BRPI0720194A2

BRPI0720194A2 - Promotor, cassete de expressão, planta transgênica, e, métodos para produzir uma planta transgênica e para conferir ou melhorar a resistência a patógeno em uma planta

Info

Publication number: BRPI0720194A2
Application number: BRPI0720194-0A
Authority: BR
Inventors: Aaron Wiig; Robert Ascenzi; Xiang Huang; Sumita Chaudhuri; Rui-Guang Zhen; Yu Han
Original assignee: Basf Plant Science Gmbh
Priority date: 2006-12-12
Filing date: 2007-12-12
Publication date: 2013-12-31
Also published as: US20090271891A1; CN101600802A; WO2008071726A3; CN101600802B; US8546647B2; AR065227A1; MX2009006148A; WO2008071726A9; EP2099918A2; WO2008071726A2; CA2672083A1

Description

"PROMOTOR, CASSETE DE EXPRESSÃO, PLANTA TRANSGÊNICA, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA E PARA CONFERIR OU MELHORAR A RESISTÊNCIA A PATÓGENO EM UMA PLANTA" CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a promotores e elementos regulatórios que regulam a transcrição de genes similares a trealose-6-fosfato fosfatase (TPP). Os promotores de genes de tipo TPP da invenção são utilizáveis para controlar a transcrição de qualquer ácido nucleico de interesse em raízes de plantas. Em particular, os promotores da invenção podem ser usados para controlar a transcrição de agentes codificando ácidos nucleicos que conferem resistência aos patógenos às plantas. FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Um dos objetivos principais de biotecnologia de plantas é a geração de plantas com novas propriedades vantajosas, por exemplo, para aumentar a produtividade agrícola, para aumentar qualidade no caso de produtos alimentícios, ou para produzir produtos químicos ou farmacêuticos. Os mecanismos de defesa naturais das plantas contra patógenos com freqüência são insuficientes. Apenas doença fungica resulta em perdas de rendimento anuais de muitos bilhões de dólares americanos. A introdução de genes estrangeiros de plantas, animais ou fontes microbianas pode aumentar a defesa. Os exemplos são a proteção de tabaco contra os danos provocados por alimentação por insetos por expressão de endotoxina de Bacillus thuringiensis sob o controle do promotor 35S CaMV ou a proteção de tabaco contra infecção fungica por expressão de uma quitinase de feijão sob o controle do promotor de CaMV. No entanto, a maior parte das abordagens descritas apenas oferece resistência a um único patógeno. ou um espectro limitado de patógenos.

Um grupo grande de patógenos de plantas biotróficas de enorme importância agro-econômica são os nematódeos. Os nematódeos são vermes redondos microscópicos que se alimentam das raízes, folhas e caules em mais de 2.000 culturas de fileiras, vegetais, frutas e plantas ornamentais, causando uma perda de cultura estimada de US$ 100 bilhões no mundo todo. Uma variedade de espécie de nematódeo parasítico infecta plantas de cultura, incluindo nematódeos do nó da raiz (RKN), nematódeos formadores de cistos e lesões (RKN). Os nematódeos de nó da raiz, que são caracterizados por causarem formação de escoriações nos sítios de alimentação, tem uma faixa de hospedeiro relativamente ampla e são assim patogênicos em um grande número de espécies de culturas. As espécies de nematódeos formadoras de cistos e lesões tem uma faixa de hospedeiro mais limitada, mas ainda causam perdas consideráveis em culturas suscetíveis.

Os nematódeos patogênicos estão presentes em todo o território americano, com as maiores concentrações ocorrendo nas regiões quentes, úmidas, do Sul e Oeste e em solos arenosos. O nematódeo do cisto da soja {Heterodera glicines), a praga mais séria das plantas da soja, foi descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte em 1954. Algumas áreas são tão pesadamente infestadas por nematódeo de cisto da soja (SCN) que a produção de soja não é mais economicamente possível sem medidas de controle. Apesar da soja ser a principal cultura econômica afetada por SCN, o SCN parasita em torno de cinqüenta hospedeiros no total, incluindo culturas de campo, vegetais, ornamentais e ervas daninhas.

Os sinais de dano pelos nematódeos incluem retardo no desenvolvimento e amarelecimento das folhas, e murchamento das plantas durante os períodos quentes. No entanto, as infestações por nematódeos podem causar perdas de rendimento significantes sem quaisquer sintomas óbvios da doença acima da terra. As causas primárias de redução do rendimento são devido a dano da raiz sob a terra. As raízes infectadas por SCN sofrem de ananismo e retardo no desenvolvimento. A infestação por nematódeo também pode diminuir o número de nódulos de fixação de nitrogênio sobre as raízes, e podem tornar as raízes mais suscetíveis a ataques por outros patógenos de plantas de origem no solo.

O ciclo de vida dos nematódeos tem três estágios principais: ovo, juvenil e adulto. O ciclo de vida varia entre as espécies de nematódeos. Por exemplo, o ciclo de vida de SCN pode geralmente ser completado em 24 a 30 dias sob condições ótimas enquanto outras espécies podem levar tanto quanto um ano, ou mais, para completar o ciclo de vida. Quando os níveis de temperatura e umidade se tornam favoráveis na primavera, os juvenis em forma de vermes eclodem dos ovos no solo. Somente os nematódeos no estágio de desenvolvimento juvenil são capazes de infectar as raízes de soja.

O ciclo de vida de SCN foi o assunto de muitos estudos, e como tal são um exemplo utilizável para a compreensão do ciclo de vida do nematódeo. Após penetrar nas raízes da soja, os juvenis SCN se movimentam através da raiz até eles contatarem o tecido vascular, quando então eles param de migrar e começam a se alimentar. Com um estilete, o nematódeo injeta secreções que modificam algumas células da raiz e transformam as mesmas em sítios de alimentação especializada. As células da raiz são morfologicamente transformadas em sincícias multinucleadas grandes (ou células gigantes no caso de RKN), que são usadas como uma fonte de nutrientes para os nematódeos. Os nematódeos se alimentando ativamente assim roubam os nutrientes essenciais das plantas resultando em perdas no rendimento. À medida que os nematódeos fêmeas se alimentam, elas incham e eventualmente se tornam tão grandes que seus corpos se rompem através do tecido da raiz e são expostas sobre a superfície da raiz.

Após um período de alimentação, os nematódeos SCN machos, que não ficam inchados quando adultos, migram para fora da raiz dentro do solo e fertilizam as fêmeas adultas aumentadas. Os machos então morrem, enquanto as fêmeas permanecem fixadas no sistema de raízes e continuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas inchadas começam a se desenvolver, inicialmente em uma massa ou saco de ovos fora do corpo, e então depois dentro da cavidade do corpo do nematódeo. Eventualmente, toda a cavidade do corpo da fêmea adulta é cheia com ovos, e o nematódeo morre. É o corpo cheio com ovos da fêmea morta que é referido como o cisto. Os cistos eventualmente são expelidos e são encontrados livres no solo. As paredes do cisto se tornam muito firmes, provendo uma proteção excelente para aproximadamente 200 a 400 ovos contidos no mesmo. Os ovos de SCN sobrevivem dentro do cisto até que condições de eclosão apropriadas ocorram. Apesar de muitos ovos poderem eclodir no primeiro ano, muitos também irão sobreviver dentro dos cistos protetores durante vários anos.

Um nematódeo pode se movimentar através do solo somente em alguns centímetros por ano por sua própria força. No entanto, a infestação por nematódeos pode se espalhar em distâncias substanciais em vários modos. Qualquer coisa que possa se movimentar no solo infestado é capaz de disseminar a infestação, incluindo o maquinário agrícola, veículos e ferramentas, vento, água, animais e os trabalhadores da fazenda. As partículas de solo coladas nas sementes com freqüência contaminam as sementes colhidas. Conseqüentemente, a infestação por nematódeos pode se espalhar quando semente contaminada de campos infestados é plantada em campos não infestados. Existe mesmo evidência de que algumas espécies de nematódeos podem ser disseminadas por aves. Somente algumas causas dentre estas podem ser evitadas.

As práticas tradicionais para o controle de infestação por nematódeos incluem: manter nutrientes no solo e níveis de pH no solo apropriados em terra infestada por nematódeos; controlar outras doenças de plantas, assim como pragas de insetos e ervas daninhas, usando práticas de higienização como arar, plantar e cultivar os campos infestados por nematódeos somente após trabalhar os campos não infestados; limpar o equipamento completamente com água em alta pressão ou vapor após trabalhar em campos infestados; não usar semente cultivada em terra infestada para o plantio de campos não infestados a não ser que a semente tenha sido limpa de modo apropriado; alternar campos infestados e alterar as culturas hospedeiras com culturas não hospedeiras; usar nematicidas; e plantar variedades de plantas resistentes.

Métodos foram propostos para a transformação genética de plantas a fim de conferir resistência aumentada aos nematódeos parasíticos de plantas. Patente US No. 5 589 622 e 5 8 24 876 são dirigidas à identificação de genes de plantas expressados especificamente em ou adjacentes ao sítio de alimentação da planta após fixação pelo nematódeo. Patente US No. 5 589 622 e 5 824 876 descreve oito promotores isolados de raízes de batata infectados com Globodera rostochiensis\ não foram descritos promotores indutíveis por nematódeos de outras espécies de plantas. Estes promotores são pretendidos como sendo utilizáveis para dirigir a expressão específica de proteínas ou enzimas tóxicas, ou a expressão de RNA anti-sentido para um gene alvo ou para genes celulares gerais.

Patente US No. 5.023.179 descreve um elemento melhorador de promotor designado ASF-1, isolado do promotor de CaMV, que é pretendido como melhorando a expressão de gene de planta em raízes.

Patente US No. 5.570.386 descreve um fragmento de deleção do promotor específico de raiz RB7 de Nicotiana tabacum, que é pretendido como sendo respondente a nematódeo.

Patente US No. 5,837.876 descreve um promotor de gene específico do córtex da raiz isolado de tabaco e designado TobRD2.

Patente US No. 5,866.777 descreve uma abordagem de dois genes para retardar a formação de uma estrutura de alimentação de nematódeos. O primeiro gene, barnase, está sob o controle de um promotor que dirige a expressão pelo menos na estrutura de alimentação. O segundo gene, barstar, está sob o controle de um promotor que dirige a expressão em todas as células da planta, exceto a estrutura de alimentação. Os promotores específicos do sítio de alimentação descritos em Patente US No. 5,866.777 incluem versões truncadas dos promotores Δ0.3TobRB7 e rolC.

Patente US No. 5.955.646 descreve regiões regulatórias quiméricas baseadas em promotores derivados de genes manopina sintase e octopina sintase de Agrobacterium tumefaciens, que são pretendidos como sendo indutíveis por nematódeos.

Patente US No. 6.005.092 descreve o promotor de N. tabacum endo-l,4-P-glucanase (Ntcel7).

Patentes US Nos. 6.262.344 e 6.395.963 descrevem promotores isolados de Arabidopsis thaliana, que são pretendidos como sendo indutíveis por nematódeos.

Patente US No. 6.448.471 descreve um promotor de A. thaliana, que é específico para os sítios de alimentação de nematódeos.

Patente US No. 6.703.541 descreve a clonagem e isolamento de gene de peroxidase P7X do milho e seu promoter, o promotor é pretendido como sendo indutível por nematódeos.

Patente US No. 6.593. 513 descreve a transformação de plantas com barnase sob o controle do promotor do gene de A. thaliana endo- l,4-p-glucanase (cell) para produzir plantas capazes de romper o ataque por nematódeos.

Patente US No. 6.906.241 descreve o uso do promotor Ntce 17 em combinação com um ácido nucleico heterólogo que codifica uma proteína nematocida ou inseticida.

Patente US No. 7.078.589 descreve a clonagem isolado de gene e promotor Pyk 20 de soja, que são pretendidos como sendo induzidos pela infecção por SCN e mostrando forte atividade em tecidos vasculares.

Publicação de pedido de patente US No. 2003/0167507 descreve o promotor de isoflavona sintase I de soja, que é pretendido como sendo específico da raiz e indutível em tecido vegetativo por ataque de parasitas.

Publicação de pedido de patente US No. 2004/0078841 descreve regiões de promotor dos promotores TUB-I5 RPL16A, e ARSKl de Arabidopsis thaliana e o promotor PSMTa de Pisum sativum, que são todos pretendidos como sendo específicos de raiz.

Publicação de pedido de patente US No. 2004/0029167 descreve uma seqüência de gene O-metiltransferase de ácido caféico Classe II de tabaco, que é pretendido como sendo indutível em resposta a dano mecânico ou químico ou a agressão pelos agentes patogênicos.

Publicação de pedido de patente US No. 2005/0262585 descreve um promotor de fosforibosilformilglicinamidina ribonucleotídeo sintase de soja e fragmentos de deleção dos mesmos, que são pretendidos como sendo respondentes a infecção por nematódeos.

WO 94/10320 descreve o fragmento de promotor A0.3TobRB7 de tabaco e seu uso em vários genes para expressão específica na célula de alimentação do nematódeo.

WO 03/033651 descreve seqüências de promotor reguladas por nematódeos sintéticos designadas SCP1, UCP3, e SUP.

WO 2004/029222 e sua Publicação de contra-parte de pedido de patente US No. 2005/0070697 descrevem regiões regulatórias de genes de adenosina-5'-fosfato deaminase e inositol-5-fosfatase, para uso na melhora da resistência a nematódeos em plantas.

Nenhum dos promotores específicos de raiz ou de sítio de alimentação acima mencionados estão atualmente em uso em sementes comerciais contendo um transgene anti-patógeno. Apesar da necessidade para estes produtos ser conhecida há muito tempo, nenhuma pessoa até agora obteve sucesso no desenvolvimento de plantas resistentes a patógenos através de tecnologia de DNA recombinante. Uma necessidade continua a existir para promotores preferidos específicos de raiz e/ou sítio de alimentação de nematódeos para combinar com transgenes codificando agentes tóxicos para os patógenos parasíticos das plantas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção provê polinucleotídeos promotores apropriados para uso para dirigir a expressão de um segundo polinucleotídeo em raízes de plantas que são susceptíveis ao ataque por patógenos. Os polinucleotídeos promotores da invenção são particularmente utilizáveis para fabricar plantas de culturas agrícolas resistentes à infestação por patógenos.

Os presentes inventores descobriram que quando os promotores de genes de plantas compreendem alguns elementos regulatórios conhecidos em orientação específica um com relação ao outro, os promotores compartilham a característica de serem indutíveis por patógenos. Assim, a invenção provê promotores apropriados para uso para dirigir a expressão de um ácido nucleico em plantas que são susceptíveis ao ataque pelos patógenos. Os patógenos são preferivelmente nematódeos. Os promotores da invenção são particularmente utilizáveis para fabricar plantas de culturas agrícolas resistentes à infestação por patógenos. Em uma forma de realização, a invenção provê um

polinucleotídeo promotor isolado capaz de mediar expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno, referido polinucleotídeo promotor tendo Configuração de Promotor 1, em que o polinucleotídeo promotor tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo em cerca de 215 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN16 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 19 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN30 tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo.

Em outra forma de realização, a invenção provê um polinucleotídeo promotor isolado capaz de mediar expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno, referido polinucleotídeo promotor tendo Configuração de Promotor 2, em que o polinucleotídeo promotor tem um filamento positivo e um filamento negativo, e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo, em que o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN7, o elemento de classe U$SCN6 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe P$OPAQ, e o elemento de classe U$SCN7 está em cerca de 400 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN6. Em ainda outra forma de realização, a invenção refere-se a um

polinucleotídeo promotor isolado capaz de mediar expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno, referido polinucleotídeo promotor tendo Configuração de Promotor 3, em que o polinucleotídeo promotor tem um filamento positivo e um filamento negativo, e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN14 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:26 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22

no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um

1

polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo, em que o elemento de classe U$SCN14 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN2, o elemento de classe USSCNl3 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN14, o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN13, o elemento de classe U$SCN30 está em cerca de 200 nucleotídeos do segundo elemento de classe P$OPAQ, e o elemento de classe USSCN2 está em cerca de 800 nucleotídeos do elemento

de classe U$SCN30.

Em outra forma de realização, a invenção provê um promotor compreendendo um polinucleotídeo promotor isolado capaz de mediar expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno, em que o polinucleotídeo promotor é selecionado dentre o grupo consistindo de a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3; b) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l; c) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 ou 1460 a 2110 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2; d) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3; e) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); f) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); g) um polinucleotídeo compreendendo uma porção biologicamente ativa de qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); e h) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3.

A invenção também refere-se a cassetes de expressão e plantas transgênicas que compreendem os polinucleotídeos promotores da invenção, e a métodos de produzir as plantas resistentes a patógenos ou controlar as infestações por patógenos parasíticos em culturas, em que os métodos empregam construções de ácido nucleico recombinantes compreendendo os promotores da invenção em associação operativa com um ácido nucleico que codifica um agente que rompe o metabolismo, crescimento e/ou reprodução de patógenos parasíticos em plantas, que confere ou melhora a resistência da planta aos patógenos parasíticos de plantas, ou que é tóxico para os patógenos parasíticos de plantas de modo a reduzir a destruição das culturas. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Seqüência de região de promotor de f Arabidopsis thaliana de locus Atlg35910 (pAW284) (SEQ ID NO:l; nucleotídeos de caixa TATA 1871-1877 estão em minúscula, negrito e itálico ) incluindo uma tabela de classes de elementos de configuração de promotor presentes em Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3 que estão contidas em aproximadamente nucleotídeos 1350-1999 do promotor como especificado em SEQ ID NO:l . Figura 2: Seqüência de região de promotor de A. thaliana de locus At5gl0100 (pAW281) (SEQ ED NO:2) incluindo a tabela de classes de elementos de configuração de promotor presentes na Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3 que estão contidas em aproximadamente nucleotídeos 1461-2110 do promotor como especificado em SEQ ID NO:2.

Figura 3: Seqüência de região de promotor de clone de cDNA de Glicine max 48986355 (RAW403) (SEQ ID NO:3; nucleotídeos de caixa TATA 808-814 estão em minúscula, negrito e itálico ) incluindo a tabela de classes de elementos de configuração de promotor presentes na Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3 que estão contidas em aproximadamente nucleotídeos 351-1000 do promotor como especificado em SEQ ID NO:3.

Figura 4: seqüência de cDNA de Glicine max clone 48986355. Figura 5: Seqüência de seqüência derivada walking de genoma

de pAW260 (SEQ ID NO:5).

Figura 6: Padrões de expressão de β-glucuronidase de vetores binários pAW284qcz, pAW281qcz, e RAW403 no teste de raiz cabeluda de soja especificado no exemplo 4. As raízes cabeludas infectadas com nematódeos de cisto de soja e raízes cabeludas não infectadas de controle foram coloridas 12 dias após a inoculação de SCN. O seguinte índice de classificação foi usado: "-" para sem coloração GUS, "+" para coloração GUS fraca, "++" para coloração GUS forte.

Figura 7: Padrões de expressão de β-glucuronidase de vetores binários pAW284qcz, RAW450, e RAW451 no teste de raiz cabeluda de soja especificado no exemplo 7. As raízes cabeludas infectadas com nematódeos de cisto de soja e raízes cabeludas não infectadas de controle foram coloridas 12 dias após a inoculação de SCN. O seguinte índice de classificação foi usado: "-" para sem coloração GUS, "+" para coloração GUS fraca, "++" para coloração GUS forte.

Figura 8: Locais de classes de elemento promotor de Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3 no promotor de A. thaliana de locus Atlg35910 (SEQ ID NO:l), promotor de A. thaliana de locus At5gl0100 (SEQ ID NO:2), e o promotor 48986355 de clone de cDNA de G. max (SEQ ID NO:3).

Figura 9: iniciadores de PCR usados para obter os promotores de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, a deleção de 986 bp de promotor de A. thaliana de locus Atl g35910 (SEQ ID NO:l), e deleção de 502 bp de promotor de A. thaliana de locus At 1 g3 5910 (SEQ ID NO: 1).

Figures lOa-c: Alinhamento de seqüência de clone de cDNA 48986355 de G. max (SEQ ID NO:4) e seqüência de G. max derivada de genoma walking contido em pAW260 (SEQ ID NO:5) clone de cDNA 48986355 de marcação. O códon de partida ATG de clone de cDNA 48986355 de G. max (SEQ ID NO:4) começa em posição de nucleotídeo 102. A região de promotor putativa de 1000 bp é descrita por SEQ ID NO:3 e é derivada das posições de nucleotídeo 32 a 1031 de seqüência pAW260 (SEQ ID NO:5).

Figures lla-c: Resultados de Genomatix DiAlign comparando nucleotídeos 1350 a 1999 de SEQ ID NO:l (correspondendo a posições de nucleotídeo 1 a 650 de Atlg35910pr650bp), nucleotídeos 1461 a 2110 de SEQ ID NO:2 (correspondendo a posições de nucleotídeo 1 a 650 de At5g 10100pr65Obp), e nucleotídeos 351 a 1000 de SEQ ID NO:3 (correspondendo a posições de nucleotídeo 1 a 650 de 48986355pr650bp). Asterísticos (*) indicam o grau relativo de similaridade local dentre as seqüências de entrada. A similaridade máxima possível é representada por sinais 10 '*'.

Figura 12: Representação espacial de classes de elemento promotor encontradas em Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3 (não em escala exata) incluindo seqüências de consenso de classe de elemento promotor. Na coluna intitulada "seqüência de consenso de cordão IUPAC de elementos" as seguintes abreviaturas são empregadas: A = adenina, C = citosina, G = guanina, T = timina, R = AouG, Y = C ouT5M = A ou C5K = GouT5W = A ouT, S = C ou G, e N = A, C5 G5 ou T.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

A presente invenção pode ser entendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada das forma de realização preferidas da invenção e os exemplos incluídos. Salvo especificado em contrário os termos usados aqui devem ser entendidos de acordo com o uso convencional pelos versados na técnica relevante. Além das definições de termos apresentadas abaixo, definições de termos comuns em biologia molecular também podem ser encontrados em Rieger et ai., 1991 Glossary of genetics: classical and molecular, 5a' Ed., Berlin: Springer-Verlag; e em Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et aL, Eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. e John Wiley & Sons, Inc., (1998 Suplemento). Deve-se entender que como usado no relatório e nas

reivindicações, "um" ou "uma pode significar um ou mais dependendo do contexto em que é usado. Assim, por exemplo, referência a "uma célula" pode significar que pelo menos uma célula pode ser usada. Deve-se entender que esta invenção não é limitada a ácidos nucleicos específicos, tipos de células específicas, células hospedeiras específicas, condições específicas, ou métodos específicos, etc, como podem variar, e como evidente variam, e numerosas modificações e variações aqui serão evidentes para o versado na técnica. Também deve-se entender que a terminologia usada aqui é para fins de descrever formas de realização específicas apenas e não destinada a ser limitativa.

Em todo este pedido, foram feitas referências a várias publicações. As descrições de todas estas publicações e as referências citada nas mesmas em suas totalidades são aqui incorporadas por referência neste pedido a fim de descrever mais completamente o estado da técnica à qual a invenção pertence. As técnicas padrões para clonagem, isolamento de DNA, amplificação e purificação, para reações enzimáticas envolvendo DNA ligase, DNA polimerase, endonucleases de restrição e outras, e várias técnicas de separação são as conhecidas e comumente empregadas pelo versado na técnica. Várias técnicas padrões são descritas em Sambrook e Russell, 2001 Molecular Cloning, 3 a. ed., Cold Spring Harbor, Plainview, New York; Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York; Wu (Ed.) 1993 Meth. Enzymol. 218, Part I; Wu (Ed.) 1979 Meth Enzymol. 68; Wu et al., (Eds.) 1983 Meth. Enzymol. 100 e 101; Grossman e Moldave (Eds.) 1980 Meth. Enzymol. 65; Miller (Ed.) 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Old and Primrose, 1981 Principies of Gene Manipulation, University of Califórnia Press, Berkeley; Schleif e Wensink, 1982 Practical Methods in Molecular Biology; Glover (Ed.) 1985 DNA Cloning Vol. I e II, IRL Press, Oxford, UK; Hames e Higgins (Eds.) 1985 Nucleic acid hybridization IRL Press, Oxford, UK; e Setlow e Hollaender 1979 Genetic Engineering: Principies and Methods, Vols. 1-4, Plenum Press, New York. Os polinucleotídeos promotores a presente invenção podem ser

providos em forma isolada e/ou purificada a partir de seu ambiente natural, em forma substancialmente pura ou homogênea, ou livres ou substancialmente livres de outros ácidos nucleicos da espécie de origem. Um ácido nucleico "isolado" como usado aqui é também substancialmente livre — no momento de seu isolamento — de outros materiais celulares ou meio de cultura quando produzidos por técnicas recombinantes ou substancialmente livres de precursores químicos quando sintetizados quimicamente. Os polinucleotídeos promotores da invenção são polinucleotídeos isolados. Quando usado aqui, o termo "isolado" engloba todas estas possibilidades.

O termo "cerca de" é usado aqui para significar aproximadamente, grosseiramente, em torno de, ou nas regiões de. Quando o termo "cerca de" é usado em conjunto com uma faixa numérica, ele modifica a faixa ao estender os limites acima e abaixo dos valores numéricos especificados. Em geral, o termo "cerca de" é usado aqui para codificar um valor numérico acima e abaixo do valor descrito por uma variância de 10 por cento, para cima ou para baixo (maior ou menor).

Os termos "promotor" ou "polinucleotídeo promotor" como usados aqui referem a uma seqüência de DNA que, quando ligada a uma seqüência de nucleotídeo de interesse, é capaz de controlar a transcrição da seqüência de nucleotídeo de interesse em mRNA. Um promotor está tipicamente, apesar de não necessariamente, localizado 5' (por exemplo, a montante) de um nucleotídeo de interesse (por exemplo proximal ao sítio de partida transcripcional de um gene estrutural) cuja transcrição em mRNA ele controla, e provê um sítio para a ligação específica por RNA polimerase e outros fatores de transcrição para iniciação e transcrição. Um "promotor constitutivo" refere-se a um promotor que é capaz de expressar a matriz de leitura aberta ou o elemento regulatório que ele controla em todos ou quase todos os tecidos e planta durante todos ou quase todos os estágios de desenvolvimento da planta. "Promotor regulado" refere-se a promotores que dirigem a expressão de genes não constitutivamente, mas em um modo temporal e/ou espacial, e incluem tanto promotores específicos de tecido como indutíveis. Diferentes promotores podem dirigir a expressão de um gene ou elemento regulatório em tecidos diferentes ou tipos de células, ou em estágios diferentes de desenvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. "Promotor específico de tecido" refere-se a promotores regulados que não são expressados em células de plantas mas somente em um ou mais tipos de células em órgãos específicos (como raízes ou sementes), tecidos específicos (como embrião ou cotilédone) ou tipos de células específicas, (como parênquima de folha ou células de armazenamento de sementes). "Promotor indutível refere-se aos promotores regulados que podem ser transformados em um ou mais tipos de células por um estímulo externo, como químico, luz, hormônio, estresse, ou um patógeno.

De acordo com a invenção, os promotores da presente invenção podem ser colocados em associação operativa com um segundo polinucleotídeo para a expressão específica de raiz e/ou indutível por patógeno do segundo polinucleotídeo em plantas a fim de variar o fenótipo desta planta. Como usado aqui, os termos "em associação operativa" "operativamente ligado," e "associado com" são interpermutáveis e significam a ligação funcional de um polinucleotídeo promotor e um segundo polinucleotídeo em um único fragmento de ácido nucleico em um tal modo que a transcrição do segundo ácido nucleico é iniciada e mediada pelo promotor. Em geral, os ácidos nucleicos que estão em associação operativa são contíguos.

Qualquer segundo polinucleotídeo pode ser colocado em associação operativa com os polinucleotídeos promotores da invenção para efetuar a expressão específica de raiz ou indutível por patógeno do segundo polinucleotídeo. Os segundos polinucleotídeos incluem, por exemplo, uma matriz de leitura aberta,uma porção de uma matriz de leitura aberta, um polinucleotídeo codificando uma proteína de fusão, um polinucleotídeo anti- sentido, um polinucleotídeo codificando uma construção de RNA de filamento duplo, um transgene, e outros. O segundo polinucleotídeo pode codificar um gene de resistência a insetos, um gene de resistência a doença bacteriana, um gene de resistência a doença fungica, um gene de resistência a doença viral, um gene de resistência a doença por nematódeos, um gene de resistência a herbicida, um gene afetando a composição ou qualidade do grão, um gene de utilização de nutrientes, um gene de redução de micotoxina, um gene de esterilidade masculina, um gene de marcador selecionável, um gene de marcador triável, um gene de marcador selecionável negativo, um gene de marcador selecionável positivo, um gene afetando as características agronômicas da planta, (isto é, rendimento), um gene de resistência a estresse ambiental (com exemplificado por genes conferindo resistência ou tolerância a seca, calor, friagem, congelamento, umidade excessiva, estresse de sal, ou estresse oxidativo), genes que melhora s propriedades ou quantidade de amido, quantidade e qualidade de óleo, composição de proteína ou aminoácido, e outros. O polinucleotídeo promotor da invenção pode ser usado em plantas da família Fabaceae para mediar a expressão em nódulos de raiz. Nesta forma de realização, o segundo polinucleotídeo pode ser um gene afetando as características agronômicas da planta como fixação de nitrogênio, transporte de nitrogênio, teor de proteína da planta, teor de proteína da semente, e outros.

Preferivelmente, o segundo polinucleotídeo codifica um RNA de filamento duplo (dsRNA) ou polinucleotídeo anti-sentido, que é substancialmente idêntico ou homólogo no todo ou em parte para um gene de planta requerido para formação ou manutenção de um sítio de alimentação de nematódeos. O segundo polinucleotídeo pode alternativamente codificar um agente que rompe o crescimento e/ou reprodução de patógenos parasíticos da planta, que confere ou melhora a resistência da planta aos patógenos parasíticos de planta, ou que é tóxico para os patógenos parasíticos de planta de modo a reduzir a destruição das culturas. Os patógenos a serem marcados são preferivelmente os nematódeos parasíticos de plantas. Qualquer segundo polinucleotídeo codificando um agente que rompe o crescimento e/ou reprodução de patógenos parasíticos de planta, que confere ou melhora a resistência da planta aos patógenos parasíticos de planta, ou que é tóxico para os patógenos parasíticos de planta pode ser empregado de acordo com a invenção. Quando os patógenos são nematódeos, o segundo polinucleotídeo também pode codificar um agente que rompe o sítio de alimentação em raízes de plantas, por exemplo, por destruição ou impedindo o desenvolvimento ou integridade de células sinciciais. O segundo polinucleotídeo pode alternativamente codificar um RNA de filamento duplo que é substancialmente idêntico a um gene de marcação de um nematódeo de planta parasítico que é essencial para o metabolismo, sobrevivência, metamorfose, ou reprodução do nematódeo. O segundo polinucleotídeo pode codificar um RNA de filamento duplo que é substancialmente idêntico a um gene de planta ou um sítio de alimentação em raízes de plantas, que leva à ruptura da sobrevivência dos nematódeos. Como usado aqui, levando em consideração a substituição de

uracila por timina, quando comparando as seqüências de RNA e DNA, os termos "substancialmente idêntico" e "correspondendo a" significam que a seqüência de nucleotídeo de um filamento do dsRNA é pelo menos cerca de 80%-90% idêntico a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 90-95% idêntico a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, e o mais preferivelmente pelo menos cerca de 95-99% idêntico ou absolutamente idêntico a 20 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo. Os genes alvo de nematódeo parasítico de planta exemplares são especificados, por exemplo, em Publicação de pedido de patente co-pendente, comumente cedida, US No. 2005/188438, incorporada aqui por referência.

Alternativamente, para o controle dos patógenos, o segundo polinucleotídeo colocado em associação operativa com o polinucleotídeo promotor da invenção pode codificar uma proteína tóxica para o patógeno, preferivelmente uma proteína tóxica para os nematódeos. Por exemplo, os ácidos nucleicos codificando toxinas microbianas ou fragmentos das mesmas, toxinas de polipeptídeo ou fragmentos das mesmas, derivados de insetos, com os descritos em Patentes US Nos. 5.457.178; 5.695.954; 5.763.568; 5.959.182; e outros, são utilizáveis nesta forma de realização da invenção.

As plantas de cultura e nematódeos patogênicos correspondentes são listados no Index of Plant Diseases in the United States (U.S. Dept. of Agriculture Handbook No. 165, 1960); Distribution of Plant- Parasitic Nematode species in North America (Society of Nematologists, 1985); e Fungi on Plants and Plant Products in the United States (American Phytopathological Society, 1989). Por exemplo, os nematódeos parasíticos de plantas que são marcados pela presente invenção incluem, sem limitação, nematódeos de cistos e nematódeos de nós de raízes. Os nematódeos parasíticos de plantas específicos que são marcados pela presente invenção incluem, sem limitação, Heterodera glicines, Heterodera schachtii, Heterodera avenae, Heterodera oryzae, Heterodera cajani, Heterodera trifolii, Globodera pallida, G. rostochiensis, ou Globodera tabacum, Meloidogyne incógnita, M. arenaria, M. hapla, M. javanica, M. naasi, M. exigua, Ditylenchus dipsaci, Ditylenchus angustus, Radofolus similis, Radofolus citrophilus, Helicótiloenchus multicinctus, Pratylenchus cojfeae, Pratylenchus brachyurus, Pratylenchus vulnus, Paratylenchus eurvitatus, Paratylenchus zeae, Rotylenchulus reniformis, Paratriehodorus anemones, Paratrichodorus minor, Paratriehodorus ehristiei, Anguina tritiei, Bidera avenae, Subanguina radieieola, Hoplolaimus seinhorsti, Hoplolaimus Columbus, Hoplolaimus galeatus, Tylenchulus semipenetrans, Hemicycliofora arenaria, Rhadinaphelenehus eoeophilus, Belonolaimus longieaudatus, Triehodorus primitivus, Naeobbus aberrans, Aphelenehoides besseyi, Hemicrieonemoides kanayaensis, Tylenchorhynchus elaytoni, Xiphinema amerieanum, Cacopaurus pestis, e outros. Em uma forma de realização, os nematódeos marcados pertencem às famílias de nematódeo induzindo alimentação ou células sinciciais. As famílias de nematódeo induzindo alimentação ou células sinciciais são Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae ou Tylenchulidae. Preferivelmente eles pertencem às famílias Heterodidae ou Meloidogynidae.

Assim, em outra forma de realização, os nematódeos marcados pertencem a um ou mais gêneros selecionados dentre o grupo de Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera, Longidorus, ou Meloidogyne. Em uma forma de realização preferida os nematódeos marcados pertencem a um ou mais gêneros selecionados dentre o grupo de Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera, ou Meloidogyne. Em uma forma de realização mais preferida, os nematódeos marcados pertencem a um ou mais gêneros selecionados dentre o grupo de Globodera, Heterodera, ou Meloidogyne. Em uma forma de realização ainda mais preferida os nematódeos marcados pertencem a um ou ambos os gêneros selecionados dentre o grupo de Globodera ou Heterodera. Em outra forma de realização os nematódeos marcados pertencem ao gênero Meloidogyne.

O gênero Globodera e Heterodera são gêneros preferidos na família de nematódeos Heterodidae. Assim, em uma forma de realização o nematódeo marcado pertence a uma ou mais espécies selecionadas dentre o grupo de Globodera achilleae, Globodera artemisiae, Globodera hipolisi, Globodera mexicana, Globodera millefolii, Globodera mali, Globodera pallida, Globodera rostochiensis, Globodera tabacum e Globodera virginiae. Em uma forma de realização preferida os nematódeos marcados pertencem a pelo menos uma das espécies Globodera pallida, Globodera tabaccum ou Globodera rostochiensis. Assim, em uma forma de realização o nematódeo marcado pertence a uma ou mais espécies selecionadas dentre o grupo de Hederodera avenae, Heterodera carotae, Heterodera ciceri, Heterodera cruciferae, Heterodera delvii, Heterodera elachista, Heterodera filipjevi, Heterodera gambiensis, Heterodera glicines, Heterodera goettingiana, Heterodera graduni, Heterodera humuli, Heterodera hordecalis, Heterodera latipons, Heterodera major, Heterodera medicaginis, Heterodera oryzicola, Heterodera pakistanensis, Heterodera rosii, Heterodera sacchari, Heterodera schachtii, Heterodera sorghi, Heterodera trifolii, Heterodera urticae, Heterodera vigni e Heterodera zeae. Em uma forma de realização preferida os nematódeos marcados pertencem a pelo menos uma das espécies Heterodera glicines, Heterodera avenae, Heterodera cajani, Heterodera gottingiana, Heterodera trifolii, Heterodera zeae ou Heterodera schachtii. Em uma forma de realização mais preferida, os nematódeos marcados pertencem às espécies Heterodera glicines ou Heterodera schachtii ou a ambas. Em uma forma de realização a mais preferida, os nematódeos marcados pertencem às espécies Heterodera glicines.

O gênero Meloidogyne é um gênero preferido na família de nematódeos Meloidogynidae. Assim, em uma forma de realização o nematódeo marcado pertence a uma ou mais espécies selecionadas dentre o grupo de Meloidogyne acronea, Meloidogyne arabica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne artiellia, Meloidogyne brevicauda, Meloidogyne camelliae, Meloidogyne chidoisodi, Meloidogyne cofeicola, Meloidogyne esigua, Meloidogyne graminicola, Meloidogyne hapla, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne indica, Meloidogyne inornata, Meloidogyne javanica, Meloidogyne lini, Meloidogyne mali, Meloidogyne microcephala, Meloidogyne microtyla, Meloidogyne naasi, Meloidogyne salasi e Meloidogyne thamesi. Em uma forma de realização preferida os nematódeos marcados pertencem a pelo menos uma dentre as espécies Meloidogyne javanica, Meloidogyne incógnita, Meloidogyne hapla, Meloidogyne arenaria ou Meloidogyne chidoisodi.

Qualquer espécie de planta pode ser transformada com os polinucleotídeos promotores da invenção. Por exemplo, plantas que podem ser transformadas com as construções de ácido nucleico contendo os polinucleotídeos promotores da presente invenção incluem, sem limitação, plantas de um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glicine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, Helianthusi Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium. Alguns derivados e variantes dos polinucleotídeos promotores

devem ser preferivelmente usados particularmente em coberturas de plantas, famílias, gêneros ou espécies d plantas. Os derivados e variantes dos polinucleotídeos promotores, que podem ser isolados de uma espécie de planta são preferivelmente usados em plantas da mesma cobertura, família, gênero ou espécie de plantas das quais a planta, usada para isolamento do derivado e variante dos polinucleotídeos promotores, pertencem a. Assim, em uma forma de realização a planta é uma planta monocotiledônea, preferivelmente uma planta da família Poaceae, Musaceae, Liliaceae ou Bromeliaceae, preferivelmente da família Poaceae. Assim, em ainda outra forma de realização, planta é uma planta Poaceae do gênero Zea, Triticum, Oryza, Hordeum, Secale, Avena, Saccharum, Sorghum, Pennisetum, Setaria, Panieum, Eleusine, Miscanthus, Brachipodium, Festuca ou Lolium. Assim, em outra forma de realização, a planta é do gênero Zea, preferivelmente da espécie Zea mays. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Triticum, preferivelmente da espécie Triticum aestivum, Triticum speltae ou Triticum durum. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Oryza, preferivelmente da espécie Oryza sativa. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Hordeum, preferivelmente da espécie Hordeum vulgare. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Secale, preferivelmente da espécie Seeale eereale. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Avena, preferivelmente da espécie Avena sativa. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Saccarum, preferivelmente da espécie Saeeharum offieinarum. Assim, em uma forma de rèalização a planta é do gênero Sorghum, preferivelmente da espécie Sorghum vulgare, Sorghum bieolor ou Sorghum sudanense. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Pennisetum, preferivelmente da espécie Pennisetum glaueum. Em uma forma de realização a planta é do gênero Setaria, preferivelmente da espécie Setaria italiea. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Panicum, preferivelmente da espécie Panieum miliaeeum ou Panicum virgatum. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Eleusine, preferivelmente da espécie Eleusine eoraeana. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Miscanthus, preferivelmente da espécie Miseanassim sinensis. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Brachipodium, preferivelmente da espécie Braehipodium distachyon. Assim, em uma forma de realização a planta é uma planta do gênero Festuca, preferivelmente da espécie Festuea arundinaria, Festuea rubra ou Festuca pratensis. Assim, em uma forma de realização a planta é uma planta do gênero Lolium, preferivelmente da espécie Lolium perenne ou Lolium multiflorum. Assim, em uma forma de realização a planta é Triticosecale.

Assim, em uma forma de realização a planta é uma planta dicotiledônea, preferivelmente uma planta da família Fabaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euforbiaceae, Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae, Sterculiaceae ou Citrus. Em uma forma de realização a planta é uma planta da família Fabaeeae5 Solanaeeae ou Brassicaceae. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Fabaceae, preferivelmente do gênero Glicine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago ou Lens. As espécies preferidas da família Fabaceae são Glicine max, Pisum sativum, Arachis hipogea, Cicer arietinum, Vicia faba, Phaseolus vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius, Medicago sativa ou Lens culinaris. Mais preferida é a espécie Glicine max. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Solanaceae, preferivelmente do gênero Solanum, Lycopersicon, Nicotiana ou Capsicum. As espécies preferidas da família Solanaceae são Solanum tuberosum, Lycopersion esculentum, Nicotiana tabaccum ou Capsicum chinense. Mais preferida é Solanum tuberosum. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Arabidopsis, Brassica ou Raphanus. As espécies preferidas da família Brassicaceae são as espécies Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica juncea ou Brassica rapa. Mais preferida é a espécie Brassica napus. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Chenopodiaceae, preferivelmente do gênero Beta. Uma espécie preferida do gênero Beta é a espécie Beta vulgaris. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Asteraceae, preferivelmente do gênero Helianassim ou Tagetes. A espécie preferida do gênero Helianassim é a espécie Helianassim annuus. Uma espécie preferida do gênero Tagetes é a espécie Tagetes erecta. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Malvaceae, preferivelmente do gênero Gossypium ou Abelmoschus. Espécies preferidas do gênero Gossypium são as espécies Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense. Mais preferida é a espécie Gossypium hirsutum. Uma espécie preferida do gênero Abelmoschus é a espécie Abelmoschus esculentus. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Linacea, preferivelmente do gênero Linum. Uma espécie preferida do gênero Linum é a espécie Linum usitatissimum. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Euforbiaceae, preferivelmente do gênero Manihot, Jatropa, Rhizinus ou Ipomea. Espécie preferida do gênero é a espécie Manihot esculenta. Uma espécie preferida do gênero Jatropa é Jatropa curca. Uma espécie preferida do gênero Rhizinus é Rhizinus comunis Uma espécie preferida do gênero Ipomea é Ipomea batatas. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Rosaceae, preferivelmente do gênero Rosa, Malus, Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium, ou Fragaria. Uma espécie preferida do gênero Fragaria é o híbrido Fragaria χ ananassa. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Cucurbitaceae, preferivelmente do gênero Cucumis, Cirullus ou Cucurbita. Espécie preferida do gênero Cucumis é a espécie Cucumis sativus. Uma espécie preferida do gênero Citrullus é Citrullus lanatus. Uma espécie preferida do gênero Cucurbita é Cucurbita pepo. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Theaceae, preferivelmente do gênero Camellia. Uma espécie preferida do gênero Camellia é a espécie Camellia sinensis. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Rubiaceae, preferivelmente do gênero Coffea. Uma espécie preferida do gênero Coffea são as espécies Coffea arabica ou Coffea canefora. Assim, em uma forma de realização a planta é da família Sterculiaceae, preferivelmente do gênero Theobroma. Uma espécie preferida do gênero Theobroma é a espécie Theobroma cacao. Assim, em uma forma de realização a planta é do gênero Citrus, preferivelmente da espécie Citrus e híbridos plantados em proximida íntima ou plantações, como Citrus sinensis, Citrus limon, Citrus reticulata, Citrus maxima, ou semelhantes.

Os promotores de Arabidopsis da invenção (SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2) representam regiões de promotor de homólogos de Arabidopsis de clone de cDNA de soja 48986355 (SEQ ID NO:4) codificando um polipeptídeo que é anotado como proteína de tipo trealose-6-fosfato fosfatase (tipo TPP). Os promotores de Arabidopsis foram isolados de DNA genômico de Arabidopsis DNA como descrito em Exemplo 2. O promotor de tipo TPP desta invenção (SEQ ID NO:3) foi isolado de DNA genômico de soja como descrito em Exemplo 1. Como demonstrado nos Exemplos, quando os promotores de Arabidopsis e de soja da invenção foram colocados em associação operativa com um gene repórter GUS, a expressão de gene GUS foi regulada de modo positivo em raízes de soja infectadas por nematódeos .

A invenção é assim corporificada em um promotor compreendendo um polinucleotídeo promotor isolado tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3, ou um fragmento de polinucleotídeo promotor mínimo derivado de um polinucleotídeo promotor isolado tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3 que é capaz de dirigir a expressão específica de raiz ou indutível por nematódeo de um segundo polinucleotídeo. Os métodos descritos aqui podem ser empregados para isolar os fragmentos de polinucleotídeo promotor mínimos de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3 que são capazes de mediar expressão específica de raiz ou indutível por nematódeo de um segundo ácido nucleico.

Alternativamente, o polinucleotídeo promotor da invenção compreende um polinucleotídeo isolado que hibridiza sob condições estringentes para um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3, ou um fragmento de polinucleotídeo promotor mínimo derivado de um polinucleotídeo promotor isolado tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3. As condições de hibridização estringentes como usadas aqui são bem conhecidas, incluindo, por exemplo, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6,4, 1 mM EDTA, 60°C hibridização durante 12-16 horas; seguido por lavagem em 0,1% SDS, 0,1% SSC em aproximadamente 65°C durante cerca de 15-60 minutos. A invenção é ainda corporificada em um polinucleotídeo promotor isolado que hibridiza sob condições estringentes para um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 748 a 998, ou 500 a 998, ou 573 a 922 de uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l; um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes em um polinucleotídeo promotor compreendendo nucleotídeos 651 a 1000 de uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2; um polinucleotídeo promotor que hibridiza sob condições estringentes para um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 400 a 609, ou 260 a 609, ou 200 a 609 de uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3; em que o polinucleotídeo promotor é induzido em raízes de uma planta infectada por patógenos parasíticos de plantas.

O polinucleotídeo promotor da invenção ainda compreende um polinucleotídeo isolado que tem pelo menos 50-60%, ou pelo menos 60-70%, ou pelo menos 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar a um polinucleotídeo promotor tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO;l, 2, ou 3, ou um fragmento de polinucleotídeo promotor mínimo derivada de um polinucleotídeo promotor tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2 ou 3. O comprimento de comparação da seqüência para polinucleotídeos é pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos até o comprimento completo da seqüência.

O termo "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de polinucleotídeos ou polipeptídeo faz referência às posições nas duas seqüências onde pares idênticos de símbolos estão juntos quando as seqüências são alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação especificada, por exemplo, ou a seqüência completa como em um alinhamento global ou a região de similaridade em um alinhamento local. Quando a porcentagem de identidade de seqüência é usada com referência a polipeptídeos, reconhece-se que as posições de resíduos que não são idênticas com freqüência diferem por substituições de aminoácidos conservativas onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo carga ou hidrofobicidade) e, assim, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando as seqüências diferem em substituições conservativas a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada ascendentemente para corrigir a natureza conservativa da substituição. As seqüências que diferem por tais substituições conservativas são ditas como tendo uma "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Os meios para fazer tais ajustes são bem conhecidos do versado na técnica. Tipicamente, isto envolve classificar uma substituição conservativa como uma correspondência parcial em vez de uma correspondência desalinhada, assim aumentado a porcentagem de similaridade de seqüência. Como usado aqui, "percentagem de identidade de seqüência"

ou "identidade de seqüência percentual" denota um valor determinado primeiro anotando em suas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, seja global ou localmente, em cada posição do constituinte como para verificar se a base de ácido nucleico idêntica ou o resíduo de aminoácido ocorre em ambas as seqüências, denotadas uma correspondência, ou se não, denotada uma correspondência desalinhada. Como referidos alinhamentos são construídos por otimização do número de bases correspondentes, enquanto concorrentemente permitindo que ambos os desalinhados em qualquer posição e para a introdução de espaços dimensionados arbitrariamente, ou regiões nulas ou vazias, onde em um modo para aumentar a significância ou qualidade do alinhamento, o cálculo determina se o número total de posições para a condição de correspondência existe, e então divide este número pelo número total de posições na janela de comparação, e por fim, multiplica o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de seqüência. "Percentagem de similaridade de seqüência" para seqüências de proteína pode ser calculada usando o mesmo princípio, em que a substituição conservativa é calculada como uma correspondência desalinhada parcial em vez de completa. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe um escore de 1 e uma substituição não conservativa recebe um escore de zero, uma substituição conservativa recebe um escore entre zero e 1. O escore de substituições conservativas pode ser obtido a partir de matrizes de aminoácidos conhecidas na arte, por exemplo matrizes Blosum ou PAM Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são

bem conhecidos na técnica. A determinação de identidade percentual ou similaridade percentual (para proteínas) entre duas seqüências podem ser obtidos usando um algoritmo matemático. Os exemplos não limitativos, preferidos, de tais algoritmos matemáticos são o algoritmo de Myers e Miller (Bioinformatics, 4(1): 11-17, 1988), o alinhamento global de Needleman- Wunsch (J. Mol. Biol., 48(3):443-53, 1970), o alinhamento local de Smith- Waterman (J. Mol. Biol., 147:195-197, 1981), o método de busca para similaridade de Pearson e Lipman (PNAS, 85(8): 2444-2448, 1988), o algoritmo de Karlin e Altschul (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215(3):403-410, 1990; PNAS, 90:5873-5877,1993). As implementações por computador destes algoritmos matemáticos podem ser usadas para comparação de seqüências para determinar a identidade de seqüência ou para identificar homólogos.

Além dos promotores compreendendo a seqüência isolada, específica, como especificada em SEQ ID NO:l, 2 ou 3 ou as regiões mínimas de promotor contidas nas mesmas, e polinucleotídeos promotores que hibridizam sob condições estringentes para polinucleotídeos promotores compreendendo uma seqüência específica, como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3, a presente invenção engloba qualquer polinucleotídeo promotor compreendendo Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, ou Configuração de Promotor 3 como descrito aqui. O termo "Configuração de Promotor" é usado aqui para descrever uma combinação específica de classes de elementos de promotor múltiplas dispostas na direção 5' a 3' dentro de uma seqüência de promotor, em que cada classe de elemento promotor está em uma orientação espacial específica com relação à outra. Os elementos de promotor podem ser identificados em numerosos modos bem conhecidos do versado na técnica. Um tal método usa o algoritmo Genomatix CoreSearch™ (Genomatix Software GmbH, Munich, Alemanha). A convenção de nomes de CoreSearch utiliza "P" para denotar um elemento promotor com base em plantas e um "U" para identificar um elemento promotor definido pelo usuário. Estes identificadores amplos são separados do tipo de elemento por um "$". A classe de elemento segue o "$". As classes na presente invenção incluem, "OPAQ" para uma seqüência de elemento promotor representativa dos vários ativadores de transcrição de tipo Opaque- 2, para ativar a transcrição e "SCN#" para uma seqüência conservada dentre os promotores induzido por SCN múltiplos, indicando uma importância para a atividade de promotor induzida por S CN. As classes de elemento promotor descritas são dispostas na direção 5' a 3' dentro de uma seqüência de DNA do promotor consistindo de dois filamentos complementares de ácido desoxirribonucleico. Um filamento é designado o filamento "positivo" e o filamento de DNA complementar é designado o filamento "negativo". As seqüências de DNA mostradas por SEQ ID NO: 1-3 indicam o filamento positivo da seqüência de DNA de filamento duplo na direção 5' a 3'.

Como indicado na Figura 12, a U$ classe de elemento promotor SCNl 6 designada como "Elemento 1" tem a seqüência de consenso RTNGGTTTAKK (SEQ ID NO: 19), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. A classe de elemento promotor U$SCN2 designada como "Elemento 2" na Figura 12 tem a seqüência de consenso WAMATGATTAKTYWN (SEQ ID N0:20), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. A classe de elemento promotor U$SCN7 designada como "Elemento 3" na Figura 12 tem a seqüência de consenso NTANNNGWWKNTTATAWATTGNYCN (SEQ ID NO:21), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. A classe de elemento promotor U$SCN13 designada como "Elemento 4" na Figura 12 tem a seqüência de consenso WCWYATWTAGTMTANTWKYMKNAMN (SEQ ID NO:22), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. A classe de elemento promotor U$SCN6 designada como "Elemento 5" na Figura 12 tem a seqüência de consenso TTNWYTTTCTCAMAMMWAW (SEQ ID NO:23), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. A classe de elemento promotor U$SCN30 designada como "Elemento 6" na Figura 12 tem a seqüência de consenso NWTNTNCTCTNTTNTWYWTTN (SEQ ID NO:24), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. A classe de elemento P$OPAQ é exemplificada pelo descritor do elemento P$02_GCN4.01, que tem a seqüência de consenso NAKWTSACRTGNMTRAN (SEQ ID NO:25), e é designada na Figura 12 como "Elemento 7," ver Lohmer S. et al. (1991) EMBO J. 10:617-624; Yunes J.A. et al (1998) Plant Cell 10:1941-1955; Lara P. et al (2003) J. Biol. Chem. 278:21003-21011; Muth J.R. et al (1996) Mol. Gen. Genet. 252:723-732; Onodera Y. et al (2001) J. Biol. Chem. 276:14139- 14152; Schmidt R.J. et al (1992) Plant Cell 4:689-700. A classe de elemento promotor U$SCN14 designada como "Elemento 8" na Figura 12 tem a seqüência de consenso NARWTRKTGKCAAAWWNKTMN (SEQ ID NO:26), determinada usando algoritmo Genomatix CoreSearch. Polinucleotídeos promotores compreendendo Configuração de

Promotor 1 são ácidos nucleicos isolados tendo um filamento positivo e um filamento negativo e compreendendo, um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo em cerca de 215 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN16 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 19 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo.

Em outra forma de realização, a invenção provê um polinucleotídeo promotor de planta, compreendendo um ácido nucleico tendo um filamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN16 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 19 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo, em que o promotor é induzido em raízes de uma planta infectada por nematódeos parasíticos de plantas ou fungos.

Polinucleotídeos promotores compreendendo Configuração de Promotor 2 são ácidos nucleicos isolados tendo um filamento positivo e um filamento negativo e compreendendo, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo, em que o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN7, o elemento de classe U$SCN6 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe P$OPAQ, e o elemento de classe U$SCN7 está em cerca de 400 nucleotídeos do elemento de classe USSCN6.

Em outra forma de realização, a invenção provê um polinucleotídeo promotor de planta compreendendo um ácido nucleico tendo um filamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N025 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo, em que o promotor é induzido em raízes de uma planta infectada por nematódeos parasíticos de plantas ou fungos. Os polinucleotídeos promotores compreendendo Configuração

de Promotor 3 são ácidos nucleicos isolados tendo um filamento positivo e um filamento negativo e compreendendo, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN14 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:26 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe USSCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo, em que o elemento de classe U$SCN14 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN2, o elemento de classe U$SCN13 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN14, o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN13, o elemento de classe U$SCN30 está em cerca de 200 nucleotídeos do segundo elemento de classe P$OPAQ, e o elemento de classe U$SCN2 está em cerca de 800 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN30.

Em outra forma de realização, a invenção provê um polinucleotídeo promotor de planta compreendendo um ácido nucleico tendo um filamento positivo e um filamento negativo, o ácido nucleico compreendendo, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN14 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:26 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo, em que o promotor é induzido em raízes de uma planta por nematódeos parasíticos de

plantas ou fungos.

A invenção ainda corporifica "variantes" ou "derivados" do promotor da invenção. Os derivados dos polinucleotídeos promotores específicos e seus elementos específicos podem incluir, mas não são limitados a deleções de seqüência, mutações de ponto unido ou múltiplo alterações em um sítio de enzima de restrição, adição de elementos funcionais, ou outros meios de modificação molecular. Esta modificação pode ou não melhorar, ou de outra forma alterar a atividade de regulação de transcrição de referidas seqüências.

Por exemplo, um versado na técnica pode delimitar os elementos funcionais o porções biologicamente ativas dentro das seqüências e deletar quaisquer elementos não essenciais. Os elementos funcionais ou porções biologicamente ativas podem ser modificados ou combinados para aumentar a utilidade ou expressão das seqüências da invenção para qualquer aplicação em particular. Os fragmentos funcionalmente equivalentes de um polinucleotídeo promotor da invenção também podem ser obtidos por remoção ou deleção de seqüências não essenciais sem deletar a essencial. A limitação da seqüência do polinucleotídeo promotor a seus elementos de mediação de transcrição, essenciais, pode ser realizada in vitro por mutações de deleção de tentativa-e-erro, ou in silico usando rotinas de busca de elemento promotor. As regiões essenciais para a atividade do promotor com freqüência demonstram agrupamentos de alguns elementos promotores conhecidos. Esta análise pode ser realizada usando algoritmos de computador, como PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements"; Higo 1999), a base de dados BIOBASE "Transfac" (Biologicische Datenbanken GmbH, Braunschweig; Wingender 2001) ou a base de dados PlantCARE (Lescot 2002). São especialmente preferidos os fragmentos equivalentes de seqüências de nucleotídeo reguladoras da transcrição, que são obtidas por deleção da região codificando a região não traduzida 5' do mRNA, assim somente provendo a região de promotor (não transcrita). A região não traduzida 5' pode ser facilmente determinada por métodos bem conhecidos na técnica (com análise 5'-RACE). Assim, algumas das seqüências de regulação da transcrição de nucleotídeos da invenção são fragmentos equivalentes de outras seqüências. O termo "promotor mínimo" como usado aqui refere-se a uma porção biologicamente ativa de um polinucleotídeo promotor que é capaz de mediar expressão específica da raiz e/ou indutível por nematódeo de um segundo ácido nucleico. Os fragmentos de promotor mínimos específicos da invenção incluem, sem limitação, um polinucleotídeo promotor compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, um polinucleotídeo promotor compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 ou nucleotídeos 1460 a 2110 de uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2, e um polinucleotídeo promotor compreendendo nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3, um polinucleotídeo promotor compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo promotor tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 1,2, ou 3.

Como indicado acima, mutantes de deleção do polinucleotídeo promotor da invenção também podem ser aleatoriamente preparados e então testados. Com esta estratégia, uma série de construções são preparadas, cada contendo uma porção diferente do clone (um subclone), e estas construções são então triadas para atividade. Um meio apropriado de triagem para a atividade consiste em fixar uma construção de promotor deletada, que contém um segmento deletado em um marcador selecionável ou triável, e isolar somente as células expressando o gene marcador. Deste modo, várias construções de promoter deletadas, diferentes, são identificadas, as quais irão reter a atividade desejada, ou mesmo melhorada. O menor segmento, que é requerido para atividade, é assim identificado através de comparação com as construções selecionadas. Este segmento pode então ser usado para construção de vetores para a expressão de genes exógenos.

Os meios para mutageneizar criar deleções em um segmento de DNA codificando qualquer seqüência de promotor são bem conhecidos do versado na técnica, e são descritos, por exemplo, em US 6.583.338, incorporado aqui por referência em sua totalidade. Um exemplo de uma variante de seqüência regulatória é um promotor formado por uma ou mais deleções de um promotor maior. A porção de 5' de um promotor até a caixa TATA próximo do sítio de partida de transcrição pode ser às vezes deletada sem abolir a atividade do promotor, como descrito por Zhu et al., (1995) A plant Cell 7:1681-1689. Um modo de rotina para remover parte de uma seqüência de DNA consiste em usar uma exonuclease em combinação com amplificação de DNA para produzir deleções abrigadas unidirecionais de clones de DNA de filamento duplo. Um kit comercial para este fim é vendido sob o nome comercial Exo-Size™. (New England Biolabs, Beverly, Mass.). As variantes biologicamente ativas também incluem, por exemplo, as seqüências de promotor nativas da invenção tendo uma ou mais substituições, deleções ou inserção de nucleotídeos.

Derivados e variantes também incluem homólogos, parálogos e ortólogos de outras espécies, como mas não limitados a bactérias, fungos, e plantas. "Homólogo" é um termo genérico usado na arte para indicar uma seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo possuindo um grau elevado de parentesco de seqüência com um seqüência de referência. Este parentesco pode ser quantificado por determinação do grau de identidade e/ou similaridade entre as duas seqüências, como aqui acima definido. Dentro deste termo genérico estão os termos "ortólogo", e "parálogo". "Parálogo" refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que dentro da mesma espécie que é funcionalmente similar. "Ortólogo" refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que é o equivalente funcional do polinucleotídeo ou polipeptídeo em outras espécies. Um gene ortólogo significa preferivelmente um gene, que está codificando uma proteína ortóloga. Mais especificamente, o termo "ortólogo" denota um polipeptídeo ou proteína obtido de uma espécie que é a contraparte funcional de um polipeptídeo ou proteína de uma espécie diferente. As diferenças de seqüência dentre os ortólogos são o resultado de especialização.

Uma das formas de realização engloba variantes alélicos de um polinucleotídeo promotor capaz de mediar a expressão preferida por raiz e/ou indutível por patógeno- selecionado dentre o grupo consistindo de a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3; b) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l; c) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 ou nucleotídeos 1460 a 2110 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2; d) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3; e) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); f) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); g) um polinucleotídeo compreendendo uma porção biologicamente ativa de qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); e h) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3. Como usado aqui, o termo " variante alélica " refere-se a um polinucleotídeo promotor contendo polimorfismos que levam a mudanças nos nucleotídeos do polinucleotídeo e que existem dentro de uma população natural (por exemplo, uma espécie ou variedade de planta). O termo "variante alélica" também refere-se a um polinucleotídeo contendo polimorfismos que levam a mudanças nas seqüências de aminoácidos de uma proteína codificada pelo nucleotídeo e que existem dentro de uma população natural. Tais variações alélicas podem tipicamente resultar em uma variância de 1-5% em um polinucleotídeo, ou variância de 1-5% na proteína codificada. As variantes alélicas podem ser identificadas por seqüenciamento do ácido nucleico de interesse em um número de plantas diferentes, que podem prontamente ser realizadas usando, por exemplo, sondas de hibridização para identificar os mesmos locus genéticos do gene nestas plantas. Todas de tais variações de ácido nucleico em um polinucleotídeo são o resultado de uma variação alélica natural e que não alteram a atividade funcional do polinucleotídeo são destinadas a estarem

dentro do escopo da invenção.

Em outra forma de realização, o promotor é induzido em raízes de uma planta exposta a um estímulo de patógeno. Este estímulo do patógeno pode estar presente, quando a planta é infectada ou no processo de se tornar infectada por nematódeos parasíticos de plantas. Um promotor mediando a expressão em resposta a um estímulo de patógeno é também chamado um promotor indutível por patógeno. O termo expressão preferida da raiz, com relação aos promotores, ácidos nucleicos isolados ou polinucleotídeos da invenção significa expressão em tecido de raiz, em particular em tecido vascular da raiz. No caso de plantas da família Fabaceae, ele também pode fazer referência à expressão em nódulos de raiz. Em outra forma de realização, o promotor é induzido em nódulos de raiz de uma planta Fabacea, por exemplo em nódulos de raiz de Glicine max. A invenção é também corporificada em cassetes de expressão compreendendo os polinucleotídeos promotores da invenção. "Cassete de expressão" neste contexto deve ser entendido amplamente como compreendendo todas as seqüências contidas no cassete que podem influenciar a transcrição de um polinucleotídeo de interesse e, se aplicável, a tradução do mesmo. Além dos polinucleotídeos promotores da invenção, o cassete de expressão da invenção ainda pode compreender elementos regulatórios que melhoram a função do polinucleotídeo de promotor, elementos genéticos que permitem a transcrição e/ou tradução em organismos procarióticos e/ou eucarióticos, e a montante, (em direção 3') elementos regulatórios como uma seqüência de terminação de transcrição e uma seqüência de poliadenilação. Os vários componentes do cassete de expressão da invenção são seqüencialmente e operativamente ligados juntos.

Assim, um cassete de expressão da invenção pode compreender um polinucleotídeo promotor capaz de mediar a expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno selecionado dentre o grupo consistindo de a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3; b) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l; c) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 ou nucleotídeos 1460 a 2110 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2; d) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3; e) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); f) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); g) um polinucleotídeo compreendendo uma porção biologicamente ativa de qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); h) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 1, 2, ou 3; i) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 1 j) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 2; e k) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 3.

Os elementos genéticos específicos que podem ser opcionalmente incluídos no cassete de expressão da invenção incluem, sem limitação, origens de replicação para permitir a replicação em bactérias, por exemplo, a região ORI de pBR322 ou P15A ori; ou elementos requeridos para a transferência de Agrobacterium T-DNA, como, por exemplo, as bordas esquerda e/ou direita de T-DNA. Outros componentes do cassete de expressão da invenção podem incluir, sem limitação, elementos regulatórios adicionais, como, por exemplo, melhoradores, introns, poliligadores, sítios de clonagem múltiplos, operadores, sítios de ligação de repressor, sítios de ligação de fator de transcrição e outros. Os melhoradores exemplares incluem elementos do promotor CaMV 35S, genes octopina sintase genes (Ellis el al., 1987), o gene actina I de arroz, o gene de álcool desidrogenase de milho (Callis 1987), gene shrunken I de milho (Vasil 1989), elemento TMV Omega (Gallie 1989) e promotores de eucariotes não plantas (por exemplo levedura; Ma 1988). As seqüências de íntron de plantas exemplares incluem introns de Adh 1, bronze 1, actina 1, actina 2 (WO 00/760067), ou o íntron de sacarose sintase ; ver: The Maize Handbook, Cap. 116, Freeling e Walbot, Eds., Springer, New York (1994).

As seqüências de líder viral também podem melhorar a transcrição de ácidos nucleicos de interesse pelo cassete de expressão da invenção. Por exemplo, seqüências de líder do vírus do mosaico do tabaco, (TMV), vírus da pinta clorótica do milho (MCMV), e vírus do mosaico da alfafa (AMV) foram demonstradas como sendo efetivas para melhorar a expressão. Outros líderes conhecidos na técnica incluem mas não são limitados a : líderes de Picornavírus, por exemplo, líder de vírus da encefalomiocardite (EMCV); líder de polivírus, líder do vírus do ataque do tabaco (TEV), líder de MDMV (vírus do mosaico do ananismo do milho ); líder de proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP)5 líder não traduzido de mRNA de proteína de capa de vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4).

Cassete de expressão da invenção também compreende um elemento de terminação de transcrição ou sinal de poliadenilação. Os elementos de terminação de transcrição exemplares incluem os do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (Bevan 1983), o terminador para o transcrito T7 do gene de octopina sintase de Agrobaeterium tumefaciens, e a terminação 3' dos genes I ou II do inibidor de protease I de batata ou tomate.

Um segundo polinucleotídeo a ser transcrito em RNA, e, opcionalmente, expressado como uma proteína é inserido no e cassete de expressão da invenção para transformação em um organismo. De acordo com a invenção, o segundo polinucleotídeo é colocado a montante (isto é na direção 3') do promotor da invenção e a jusante dos elementos de terminação de transcrição, em ligação covalente com os mesmos. Preferivelmente, a distância entre o segundo polinucleotídeo e o promotor da invenção não é maior do que 200 pares de base, mais preferivelmente não é maior do que 100 pares de base, o mais preferivelmente não é maior do que 50 pares de base.

Cassete de expressão da invenção também pode ser montado por inserção de um promotor da invenção em um genoma de planta. Esta inserção irá resultar em uma ligação operável para uma seqüência de interesse de ácido nucleico nativa para o genoma. .Estas inserção permitem que o ácido nucleico de interesse seja expressado ou super-expressado preferivelmente em tecido de raiz, após a indução por nematódeos, como o resultado das propriedades de regulação de transcrição do promotor da invenção. A inserção também pode ser dirigida ou por acaso. Preferivelmente, a inserção é dirigida e realizada, por exemplo, por recombinação homóloga. Por este procedimento, um promotor natural pode ser substituído pelo promotor da invenção, assim modificando o perfil de expressão de um gene endógeno.

Cassete de expressão da invenção pode ser inserido em um vetor recombinante, plasmídeo, cosmídeo, YAC (cromossomo artificial de levedura), BAC (cromossomo artificial bacteriano), ou qualquer outro vetor apropriado para transformação em célula hospedeira. As células hospedeiras preferidas são células bacterianas, em particular células de Escherichia eoli, Agrobaeterium tumefaeiens e Agrobaeterium rhizogenes, e células de plantas. Quando a célula hospedeira é uma célula de planta, o cassete de expressão ou vetor pode se tornar inserido no genoma da célula de planta transformada. Alternativamente, o cassete de expressão ou vetor pode ser mantido extra cromossomicamente. O cassete de expressão ou vetor da invenção pode estar presente no núcleo, cloroplasto, mitocôndria, e/ou plastídeo das células da planta. Preferivelmente, o cassete de expressão ou vetor da invenção é inserido no DNA cromossômico de um núcleo de célula de planta.

Cassete de expressão da invenção pode ser transformado em uma planta de modo a prover uma planta transgênica compreendendo um ou mais polinucleotídeos em associação operativa com um polinucleotídeo promotor da invenção. Planta transgênica desta forma de realização compreende um promotor compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, ou SEQ ID NO:3, um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:l, um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:2, ou um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:3. Alternativamente, a planta transgênica da invenção compreende um polinucleotídeo promotor que hibridiza sob condições estringentes em um promotor compreendendo uma seqüência de ácido nucleico como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:l, um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:2, ou um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:3. Ainda mais, a planta transgênica da invenção compreende um polinucleotídeo promotor tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO: 1, um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:2, ou um fragmento de promotor mínimo de SEQ ID NO:3; um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, ou 3; um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 1; um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 2; e k) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor3.

As plantas transgênicas da invenção são feitas usando métodos de transformação bem conhecidos do versado na arte de biotecnologia de plantas. Qualquer método pode ser usado para transformar o vetor de expressão recombinante em células de plantas para dar as plantas transgênicas da invenção. Os métodos apropriados para transformação ou transfecção de células hospedeiras incluindo células de plantas podem ser encontrados, por exemplo, em W02006/024509 (PCT/EP2005/009366; USSN60/6060789) e em Sambrook et al. supra, e em outros manuais de laboratório como Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, Ed: Gartland e Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey.

Os métodos gerais para a transformação de plantas dicotiledôneas são também descritos, por exemplo, em Patentes US Nos. 4.940,838; 5.464.763, e outros. Métodos para transformação de plantas dicotiledôneas específicas por exemplo, algodão, são especificados em Patentes US Nos. 5.004.863; 5.159.135; e 5,846.797. Os métodos de transformação de soja são especificados em Patentes US Nos. 4.992.375; 5.416.011; 5.569.834; 5,824.877; 6.384.301 e em EP 0301749B1. Outros métodos de transformação de plantas são descritos em, por exemplo, Patentes US Nos. 4.945.050; 5.188.958; 5.596.131; 5.981.840, e outros.

O termo "planta" como usado aqui pode, dependendo do contexto, ser entendido como fazendo referência a plantas completas, células de plantas, órgãos de plantas, sementes de plantas e a progênie das mesmas. A palavra "planta" também se refere a qualquer planta, particularmente a planta de semente, e pode incluir, mas não limitada a plantas de cultura. As partes de plantas incluem, mas não limitadas a caules, raízes, brotos, frutas, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, gametófitos, esporófitos, pólen, micrósporos, hipocótiles, cotilédones, anteros, sépalas, pétalas, pólen, sementes e outras. Uma planta pode ser de um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de milho, trigo, cevada, sorgo, centeio triticale, arroz, cana de açúcar, árvores cítricas, abacaxi, coco, banana, café, chá, tabaco, girassol, ervilha, alfafa, soja, cenoura, aipo, tomate, batata, algodão, tabaco, berinjela, pimenta, colza de semente oleígena, canola, beterraba, repolho, couve-flor, brócolis, alface, Lotus sp., Medicago truncatula, gramínea perene, erva-castelhana, e Arabidopsis thaliana. Em outra forma de realização a planta pode ser de um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de árvores cítricas, abacaxi, café, chá, tabaco, tabaco, girassol, ervilha, alfafa, soja, cenoura, aipo, tomate, batata, algodão, tabaco, berinjela, pimenta, colza de semente oleígena, canola, beterraba, repolho, couve-flor, brócolis, alface, Lotus sp., Medieago truncatula e Arabidopsis thaliana. Em outra forma de realização a planta pode ser de um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de, tabaco, girassol, ervilha, alfafa, soja, tomate, batata, algodão, tabaco, berinjela, pimenta, colza de semente oleígena, canola, beterraba, repolho, couve-flor, brócolis, alface, Lotus sp., Medicago truncatula e Arabidopsis thaliana. Em outra forma de realização a planta pode ser de um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de milho, trigo, cevada, sorgo, centeio triticale, arroz, cana de açúcar, abacaxi, coco, banana, gramíneas perenes e erva-castelhana.

As plantas transgênicas da invenção podem ser cruzadas com plantas similares transgênicas ou com plantas transgênicas faltando o promotor da invenção e segundo ácido nucleico ou com plantas não transgênicas, usando métodos conhecidos de cruzamento de plantas, para preparar sementes. Além disso, a planta transgênica da presente invenção pode compreender e/ou ser cruzada com outra planta transgênica que compreende, um ou mais genes de interesse diferentes operativamente ligados a um polinucleotídeo promotor da presente invenção ou a outro promotor, assim criando uma "pilha" de transgenes em uma planta e/ou sua progênie. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada, compreendendo o ácido nucleico de interesse e o promotor da invenção. A planta pode ser uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o cassete de expressão particular herdado através de um parental fêmea ou através de um parental macho. A segunda planta pode ser uma planta endogâmica. A transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídos na presente invenção as sementes de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis cruzadas. As sementes da invenção podem ser colhidas a partir de plantas transgênicas férteis e serem usadas para cultivar gerações de progênies de plantas transformadas desta invenção, incluindo linhagens de plantas híbridas compreendendo a construção de DNA.

"O empilhamento de genes" também pode ser obtido por transferência de dois ou mais genes no núcleo da célula por transformação da planta. Os genes múltiplos podem ser introduzidos no núcleo da célula durante a transformação ou seqüencialmente ou em uníssono. Os genes múltiplos em plantas ou espécie de patógeno alvo podem ser regulados de modo negativo por mecanismos de silenciamento de genes, especificamente RNAi, usando um transgene único marcando seqüências de interesse parciais, ligadas múltiplas. Os genes múltiplos, empilhados, sob o controle de promotores individuais, também podem ser super-expressados para atingir um fenótipo único ou múltiplo desejado. As construções contendo empilhamentos de genes de tanto genes super-expressados como alvos silenciados também podem ser introduzidas em plantas fornecendo fenótipos únicos ou múltiplos agronomicamente importantes. Em algumas formas de realização as seqüências de ácido nucleico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer seqüência de polinucleotídeos de interesse para criar os fenótipos desejados. As combinações podem produzir plantas com um variedade de combinações de traços, incluindo mas não limitadas a resistência a doença, tolerância a herbicidas, melhora do rendimento, tolerância a frio e seca. Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo mas não limitado ao cruzamento de plantas por métodos convencionais ou por transformação genética. Se os traços forem empilhados por transformação genética, as seqüências de polinucleotídeos de interesse podem ser combinadas de modo seqüencial ou simultâneo em qualquer ordem. Por exemplo se dois genes forem ser introduzidos, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados ou no mesmo cassete de transformação. A expressão das seqüências pode ser dirigida pelos mesmos ou por diferentes promotores.

A invenção ainda compreende uma cultura compreendendo uma pluralidade das plantas transgênicas da invenção, plantadas juntas em um campo agrícola.

As plantas transgênicas da invenção podem ser usadas em um método de controlar uma infestação por patógeno parasítico na planta em uma cultura, que compreende a etapa de cultivar referida cultura a partir de sementes compreendendo um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo promotor da invenção em associação operativa com um segundo polinucleotídeo que codifica um agente que rompe o metabolismo, crescimento e/ou reprodução de referido patógeno parasítico na planta, que melhora a tolerância da planta ao referido patógeno parasítico na planta, ou que é tóxico ao referido patógeno parasítico na planta, em que o cassete de expressão é estavelmente integrado nos genomas de células de plantas, plantas e/ou sementes. Estes agentes incluem, sem limitação, um RNA de filamento duplo, que é substancialmente idêntico a um gene de marcação de um patógeno parasítico na planta, que é essencial para a sobrevivência, metamorfose ou reprodução do patógeno, um RNA de filamento duplo que é substancialmente idêntico a um gene de planta requerido para manter um sítio de alimentação de nematódeo, um RNA anti-sentido, um siRNA, um miRNA ou seu precursor, uma proteína que interfere com o metabolismo, sobrevivência, metamorfose ou reprodução do patógeno ou toxina microbiana, uma toxina derivada do inseto, que interfere com o metabolismo, sobrevivência, metamorfose ou reprodução do patógeno, e semelhantes. Os seguintes exemplos não são destinados a limitar o escopo

das reivindicações da invenção, mas são ao contrário destinados a serem exemplares de algumas formas de realização. Quaisquer variações nos métodos exemplificados que ocorrem para os versados na arte são destinados a estar dentro do escopo da presente invenção. EXEMPLOS

Exemplo 1 Clonagem de promotores de gene tipo TPP de soja

Sementes de soja Glicine max cv. Williams 82 foram germinadas em placas a 1% agar durante 3 dias a 25°C e transferidas sobre bolsas de germinação com uma muda por bolsa. Um dia depois, cada muda foi inoculada com 1000 juvenis no segundo estágio (J2) de Heterodera glicines race3. As mudas foram mantidas na mesma condição de cultivo. A posição da ponta da raiz foi marcada sobre a bolsa. Um dia após a inoculação, a muda foi retirada e enxaguada em água pra remover os restantes nematódeos sobre a superfície, e então transferidas sobre uma nova bolsa e a posição da ponta da raiz foi marcada sobre a bolsa.

Seis dias após inoculação, a porção da raiz entre as duas marcas foi fatiada em pedaços de 1 cm de comprimento com uma lâmina de barbear e imediatamente fixadas em uma solução contendo 3 partes de etanol e 1 parte de ácido acídico glacial. A solução foi submetida a vácuo a 400 mm Hg durante 15 minutos duas vezes e então mantida em gelo durante 4-8 horas. Os pedaços de raiz foram então infiltrados por 10% sacarose durante 4 horas em gelo e então 15% sacarose durante 4 horas em gelo. Durante cada etapa de infiltração, a solução foi primeiro submetida a vácuo durante 15 minutos a 400 mm Hg. Todas as soluções de sacarose foram DEPC (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) tratadas para suprimir a atividade de RNAase.

Os pedaços de raiz foram então retirados e colocados em papel toalha para remover o líquido sobre a superfície e então incrustados em OCT (temperatura de corte ótima) (Sakura Finetechnical Co., Ltd., Tokyo, Japão) em um criomolde, seguido por imediatamente congelando em nitrogênio líquido. Uma vez que o OCT formou um bloco no molde, ele pode ser armazenado a -80°C.

Os pedaços de raiz foram seccionados a 10 μηι longitudinalmente com Leica Cryostat C3050s (Leica Microsystems Nussloch GmbH, Nussloch, Alemanha). A temperatura para o corte é fixada a -15°C. As seções foram transferidas sobre uma lâmina PEN (P.A.L.M. Microlaser Technologies GmbH, Bernried, Alemanha) sobre o lado da membrana e armazenadas a -80°C.

As laminas foram primeiro fixadas em etanol frio (4°C) 70% durante 1 minuto, então os OCT foram dissolvidos por imersão das lâminas em Ix PBS (Mediatech Inc., Herndon, VA) durante 2 minutos, seguido por desidratação em 70%, 95%, e 100% etanol durante 1 minuto em cada solução. As lâminas foram então secadas ao ar e montadas sobre o microscópio PALM (P.A.L.M. Microlaser Technologies GmbH, Bernried, Alemanha) para observação. As células sinciciais foram identificadas por sua morfologia única de tamanho de células aumentado, paredes de células espessadas e citoplasma denso. A tampa de um micro-tubo de 200 μΐ foi cheia com 20 μΐ de tampão de extração de RNA do kit e montada sobre a amostra com um suporte, com a extremidade aberta voltada para a amostra. Usando a interface de computador do sistema PALM, a região de corte foi definida. Então, um feixe de laser foi acendido através da lâmina e cortou o sincício em pedaços pequenos. Ao mesmo tempo, a força do feixe de laser soprou os pedaços cortados no tampão de extração de RNA acima da amostra. Uma vez acabado, a tampa foi removida do suporte e re-tampada sobre seu tubo, e o tampão de extração de RNA contendo as peças cortadas das sincícias foi girado para o fundo do tubo.

O RNA total celular foi extraído e isolado das células capturadas no laser usando o kit de isolamento de RNA PicoPure™ de Arcturus (Arcturus Inc., Mountain View, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para amplificar RNA do RNA total de produção baixa, kit de amplificação de RNA RiboAmp™ HS de Arcturus (Arcturus Inc., Mountain View, CA) foi usado de acordo com as instruções do fabricante, incluindo a adição de veículo de ácido nucleico para o RNA de amostra de entrada antes do início do protocolo de RiboAmp™ HS como recomendado no guia do usuário. A amplificação com sucesso foi obtida quando tão pouco como 500 pg de RNA de referência junto com o ácido nucleico de veículo suprido no kit de amplificação de RNA RiboAmp™ HS RNA, foram usados como uma entrada na reação de amplificação.

Os produtos de PCR de cDNA de soja (Glicine max) representando o conjunto de genes a serem interrogados são colocados em pontos roboticamente sobre um suporte de vidro quimicamente modificado (UltraGAPS, Corning Inc., Acton, MA) após purificação e re-colocação em suspensão em 50%DMSO usando um Gen III Spotter (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Uma placa de PCR de controle consistia de um conjunto de genes de controle (18 genes em 12 réplicas) foi incluída no começa das sessões de formação de pontos, como tal, os primeiros 18 pontos na primeira fileira de cada painel foram genes tipo raios internos e eles podem ser usados como controles de QC e/ou para obter uma curva padrão com a abundância normalizada para os outros clones no painel foi calculada. Os genes de controle são um conjunto comercialmente disponível de genes artificiais designados com base nas seqüências das regiões inter-gênicas de leveduras (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

A implementação de um conjunto de genes de controle no processo de microarranjo permitiu a adoção de uma abordagem de hibridização com base em cor única em vez do formato de hibridização de duas cores previamente praticado, isto é, rotulação e hibridização de uma amostra de cDNA única para um arranjo de cDNA em vez de um par de amostra de tratamento versus referência. Assim, a intensidade de sinal normalizada, e assim a abundância de transcrito absoluta para cada transcrito expressado na amostra de RNA original, em vez de relações, podem ser calculadas e comparadas entre amostras e experiências diferentes cruzadas. As amostras de RNA amplificadas (aRNA) foram

indiretamente rotuladas com Cy 3 usando a tecnologia 3DNA Dendrimer of Genisphere™ com descrito no protocolo de rotulação à base em iniciador aleatório (Genisphere, Hatfield, PA) e hibridizadas com os arranjos de cDNA de soja usando um protocolo de hibridização em duas etapas, como descrito nas instruções do fabricante (Genisphere, Hatfield, PA). Os produtos de cDNA a partir da transcrição reversa de aRNA foram purificados em coluna e sua qualidade verificada em Agilent BioAnalyzer. O cDNA purificado foi então ligado para capturar seqüências e ainda purificado e concentrado usando protocolos padrões de biologia molecular. Para aumentar a reprodutibilidade e a comparatibilidade de amostras cruzadas, quantidade idêntica (-250 ng) de mistura de ligação de seqüência de captura de cDNA purificada foi usada para hibridizar os arranjos para todas as amostras. A quantidade conhecida de pré- mistura de cdNA correspondente para os genes de controle foi salpicada sobre o cDNA de amostra antes da hibridização e rotulação. Para minimizar as variações associadas com a hibridização manual, todas as hibridizações foram realizadas em um dispositivo Lucidea Pro Automated Slide Processor (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

As lâminas processadas foram escaneadas usando um Gen III Scanner (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Os arquivos .gel gerados do Gen III Scanner foram importados e analisados usando um software de extração de aspectos ImaGene™ versão 5.1 de BioDiscovery (Los Angeles, CA) em que as imagens foram segmentadas em pixéis e convertidas em valores de intensidade numérica. O fundo local e outros valores de QC associados com cada ponto sobre a imagem foram também obtidos.

Os dados brutos obtidos de ImaGene™ foram diretamente importados em uma linha de análise de dados de expressão de micro-arranjo com base em SAS desenvolvida na emprega e processos nas seguintes etapas seqüenciais. Os dados de pontos negativos, vazios e ruins foram removidos do conjunto de dados. A definição dos pontos negativos, vazios e ruins, seguiram as recomendações dos desenvolvedores do software (BioDiscovery, Los Angeles, CA) assim como com base em configurações empiricamente determinadas para remoção de dados. Os pontos negativos foram definidos como quaisquer pontos em que um valor de sinal negativo foi obtido após correção para o fundo local. Os pontos vazios foram definidos como muitos pontos que tinham valores de sinal após correção para o fundo local de menos do que η χ SDfondo onde η é comumente definido como 2 ou 3. Ao passo que os pontos ruins foram definidos como quaisquer pontos com CVintenSidade de sinal maior do que um valor empiricamente definido, que é uma medida da morfologia do ponto/ sinal, contaminação estranha e uniformidade do sinal de hibridização. Todas as configurações foram feitas antes do processamento das imagens em um software ImaGene™ e os pontos serão etiquetados com um valor de "bandeira" não zero indicativo do tipo de faltas de QC no arquivo de saída do ImaGene™. Somente os pontos com um valor de "bandeira" de "O" foram mantidos para outras análises. As medidas de sinal retidas foram normalizadas de modo que os meios de base global para cada arranjo foram escalonados em 500.

Como um pré-requisito para o desenvolvimento com sucesso de uma abordagem para controlar as infestações por nematódeos, genes expressados como um resultado de infestação por nematódeo de raízes de soja, precisam ser identificados. Estes genes incluem, mas não limitados aos genes que são essenciais para a formação de sincícias e genes diferencialmente expressados em resposta à uma infecção por SCN.

Para identificar os genes especificamente e/ou diferencialmente expressados em sincícias, três tipos de células e tecidos de raiz foram coletados e usados para a extração de RNA celular total, as sincícias, segmentos de raiz não em contato direto com o nematódeo do cisto de soja, mas são da raiz de soja infectada por SCN designadas como "não sincícias" e raízes de controle não tratadas. O RNA total foi extraído, isolado

de sincícias capturadas em LCM e amplificado como descrito acima. Para

®

isolar o RNA total de segmentos de raiz, kit de isolamento de RNA TRIZOL de Invitrogen Life Technologies (Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califórnia) foi usado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O RNA total foi ainda purificado usando Kit Qiagen RNeasy Midi (Qiagen Inc., Valentia, CA) como descrito nas instruções do fabricante. Para melhor comparar os dados de expressão gerados das sincícias capturadas em LCM e segmentos de tecido de raiz, RNA total preparado a partir de tanto "não sincícias" e como raízes de controle não tratadas foram submetidos ao mesmo processo de amplificação de RNA de 2 ciclos, como descrito acima, de modo que o aRNA amplificado de todos os três tipos de célula /tecido de raiz de soja foram comparados na análise final.

Tabela 1 descreve o número de amostras de sincícias capturadas em LCM e "não sincícias" e amostras de tecidos de raiz de controle coletadas e analisadas neste estudo. A informação sobre a amplificação de RNA e hibridização de micro-arranjos também foi incluída nesta tabela.

Tabela 1. Amostra de tecido e informação experimental

Nome da amostra / Número de Número de RNA Número de tratamento amostras amplificado Hibridização Sincícias 6 dias 2 2 9 Não Sincícias 6 dias 2 2 11 Raízes não tratadas 6 dias 3 4 17

As análises estatísticas de dados de expressão de genes

gerados a partir de amostras de sincícias capturadas em LCM, "não sincícias" e tecidos de raiz de controle levou à identificação of genes expressados especificamente dou diferencialmente em sincícias. Um tal gene (48986355) é anotado com codificando uma proteína de tipo trealose-6-fosfato fosfatase. Tabela 2 resumiu os dados de expressão como medidos por análise de micro- arranjo de cDNA através de três amostras de células / tecido: sincícias, não sincícias infectadas com SCN e tecidos de raiz de controle não tratados. Os níveis relativos de expressão de genes são expressados como intensidades de sinal normalizados (± desvio padrão) como descrito acima.

Tabela 2. Expressão de gene trealose-6-fosfato fosfatase gene

Nome do Gene Sincícias #1(N) Sincícias #2(N) Não Sincícias Raízes de controle 48986355 712+90 (4) 453±205(5) ND* ND N em (N) é o número de medidas c e microarranjo de cDNA

ND: Não detectável sob as condições experimentais descritas neste estudo. Como demonstrado na Tabela 2, clone de cDNA 48986355 de soja foi identificado como sendo regulado de modo positivo em sincícias de raízes de soja infectadas. Figura 4 mostra a seqüência de clone de cDNA 48986355 de soja . A seqüência de cDNA 48986355 (SEQ ID NO:4) foi determinada como sendo de comprimento completo porque ela é um códon de parada TAG partindo em bp 87 a montante e na mesma armação que o códon de partida ATG da matriz de leitura aberta de trealose-6-fosfato fosfatase que começa em par de base 102.

Para clonar a seqüência de promotor de 48986355, o Kit Universal Genome Walking Kit (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Calif.) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Para isto, DNA genômico de soja (<Glicine max, Resnik) foi extraído usando Qiagen DNAeasy Plant Minikit (Qiagen). O procedimento consistia de duas amplificações PCR, usando um iniciador de adaptador e um iniciador específico de gene para cada reação de amplificação. As seqüências de iniciadores usados para isolar os promotores da invenção são mostradas na Figura 9. Os iniciadores específicos de genes que marcam 48986355 (SEQ ID NO:4) foram iniciador primário, 48986355GW (SEQ ID NO: 10) e iniciador abrigado, 48986355GWnest (SEQ ID NO: 11). Os iniciadores adaptadores usados foram APl (SEQ ID NO:12) e AP2 (SEQ ID NO: 13). Usando este protocolo, vários clones foram isolados e sequenciados.

O produto clonado mais longo foi identificado como pAW260 (SEQ ID NO:5). Um alinhamento de seqüência de pAW260 com 48986355 indicou que este clone é idêntico a 48986355 (SEQ ID NO:4) como mostrado em Figuras lOa-c. O alinhamento revelou que pAW260 continha uma seqüência de promotor de 1000 bp a montante do ATG de posição de nucleotídeo de 32 a 1031 de seqüência pAW260 (ver Figuras lOa-c). Esta região de promotor foi clonada dentre pAW260 usando técnicas padrões de PCR e os iniciadores 48986355prF (SEQ ID NO: 14) e 48986355prR (SEQ ID NO: 15). 48986355prF e 48986355prR amplificaram o fragmento de promotor de 1000 bp de pAW260 contendo os sítios de enzima de restrição Xmal e Ascl respectivamente para facilidade de clonagem direcional. O promotor 48986355 e as seqüências 5'UTR, sem os sítios de restrição usados para clonagem, é mostrado como SEQ ID NO:3. A seqüência de nucleotídeos 1- 841 representa a seqüência de promotor completa com a região de promotor de núcleo se estendendo em nucleotídeos 491-841. O sinal TATA se estende em nucleotídeos 808-814 e a seqüência de líder não traduzida 5' do mRNA dos nucleotídeos 841-1000. Exemplo 2 Clonagem de promotores de Trealose-6-Fosfato Fosfatase (TPP) de Arabidopsis

Os genes de Arabidopsis Atlg35910 e At5gl0100 foram selecionados com base em sua similaridade para a seqüência de cDNA de soja indicada no Exemplo 1. DNA genômico de Arabidopsis (ecotipo Columbia) foi extraído usando Qiagen DNAeasy Plant Minikit (Qiagen, Valencia, Califórnia, US). As regiões de DNA genômico de 1.999 bp (SEQ ID NO:l) e 2.110 bp (SEQ ID NO:2) (seqüências putativas promotoras) diretamente a montante do codon ATG incluindo região não traduzida 5' correspondendo genes de tipo trealose-6-fosfato fosfatase- de Arabidopsis com identificadores de locus, Atlg35910 e At5gl0100 respectivamente, foram clonados usando protocolos de amplificação PCR padrões. Para isto, aproximadamente 0,1 μg de DNA genômico de Arabidopsis foi usado com o gabarito de DNA na reação de PCR. Os iniciadores usados para amplificação PCR de seqüências de promotor de Arabidopsis são mostrados na Figura 9 e foram designados com base em base de dados da seqüência genômica de Arabidopsis (TAIR). As seqüências de iniciador descritas por SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:8 contém o sítio de restrição de Xmal para facilidade de clonagem. As seqüências de iniciador descritas por SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:9 contém o sítio Ascl para facilidade de clonagem. As seqüências de iniciador descritas por SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO:7 foram usados para amplificar a região de promotor de Arabidopsis locus Atl g35910. As seqüências de iniciador descritas por SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9 foram usados para amplificar a região de promotor de Arabidopsis locus At5gl0100. A mistura de reação de amplificação continha os seguintes :

2,5 μΐ IOX Hot Start tampão; 0,15 μΐ Hot Start Taq DNA polimerase; 0,5 μΐ mM dNTPs; 0,5 μΐ 10 μΜ iniciador A; 0,5 μΐ 10 uM iniciador B; 1,0 μΐ Columbia Arabidopsis DNA genômico (aproximadamente 100 ng); 19,85 μΐ água. Termociclor: Termociclor T3 (Biometra, Goettingen, Alemanha) foi usado para a amplificação usando a seguinte configuração: 1 ciclo com 900 segundos a 94°C; 5 ciclos com 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 52°C, e 120 segundos a 72°C; 30 ciclos com 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 62°C, e 120 segundos a 72°C; 1 ciclo com 300 segundos a 72°C.

O tamanho do fragmento de DNA amplificado para cada produto de PCR foi verificado por eletroforese de gel agarose padrão e o DNA extraído do gel por kit de extração de gel Qiagen (Qiagen, Valencia, Califórnia, US)). Os fragmentos purificados foram clonados por TOPO em pCR2.1 usando o kit de clonagem TOPO TA seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen). Os fragmentos clonados foram seqüenciados usando um seqüenciador automatizado Applied Biosystem 3 73A (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia, US) e verificados como tendo a seqüência esperada usando o alinhamento de seqüência ClustalW (European Bioinformatics Institute, Cambridge, UK) da ferramenta de análise de seqüência Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, USA). Os fragmentos de DNA de 1.999 bp e 2.110 bp correspondendo a regiões de promotor de Atlg35910 e At5gl0100 são mostrados como SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2. Os sítios de restrição introduzidos nos iniciadores para facilitar a clonagem não foram incluídos nas seqüências.

Exemplo 3 Construção de vetor binário para a transformação e geração de raízes cabeludas transgênicas Para avaliar a atividade de expressão dos promotores clonados, fragmentos de genes correspondendo a nucleotídeos 1-1999 de SEQ ID NO:l, nucleotídeos 1-2110 de SEQ ID NO:2 e nucleotídeos 1-1000 de SEQ ID NO:3 foram clonados a montante de um gene repórter GUS (β-glucuronidase bacteriano ou gene GUS (Jefferson (1987) EMBO J. 6, 3901-3907) para criar os vetores binários pAW284qcz, pAW281qcz, e RAW403, respectivamente. Um marcador selecionável de planta nos vetores binários é uma forma resistente a herbicida de gene de ácido acetohidroxi sintase (AHAS, EC 4.1.3.18, também conhecido como acetolactato sintase ou ALS) de Arabidopsis thaliana (Sathasivan et al., Plant Phys. 97:1044-50, 1991). ARSENAL (imazapyr, BASF Corp5 Florham Park, NJ) foi usado como o agente de seleção.

No presente exemplo, vetores binários pAW284qcz, pAW281qcz, e RAW403qcz foram transformados em cepa de A. rhizogenes K599 por eletroporação (Cho et al., (1998) Plant Sei. 138, 53-65). O Agrobacterium transformado foi usado para induzir a formação de raiz cabeluda de soja usando os seguintes protocolos. Aproximadamente cinco dias antes da inoculação de A. rhizogenes, sementes de soja cultivar Williams 82 (susceptível a SCN) foram esterilizadas com 10% alvejante durante 10 minutos e germinadas em 1% agar a 250C com iluminação de 16 horas /dia. Aproximadamente três dias antes da inoculação de A. rhizogenes, um estoque congelado de A. rhizogenes cepa K599 contendo o vetor binário foi riscado em placas de LB + canamicina (50 μg/ml) e incubados a 28°C no escuro. Aproximadamente um dia antes da inoculação de A. rhizogenes, uma colônia foi retirada da placa e inoculada em LB líquido + canamicina (50 μg/ml). A cultura foi agitada a 28°C durante aproximadamente 16 horas. A concentração de A. rhizogenes na cultura líquida foi ajustada a OD6oo = 1-0.

Cotilédones foram excisados de mudas de soja e o lado adaxial foi ferido várias vezes com um escalpe. 15 μΐ de uma suspensão de A. rhizogenes foram inoculados sobre a superfície ferida, e o cotilédone foi colocado com o lado adaxial para cima em um placa de agar a 1% durante 3 dias a 25°C com iluminação de 16 horas /dia. Os cotilédones foram então 5 transferidos sobre placas MS contendo 500 μg/ml carbenicilina (para suprimir A. rhizogenes) e 1 μΜ ARSENAL. Após cultivar os cotilédones em meio de seleção durante 2 semanas, raízes cabeludas foram induzidas do sítio de ferimento. As raízes resistentes a ARSENAL e crescendo no meio seleção foram colhidas e transferidas sobre meio seleção novo da mesma composição 10 e incubados a 25°C no escuro. Duas semanas após colheita raízes cabeludas e cultivando as mesmas em meio de seleção, as raízes cabeludas foram subcultivadas em meio MS contendo carbenicilina 500 μg/ml mas não ARSENAL.

Exemplo 4 Detecção de Atividade Promotor em raízes cabeludas de soja Como especificado em Exemplo 3, os promotores da invenção

foram colocados em associação operativa com o gene repórter GUS para determinar sua atividade de expressão. A atividade de β-glucuronidase do gene GUS pode ser detectada in planta por meio de uma substância cromogênica como ácido 5-bromo-4-cloro -3-indoil-B-D-glucurônico (x- Gluc) em uma atividade reação de coloração.

Para estudar a atividade de promotor de SEQ ID NOs:l, 2, e 3 na presença e ausência de infecção por nematódeo, várias linhagens transgênicas independentes foram geradas a partir da transformação com pAW284qcz, pAW281qcz, e RAW403. Aproximadamente três semanas após 25 o subcultivo, as linhagens transgênicas de raiz cabeluda em MS foram inoculados com J2 descontaminado na superfície de SCN raça 3 em 2000 J2/ nível de placa. Em 12 dias após inoculação (DAI), as raízes foram colhidas por remoção das placas de agar e suavemente enxaguadas com mudanças na água e coloridas com solução de coloração GUS contendo X-Gluc (2mg/l) a 37°C durante 16 horas. Em cada ponto de tempo após inoculação, uma placa de controle não inoculada de cada linhagem foi também colorida com solução de coloração GUS. Após coloração GUS, as raízes foram coloridas em um ácido fucsina e então descoloridas para visualizar os nematódeos, que foram 5 coloridos vermelhos. As raízes foram então observadas sob um microscópio para a detecção de expressão GUS.

Para cada linhagem transgênica, 10 sincícias aleatoriamente recolhidas foram observadas e classificadas para intensidade de expressão GUS em 12 dias após infecção (DAI). O seguinte índice de escore foi usado: para sem coloração, “+” para coloração fraca, “-H-” para coloração forte.

Uma média de ciclo das 10 contagens foi usada para determinar o nível de expressão GUS nas sincícias para esta linhagem. Além disso, nível de expressão GUS nas mesmas linhagens para outros tecidos de raiz como calos, ponta da raiz, vasculatura, cortical e primordial foram também registrados 15 usando o mesmo índice de escore GUS de para sem coloração, “+” para coloração fraca, “++” para coloração forte. Os resultados para linhagens transformadas com pAW284qcz, pAW281qcz, e RAW403 são apresentados na Figura 6.

O resultado da coloração GUS indica que para a maior parte das linhagens testadas, o fragmento de promotor em pAW284 mostrou expressão GUS intermediária a forte nas sincícias a 12 DAI. Em contraste, a expressão GUS em outras partes da raiz como pontas da raiz, tecido vascular, e córtex da raiz não foi detectada ou era muito fraca.

Exemplo 5 Clonagem de deleções de promotor de Atlg35910 (SEQID NO:l) A fim de definir mais precisamente a região de promotor de

Atlg35910 (SEQ ID NO:l), fragmentos mais curtos da seqüência a montante foram testados. DNA plasmídeo de pAW284qcz foi extraído de E. coli usando o kit Qiagen Plasmid miniprep (Qiagen). Os fragmentos de deleção do promotor de 986 bp e 502 bp de promotor de A. thaliana locus Atlg35910 (SEQ ID NO: 1) contidos em pAW284qcz foram amplificados usando protocolo de amplificação de PCR padrão. Para isto, aproximadamente 0,1 μg de DNA plasmídeo pAW284qcz foi usado como o gabarito de DNA na reação de PCR. Os iniciadores usados para amplificação de PCR das seqüências de 5 promotor de Arabidopsis são mostrados na Figura 9 e foram designados com base na seqüência de promotor de promotor de A. thaliana locus Atlg35910 (SEQ ID NO:l) contido em pAW284qcz. As seqüências de iniciador descritas para SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 17 contém o sítio de restrição de Pstl para facilidade de clonagem. A seqüência de iniciador descrita por SEQ ID NO: 18 10 anela a montante do sítio Ascl em pAW284qcz de modo que um sítio Aatll estará contido em fragmentos amplificados para facilidade de clonagem. As seqüências de iniciador descritas por SEQ ID NO: 16 e SEQ ID NO: 18 foram usados para amplificar a região de deleção de promotor de 986 bp de promotor de Arabidopsis locus Atlg35910 contido em pAW284qcz. As 15 seqüências de iniciador descritas por SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 foram usadas para amplificar a região de deleção de promotor de 502 bp de promotor de Arabidopsis locus Atl g35910 contido em pAW284qcz.

A mistura de reação de amplificação continha os seguintes : 2,5 μΐ IOX Pfu Turbo tampão; 0,5 μΐ Pfu Turbo DNA polimerase; 0,5 μΐ 10 20 mM dNTPs; 0,5 μΐ 10 μΜ iniciador A; 0,5 μΐ 10 μΜ iniciador B; 1,0 μΐ pAW284qcz DNA plasmídeo (aproximadamente 100 ng); 19,50 μΐ água. T3 Termociclor (Biometra, Alemanha) foi usado para a amplificação usando a seguinte configuração: 1 ciclo com 60 segundos a 94°C; 32 ciclos com 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 52°C, e 120 segundos a 72°C; 1 ciclo com 25 300 segundos a 72°C.

O tamanho do fragmento de DNA amplificado para cada produto PCR foi verificado por eletroforese de gel agarose padrão e o DNA extraído do gel por kit de extração de gel Qiagen (Qiagen, Hilden, Alemanha). Os fragmentos purificados foram digeridos com Pstl e Aatll seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs5 Ipswich5 Massachusetts, US). Os fragmentos digeridos foram purificados usando o kit de purificação Qiagen PCR (Qiagen). A região de deleção de promotor de 986 bp de promotor Atlg35910 amplificado usando iniciadores SEQ ID NO: 16 e 5 SEQ ID NO: 18 é representada por nucleotídeos 1014 a 1999 de SEQ ID NO:l. A região de deleção de promotor de 502 bp de promotor Atlg35910 amplificado usando iniciadores SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 é representada por nucleotídeos 1498 a 1999 de SEQ ID NO:l. Os sítios de restrição introduzidos nos iniciadores para facilitar a clonagem não são 10 incluídos nas seqüências designadas.

Exemplo 6 Construção de vetor binário Atlg35910 - Deleções de promotor para transformação e geração de raízes cabeludas transgênicas

Para avaliar a atividade de expressão das deleções de promotores clonados derivados de pAW284qcz, fragmentos de genes 15 correspondendo a nucleotídeos 1014 a 1999 de SEQ ID NO:l e 1498 a 1999 de SEQ ID NO:l foram clonados a montante de um gene repórter GUS (B- glucuronidase bacteriano ou gene GUS (Jefferson (1987) EMBO J. 6, 3901- 3907) para criar os vetores binários RAW450 e RAW451, respectivamente. Um marcador de seleção de planta nos vetores binários foi um gene AHAS 20 mudado de A. thaliana que conferiu tolerância ao herbicida ARSENAL (imazapyr, BASF Corporação, Florham Park5 NJ).

No presente exemplo, vetores binários RAW450 e RAW451 foram transformados em cepa de A. rhizogenes K599 por eletroporação. O Agrobacterium transformado foi usado para induzir a formação de raiz 25 cabeluda de soja usando os seguintes protocolos. Aproximadamente cinco dias antes da inoculação de A. rhizogenes, sementes de soja cultivar Williams 82 (Susceptíveis a SCN) foram esterilizadas com 10% alvejante durante 10 minutos e germinadas em 1% agar a 250C com iluminação de 16 horas/dia. Aproximadamente três dias antes da inoculação de A. rhizogenes, um estoque congelado de cepa de A. rhizogenes K599 contendo o vetor binário foi riscado sobre placas de LB + canamicina (50 μg/ml) e incubado a 28°C no escuro. Aproximadamente um dia antes da inoculação de A. rhizogenes, uma colônia foi retirada da placa e inoculada em LB líquido + canamicina (50 μg/ml). A 5 cultura foi agitada a 28°C durante aproximadamente 16 horas. A concentração de A. rhizogenes na cultura líquida foi ajustada a ODôoo = IjO.

Cotilédones foram excisados de mudas de soja e o lado adaxial foi ferido várias vezes com um escalpe. 15 μΐ de suspensão de A. rhizogenes foram inoculados sobre a superfície ferida, e o cotilédone foi colocado com o 10 lado adaxial para cima em um placa de agar a 1% durante 3 dias a 25°C com iluminação de 16 horas /dia. Os cotilédones foram então transferidos sobre placas MS contendo 500 Carbenicilina (para suprimir A. rhizogenes) e

1 μΜ ARSENAL. Após cultivar os cotilédones em meio de seleção durante 2 semanas, raízes cabeludas foram induzidas do sítio de ferimento. As raízes 15 resistentes a ARSENAL e crescendo no meio de seleção foram colhidas e transferidas sobre meio de seleção novo da mesma composição e incubadas a 25°C no escuro. Duas semanas após coletar as raízes cabeludas e cultivar as mesmas em meio de seleção, as raízes cabeludas foram subcultivadas sobre meio MS contendo Carbenicilina 500 μg/ml mas não ARSENAL.

Exemplo 7 Detecção de atividade de deleção de promotor em raízes cabeludas de soja

Como especificado em Exemplo 6, os promotores da invenção foram colocados em associação operativa com o gene repórter GUS para determinar sua atividade de expressão. A atividade de B-glucuronidase do 25 gene GUS pode ser detectada in planta por meio de uma substância cromogênica como ácido 5-bromo-4-cloro -3-indoil-B-D-glucurônico (x- Gluc) em uma reação de coloração de atividade.

Para estudar a atividade de promotor dos fragmentos de deleção de SEQ ID NO:l na presença e ausência de infecção por nematódeo, várias linhagens transgênicas independentes foram geradas a partir da transformação com pAW284qcz, RAW450, e RAW451. Aproximadamente três semanas após subcultivo, as linhagens de raízes cabeludas transgênicas sobre MS, foram inoculadas com J2 descontaminado na superfície de SCN raça 3 no nível 2000 J2/placa. Em 12 dias após inoculação (DAI), as raízes foram colhidas por remoção das placas de agar e suavemente enxaguadas com mudanças na água e coloridas com solução de coloração GUS contendo X- Gluc (2mg/l) a 37°C durante 16 horas. Em cada ponto de tempo após inoculação, uma placa de controle não inoculada de cada linhagem foi também colorida em solução de coloração GUS. Após coloração GUS, as raízes foram coloridas em fucsina ácida e então descoloridas para visualizar os nematódeos, que foram coloridos de vermelho. As raízes foram então observadas sob um microscópio para detecção de expressão GUS.

Para cada linhagem transgênica, 10 sincícias aleatoriamente tomadas foram observados e classificadas para intensidade de expressão GUS em 12 Dias após infecção (DAI). O seguinte índice de escore foi usado: para sem coloração, “+” para coloração fraca, “++” para coloração forte. Uma média de ciclos das 10 contagens foi usada para determinar o nível de expressão GUS nas sincícias para esta linhagem. Além disso, o nível de expressão GUS nas mesmas linhagens para outros tecidos de raiz como calos, ponta da raiz, vasculatura, cortical e primordial foi também registrado usando o mesmo índice de escore GUS de para sem coloração, “+” para coloração fraca, “++” para coloração forte. Os resultados para linhagens transformadas com pAW284qcz, RAW450, e RAW451 são apresentados na Figura 7. A seqüência de promotor de 986 bp contido em RAW450 não foi capaz de conferir expressão induzida por nematódeos em sincícias. A seqüência de promotor de 502 bp contida em RAW451 foi capaz de conferir expressão induzido por nematódeos em sincícias, indicando que todos os elementos regulatórios requeridos são encontrados dentro da região de 502 bp a montante do códon de partida. Estes resultados estão consistentes com os resultados das análises de promotor usando Genomatix especificado em Exemplo 9.

Exemplo 8 Análise de Promotores PLACE

Os resultados da análise de PLACE (National Institute of Agrobiologics Sciences, Ibaraki, Japão) indicam uma caixa TATA localizada em posição de nucleotídeo 1871 para posição de nucleotídeo 1877 de SEQ ID NO:l como mostrado na Figura 1. conseqüentemente, a região não traduzida 5' começa em cerca de posição de nucleotídeo 1907. A seqüência descrita por SEQ ID NO:l termina imediatamente antes do códon de partida ATG. A região de núcleo em potencial do promotor descrito por SEQ ID NO:l vai de posição de nucleotídeo 1557 aposição de nucleotídeo 1907.

Os resultados de análise PLACE indicam que nenhuma caixa TATA está localizada em cerca de 300 bp da extremidade 3' de SEQ ID NO:2 como mostrado na Figura 2. Uma região não traduzida 5’ prevista começa em cerca de posição de nucleotídeo 2000. A seqüência descrita por SEQ ID NO:2 termina imediatamente antes do códon de partida de ATG. A região de núcleo em potencial do promotor descrito por SEQ ID NO:2 é de posição de nucleotídeo 1650 à posição de nucleotídeo 2000.

Os resultados de PLACE indicam uma caixa TATA localizada em posição de nucleotídeo 808 a posição de nucleotídeo 814 de SEQ ID NO:3 como mostrado na Figura 3. Conseqüentemente, a região não traduzida 5’ começa em cerca de posição de nucleotídeo 841. A região de núcleo em potencial do promotor descrito por SEQ ID NO:3 é de posição de nucleotídeo 491 a posição de nucleotídeo 841.

Exemplo 9 Identificação de Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3

Genomatix é um aplicativo de software de análise de seqüência de promotor contendo algoritmos DiAlign e FrameWorker (Genomatix, Munich, Alemanha). DiAlign é uma ferramenta alinhamento de seqüência múltipla e FrameWorker pode escanear um conjunto de seqüências de DNA para sítios de ligação de fator de transcrição correlacionados com orientação e distância (classes de elemento promotor).

Os 3’ de 650 bp de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO:3 foram usados para as duas análises de Genomatix descritas acima. Isto corresponde a nucleotídeos 1349 a 1999 de SEQ ID NO:l, nucleotídeos 1460 a 2110 de SEQID NO:2, e nucleotídeos 350 a 1000 de SEQ ID NO:3.

Para determinar se se tem homologia de seqüência entre nucleotídeos 1349 a 1999 de SEQ ID NO:l, nucleotídeos 1460 a 2110 de SEQ ID NO:2, e nucleotídeos 350 a 1000 de SEQ ID NO:3, o programa Genomatix DiAlign foi usado. DiAlign é um programa de alinhamento (DNA ou proteína) que se baseia na comparação de segmentos completos de seqüências em vez de uma comparação de um único ácido nucleico/ aminoácido. Asterísticos (*) indicam o grau relativo de similaridade local entre as seqüências de entrada. A similaridade máxima possível é representada por 10 sinais ‘*\ O resultado desta análise é mostrado nas Figuras 1 la-c. Nucleotídeos 1349 a 1999 de SEQ ID NO:l, nucleotídeos 1460 a 2110 de SEQ ID NO:2, e nucleotídeos 350 a 1000 de SEQ ID NO:3 foram comparados usando o algoritmo Genomatix FrameWorker para determinar uma configuração comum de classes de elementos promotores de plantas usando tanto elementos de promotores assim como novos elementos promotores associados com promotores indutíveis de cistos de soja com identificados usando o algoritmo Genomatix CoreSearch. Os parâmetros usados para a análise Genomatix FrameWorker foram os seguintes : uma distância de 5 a 200 bp entre elementos promotores, uma similaridade de núcleo de 1,0, e uma similaridade de matriz otimizada. Os modelos de configuração de promotor múltiplos foram identificados nesta análise. Configuração de Promotor 1, Configuração de Promotor 2, e Configuração de Promotor 3 foram gerados que compreendem 6, 3, e 5 elementos promotores, respectivamente, como resumido na Figura 8. O modelo contendo seis classes de elementos promotores foi designado Configuração de Promotor 1. Configuração de Promotor 1 foi determinada usando um método diferente do 5 que para a determinação de Configuração de Promotor 2 e Configuração de Promotor 3. Descobriu-se que existem elementos comuns múltiplos entre nucleotídeos 1349 a 1999 de SEQ ID NO:l, nucleotídeos 1460 a 2110 de SEQ ID NO:2, e nucleotídeos 350 a 1000 de SEQ ID NO:3. Especificamente, existem 3 pares de elementos que ocorrem dentro de orientação íntima um 10 com o outro, como descrito no Sumário da Invenção e como mostrado na Figura 12 para Configuração de Promotor I. O modelo contendo três classes de elemento promotor foi designado Configuração de Promotor 2. O modelo contendo cinco classes de elemento promotor foi designado Configuração de Promotor 3. Os locais de classes de elemento promotor contidos em 15 seqüências de promotor de SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO:3 são mostrados na Figura 1, Figura 2, e Figura 3, respectivamente. Além disso, Figura 12 mostra a orientação espacial comum das classes de elemento promotor em todas as três Configurações de Promotor.

Exemplo 10 Construção de vetor binário para gerar construções de promotor de planta completo em uma seleção BAR

Para avaliar a atividade de expressão de seqüências de promotor clonadas representadas por SEQ ID NO. l, SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO:3 em nódulos de soja após infecção por Bradyrhizobium japonicum e inoculação fungai com Rhizoctonia solani forma specialis (f. sp.) glicines e 25 Fusarium solani f. sp. glicines, seqüências de promotor representadas por SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO:3 foram clonadas a montante de um gene repórter GUS para criar os vetores binários RAW425, RAW424, e RTJ131, respectivamente. Um marcador de seleção de planta nos vetores binários é um gene BAR dirigido pelo promotor constitutivo de gene de nopalina sintase (p-NOS, An G. at al., A planta Cell 3:225-233, 1990). Vetores binários RAW425, RAW424, e RTJ131 foram usados para gerar raízes transgênicas para análise.

Exemplo 11 Sistema de teste de planta com raízes de soja

Sementes de soja limpas de cultivar de soja Glicine max cv. Williams 82 foram esterilizadas em uma câmara com um gás cloro produzido por adição de 3,5 ml 12N HCl em gotas sobre 100 ml alvejante. Todas as operações foram conduzidas em uma coifa. Após 24 horas na câmara, as sementes foram removidas e usadas imediatamente ou armazenadas em temperatura ambiente até uso. As sementes descoloridas ou as sementes partidas foram removidas. Para embeber as sementes, meio GM quente foi despejado em tomo das sementes até as sementes serem completamente cobertas pelo meio. As mudas foram cultivadas na luz durante 5-7 dias até o epicótilo estar estendido além dos cotilédones. As mudas foram armazenadas a 4°C durante a noite antes de serem usados na transformação. O GM (meio de germinação) compreende: IX B5 sais e vitaminas, IX MS carga de ferro, 2% sacarose, e 0,8% Noble agar a pH 5,8. Como uma alternativa, sementes de soja podem ser germinadas em 1% agar (50 ml) em discos de Petri durante 7 dias antes da inoculação de Agrobacterium.

Três dias antes da inoculação de Agrobacterium, uma cultura de Agrobacterium, por exemplo, cultura líquida desarmada de A. rhizogenes cepa K599, foi colocada em meio 5ml LB + Kan50 (contendo 50 ug/ml Canamicina) em um agitador a 28°C durante a noite. No próximo dia, Iml da cultura foi tomado e espalhado sobre uma placa de agar LB + Kan50. As placas foram incubadas em um incubador a 28°C durante dois dias. No final do período de dois dias, as placas foram cobertas com colônias espessas. Uma placa foi preparada para cada 50 explantes a serem inoculados.

As mudas de soja preparadas como descrito acima tinham hipocótilos alongados com aproximadamente 3 a 5 cm de comprimento com epicótilos visíveis. Os explantes foram então preparados por remoção dos epicótilos e parte dos hipocótilos. O explante continha um ou dois cotilédones, um meristema anxilar e o hipocótilo cerca de 2~3 cm de comprimento. A capa da semente foi removida para facilitar o desenvolvimento do cotilédone. A extremidade cortada do hipocótilo foi o alvo para a transformação/infecção.

Alternativamente, cotilédones contendo a extremidade proximal de sua conexão com as mudas foram usados como outro tipo de explante para transformação. A extremidade cortada foi o alvo para a inoculação de Agrobacterium.

Após os explantes serem cortados das mudas, a extremidade de corte foi imediatamente imersa em colônias espessas de A. rhizogenes preparadas acima de modo que as colônias eram visíveis sobre a extremidade cortada. Os explantes foram colocados em 1% agar em discos de Petri para co-cultivação. Aproximadamente 10 explantes foram colocados em disco. Os discos foram selados com Saran wrap e co-cultivados a 25-27°C sob luz durante 6 dias.

Após a etapa de transformação e co-cultivo no Exemplo 15, explantes de soja foram transferidos para um meio de indução de raiz com um agente de seleção, por exemplo, S-B5-605 para seleção de gene Bar, ou S-B5- 708 para uma seleção de gene AHAS. Os explantes foram inseridos, de modo que os calos no fundo estavam apenas abaixo da superfície do meio. Seis a nove explantes foram colocados em cada disco de Petri. Culturas foram mantidas nas mesmas condições que na etapa de co-cultivo.

O meio S-B5-605 compreende: sais 0,5X B5, 3mM MES, 2% sacarose, IX B5 vitaminas, 400μg/ml Timentina, 0,8% Noble agar, e 3 μg/ml Glufosinato de amônio (agente de seleção para gene Bar) a pH 5,8. O meio S- B5-708 meio compreende: sais 0,5X B5, 3mM MES, 2% sacarose, IX B5 vitaminas, 400μg/ml Timentina, 0,8% Noble agar, e 1 μΜ Imazapyr (agente de seleção para gene AHAS) a pH5,8.

Duas a três semanas após a indução de raiz, raízes transformadas foram formadas sobre as extremidades cortadas dos explantes. As raízes alongadas localizadas nos tecidos acima dos calos foram removidas 5 durante a transferência. Para a seleção de genes Bar, explantes foram transferidos para um meio de alongamento de raiz suplementado com 3 mg/l Glufosinato de amônio e 400 mg/l Timentina sem IBA (meio S-MS-607) para outra seleção. Para a seleção de gene AHAS, explantes foram transferidos para o mesmo meio de seleção (meio S-B5-708) para outra seleção. Raízes 10 transgênicas proliferaram bem dentro de uma semana no meio e estavam prontas para serem subcultivadas. O meio S-MS-607 compreende: sais 0,2X MS e vitaminas B5, 2% sacarose, 400 mg/l Timentina, e 3mg/L Glufosinato de amônio a pH5,8

As raízes soja brancas e fortes foram excisadas dos explantes 15 com raízes e cultivadas em meio de crescimento de raiz suplementado com 200 mg/l Timentina (meio S-MS-606) em ou placas com seis cavidades ou discos de Petri. As pontas de raízes principais foram removidas para induzir um crescimento de raiz secundária. Culturas foram mantidas em temperatura ambiente sob condição de escuro. Cada evento de raiz foi subcultivado em 20 três diferentes cavidades como réplicas. As raízes subcultivadas em cada cavidade devem crescer com vigor nas raízes laterais. O meio S-MS-606 compreende: sais 0,2X MS e vitaminas B5, 2% sacarose, e 200mg/l timentina apH5,8.

Exemplo 12 Sistema de teste de planta com raízes - Indução do Nódulo e Detecção de Atividade de Promotor em nódulos

Como especificado em Exemplo 10, os polinucleotídeos promotores da invenção foram colocados em associação operativa com o gene repórter GUS para determinar a atividade da expressão. A atividade de B- glucuronidase de gene GUS pode ser detectada in planta por meio de uma substância cromogênica como ácido 5-bromo-4-cloro -3-indoil-B-D- glucurônico (x-Gluc) em uma reação de coloração de atividade.

No presente exemplo, vetores binários RAW425, RAW424, e RTJl31 foram transformados na cepa de A. rhizogenes K599 SHAO17 5 desarmada (pSBl) por eletroporação. O Agrobacterium transformado foi usado para induzir uma formação de raiz de soja TRAP usando o protocolo descrito em Exemplos 11, 12, 13, 15, 16, e 17. Os explantes com raízes foram removidos do meio de alongamento e as raízes foram lavadas com água para remover o meio em excesso. Os explantes completos foram transferidos para 10 vasos com 10,16 cm contendo areia úmida. Os explantes foram aguados a cada 2 dias com meio de nodulação tamponado (Ehrhardt et al., 1992). Após dois dias em areia úmida, as raízes dos explantes foram inoculadas com Bradyrhizobium japonicum.

Para isto, uma cultura de 4ml de Bradyrhizobium japonicum 15 foi iniciada em meio líquido YM e cultivadas a 28 C com agitação. O meio YM contém por litro: IOg Mannitol, 0,4g extrato de levedura, 1 ml K2HP04 (10% p/v carga), 4 ml KH2P04 (10% p/v carga), I ml NaCl (10% p/v carga), e 2 ml MgS04,7H20 (10% p/v carga). O pH foi ajustado a 6,8 e o a solução de volume final de 1 litro foi autoclavada. Após 7 dias, 600 microlitros de 20 cultura de iniciador foram transferidos para um meio líquido YM novo com 40ml. As culturas múltiplas de 40 ml foram iniciadas. As culturas cresceram durante 48 horas a 28 C com agitação em um OD6OO de aproximadamente

0,2. As culturas de Bradyrhizobium japonicum foram combinadas e diluídas 6 vezes com meio de nodulação tamponado. Cada vaso contendo um explante 25 com raízes foi inoculado com aproximadamente 25 ml de cultura diluída de Bradyrhizobium japonicum. Aproximadamente 4 furos com cerca de 5,08 cm de profundidade foram criados na areia usando um pino de madeira e cultura diluída de Bradyrhizobium japonicum foi inoculada nos furos usando uma pipeta. Começando no dia após a inoculação, os explantes com raízes foram aguados com meio de nodulação tamponado a cada 2 dias. Após 2 semanas, os sistemas de teste de plantas com raízes foram removidos dos vasos com 10,16 cm e as raízes foram lavadas com água para remover a areia. As regiões de raiz contendo nódulos foram dissecadas usando uma lâmina de barbear e colocadas em solução de coloração GUS contendo X-Gluc (2mg/l) e então transferidas a 37°C durante 16 horas. Alguns nódulos foram fatiados pela metade usando a lâmina. A solução de coloração GUS foi removida e substituída com uma solução contendo partes iguais de glicerol, água, e ácido acético. Os nódulos de raiz foram então observados para coloração GUS. Foi observado que o promotor descrito por SEQ ID NO:l contido na construção RAW425 de fato induziu a expressão de GUS em nódulos de raiz. Foi observado que o promotor descrito por SEQ ID NO:2 contido em RAW424 de fato induziu a expressão de GUS em nódulos de raiz. Foi observado que o promotor descrito por SEQ ID NO:3 contido em construção RTJl31 de fato induziu a expressão de GUS em nódulos de raiz. Exemplo 13 Coloração GUS de planta completa

Plantas completas de soja transgênica são geradas contendo as seqüências de promotor representadas por SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, e SEQ ID NO:3 em associação operativa com o gene repórter GUS por transformação das construções RAW425, RAW424, e RTJ131, respectivamente, para caracterizar a expressão do promotor em resposta à infecção por nematódeo em raízes e tecidos de plantas completas em todo o ciclo de vida da planta. Os métodos representativos de caracterização de promotor em plantas completas de soja incluem mas não são limitados às seguintes descrições. As sementes de soja transgênica Tl são testadas para zigosidade e eventos de cópia única são germinados, cultivados em condições de estufa, e amostrados para expressão GUS em vários estágios de desenvolvimento em tecidos da folha, caule, flor, embrião e da vagem das sementes. Além disso, tecidos de raiz são colhidos em vários tempos antes e após infecção por SCN em raízes de controle inoculadas e não inoculadas. As plantas múltiplas são testadas para cada evento de modo a determinar tendências consistentes na análise da coloração GUS. As amostras colhidas são cortadas de uma planta e imediatamente colocadas em solução de 5 coloração GUS contendo X-Gluc (2mg/l), infiltradas a vácuo durante 20 minutos, e transferidas a 37°C durante 16 horas. Os tecidos são então observados e classificados para a intensidade de coloração GUS. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> BASF Plant Science GmbH Wiig, Aaron

<120> PROMOTORES DE GENE TREALOSE-6-FOSFATO FOSFATASE DE PLANTA INDUTÍVEL POR PATÓGENO E ELEMENTOS REGULADORES

<130> PF58033

<160> 26

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 1999

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<4 00> 1

gtagtgccct tcatggatac caaaagagaa aatttgattt agtgcataca tataacaata 60 taacgccgca taataatact gtataaaaca gtcatgtaac gatatgacag cagtaataca 120 gttccaagag acgttataat cgtatgcaat catatgcttg cgtagatttt ccaacagttt 180 tgtttcgttg ataggaggaa ctcaacactc tagggtagtg attggtagac actattagca 240 caaaaaatat taattttact ctgatgttta ccaaaaaagt taccaatcaa atatttaaga 300 gatcgtactc ttccacggcg actctaaaaa ccaaagatat aggttagact cataactact 360 ttataaagaa aatgtttaac gataactacc gagatctaat aaataaacct tcattttcaa 420 gtatattata tttgcttctt ttgtttatat atcaaaccaa gttctggttt ataaaaatat 480 tagataaaac tcgtctaaat aggtaggtgt aaaataaaat tttaaatttt tatcgataat 540 atttaaaatt tgaaaagtta ataatgatcc acacattttt tctaatattt aatttagtaa 600 tttttgtatt aaataaaatt tcaatcatat acattcgatt tttctataca ttttaactat 660 ctatttctgc ataataaact gtattttcat tttatacgct tcatcttatg gatgatattt 720 aaattttaaa tagtaattca tacacttttt aatatttaat ttagtatttt cttaaatcca 780 aattttaatc ttacaattta aatatctact ttaacataat acaaatacaa tttaatttca 840 ttgtattaaa ttcaaatata atttgattat aataaaatac aatttaattc taaaaagtcc 900 atcttagatt ttaattttcc tttttagttt tgaaaattaa aaatttaaat ttattagata 960 tatatgttac tttttcagtt ttcctattta tttaagaaaa aaatattttt taacacatgt 1020 caacttgtaa acaatagact gaacacgtca ttttatatta tgtttagttt tgaaaattaa 1080 agttaattaa atatttatat ttcttttttt tagcttttct aattattttt aaaatagtaa 1140 atatttttaa tacaaatcaa tatctgaaca atagatttga tacataacat aatcctataa 1200 attattaact tggaaaacga tagtttatat aataaaatta ttttcttaag ttctctaacc 1260 ataacaatta aactatattt tagcgaagaa aagaagagaa taccgagaga acgcaacttg 1320 cactaaaagc taccactttg gcaaatcact catttatatt attatatact atcacctcaa 1380 ttcaatcgaa acctcaaaat aacactaata tatacacaaa gaaacaacag aataacaccg 1440 aagaatatag gtttaggaaa atccagaatt tgttgagact aaagagatca aattttcgat 1500 acaaggtttt gctcaatttg tattttcata ataaaattct ttatttcacc atagacttac 1560 atgattagtt tttcttttaa taaaaaaaaa cacgcgacat gaaaattata ttatctcagt 1620 gttgtcgaat ttgaatttga attttgagtt aaatactaca catttgttga caacttatta 1680 aactttacaa gtctgctaca aatattgtca aatatttact aattaatgga ccaaaatcct 1740 ctaacttgca aatttgtatc tacatcaact taaaaattag gaatatgcga cccaaaaaaa 1800 aaaaaactag gaataataat aaaaaaatgg aatgatgtgg aggaagctct ttactctttg 1860 agaggaagtt tataaattga ccacacattt agtctattat catcacatgt attaagactt 1920 gacaacttgt ctttctcaca ccaaacccct ctcctctgtt tcataacatc tgctctttct 1980 tttttttcct aagccccta 1999 <210> 2

<211> 2110

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

ggacaacatt gttaagagga gataagagat ataggaagct tcttttgctg cgtttcctct 60 tcttgaatca atagttccat acaaaatggc attatgatca aactaggtta agaagaaatg 120 caaaaaagga acaactaaaa ataggtcaaa attaaataat gaaaagaaca agaacaatta 180 atttttctct tctcaaatcg atatcaaatt ctcaatagac tttggtgatg ggtttgtctt 240 ctgttctgtt ctgttctgtc aattcaagat ttcttttccc ctctctctct ttttctgttg 300 ttgtttgtct ctcttttttc ttatggctat tgcatgttga cctggtattg agagaaacag 360 aaaatgaacc tcagatttgt taagtcaata tttagaaaga aaaatggata cttgtcggaa 420 caaaaaaggg tccgagtttt tctcgacccg attctatttt tggttgattt tttggggttc 480 aaatttgtta ttatattttt tctaagtaat ttaaggtgtt tacgacgacg tatgtggatt 540 gctcataaaa tctaaaataa tgtgggttca ccaaatcaag aatctaaaga gacaattttc 600 tagttatctt tatatatatg tttgtatttg ccatttagaa gtttagaact caaaactcag 660 ttcttacaat gctagctata atttgcatga aaatagaaaa tgatattttc gtgtcttctt 720 ttttttttgg cagatttttg tgaaaaatat ctttaaacca cacttgttaa ttataaaaca 780 cagaaatatg tttatgttgc actggccctc agtttcgtga cgtgttgtaa agctggtata 840 cgtacgtata ggttccggga agaaactagt tttaaatgaa ttacaaaatg ttttttaagt 900 agtgaattag tactaatcac ctcgtaaccc taaattaata acataataca gcaataaaca 960 attcttaaac gagtggttaa ctagcaaatt acgttaactc cttaaccaac caacgggaaa 1020 aaacaaaacc ataatattaa aaaacaaagg gaacgatcga ctgattagtc gagaagcaga 1080 acttgtgggc ttcgtgcaca cacgtaatca cgtataatga atttattcta tatgtaatta 1140 tgtattaata cttttacctt tgttttatga ctaaattatt atgcatgctt gaagtcgctt 1200 ttaggtctaa tagaaaaaga atctgccgac ttactagaga gtactgagta gagactagag 1260 aaggggttta tccatttatg tttcattagg gacacttact gaagtagacc acacgtgcgg 1320 tgtttggctc gaagcacgac aagattcaga tgagtcatat cacctatact tctgtcaagt 1380 agtgaccgac acgttatgag tcccttttga tctctttagg cttcttctgt tcggtccatt 1440 ggccggcgaa gtagcgcttg acactccata agaccttcga atatcattat ataactaata 1500 acttgcacaa tgtagttcac tgttgtaata aatgatttat caaactatca atgcattcat 1560 aatctgtggg tttattcgtt tagagatggt gtcaaaatat tatatgtgaa tagaaactgg 1620 aacaataata taatttttct gtttttgaga tttataccga atgaaggaaa tcatatatag 1680 tatacttttc ttaaccaaat ctaatgtaca aatgttttaa atttgcaata atccaaccgc 1740 agagacgcgg attcgacgac tcgcatggtt cggcgacatt gacattagga cacgttacaa 1800 cgtacgcgaa tgagcgtagg cccatttaaa cccattatta ggcccagtag gtcccacttt 1860 tttacctttg ttctcctaca taaaccaaat tcgcagagta agctggaaaa aacacacacc 1920 caagtcatct tcatcttctt cctctctctt catcttttat tttgtaatat ctctacctta 1980 atctctagtt ttctcaaatg ggtaggcttt ggttttactt tgatccatct tgacacttta 2040 actatccttc tctttgtgta acctatcctc tgtttttgca gtgcgttttg tcgtggaaaa 2100 accacagata 2110 <210> 3 <211> 1000 <212> DNA <213> Glycine max <4 00> 3 aaactcgctg attaatgcat aaagagatta attttctatt ttatttttca 60 ctggtaaaga caaacataat ttttcaaaag caagttgtat ttgaagcacc tcagaaatat taaatgttag 120 agattcaatc tttgaatttc taataagaga gggggttaac tacatattta gtgtttgata 180 gtaatttgag aaaaatatat ttagttttga tagcacttaa aaaaccccta gaagaaataa 240 gaagaaagaa acagacactt ttcttaacaa atatttgaat cttaatttac tattttttta 300 ttaaaaaaat tactatatca tggtaaagta accataaact aactcttcta ttactcaata 360 gtgttggtca cagagtaata tatccttaaa accattcttt acttttattc aaaaaaataa 420 taatcctaaa agcaaggtgc tattaaactt aatagaatat gataaagcaa gttagtggca 480 aaatggtcat gaaacaaaat tatcagtaaa agttcctcat tattgtgaaa actcctactc 540 ctcaaagaaa agaagaagaa aaaaaaaacc ttggaaaagg aggtttctga gcgattacta 600 tgtggtccct cctactttct tatttagtat agttgccgaa aagaggtgat aatttcgtcg 660 gtttatgccc gtgtaaccga agtttataaa ttgaccacac acacacaccc tcgcttctta 720 tacgtgactt gaacccacca acgagtagaa aacgagtcca ttttttattt cctttttttt 780 tctttattca aacccttttt tctcccctat aaattccacg ttgagcaaag gaagcatcca 840 tccaaataca cccataacca tccctctctg ttctcttctc tgccttctct gtgtataacc 900 ccgtgaccct tcttctcatt tctcattctc ttttctttct cacaagagtt attgttatta 960 ttgttataac tattgttact attactaaac ttggtgtaga 1000 <210> 4

<211> 1604

<212> DNA

<213> Glycine max

<400> 4

cccgtgaccc ttcttctcat ttctcattct cttttctttc tcacaagagt tattattatt 60 attgttataa ctattgttac tattactaaa cttggtgtag aatgacgaac cgtaatgtga 120 ataacaccct tgtggagttg gcaatgtcga tttcaaacac aagtgctcta cctagagcta 180 cggtgcctgg aataatggcc ttgcttggtg gggttttggg cctaccccag aagaagctct 240 taatgaaaac tttggaagat ggaagtgtta ataaaggagg gaccaaagtt attaacacat 300 ggattgattc aatgagagcc tcttctccca cacgagtcaa atccacacaa aaccaagacc 360 caacaagtcc ttggacactt taccaccctt cggcactgag catgtttgat cagattgtat 420 gtgagtccaa aggaaagcag attgtgactt ttcttgacta tgatggaact ctctccccaa 480 ttgttgcaga tccagataaa gcatacatga gtaaaaagat gaggaccaca ttgaaggact 540 tagcaaggca tttccccact gccatcgtga gtggaaggtg cctggacaag gtgtataact 600 ttgtaagatt ggcagaactg tactatgctg ggagccatgg aatggacatc aagggaccaa 660 caaataagcg aagtactaag aaggaaaatg aacaagtgct cttccaaccc gctagtgaat 720 tcttgcccat gatcaatgag gtgtacaaca tcttggtgga aaaaacaaag tctgtccctg 780 gggctaaggt agaaaataac aagttttgct tgtccgtgca ctttcgctgt gttgacgaaa 840 agagttgggt gtcattggct gaacaagtga gcttcgtgct caacgagtac ccaaaactta 900 agctaactca agggagaaaa gtgcttgaga ttcgaccaac cataaaatgg gacaagggca 960 aggctcttga attcttgcta gagtcactgg gatatgctaa ttctgataat gtatttccaa 1020 tctatattgg ggatgatcga actgatgaag atgcttttaa ggttttacgg aggaggggtc 1080 atggggttgg gattctagtt tctaaaattc caaaagaaac tgatgcttcc tacactttgc 1140 aagatccaac agaggttggg cagtttttga ggcatttggt ggagtggaaa agaacgagtt 1200 cccaatacca caagttgtag attcttagat gaattcaggg aaattgacac cagcccataa 1260 tttggtcaag gggtggttcc aattatatcc cttttcttgt tcgaaatagg aaatagtgtg 1320 ttccataatt taaagtttta gggaggaaca aagttgaaat agctagctag gttctctctc 1380 tattttcttt ttctaatgta atctattcca tcacacgttt gcatgcgcat gcggatagtg 1440 aaagaattga tgttttatgc cgcaattgcg agtggcgcgt caaccttctt gctctgaatt 1500 gtacttgtcg tacgtgtgga caatgtggta ttgaaaatga aaatcaccaa caacttcaac 1560 ttcaaaaggt gatttagacc aaaaagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1604 <210> 5

<211> 1105

<212> DNA

<213> Glycine max

<4 00> 5

actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtaaag aaaactcgct gattaatgca 60 taaagagatt aattttctat tttatttttc acaaacataa tttttcaaaa gcaagttgta 120 tttgaagcac ctcagaaata ttaaatgtta gagattcaat ctttgaattt ctaataagag 180 agggggttaa ctacatattt agtgtttgat agtaatttga gaaaaatata tttagttttg 240 atagcactta aaaaacccct agaagaaata agaagaaaga aacagacact tttcttaaca 300 aatatttgaa tcttaattta ctattttttt attaaaaaaa ttactatatc atggtaaagt 360 aaccataaac taactcttct attactcaat agtgttggtc acagagtaat atatccttaa 420 aaccattctt tacttttatt caaaaaaata ataatcctaa aagcaaggtg ctattaaact 480 taatagaata tgataaagca agttagtggc aaaatggtca tgaaacaaaa ttatcagtaa 540 aagttcctca ttattgtgaa aactcctact cctcaaagaa aagaagaaga aaaaaaaaac 600 cttggaaaag gaggtttctg agcgattact atgtggtccc tcctactttc ttatttagta 660 tagttgccga aaagaggtga taatttcgtc ggtttatgcc cgtgtaaccg aagtttataa 720 attgaccaca cacacacacc ctcgcttctt atacgtgact tgaacccacc aacgagtaga 780 aaacgagtcc attttttatt tccttttttt ttctttattc aaaccctttt ttctccccta 840 taaattccac gttgagcaaa ggaagcatcc atccaaatac acccataacc atccctctct 900 gttctcttct ctgccttctc tgtgtataac cccgtgaccc ttcttctcat ttctcattct 960 cttttctttc tcacaagagt tattgttatt attgttataa ctattgttac tattactaaa 1020 cttggtgtag aatgacgaac cgtaatgtga ataacaccct tgtggagttg gcaatgtcga 1080 tttcaaacac aagtgctcta cctag 1105

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<4 00> 6

cccggggtag tgcccttcat ggatac 26

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<4 00> 7

ggcgcgccta ggggcttagg aaaaaaaaga aagag 35

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<400> 8

cccgggggac aacattgtta agaggag 27

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<400> 9

ggcgcgccta tctgtggttt ttccacgac 29

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<4 00> 10

caaggccatt attccaggca ccgtagctc

29 <210> 11 <211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> seqüência iniciadora

<4 00> 11

ctaggtagag cacttgtgtt tgaaatcgac

<210> 12

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<400> 12

gtaatacgac tcactatagg gc

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<400> 13

actatagggc acgcgtggt

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<4 00> 14

ccttactata gggcacg

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora

<4 00> 15

ggcgcgcctc tacaccaagt ttagtaatag

<210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora <4 00> 16

gcatctgcag cacatgtcaa cttgtaaac 29

<210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> seqüência <400> 17 gcatctgcag gatacaaggt tttgctc 27

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência iniciadora <400> 18

gcttgacgtc taggggctta gg 22

<210> 19

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência consenso de motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n é a, c, g, ou t

<4 00> 19

rtnggtttak k 11

<210> 20

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220> <221> misc__f eature

<222> (15).. (15)

<223> η é a, c, g, ou t

<4 00> 20 wamatgatta ktywn

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(6)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (22).. (22)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 21

ntannngwwk nttatawatt gnycn

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc feature <222> (22) . . (22)

<223> η é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (25) .. (25)

<223> n é a, c, g, ou t

<4 00> 22

wcwyatwtag tmtantwkym knamn

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n é a, c, g, ou t

<4 00> 23

ttnwytttct camammwaw

<210> 24

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (11) . . (11)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (14) . . (14)

<223> n é a, c, g, ou t <220>

<221> misc_feature

<222> (21).. (21)

<223> η é a, c, g, ou t

<4 00> 24

nwtntnctct nttntwywtt n

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1) .. (1)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (12).. (12)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17).. (17)

<223> n é a, c, g, ou t

<4 00> 25

nakwtsacrt gnmtran

<210> 26

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência motivo promotora definida usando código ambíguo IUPAC

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (17) . . (17)

<223> n é a, c, g, ou t

<220>

<221> misc_feature

<222> (21)..(21)

<223> n é a, c, g, ou t

<400> 26

narwtrktgk caaawwnktm n

21

Claims

1. Promotor, caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo isolado capaz de mediar expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno, referido polinucleotídeo sendo selecionado dentre o grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 1, 2, ou 3; b) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l; c) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 ou nucleotídeos 1460 a 2110 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2; d) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3; e) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); f) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); g) um polinucleotídeo compreendendo uma porção biologicamente ativa de qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); h) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 1, 2, ou 3; i) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 1, em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo em cerca de 215 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN16 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 19 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo; j) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 2, em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo, em que o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN7, o elemento de classe USSCN6 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe PSOPAQ, e o elemento de classe U$SCN7 está em cerca de 400 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN6; e k) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 3, em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN14 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:26 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo, em que o elemento de classe U$SCN14 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN2, o elemento de classe U$SCN13 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN14, o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN13, o elemento de classe USSCN30 está em cerca de 200 nucleotídeos do segundo elemento de classe P$OPAQ, e o elemento de classe U$SCN2 está em cerca de 800 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN30.

2. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l.

3. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado tem pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907 de SEQ ID NO:l, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1498 a 1999 de SEQ ID NO: 1, e um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1349 a 1999 de SEQ ID NO: 1.

4. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende nucleotídeos 1650 a 2000 ou nucleotídeos 1460 a 2110 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2.

5. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado tem pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 de SEQ ID NO:2, e um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1460 a 2110 de SEQ ID NO:2.

6. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3.

7. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado tem pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 de SEQ ID NO:3, e um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 350 a 1000 de SEQ ID NO:3.

8. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o patógeno é um nematódeo.

9. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende Configuração de Promotor 1, e em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 20 no filamento positivo em cerca de 215 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN16 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 19 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 21 no filamento positivo, e um elemento de classe U$SCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 23 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo.

10. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende Configuração de Promotor 2, e em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 21 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 25 no filamento positivo, e um elemento de classe USSCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 23 no filamento positivo, em que o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN7, o elemento de classe U$SCN6 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe P$OPAQ, e o elemento de classe U$SCN7 está em cerca de 400 nucleotídeos do elemento de classe USSCN6.

11. Promotor de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo compreende Configuração de Promotor 3, e em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN14 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 26 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 22 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 25 no filamento positivo, e um elemento de classe USSCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 24 no filamento positivo, em que o elemento de classe USSCN14 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe USSCN2, o elemento de classe USSCNl 3 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe USSCNl 4, o elemento de classe PSOPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe USSCNl3, o elemento de classe USSCN30 está em cerca de 200 nucleotídeos do segundo elemento de classe PSOPAQ, e o elemento de classe USSCN2 está em cerca de 800 nucleotídeos do elemento de classe USSCN30.

12. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de compreender o promotor como definido na reivindicação 1.

13. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ainda compreender um segundo polinucleotídeo operativamente ligado ao promotor.

14. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que referido segundo polinucleotídeo confere a uma planta um traço ou propriedade selecionado dentre o grupo consistindo de rendimento, resistência aumentada sob condições de estresse, qualidade nutricional aumentada, resistência aumentada a patógenos, teor de proteína ou óleo aumentado ou modificado de uma planta.

15. Planta transgênica, caracterizada pelo fato de ser transformada com um cassete de expressão compreendendo um polinucleotídeo promotor isolado capaz de mediar expressão preferida pela raiz ou indutível pelo patógeno, referido polinucleotídeo promotor sendo selecionado dentre o grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQID NO:l, 2, ou 3; b) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907, ou nucleotídeos 1498 a 1999, ou nucleotídeos 1349 a 1999 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQID NO:l; c) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 ou nucleotídeos 1460 a 2110 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2; d) um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 ou nucleotídeos 350 a 1000 de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3; e) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); f) um polinucleotídeo hibridizando sob condições estringentes para qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); g) um polinucleotídeo compreendendo uma porção biologicamente ativa de qualquer um dos polinucleotídeos de a) até d); h) um polinucleotídeo compreendendo um fragmento de pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 100 nucleotídeos consecutivos, ou pelo menos 200 nucleotídeos consecutivos de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, 2, i) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 1, em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, um elemento de classe USSCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo em cerca de 215 nucleotídeos de um elemento de classe U$SCN16 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO: 19 no filamento positivo, um elemento de classe USSCNl 3 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe USSCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, e um elemento de classe USSCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo em cerca de 80 nucleotídeos de um elemento de classe USSCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo; j) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 2, em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe USSCN7 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:21 no filamento positivo, um elemento de classe PSOPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe USSCN6 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:23 no filamento positivo, em que o elemento de classe PSOPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe USSCN7, o elemento de classe USSCN6 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe PSOPAQ, e o elemento de classe USSCN7 está em cerca de 400 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN6;e k) um polinucleotídeo compreendendo Configuração de Promotor 3, em que o polinucleotídeo tem um filamento positivo e um filamento negativo e compreende, em combinação e na ordem 5' a 3', um elemento de classe U$SCN2 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID N0:20 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN14 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:26 no filamento positivo, um elemento de classe U$SCN13 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:22 no filamento positivo, um elemento de classe P$OPAQ compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:25 no filamento positivo, e um elemento de classe USSCN30 compreendendo um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:24 no filamento positivo, em que o elemento de classe U$SCN14 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN2, o elemento de classe U$SCN13 está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN14, o elemento de classe P$OPAQ está em cerca de 200 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN13, o elemento de classe U$SCN30 está em cerca de 200 nucleotídeos do segundo elemento de classe PSOPAQ, e o elemento de classe U$SCN2 está em cerca de 800 nucleotídeos do elemento de classe U$SCN30.

16. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão ainda compreende um segundo polinucleotídeo operativamente ligado ao polinucleotídeo de promotor.

17. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada dentre o grupo consistindo de milho, trigo, cevada, sorgo, centeio triticale, arroz, cana de açúcar, árvores cítricas, abacaxi, coco, banana, café, chá, tabaco, girassol, ervilha, alfafa, soja, cenoura, aipo, tomate, batata, algodão, tabaco, berinjela, pimenta, eolza de semente oleígena, canola, beterraba, repolho, couve-flor, brócolis, alface, Lotus sp., Medicago truncatula, gramínea perene, erva- castelhana, e Arabidopsis thaliana.

18. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo promotor tem pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:l, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1557 a 1907 de SEQ ID NO:l, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1498 a 1999 de SEQ ID NO:l, e um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1349 a 1999 de SEQ ID NO:l.

19. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo promotor tem pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:2, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1650 a 2000 de SEQ ID NO:2, e um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 1460 a 2110 de SEQ ID NO:2.

20. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo promotor tem pelo menos 70% de identidade de seqüência para um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo consistindo de um polinucleotídeo tendo uma seqüência como especificada em SEQ ID NO:3, um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 491 a 841 de SEQ ID NO:3, e um polinucleotídeo compreendendo nucleotídeos 350 a 1000 de SEQ ID NO:3.

21. Método para produzir uma planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) preparar uma construção compreendendo o promotor como definido na reivindicação 1 operativamente ligado a um ou mais polinucleotídeos; b) transformar uma célula de planta com a construção de a) em que o promotor induz transcrição preferida pela raiz ou induz transcrição do segundo polinucleotídeo operativamente ligado na célula de planta em resposta a um estímulo de patógeno; e c) regenerar a célula de planta transformada para produzir uma planta transgênica tendo resistência a patógeno ou resistência a patógeno melhorada.

22. Método acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo operativamente ligado confere a uma planta um traço ou propriedade selecionado dentre o grupo consistindo de rendimento, resistência aumentada sob condições de estresse, qualidade nutricional aumentada, resistência aumentada a patógenos, teor de proteína ou óleo aumentado ou modificado de uma planta.

23. Método para conferir ou melhorar a resistência a patógeno em uma planta, caracterizado pelo fato de compreender a) preparar um cassete de expressão como definido na reivindicação 13 compreendendo um primeiro ácido nucleico que está em complementação anti-sentido para um segundo ácido nucleico tendo a seqüência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1; b) transformar uma célula de planta com a construção de a) em que a primeira seqüência de nucleotídeo rompe ou regula de modo negativo a função regulatória da segunda seqüência de ácido nucleico; e c) regenerar a célula de planta transformada para produzir uma planta transgênica tendo resistência a patógeno ou resistência a patógeno melhorada.