稻、甘蔗，柑桔树、菠萝、椰子、香蕉、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜(oilseed rape)、芸苔(canola)、甜菜、甘蓝、花椰菜、青花椰菜(broccoli)，莴苣、百脉根属(Lotus sp.)、蒺藜苜蓿(medicagotruncatula)、多年生草(prerennial grass)、黑麦草和拟南芥。在另一个实施方案中，植物可来自选自柑桔树、菠萝、咖啡、茶、烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔(canola)、甜菜、甘蓝、花椰菜、青花椰菜，莴苣、百脉根属、蒺藜苜蓿和拟南芥的属。在另一个实施方案中，植物可来自选自烟草、向日葵、豌豆、苜蓿、大豆、番茄、马铃薯、棉花、烟草、茄子、胡椒、油菜、芸苔(canola)、甜菜、甘蓝、花椰菜、青花椰菜，莴苣、百脉根属、蒺藜苜蓿和拟南芥的属。在另一个实施方案中，植物可来自选自玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、小黑麦、稻、甘蔗、菠萝、椰子、香蕉、多年生草和黑麦草的属。

可使用已知的植物育种方法使本发明的转基因植物与相似的转基因植物或与缺乏本发明的启动子和第二核酸的转基因植物或与非转基因植物杂交来制备种子。此外，本发明的转基因植物可包含与本发明的启动子多核苷酸或与其它启动子有效连接的一个或多个不同的目的基因，和/或与另一转基因植物杂交(所述另一转基因植物包含与本发明的启动子多核苷酸或其它启动子有效连接的一个或多个不同的目的基因)，从而在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积(stack)”。然后种植种子以获得包含目的核酸和本发明启动子的杂交能育转基因植物。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。杂交能育转基因植物可具有通过雌性亲本或通过雄性亲本遗传的特定表达盒。该第二植物可以是近交系植物。杂交能育转基因植物可以是杂种。也包括在本发明的范围内的是这些杂交能育转基因植物中的任一种的种子。可从能育转基因植物收获本发明的种子并且用于生长本发明的转化植物的后代(包括包含DNA构建体的杂种植物品系)。

“基因堆积”还可通过使用植物转化将两个或更多个基因转移入细胞核来实现。在转化过程中可将多个基因顺序地或一齐地导入细胞核。可通过基因沉默机制，特别地RNAi，使用靶向连接的多个目的部分序列的单个转基因，下调植物或靶病原体物种中的多个基因。还可过表达在相应的启动子控制下的堆积的多个基因来获得期望的单个或多个表型。还可将包含具有过表达的基因和沉默的靶标的基因堆积的构建体导入植物，从而产生单个或多个农艺学上重要的表型。在某些实施方案中，可将本发明的核酸序列与目的多核苷酸序列的任何组合进行堆积来产生期望的表型。所述组合可导致具有各种性状组合(包括但不限于疾病抗性、除草剂抗性、生产增强、冷和干旱耐受性)的植物。可通过任何方法，包括但不限于利用常规方法的杂交育种植物或遗传转化来产生这些堆积的组合。如果通过遗传转化堆积性状，可以以任何顺序相继地或同时地组合目的多核苷酸序列。例如如果要导入两个基因，可将两个序列包含在分开的转化盒中或包含在相同的转化盒中。可用相同的或不同的启动子来驱动序列表达。

本发明还包括农作物(crop)，所述农作物包括在农田中种植在一起的多个本发明转基因植物。

本发明的转基因植物可用于在农作物中控制植物寄生性病原体侵染的方法中，该方法包括从包含表达盒的种子生长所述农作物的步骤，所表达盒包含与编码活性剂的第二多核苷酸有效连接的本发明的启动子多核苷酸，所述活性剂破坏所述植物寄生性病原体的新陈代谢、生长和/或生殖，提高植物对所述植物寄生性病原体的耐受性，或对所述植物寄生性病原体是有毒的，其中表达盒被稳定地整合入植物细胞、植物和/或种子的基因组中。此类活性剂包括但不限于与寄生性植物病原体的靶基因(所述靶基因是病原体存活、变态或生殖所必需的)基本上相同的双链RNA；与维持线虫摄食位置所需的植物基因基本上相同的双链RNA；干扰病原体的新陈代谢、存活、变态或生殖的反义RNA、siRNA、miRNA或其前体或蛋白质，或干扰病原体的新陈代谢、存活、变态或生殖的微生物毒素、来源于昆虫的毒素等。

下列实施例无意限制权利要求的范围，而是旨在作为某些实施方案的示例。本领域技术人员可想到的这些示例性方法的任何变化均旨在落入本发明的范围之内。

实施例

实施例1从大豆克隆TPP-样基因启动子

将大豆Glycine max cv.Williams 82种子在25℃下于1％琼脂板上萌发3天，然后以每袋1颗幼苗转移至萌发袋。一天后，每幼苗用1000只大豆胞囊线虫小种3的二龄幼虫(J2)接种。将幼苗保持在相同的培养条件下。在袋子上标记根尖的位置。接种一天后，取出幼苗，然后在水中漂洗以除去表面上的剩余线虫，然后转移至新的袋子，并且在袋子上标记根尖的位置。

在接种后6天，用剃须刀片将两个标记之间的根部分切成1cm长的棍段并且立即将其在含有3份乙醇和1份冰醋酸的溶液中固定。将溶液在400mm Hg下抽真空15分钟，进行2次，然后在冰上保持4至8小时。然后在冰上用10％蔗糖浸渗(infiltration)根段4小时，然后在冰上用15％蔗糖浸渗4小时。在每个浸渗步骤中，首先将溶液在400mm Hg下抽真空15分钟。将所有蔗糖溶液进行DEPC(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)处理以抑制RNA酶活性。

然后取出根段，用纸巾吸干以除去表面的液体，然后于Cryomold中包埋在OCT(Optimum Cutting Temperature)(Sakura Finetechnical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)中，之后立即在液氮中冷冻。一旦OCT在模具中形成块后，可将其在-80℃下贮存。

用Leica Cryostat C3050s(Leica Microsystems Nussloch GmbH，Nussloch，Germany)沿纵向将根段切成10μm的切片。切片温度设置在-15℃。将切片转移至PEN(P.A.L.M.Microlaser Technologies GmbH，Bernried，Germany)载玻片的膜侧上并且在-80℃下保存。

首先将载玻片在冷(4℃)70％乙醇中固定1分钟，然后通过将载玻片浸没于1x PBS(Mediatech Inc.，Herndon，VA)中2分钟来溶解OCT，之后在70％、95％和100％乙醇中脱水，在各溶液中各1分钟。然后风干载玻片，将其置于PALM(P.A.L.M.Microlaser Technologies GmbH，Bernried，Germany)显微镜上进行观察。合胞体细胞根据它们的独特形态学，扩大的细胞大小、增厚的细胞壁以及稠密的细胞质，来鉴定。在200μl微量试管(micro-tube)的盖子上装上来自试剂盒的20μl RNA提取缓冲液，并且使用支架将其安装在样品上方，使开放端面朝样品。使用PALM系统的计算机界面，界定切割区域。然后发射激光束穿过载玻片并且将合胞体切成小块。同时，激光束的力量将切块吹入样品上方的RNA提取缓冲液中。完成后，立即将盖子从支架取下，然后重新盖在其管上，将含有合胞体切块的RNA提取缓冲液离心至管底。

使用来自Arcturus(Arcturus Inc.，Mountain View，CA)的PicoPure^TMRNA分离试剂盒，按照厂商说明书，从激光捕获的细胞提取和分离总细胞RNA。

为了从低输入量的总RNA扩增RNA，按照厂商说明书使用来自Arcturus(Arcturus Inc.，Mountain View，CA)的RiboAmp^TM HS RNA扩增试剂盒，包括在开始用户指南上所推荐的RiboAmp^TM HS方案之前，向输入的样品RNA中加入核酸载体。当少至500pg的参照RNA和RiboAmp^TMHS RNA Amplification试剂盒提供的载体核酸一起在扩增反应中用作输入物时，获得成功的扩增。

在纯化和使用Gen III Spotter(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)重悬浮于50％DMSO中后，将代表待询查的一系列基因的大豆(Glycine max)cDNA PCR产物利用机器人点在经化学修饰的玻璃载体(UltraGAPS，Corning Inc.，Acton，MA)上。在所有点样期(spotting sessions)开始时，包括由一组对照基因(18个基因，12份重复)组成的对照PCR板，这样，每一个面板的第一行的前18个点是外部掺加基因(spike gene)，它们可用作QC对照和/或用于获得标准曲线，借助于所述标准曲线计算了面板中其他克隆的标化后丰度。对照基因是可商购获得的一组基于酵母的基因间区域的序列设计的人工基因(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

在微阵列方法中一组对照基因的执行使得可以采用基于单色的杂交方法而不用之前实践的两色杂交模式，即，标记单个cDNA样品并使之与cDNA阵列杂交而不是使用处理样品和参照样品对。因而，可计算原始RNA样品中各表达转录物的标化信号强度和由此绝对转录物丰度(而非比值)，并且可在样品间和不同实验间比较。

如基于随机引物的标记方案(Genisphere，Hatfield，PA)中所述，使用Genisphere^TM的3DNA Dendrimer技术用Cy 3间接标记扩增的RNA(aRNA)样品，然后使用Mfr的说明书中描述的两步骤杂交方案(Genisphere，Hatfield，PA)使其与大豆cDNA阵列杂交。对来自aRNA的逆转录的cDNA产物进行柱纯化，然后在Agilent BioAnalyzer上检查其质量。然后将纯化的cDNA连接至捕获序列(capture sequence)，使用标准分子生物学方法对其进行进一步纯化和浓缩。为了增加重复性和样品间可比性，对于所有样品，将相同量(～250ng)的纯化cDNA-捕获序列连接混合物用于阵列杂交。在杂交和标记之前，将已知量的对照基因的相应cDNA预混合物掺加入样品cDNA中。为了使与手工杂交相关的变异减少至最小，在Lucidea ProAutomated Slide处理器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)上进行所有杂交。

使用Gen III扫描仪(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)扫描经处理的载玻片。导入从Gen III扫描仪产生的.gel文件，使用来自BioDiscovery(Los Angeles，CA)的特征提取软件ImaGene^TM version 5.1进行分析，其中，图像被分解成像素并且被转化成数字强度值。还获得与图像上的各点相关的局部背景和其他QC值。

将从ImaGene^TM获得的原始数据直接输入内部开发的基于SAS的微阵列表达数据分析流水线(pipeline)，然后在下列连续步骤中进行处理。从数据集中除去来自阴性点、空点和坏点的数据。阴性点、空点和坏点的定义遵循软件开发人员的建议(BioDiscovery，Los Angeles，CA)和基于经验性确定的用于数据去除的设置(setting)。阴性点定义为在就局部背景进行校正后获得阴性信号值的任何点。空点定义为在就局部背景进行校正后具有低于n x SD_背景的信号值的任何点，其中n通常定义为2或3。而坏点定义为CV_信号强度大于经验确定的值的任何点，该经验确定值是点/信号形态学、外来污染和杂交信号的均一性的量度。在ImaGene^TM软件中处理图像之前必须设定好所有这些设置值，并且在ImaGene^TM输出文件中给点标上非零“标签”(flay)值，指示QC差错(miss)的类型。只有具有“0”的“标签”值的点才保留用于进一步分析。将保留的信号测量值标准化，这样每个阵列的整体背景平均值(global ground means)按比例扩大至500。

作为成功开发用于控制线虫侵染的方法的前提，需要鉴定由于线虫侵染大豆根而引发表达的基因。这些基因包括但不限于合胞体形成所必需的基因和响应SCN感染而差异表达的基因。

为了鉴定在合胞体中特异性和/或差异表达的基因，收集三种类型的细胞和根组织并且将其用于总细胞RNA的提取，即，合胞体、不直接与大豆胞囊线虫接触但来自SCN感染的大豆根的根区段(称为“非合胞体)”和未处理的对照根。如上所述从LCM捕获的合胞体提取、分离总RNA并且进行扩增。为了从根区段分离总RNA，按照厂商推荐的方案使用来自Invitrogen Life Technologies(Invitrogen Corporation，Carlsbad，California)的

RNA分离试剂盒。按照厂商的用户指南所描述的，使用Qiagen RNeasy Midi试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)进一步纯化总RNA。为了更好地比较从LCM捕获的合胞体和根组织区段产生的表达数据，使从“非合胞体”和未处理的对照根制备的总RNA接受相同的如上所述2轮RNA扩增过程，这样在最终的分析中比较的是来自大豆根的所有三种细胞/组织类型的扩增的aRNA。

表1描述了本研究中收集和分析的LCM捕获的合胞体样品和“非合胞体”以及对照根组织样品的数目。关于RNA扩增和微阵列杂交的信息也包括在该表中。

表1.组织样品和实验信息

样品名称/处理	样品的数目	扩增的RNA的数目	杂交的数目
				6-天的合胞体	2	2	9
6-天的非合胞体	2	2	11
				6-天的未处理的根	3	4	17

从LCM捕获的合胞体、“非合胞体”和对照根组织的样品产生的基因表达数据的统计分析导致在合胞体中特异性表达或差异表达的基因的鉴定。一个这样的基因(48986355)被注释为编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶样蛋白。表2概括了通过cDNA微阵列分析在所有三种细胞/组织样品：合胞体、SCN感染的非合胞体和未处理的对照根组织上测量到的表达数据。基因表达的相对水平表示为上述的经标准化的信号强度(±标准差)。

表2.海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因的表达

基因名称	合胞体#1(N)	合胞体#2(N)	非合胞体	对照根
					48986355	712±90(4)	453±205(5)	ND^*	ND

(N)中的N是cDNA微阵列测量的次数。

ND：在本研究中描述的实验条件下未能检测到的。

如表2中所显示的，大豆cDNA克隆48986355经鉴定在SCN-感染的大豆根的合胞体中上调。图4描述了大豆cDNA克隆48986355的序列。48986355cDNA序列(SEQ ID NO：4)经测定为全长，因为存在始于bp 87的TAG终止密码子，该密码子位于开始于碱基对102的编码海藻糖-6-磷酸磷酸酶的开放阅读框的ATG起始密码子的上游并在相同读框中。

为克隆48986355的启动子序列，按照厂商说明书使用UniversalGenome Walking试剂盒(Clontech Laboratories Inc.，Palo Alto，Calif.)。为此，使用Qiagen DNAeasy Plant Minikit(Qiagen)提取大豆(Glycine max，Resnik)基因组DNA。方法由两个PCR扩增组成，对于每个扩增反应使用衔接子引物和基因特异性引物。用于分离本发明的启动子的引物的序列示于图9中。靶向48986355(SEQ ID NO：4)的基因特异性引物是初级引物(primary primer)48986355GW(SEQ ID NO：10)和嵌套引物(nestedprimer)48986355GWnest(SEQ ID NO：11)。所使用的衔接子引物是AP1(SEQ ID NO：12)和AP2(SEQ ID NO：13)。通过使用该方案，分离并且测序了数个克隆。

最长的克隆产物鉴定为pAW260(SEQ ID NO：5)。如图10a-c中所示，pAW260与48986355的序列比对表明，该克隆与48986355(SEQ ID NO：4)相同。比对显示，pAW260在ATG的上游从pAW260序列的核苷酸位置32至1031包含1000bp的启动子序列(参见图10a-c)。使用标准PCR技术以及引物48986355prF(SEQ ID NO：14)和48986355prR(SEQ ID NO：15)将该启动子区域克隆出pAW260。48986355prF和48986355prR从pAW260扩增了分别包含限制性酶位置XmaI和AscI以便于定向克隆的该1000bp的启动子片段。48986355启动子和5’UTR序列(无用于克隆的限制性位点)示于SEQ ID NO：3。核苷酸序列1-841为具有跨核苷酸491-841的核心启动子区域的完整启动子序列。TATA信号跨越核苷酸808-814，mRNA的5’非翻译前导序列来自核苷酸841-1000。

实施例2从拟南芥克隆海藻糖-6-磷酸磷酸酶(TPP)的启动子

基于与实施例1中显示的大豆cDNA序列的相似性选择了拟南芥At1g35910和At5g10100基因。使用Qiagen DNAeasy Plant Minikit(Qiagen，Valencia，California，US)提取拟南芥(哥伦比亚生态型)基因组DNA。使用标准PCR扩增方案克隆了相应于分别具有基因座标识符At1g35910和At5g10100的拟南芥海藻糖-6-磷酸磷酸酶样基因的1,999bp(SEQ IDNO：1)和2,110bp(SEQ ID NO：2)基因组DNA区域(推定的启动子序列)，所述DNA区域位于ATG密码子紧上游并包括5’非翻译区。为此，在PCR反应中使用大约0.1μg的拟南芥基因组DNA作为DNA模板。用于拟南芥启动子序列的PCR扩增的引物示于图9并且基于拟南芥基因组序列数据库(TAIR)设计。由SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8描述的引物序列包含XmaI限制性位点以便于克隆。由SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9描述的引物序列包含AscI限制性位点以便于克隆。由SEQ ID NO：6和SEQ IDNO：7描述的引物序列用于扩增拟南芥基因座At1g35910的启动子区域。由SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9描述的引物序列用于扩增拟南芥基因座At5g10100的启动子区域。

扩增反应混合物包含下列物质：2.5μl 10X Hot Start缓冲液；0.15μlHot Start Taq DNA聚合酶；0.5μl 10mM dNTPs；0.5μl 10μM引物A；0.5μl 10uM引物B；1.0μl哥伦比亚拟南芥基因组DNA(大约100ng)；19.85μl水。使用下列设置利用热循环仪：T3Thermocycler(Biometra，Goettingen，Germany)进行扩增：1个循环：在94℃下进行900秒；5个循环：在94℃下进行30秒，在52℃下进行30秒，和在72℃下进行120秒；30个循环：在94℃下进行30秒，在62℃下进行30秒，和在72℃下进行120秒；1个循环：在72℃下进行300秒。

使用标准琼脂糖凝胶电泳验证各PCR产物的扩增的DNA片段大小，并且使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Valencia，California，US))从凝胶提取DNA。按照厂商说明书(Invitrogen)使用TOPO TA克隆试剂盒将纯化的片段TOPO克隆入pCR2.1。使用Applied Biosystem 373A(AppliedBiosystems，Foster City，California，US)自动测序仪测定克隆的片段的序列，然后通过使用来自序列分析工具Vector NTI(Invitrogen，Carlsbad，California，USA)的序列比对ClustalW(European Bioinformatics Institute，Cambridge，UK)，验证所述克隆的片段为预期的序列。相应于At1g35910和At5g1010的启动子区域的1,999bp和2,110bp DNA片段示于SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2。引物中导入的用于帮助克隆的限制性位点包含在这些序列中。

实施例3用于转化和产生转基因毛根的二元载体构建

为了评估克隆的启动子的表达活性，将相应于SEQ ID NO：1的核苷酸1-1999、SEQ ID NO：2的核苷酸1-2110和SEQ ID NO：3的核苷酸1-1000的基因片段克隆至GUS报告基因(细菌β-葡糖醛酸酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游，分别产生二元载体pAW284qcz、pAW281qcz和RAW403。二元载体中的植物选择标记是来自拟南芥的乙酰羟酸合酶(AHAS，EC 4.1.3.18，也称为乙酰乳酸合酶或ALS)基因的抗除草剂形式(Sathasivan等人，Plant Phys.97：1044-50，1991)。ARSENAL(imazapyr，BASF Corp，Florham Park，NJ)用作选择剂。

在本实施例中，通过电穿孔(Cho等人，(1998)Plant Sci.138，53-65)将二元载体pAW284qcz、pAW281qcz和RAW403qcz转化入毛根农杆菌(A.rhizogenes)K599株。使用下列方案将经转化的农杆菌用于诱导大豆毛根形成。在毛根农杆菌接种前大约5天，用10％漂白剂对来自大豆栽培种Williams 82(SCN-易感性)的种子消毒10分钟，然后在1％琼脂上在25℃使用16小时/日光照进行萌发。在毛根农杆菌接种前大约3天，将包含二元载体的毛根农杆菌株K599的冷冻贮存物在LB+卡那霉素(50μg/ml)板上划线并且在黑暗处于28℃温育。在毛根农杆菌接种前约1天，从板上挑取菌落，将其接种入液体LB+卡那霉素(50μg/ml)。在28℃摇动培养物大约16小时。将液体培养物中的毛根农杆菌的浓度调整至OD₆₀₀＝1.0。

从大豆幼苗切取子叶并且用解剖刀损伤近轴面数次。用15μl毛根农杆菌悬浮液接种在损伤的表面，然后以近轴面向上将子叶置于1％琼脂板上，于25℃使用16小时/日光照孵育3天。然后将子叶转移至含有500μg/ml羧苄青霉素(以抑制毛根农杆菌)和1μM ARSENAL的MS板上。在选择培养基上培养子叶2周后，从损伤位置诱导出毛根。收获抗ARSENAL并且在选择培养基上生长的根，然后将其转移至相同组成的新鲜选择培养基上，在黑暗处于25℃下进行温育。在收获毛根并且将它们在选择培养基上培养后2周，将毛根传代培养至含有羧苄青霉素500μg/ml但不含ARSENAL的MS培养基上。

实施例4 大豆毛根中启动子活性的检测

如实施例3中所示，将本发明的启动子置于与GUS报告基因有效连接以测定它们的表达活性。通过在活性染色反应中使用生色物质例如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)，可以在植物中(in planta)检测GUS基因的β-葡糖醛酸酶活性。.

为了研究SEQ ID NO：1、2和3在线虫感染存在及不存在的情况下的启动子活性，自使用pAW284qcz、pAW281qcz和RAW403的转化中产生几个独立的转基因株系。在传代培养后大约3周，以2000只J2/板的水平用表面去污染的SCN小种3的J2接种MS上的转基因毛根株系。在接种后12天(DAI)，通过从琼脂板上取出而收获根，然后将其换到水中轻轻地漂洗，然后在含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色液中于37℃染色16小时。在接种后的每一个时间点上，也在GUS染色液中对来自各株系的未接种的对照板进行染色。在GUS染色后，将根在酸性品红中染色，然后脱色以显现染成红色的线虫。然后在显微镜下观察根以检测GUS表达。

对于每个转基因株系，在感染后12天(DAI)观察10个随机挑取的合胞体并且就GUS表达的强度进行评分。使用下列评分指标：“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。10个计数的上舍入平均值用于确定对于该株系而言合胞体中的GUS表达水平。此外，相同株系中的其他根组织例如愈伤组织、根尖、维管组织、皮层和原基(primordial)的GUS表达水平也使用相同的GUS评分指标(“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色)来记录。用pAW284qcz、pAW281qcz和RAW403转化的株系的结果示于图6。

GUS染色的结果表明，对于大多数受检株系，pAW284中的启动子片段在12DAI在合胞体中显示中等至强GUS表达。相反地，在其他根部分例如根尖、维管组织和根皮层中GUS表达未被检测到或非常微弱。

实施例5 At1g35910(SEQ ID NO：1)启动子的克隆缺失

为了更精确地定义At1g35910的启动子区域(SEQ ID NO：1)，检测该上游序列的较短片段。使用Qiagen Plasmid miniprep试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌提取pAW284qcz的质粒DNA。使用标准PCR扩增方案扩增pAW284qcz中包含的拟南芥基因座At1g35910启动子(SEQ ID NO：1)的986bp和502bp启动子缺失片段。为此，在PCR反应中使用大约0.1μgpAW284qcz质粒DNA作为DNA模板。用于拟南芥启动子序列的PCR扩增的引物示于图9，并且所述引物基于pAW284qcz中包含的拟南芥基因座At1g35910启动子(SEQ ID NO：1)的启动子序列而设计。由SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17描述的引物序列包含PstI限制性位点以便于克隆。由SEQ ID NO：18描述的引物序列与pAW284qcz中的AscI位置的上游退火，从而使AatII位置包含在扩增的片段中以便于克隆。由SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18描述的引物序列用于扩增pAW284qcz中包含的拟南芥基因座At1g35910启动子的986bp启动子缺失区域。由SEQ ID NO：17和SEQID NO：18描述的引物序列用于扩增pAW284qcz中包含的拟南芥基因座At1g35910启动子的502bp启动子缺失区域。

扩增反应混合物包含下列物质：2.5μl 10X Pfu Turbo缓冲液；0.5μlPfu Turbo DNA聚合酶；0.5μl10mM dNTPs；0.5μl10μM引物A；0.5μl10μM引物B；1.0μl pAW284qcz质粒DNA(大约100ng)；19.50μl水。使用下列设置将T3Thermocycler(Biometra，Germany)用于扩增：1个循环：在94℃下进行60秒；32个循环：在94℃下进行30秒，在52℃下进行30秒，和在72℃下进行120秒；1个循环：在72℃下进行300秒。

使用标准琼脂糖凝胶电泳验证各PCR产物的扩增的DNA片段大小，然后使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，Hilden，德国))从凝胶提取DNA。按照厂商说明书(New England Biolabs，Ipswich，Massachusetts，US)使用PstI和AatII消化纯化的片段。使用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化消化的片段。使用引物SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18扩增的At1g35910启动子的986bp启动子缺失区域为SEQ ID NO：1的核苷酸1014至1999。使用引物SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18扩增的At1g35910启动子的502bp启动子缺失区域为SEQ ID NO：1的核苷酸1498至1999。引物中导入用于帮助克隆的限制性位点未包括在所述序列中。

实施例6用于转化和产生转基因毛根的

At1g35910启动子缺失二元载体构建

为了评估来源于pAW284qcz的克隆的启动子缺失的表达活性，将相应于SEQ ID NO：1的核苷酸1014-1999和SEQ ID NO：1的1498-1999的基因片段克隆至GUS报告基因(细菌β-葡糖醛酸酶或GUS基因(Jefferson(1987)EMBO J.6，3901-3907)的上游，分别产生二元载体RAW450和RAW451。二元载体中的植物选择标记是来自拟南芥的、提供对除草剂ARSENAL(imazapyr，BASF Corporation，Florham Park，NJ)的耐受性的、突变AHAS基因。

在本实施例中，通过电穿孔将二元载体RAW450和RAW451转化入毛根农杆菌K599株。使用下列方案将转化的农杆菌用于诱导大豆毛根的形成。在毛根农杆菌接种前大约5天，用10％漂白剂对来自大豆栽培种Williams 82(SCN-易感性)的种子消毒10分钟，然后在1％琼脂上在25℃使用16小时/日光照来进行萌发。在毛根农杆菌接种前大约3天，将包含二元载体的毛根农杆菌株K599的冷冻贮存物在LB+卡那霉素(50μg/ml)板上划线并且在黑暗处于28℃温育。在毛根农杆菌接种前约1天，从板上挑取菌落，将其接种入液体LB+卡那霉素(50μg/ml)。在28℃摇动培养物大约16小时。将液体培养物中的毛根农杆菌的浓度调整至OD₆₀₀＝1.0。

从大豆幼苗切取子叶并且用解剖刀损伤近轴面数次。用15μl毛根农杆菌悬浮液接种在损伤的表面，然后于25℃使用16小时/日光照以近轴面向上将子叶置于1％琼脂板上3天。然后将子叶转移至含有500μg/ml羧苄青霉素(以抑制毛根农杆菌)和1μM ARSENAL的MS板上。在选择培养基上培养子叶2周后，从损伤位置诱导出毛根。收获抗ARSENAL并且在选择培养基上生长的根，然后将其转移至相同组成的新鲜选择培养基上，在黑暗处于25℃进行温育。在收获毛根并且将它们在选择培养基上培养后2周，将毛根传代培养至含有羧苄青霉素500μg/ml但不含ARSENAL的MS培养基上。

实施例7大豆毛根中检测启动子缺失的活性

如实施例6中所示，将本发明的启动子置于与GUS报告基因有效连接来测定它们的表达活性。可通过生色物质例如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性染色反应中在植物中检测GUS基因的β-葡糖醛酸酶活性。

为了研究在线虫感染存在及不存在的情况下SEQ ID NO：1的缺失片段的启动子活性，从用pAW284qcz、RAW450和RAW451的转化中产生几个独立的转基因株系。在传代培养后约三周，以2000只J2/板的水平用表面去污的SCN小种3的J2接种MS上的转基因毛根株系。在接种后12天(DAI)，通过从琼脂板上取下来收获根，将其换入水中轻轻漂洗，然后在含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色液中于37℃染色16小时。在接种后的每一个时间点上，也在GUS染色液中对来自各系的未接种的对照板进行染色。在GUS染色后，在酸性品红中对根进行染色，然后脱色以显现染成红色的线虫。然后在显微镜下观察根以检测GUS表达。

对于每个转基因系，在感染后12天(DAI)观察10个随机挑取的合胞体并且就GUS表达的强度对其进行评分。使用下列评分指标：“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色。10个计数的上舍入平均值用于确定在该系中合胞体中的GUS表达水平。此外，相同株系的其他根组织例如愈伤组织、根尖、维管组织、皮层和原基的GUS表达水平也使用相同的GUS评分指标(“-”表示无染色，“+”表示弱染色，“++”表示强染色)来记录。用pAW284qcz、pAW450和RAW451转化的株系的结果示于图7。

RAW450中包含的986bp启动子序列不能在合胞体中提供线虫诱导的表达。RAW451中包含的502bp启动子序列能够在合胞体中提供线虫诱导的表达，表明所有的必需调控元件都存在于起始密码子上游502bp的区域内。这些结果与实施例9中所述的使用Genomatix的启动子分析结果一致。

实施例8启动子的PLACE分析

PLACE(National Institute of Agrobiological Sciences，Ibaraki，Japan)分析结果表明TATA框位于如图1中所示的SEQ ID NO：1的核苷酸位置1871至核苷酸位置1877。因此，5’非翻译区始于大约核苷酸位置1907。由SEQ ID NO：1描述的序列终止于正好ATG起始密码子之前。由SEQ IDNO：1描述的启动子的潜在核心区域是核苷酸位置1557至核苷酸位置1907。

PLACE分析结果表明无TATA框定位于图2中显示的SEQ ID NO：2的3’末端大约300bp内。预测的5’非翻译区始于大约核苷酸位置2000。由SEQ ID NO：2描述的序列终止于正好ATG起始密码之前。由SEQ IDNO：2描述的启动子的潜在核心区域是核苷酸位置1650至核苷酸位置2000。

PLACE结果表明TATA框位于如图3中所示的SEQ ID NO：3的核苷酸位置808至核苷酸位置814。因此，5’非翻译区始于大约核苷酸位置841。由SEQ ID NO：3描述的启动子的潜在核心区域是核苷酸位置491至核苷酸位置841。

实施例9启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3的鉴定

Genomatix是包含DiAlign和FrameWorker(Genomatix，Munich，Germany)算法的启动子序列分析软件应用程序。DiAlign是多序列比对工具，FrameWorker可扫描一组DNA序列以确定取向和距离相关的转录因子结合位点(启动子元件种类)。

SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的3’650bp用于上述的两个Genomatix分析。这相应于SEQ ID NO：1的核苷酸1349至1999、SEQ ID NO：2的核苷酸1460至2110和SEQ ID NO：3的核苷酸350至1000。

为确定SEQ ID NO：1的核苷酸1349至1999、SEQ ID NO：2的核苷酸1460至2110和SEQ ID NO：3的核苷酸350至1000之间是否存在序列同源性，使用Genomatix DiAlign程序。DiAlign是依赖于序列的完整区段的比较而非单核酸/氨基酸的比较的(DNA或蛋白质)比对程序。星号(＊)指示输入序列之间相对的局部相似性程度。最大可能相似性由10个‘＊’符号表示。该分析的结果示于图11a-c。使用Genomatix FrameWorke算法比较SEQID NO：1的核苷酸1349至1999、SEQ ID NO：2的核苷酸1460至2110和SEQ ID NO：3的核苷酸350至1000，以使用已知植物启动子元件和通过Genomatix CoreSearch算法鉴定的大豆胞囊线虫诱导型启动子相关的新启动子元件，确定植物启动子元件种类的共同构型。用于GenomatixFrameWorker分析的参数如下：启动子元件之间5至200bp的距离、1.0的核心相似性和优化的矩阵相似性(matrix similarity)。在该分析中鉴定了多个启动子构型模式。产生了分别包含6、3和5个启动子元件的启动子构型1、启动子构型2和启动子构型3，如图8中所概述的。包含6个启动子元件种类的模式称为启动子构型1。使用与确定启动子构型2和启动子构型3不同的方法确定了启动子构型1。发现，在SEQ ID NO：1的核苷酸1349至1999、SEQ ID NO：2的核苷酸1460至2110和SEQ ID NO：3的核苷酸350至1000之间存在多个共同的元件。特别地，对于启动子构型1，如发明概述中描述的和图12中显示的，存在彼此之间取向密切相关的3对元件。包含3个启动子元件种类的模式被称为启动子构型2。包含5个启动子元件种类的模式被称为启动子构型3。SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的启动子序列中包含的启动子元件种类的定位分别示于图1、图2和图3中。此外，图12显示在所有三个启动子构型中启动子元件种类的共同空间取向。

实施例10二元载体构建产生

具有BAR选择的完整植物启动子构建体

为了评估SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的克隆的启动子序列在大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)感染和使用立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)大豆专化型(f.sp.)和腐皮镰孢大豆专化型(Fusarium solani f.sp.glycines)进行真菌接种后在大豆根瘤中的表达活性，将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的启动子序列克隆在GUS报告基因的上游以分别产生二元载体RAW425、RAW424和RTJ131。二元载体中的植物选择标记是由组成型胭脂碱合酶基因启动子(p-NOS，An G.等人，The Plant Cell 3：225-233，1990)驱动的BAR基因。将二元载体RAW425、RAW424和RTJ131用于产生转基因根以进行分析。

实施例11大豆生根植物测定系统

(Soybean Rooted Plant Assay System)

在小室中，用通过向100ml漂白剂中逐滴加入3.5ml12N HCl产生的氯气，对来自大豆栽培种Glycine max cv.Williams 82的干净大豆种子进行消毒。所有操作在通风橱中进行。在小室中进行24小时后，取出种子，立即使用或在室温下贮存直至使用。除去变色的种子或破裂的种子。为了浸种，将温GM培养基倒在种子周围直至种子被培养基完全覆盖。幼苗在光照下生长5至7天直至上胚轴延伸超出子叶。在用于转化前可以将幼苗在4℃保存过夜。GM(萌发培养基)包含：1X B5盐和维生素、1X MS(铁原液iron stock)、2％蔗糖和0.8％纯净琼脂，pH5.8。作为备选，可在农杆菌接种前，将大豆种子在陪替培养皿中在1％琼脂(50ml)上萌发7天。

在农杆菌接种前3天，将农杆菌培养物例如卸甲(disarmed)毛根农杆菌株K599液体培养物在28℃的振荡器中置于5ml LB+Kan50(含有50ug/ml卡那霉素)培养基中过夜。第二天，取出1ml培养物，将其涂在LB+Kan50琼脂板上。将板在28℃的培养箱中温育2天。在此两天期结束时，板上覆盖了厚厚的菌落。对于每50个待接种的外植体制备一块板。

如上所述制备的大豆幼苗具有长度大约3至5cm的伸长的下胚轴和可见的上胚轴。然后通过除去上胚轴和部分下胚轴来制备外植体。外植体包含一个或两个子叶、腋生分生组织(axillary meristem)和长度大约2至3cm的下胚轴。除去种皮以促进子叶发育。下胚轴的切口端(cut end)是转化/感染的靶。

备选地，将包含近端(从其与幼苗的连接而言)的子叶用作另一种类型的转化外植体。切口端是农杆菌接种的靶。

在将外植体切离幼苗后，立即将切口端浸入上面制备的厚厚的毛根农杆菌菌落中以使菌落在切口端可见。将外植体置于陪替培养皿中的1％琼脂上以进行共培养。将大约10个外植体置于一个皿中。用Saran包装膜(Saran wrap)密封皿，然后在光照下于25-27℃共培养6天。

在实施例15中的转化和共培养步骤后，将大豆外植体转移至具有选择剂(例如，S-B5-605，对于Bar基因选择，或S-B5-708，对于AHAS基因选择)的生根诱导培养基。插入外植体以使底部的愈伤组织正好在培养基表面下方。每一个陪替培养皿放置6至9个外植体。将培养物保持在与共培养步骤中的条件相同的条件下。

S-B5-605培养基包含：0.5X B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1X B5维生素、400μg/ml特美汀(Timentin)、0.8％纯净琼脂和3μg/ml草铵膦(Bar基因的选择剂)，pH5.8。S-B5-708培养基包含：0.5X B5盐、3mM MES、2％蔗糖、1X B5维生素、400μg/ml特美汀、0.8％纯净琼脂和1μM Imazapyr(AHAS基因的选择剂)，pH5.8。

在根诱导后2至3周，在外植体的切口端上形成转化的根。在转移过程中除去位于愈伤组织上方组织上的伸长的根。对于bar基因选择，将外植体转移至补充有3mg/l草铵膦和400mg/l特美汀但无IBA的根延伸培养基(S-MS-607培养基)以进行进一步选择。对于AHAS基因选择，将外植体转移至相同的选择培养基(S-B5-708培养基)以进行进一步选择。一周内，转基因根在培养基中繁殖良好，并且准备进行传代培养。S-MS-607培养基包含：0.2X MS盐和B5维生素、2％蔗糖、400mg/l特美汀和3mg/L草铵膦，pH5.8。

从生根的外植体切取强状且白色的大豆根，然后将其在6孔板或陪替培养皿中培养在补充有200mg/l特美汀的根生长培养基(S-MS-606培养基)中。除去主根根尖以诱导次生根生长。在黑暗的条件中于室温下维持培养物。将每个根事件传代培养至3个不同的孔中作为复本。每孔中传代培养的根将旺盛地生长侧根。S-MS-606培养基包含：0.2X MS盐和B5维生素、2％蔗糖和200mg/l特美汀，pH5.8。.

实施例12生根植物测定系统

根瘤的诱导和根瘤中启动子活性的检测

如实施例10中所示，将本发明的启动子多核苷酸置于与GUS报告基因有效连接来测定表达活性。可通过生色物质例如5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖醛酸(x-Gluc)在活性染色反应中于植物中检测GUS基因的β-葡糖醛酸酶活性。

在本实施例中，通过电穿孔将二元载体RAW425、RAW424和RTJ131转化入卸甲毛根农杆菌K599株SHA017(pSB1)。使用实施例11、12、13、15、16和17中述及的方案将转化的农杆菌用于诱导大豆TRAP根形成。从延伸培养基中取出生根的外植体，用水清洗根以除去多余的培养基。将完整的外植体转移至装有湿沙子的4英寸花盆。每2天用BufferedNodulation培养基(Ehrhardt等人，1992)浇灌外植体一次。在湿沙子中2天后，用大豆慢生根瘤菌接种外植体的根。

为此，4ml大豆慢生根瘤菌培养物在YM液体培养基中开始，在摇动的条件下于28C下培养。每升YM培养基包含：10g甘露醇、0.4g酵母提取物、1ml K2HPO4(10％w/v原液)、4ml KH2PO4(10％w/v原液)、1mlNaCl(10％w/v原液)和2ml MgSO4.7H20(10％w/v原液)。将pH调整至6.8，并且对1升终体积溶液进行高压灭菌。7天后，将600微升起子培养物转移至40ml新鲜YM液体培养基。开始多个40ml培养物。培养物在摇动的条件在28C下生长48小时，达到大约0.2的OD600。合并这些大豆慢生根瘤菌培养物并且用Bufferen Nodulation培养基稀释6倍。用大约25ml稀释的大豆慢生根瘤菌培养物接种栽有生根的外植体的各花盆。使用木钉(wooden dowel)在沙子中产生大约4个大约2英寸深的洞，使用移液器将稀释的大豆慢生根瘤菌培养物接种入洞中。从接种后的第二天开始，每2天用Buffered Nodulation培养基灌溉生根的外植体一次。

2周后，从4英寸的花盆中取出生根的植物测定系统，用水清洗根以除去沙子。使用剃须刀片切下包含根瘤的根的区域并且将其置于含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色液中，然后转移至37℃进行16小时。使用剃须刀片将一些根瘤切成两半。除去GUS染色液，用包含等份的甘油、水和醋酸的溶液替代。然后观察根瘤的GUS染色。观察到构建体RAW425中包含的SEQ ID NO：1所示启动子在根瘤中确实诱导GUS表达。观察到RAW424中包含的SEQ ID NO：2所示启动子确实在根瘤中诱导GUS表达。观察到构建体RTJ131中包含的SEQ ID NO：3所示启动子确实在根瘤中诱导GUS表达。

实施例13完整植物的GUS染色

通过分别转化构建体RAW425、RAW424和RTJ131产生包含与SEQID NO：1、SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示启动子序列有效连接的GUS报告基因的转基因大豆完整植物，以表征在整个植物的生活周期中在根和整个植物组织中响应线虫感染的启动子表达。大豆完整植物中启动子表征的代表性方法包括但不限于下列描述。就接合性(Zygosity)检测转基因大豆T1种子，萌发单拷贝事件，在温室条件下生长，取样研究在叶、茎、花、胚和种荚组织中不同发育阶段的GUS表达。此外，在SCN感染之前和之后的不同时间点在接种的和未接种的对照根中收获根组织。对于每一个事件检测多个植物以确定GUS染色分析中的一致倾向。将收获的样品切离植物，然后立即置于含有X-Gluc(2mg/l)的GUS染色液中，真空渗透20分钟，然后转移至37℃进行16小时。然后观察组织并且就GUS染色的强度对其进行评分。

Claims

1.启动子，其是能够介导根偏爱性或病原体诱导型表达的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自：

a)SEQ ID NO：1、2或3中所示的序列的多核苷酸；

b)由SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1557至1907，或核苷酸1498至1999，或核苷酸1349至1999组成的多核苷酸；

c)由SEQ ID NO：2中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1650至2000，或核苷酸1460至2110组成的多核苷酸；和

d)由SEQ ID NO：3中所示的序列的多核苷酸的核苷酸491至841，或核苷酸350至1000组成的多核苷酸。

2.权利要求1的启动子，其中分离的多核苷酸由SEQ ID NO：1中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1557至1907，或核苷酸1498至1999，或核苷酸1349至1999组成。

3.权利要求1的启动子，其中分离的多核苷酸由SEQ ID NO：1的核苷酸1557至1907的多核苷酸组成。

4.权利要求1的启动子，其中分离的多核苷酸由SEQ ID NO：2中所示的序列的多核苷酸的核苷酸1650至2000，或核苷酸1460至2110组成。

5.权利要求1的启动子，其中分离的多核苷酸由SEQ ID NO：2的核苷酸1650至2000的多核苷酸组成。

6.权利要求1的启动子，其中分离的多核苷酸由SEQ ID NO：3中所示的序列的多核苷酸的核苷酸491至841，或核苷酸350至1000组成。

7.权利要求1的启动子，其中分离的多核苷酸由SEQ ID NO：3的核苷酸491至841的多核苷酸组成。

8.权利要求1的启动子，其中病原体是线虫。

9.包含权利要求1的启动子的表达盒。

10.权利要求9的表达盒，其还包含与启动子有效连接的第二多核苷酸。

11.权利要求9的表达盒，其中所述第二多核苷酸向植物赋予选自如下的性状或性质：产量、在胁迫条件下增加的抗性、增加的营养质量、增加的抗病原体抗性、增加的或改变的植物的蛋白质或油含量。

12.产生转基因植物的方法，其中所述方法包括步骤：a)制备包含与一个或多个多核苷酸有效连接的权利要求1的启动子的构建体；b)用a)的构建体转化植物细胞，其中启动子诱导根偏爱性转录或响应病原体刺激而在植物细胞中诱导有效连接的第二多核苷酸转录；和c)再生转化的植物细胞以产生具有病原体抗性或提高的病原体抗性的转基因植物。

13.权利要求12的方法，其中有效连接的多核苷酸向植物赋予选自如下的性状或性质：产量、在胁迫条件下增加的抗性、增加的营养质量、增加的抗病原体抗性、增加的或改变的植物的蛋白质或油含量。