CN103275999B - 一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶、其编码序列、载体、菌株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列。本发明还公开了一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶，用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌，所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽膜结合型海藻糖酶中的应用及绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的制备方法。本发明制得的酶蛋白分子量为60KD，最佳pH值为7.0，最佳温度为50℃，可降解海藻糖成为葡萄糖。纯化出的海藻糖酶可以用于工业及其它一些领域海藻糖含量的定性及定量工作，同时可为昆虫海藻糖酶抑制剂的研发提供基础。

Description

一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶、其编码序列、载体、菌株及应用

技术领域

本发明涉及农业科学技术领域，具体涉及一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶、其编码序列、载体、菌株及应用。

背景技术

绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera:Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树、牧草等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于转Bt基因棉的大面积种植和农业产业结构的调整等原因，绿盲蝽种群数量急剧上升，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。

绿盲蝽膜结合型海藻糖酶(membrane-bound trehalase，ALTre-2)是其体内的重要酶系，它是一种跨膜蛋白，主要水解食物中的海藻糖，在飞行、肌肉运动和取食阶段中肠等生理活动中发挥作用，同时ALTre-2也影响昆虫中肠几丁质的合成，因此，膜结合型海藻糖酶已成为害虫控制的重要靶标。

运用昆虫海藻糖酶抑制剂防治昆虫是一种害虫防控新兴方法，然而目前从体外获得的重组海藻糖酶十分缺乏，同时对于绿盲蝽膜结合型海藻糖酶，国内外未见相关研究。因此分离纯化绿盲蝽膜结合型海藻糖酶，研究其生化特征，这对于进一步开发其抑制剂有着重要的理论意义和指导作用。

发明内容

发明目的：本发明的第一个目的是提供一种用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列，如SEQ ID NO：1所示。

本发明的另一个目的在于提供一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

本发明的又一个目的是提供用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

本发明的又一个目的是提供所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽膜结合型海藻糖酶中的应用。

本发明的又一目的是提供一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的制备方法。

技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供一种用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

含有所述的用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌。

所述的重组表达载体，将所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的重组表达载体。

所述的重组表达载体，所述大肠杆菌表达载体为PET28a。

所述的转基因重组菌，所述重组菌是将所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。

所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。

所述的DNA序列、所述的重组表达载体、转基因细胞系统或转基因重组菌在生产绿盲蝽膜结合型海藻糖酶中的应用。

一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的制备方法，是培养所述的转基因重组菌得到的绿盲蝽膜结合型海藻糖酶。

一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶（ALTre-2）的制备方法，包括以下步骤：

1、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因的扩增；

2、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因原核表达载体构建；

3、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶蛋白的变性和复性；

4、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶蛋白的纯化即得到绿盲蝽膜结合型海藻糖酶。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

1．本发明的绿盲蝽膜结合型海藻糖酶由519个氨基酸组成，是目前报道分子量较小的海藻糖分解酶，小分子的酶蛋白可具有更高的比活，比大分子量的酶更加容易实现工程菌的高效表达，容易降低酶的生产成本。本发明制得的酶蛋白分子量为60KD，最佳pH值为7.0，最佳温度为50℃，可降解海藻糖成为葡萄糖。纯化出的海藻糖酶可以用于工业及其它一些领域海藻糖含量的定性及定量工作，同时可为昆虫海藻糖酶抑制剂的研发提供基础。

2．本发明的绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的适合反应温度范围广，在25～60℃都能保持较高的酶活力，在工艺中可以通过降低反应温度来提高海藻糖的分解率，也可以通过提高反应温度来加快反应速度。

附图说明

图1绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因全长序列的PCR扩增电泳图。泳道1：为2000bp的DNA maker，泳道2：绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因

图2NdeI和XhoI双酶切T载体的电泳图。泳道1：A4101表示的是该绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的基因片段，泳道2：为10000bp的DNA maker。

图3pET28a-ALTre-2诱导表达的SDS-PAGE分析电泳图。

图4不同咪唑浓度梯度下pET28a-ALTre-2重组表达产物纯化分析电泳图。

图5复性的ALTre-2IEF银染检测电泳图。

图6纯化的ALTre-2IEF银染检测电泳图。

图7pH对ALTre-2酶活的影响曲线图。

图8温度对ALTre-2酶活的影响曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1：ALTre-2基因的获得

采用TRIzol法提取绿盲蝽总RNA，选择电泳图谱良好并且OD260/OD280值在1.8～2.0之间的总RNA样品合并进行mRNA的纯化，反转录合成第一链cDNA，PCR反应体系为：0.5μg总RNA，0.5μl Oligo-dT18，2μl5×反应缓冲液，2μl10mM dNTP，40U RNasin，200U SuperscriptⅡ，加ddH₂O至10μl；PCR反应参数为：42℃30min，75℃30min，4℃5min。根据已知昆虫膜结合型海藻糖酶基因的保守序列设计适用于PCR扩增引物ALTre-2-F(5′-GAGTTCTACTACTGGGATTC-3′)及ALTre-2-R(5′-GCGTTGGGATAGTCCCATTG-3′)，获得绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因保守序列，该保守序列参见序列表中的SEQ ID NO：3，PCR反应体系为：2.5μl10×反应缓冲液，2μl25mMMg²⁺，2μl10mM dNTP，0.5μl Taq plus DNA聚合酶，1μl10μM上游引物ALTre-2-F，1μl10μM下游引物ALTre-2-R，cDNA模板1μl，加ddH₂O至25μl；PCR反应参数为：94℃5min；94℃30s，55℃50s，72℃90s，35个循环；72℃继续延伸10min；在根据获得的ALTre-2基因的保守序列设计适用于RACE方法的扩增引物，ALTre-2-5′-R1(5′-TCATTGGTCGCTTGGATGTAAGAG-3′)和ALTre-2-5′-R2(5′-TCCAGGGTGCCGATATGCCTGTC-3′)，ALTre-2-3′-F1(5′-ACTGGCGGCTGAATGGTTGGAAG-3′)，ALTre-2-3′-F2(5′-CTAATTTGGCACCTTTGTGGACG-3′)，扩增方法具体参见宝生物大连有限公司的cDNA末端的快速扩增(RACE)试剂盒的方法进行扩增，PCR反应参数为：94℃30s，70℃180s，5个循环；94℃30s，70℃30s，72℃180s，5个循环；94℃30s，68℃30s，72℃180s，72℃继续延伸5min。电泳结果显示PCR扩增分别得到与预期大小1560bp相符的条带（图1）。将PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离和胶回收纯化目的DNA，与pGEM-TEasy载体进行连接，转入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落培养，经菌落PCR鉴定为阳性的菌液及序列测定正确的进行下一步载体构建。

结论：ALTre-2基因ORF框包含1560个碱基，编码519个氨基酸。

实施例2：ALTre-2基因原核表达载体的构建

ALTre-2基因原核表达载体构建方法：含有ALTre-2基因T载体的原核表达载体构建方法为：将上述测序连入pGEM-TEasy载体及pET28a均用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，进行大片段连接（图2）。酶切体系为：2种限制性内切酶各1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，带有合适酶切位点的基因片段10.0μl，用ddH₂O补足至20μl，37℃水浴3h。连接体系为：酶切回收后的载体5.0μl，基因片段10.0μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×Buffer缓冲液2.0μl，用ddH₂O补足至20μl，16℃反应12～16h。连接产物转化大肠杆菌TOP10后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒pET28a-ALTre-2转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后涂布到含卡那霉素（50μg/mL）的平板上，37℃，250r/min培养过夜；次日在转化后的平板上挑选单克隆到LB培养基（含50ug/ml卡那霉素、10mL）中，37℃，250r/min培养过夜；次日将菌液按1%的比例接种到LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素）中，37℃摇床中培养2～3h，在菌液的OD600达到0.6～0.8之间时，降低培养温度到25℃，继续培养15分钟后，取0.5mL菌液做诱导前对照样品，其余培养液中在不同温度条件下进行目的蛋白的表达（18℃，0.2mM IPTG，过夜培养；25℃，0.2mM IPTG，过夜培养；37℃，0.2mM IPTG，培养5h）。离心少量菌体，分别取上清和沉淀，加适量TE溶液（pH8.0），震荡悬浮后加入等体积的2×SDS缓冲液，100℃5min，12%SDS-PAGE电泳检测重组ALTre-2蛋白的表达情况（图3）。

结论：经37℃，0.2mM IPTG诱导5h后ALTre-2基因可在pET28a载体中进行高效表达，主要以包涵体形式存在。

实施例3：ALTre-2融合蛋白变性和复性及蛋白的纯化

按下述步骤进行包涵体蛋白的变性：4000g、4℃离心15min弃上清，PBS缓冲液洗涤菌体2次后，PBS缓冲液重悬，高压破细胞，12000g、4℃离心30min，保留沉淀包涵体，加入60mL结合缓冲液（6M盐酸胍、100mM Tris、300mM NaCl、pH8.0），重悬包涵体，搅拌溶解，16000g、4℃离心30min，保留上清；在分别加入以下缓冲液进行洗脱（缓冲液A：6M盐酸胍、100mM Tris、300mM NaCl、pH8.0；缓冲液B:8M尿素、100mMTris、300mM NaCl、pH8.0；缓冲液C:8M尿素、100mM Tris、300mM NaCl、不同浓度咪唑、pH8.0）；然后用10倍于柱床体积的Binding buffer（20mM pH7.9的Tris-HCl，10mM咪唑，0.5M NaCl）清洗平衡柱子，流速为60ml/h；再将上清上柱，流速为45ml/h，收集穿透液，用10倍于柱床体积的Binding buffer（20mM pH7.9的Tris-HCl，10mM咪唑，0.5M NaCl）清洗柱子，流速为60ml/h；最后用Eultion Buffer（pH=8.0的TE洗脱液）洗脱，流速为45ml/h，收集洗脱液（图4）。

选用下述复性液进行包涵体蛋白的复性：55mM Tris、50mM NaCl、0.88mM KCl、0.77M尿素、0.44M精氨酸、0.05%PEG4000、2mM GSH、0.4m氧化型谷胱甘肽（MGSSG）。样品加入0.3%十二烷基肌胺酸钠（SKL）透析复性缓冲液，逐步去除变性剂，最终透析于PBS pH7.4，离心取上清检测（图5）。

结论：用含8M尿素、20mM咪唑的包涵体洗脱液洗脱包涵体，再用含0.77M尿素、0.44M精氨酸进行复性后，可成功获得ALTre-2蛋白，大小约为60KD。

蛋白纯化方法：将复性得到的蛋白经超滤浓缩后，溶解于PBS缓冲液（pH7.4）中，用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度（图6）。

结论：该蛋白浓度为1.1mg/mL。

实施例4：ALTre-2活性检测及最佳pH和温度的测定

ALTre-2活性检测：以海藻糖为底物测定靶蛋白的酶活性，反应混合物总体积为2mL，包含0.4ml0.3mg/mL溶解在PBS缓冲液（pH7.4）中的纯化蛋白溶液，0.5ml40mmol/L海藻糖和1.1mL PBS缓冲液(pH8.0)。混合溶液在37℃孵育60min，沸水浴5min以终止反应，4℃，12000rpm/min离心10min，冰敷10min后待测。使用已糖激酶法测定待测溶液的葡萄糖生成量。靶蛋白酶活性以nmol(葡萄糖)·μg^-1(蛋白)·min^-1表示。

结论：ALTre-2具海藻糖酶活性，酶活性为84.747±3.299nmol·μg^-1·min^-1。

ALTre-2反应的最佳pH和温度测定：从pH3.0～9.0每隔1.0个pH设置一个梯度，分别测定pH对ALTre-2酶活的影响（表1，图7）；从5.0～95.0℃每隔10℃设置一个温度地图，分别测定温度对ALTre-2酶活的影响（表2，图8），测定方法如上述活性检测方法，其中对照-control是对蒸馏水进行酶活测定。

结论：ALTre-2最佳pH为7.0，最佳温度为50℃。

表1

表2

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。 

2.一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 

3.含有权利要求1所述的用于编码绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的DNA序列的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌。 

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，将权利要求1所述的DNA序列插入到大肠杆菌表达载体中得到的表达绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的重组表达载体。 

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述大肠杆菌表达载体为PET28a。 

6.一种转基因重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4或5所述的重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选得到转基因重组菌。 

7.根据权利要求6所述的转基因重组菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为BL21（DE3）。 

8.权利要求1所述的DNA序列、权利要求3所述的重组表达载体、转基因细胞系或转基因重组菌在生产绿盲蝽膜结合型海藻糖酶中的应用。 

9.一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的制备方法，是培养权利要求3或6所述的转基因重组菌得到的绿盲蝽膜结合型海藻糖酶。 

10.一种绿盲蝽膜结合型海藻糖酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 

1）、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因的扩增，所述绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：1所示； 

2）、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶基因原核表达载体构建； 

3）、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶蛋白的变性和复性； 

4）、绿盲蝽膜结合型海藻糖酶蛋白的纯化即得到绿盲蝽膜结合型海藻糖酶。