CN105612256A - 针对丛根病的抗性基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种编码多肽的新核酸分子，所述多肽可以在植物中，特别是在表达该多肽的甜菜属植物中，赋予对病原体(尤其是“甜菜坏死黄脉病毒”(BNYVV))的抗性，并且也提供编码Beta？maritima的RZ-3基因的优选核酸分子，以及它们的衍生物和同源物。本发明的另外的方面包括载体、转基因植物细胞、转基因植物、转基因植物和它们的制备方法，以及鉴定赋予抗性的核酸分子的方法。

Description

针对丛根病的抗性基因
发明领域
本发明涉及编码多肽的核酸分子，所述多肽可以在植物中，特别是在表达所述多肽的甜菜属植物中赋予(convey)对病原体(尤其是“甜菜坏死黄脉病毒”(BeetNecroticYellowVeinVirus，BNYVV))的抗性。本发明也涉及多肽，其可以在植物中赋予对病原体的抗性，尤其是在表达所述多肽的甜菜属植物中对BNYVV的抗性，且该多肽是由本发明中的核酸分子编码的。本发明还涉及包含该核酸分子或其部分的转基因植物、植物细胞、植物器官、植物组织、植物部分或植物的种子，以及涉及产生这种类型的转基因植物或植物细胞的方法。本发明也包括检测该赋予抗性的核酸分子的方法，以及筛选具有该赋予抗性的核酸分子的植物或植物细胞的方法。
发明背景
就利润而言，丛根病(Rhizomania)是世界范围内最严重的甜菜疾病，可能导致50％或者更多的收入损失。该疾病，同样被称为“疯根病(rootmadness)”，是由“甜菜坏死黄脉病毒”(BeetNecroticYellowVeinVirus，BNYVV)引起的，并由土传原生动物甜菜多粘菌(Polymyxabetae)传播。BNYVV感染表现出其在细根和次生根中增加的增殖，以及形成大大减少的根体，所述根体具有减少的糖含量。被感染的植物显示出减少的水摄取，因而对干旱胁迫更加敏感。当感染传播至整株植物，其导致叶脉变黄，坏死病斑，以及叶片上的黄色斑点。因为像其他病毒性疾病一样，治愈性地抗击这种疾病是不可能的，所以只能通过培育抗性品种来防止损害。目前在本质上被检测的三个主要的针对丛根病的基因是：RZ-1(也被称为“Holly”)、RZ-2和RZ-3。此外，文献中还描述了更多的丛根病抗性基因，不过这些重要性较小。目前，抗性基因RZ-1已经被掺入到大多数育种品系中(种子亲本和/或授粉亲本组分)。然而，人们发现，由RZ-1赋予的抗性在严重的感染区域或者有多种BNYVV致病型的区域是不足够的(例如Sohi&Maleki,2004)。为此，过去就有人提议将RZ-1与例如RZ-2或RZ-3联合使用。RZ-2和RZ-3起源于甜菜(Betavulgarissubsp.maritime)来源(WB42,WB41)，且遗传上定位于甜菜基因组中3号染色体上的相同的区域，而RZ-1同样定位在3号染色体上，但在RZ-2和RZ-3的南部。Scholten等人(1999)确定RZ主要基因RZ-1和RZ-2之间20-25cM的距离。Gidner等人(2005)发现了RZ-1和RZ-2之间5cM的更短距离，并且没有得出RZ-2和RZ-3定位在相同基因座的结论。Schmidlin等人(2008)通过感染的甜菜中的表达分析发现了差异诱导的基因，然而这些基因并不对应于RZ-2或RZ-3。在Larson等人(2008)的研究中，用MALDI-TOF-MS的方法在甜菜中检测到某些BNYVV诱导的蛋白，然而科学家们没有能鉴别到由RZ-1、RZ-2或RZ-3编码的蛋白。此外，该序列区域，尤其是在该抗性基因附近的序列区域是重复性的，其造成诊断标记的开发特别困难。直到现在，对于特定的丛根病抗性基因，高分辨率的标记图谱和已被证实的候选基因都不是公开可得的。另外，这些抗性基因的功能背景，即遗传学结构，之前还不完全清楚。
对于旨在抵消打破抗性的BNYVV分离株风险的抗丛根病可持续种植，有必要不断地鉴别新的抗性基因并且将这些基因整合到作物植物(如甜菜)的基因库中。
发明概述
本发明基于上述现有技术而开发，其中本发明的一个目的是提供可以在植物中赋予丛根病抗性的核酸分子和/或多肽。更进一步的目的是提供转基因丛根病抗性植物，以及产生其的方法。本发明的更进一步的目的是提供使用和开发分子标记的方法，其使得可以实现抗丛根病的有效种植和新的抗性植物品系的开发。
实现所述目标的本发明的实施方案是基于对来源于供体甜菜亚种maritime(Betavulgarissubsp.maritima)的一个基因的遗传学精细定位、鉴定、分离和表征，所述基因编码多肽或蛋白质，所述多肽或蛋白质可以在表达所述多肽的植物中赋予对病原体的抗性。
一些在本申请中用到的术语将首先在下文中被更详细地解释：
术语“大约”与核苷酸序列长度的说明相连的时候表示偏差在±200个碱基对，优选偏差±100个碱基对，且尤其优选偏差±50个碱基对。
“甜菜属植物”属于狐尾草家族(苋科(Amaranthaceae))。这些植物包括物种大果甜菜(Betamacrocarpa)、甜菜(Betavulgaris)、Betalomatogona、Betamacrorhiza、白花甜菜(Betacorolliflora)、三蕊甜菜(Betatrigyna)和Betanana的植物。物种Betavulgaris的植物特别是Betavulgarissubsp.maritima(Seemangold)或者Betavulgarissubsp.vulgaris的植物。这些包括，例如：Betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(狭义上的甜菜)、Betavulgarisssp.vulgarisvar.vulgaris(Mangold)、Betavulgarisssp.vulgarisvar.conditiva(甜菜根)、Betavulgarisssp.vulgarisvar.crassa/alba(饲用甜菜)。
术语“杂交”或“杂交技术”理解为单链核酸分子附着至以最大可能的程度互补的核酸链的过程，即形成碱基对。用于杂交的标准方法例如在Sambrook等人(2001)中描述。这优选地理解为意指核酸分子的碱基中至少60％，更优选地至少65％、70％、75％、80％或者85％，特别优选地90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％能够与以最大可能程度互补的核酸链形成碱基配对。这种退火的可能性依赖于杂交条件的严格性。术语“严格性”与杂交条件相关。当碱基配对障碍时给予高严格性；当碱基配对容易时给予低严格性。杂交条件的严格性依赖于例如盐浓度或离子强度或温度。通常，严格性可以随温度升高和/或盐含量降低而提高。“严格杂交条件”理解为指杂交主要仅发生在同源核酸分子之间时的条件。这里的术语“杂交条件”不仅涉及核酸实际附着期间的一般条件，也涉及后续洗涤期间的一般条件。严格杂交条件是，例如，主要仅那些具有至少70％，优选至少75％、至少80％、至少85％或者至少90％，特别优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的序列相同性的核酸分子杂交的条件。严格杂交条件例如是：在4xSSC中于65℃杂交，随后多次在0.1xSSC中于65℃洗涤，共约1小时。本文所用术语“严格杂交条件”也可以指：于68℃在0.25M的磷酸钠，pH7.2、7％SDS、1mMEDTA和1％BSA中杂交16小时，随后用2xSSC和0.1％SDS在68℃洗涤两次。杂交优选在严格条件下进行。
“分离的核酸分子”理解为指从其天然或者原始环境中析出(dissolve)的核酸分子。该术语也包括合成产生的核酸分子。“分离的多肽”理解为指从其自然或者原始环境中析出的多肽。该术语也包括合成的多肽。
“分子标记”是在植物群体中具有多态性的核酸。这样的标记因此能够检测和区分不同的等位基因状态(等位基因)。用于该目的的已知的分析方法为RFLP、AFLP、SNP、SSR或者KASP。术语“分子标记”涉及与基因组序列互补的或者至少以最大可能程度互补或者同源的核苷酸序列，例如用作探针或者引物的核酸。描述多态性的标记可以用已经确立的方法检测。这些方法包括，例如，基于PCR的序列特异扩增、检测“限制片段长度多态性”(RFLP)、借助“等位基因特异性杂交”(ASH)检测多核苷酸多态性、检测扩增的植物基因组可变序列、检测“自主序列复制”、检测“简单序列重复”(SSR)，检测“单核苷酸多态性”(SNP)，或者检测“扩增片段长度多态性”(AFLP)。更进一步地，用于检测“表达序列标签”(EST)及衍生自EST序列的SSR标记和“随机扩增多态性DNA”(RAPD)的方法也是已知的。
“启动子”是指非翻译的调控DNA序列，通常在编码区域的上游，其包含RNA聚合酶的结合点并起始DNA的转录。
“病原体”是指与植物相互作用，在植物的一个或多个器官导致疾病症状的生物体。这些病原体包括，例如：动物、真菌、细菌或病毒生物体或卵菌(oomycetes)。
“病原体感染”理解为是指当病原体与宿主植物组织相互作用的最早的瞬间。以病毒病原体BNYVV实例为例，该病毒由原生动物甜菜多粘菌(Polymyxabetae)传播。多粘菌(Polymyxa)形成可以在地下存活数十年的孢子。所述病毒也在这些孢子中存活。当这些休眠的孢子萌发形成可移动的游动孢子时，病毒可以经由这些孢子穿入到植物宿主组织的细胞中并且可以在该处与宿主相互作用(Esser2000)。
植物“器官”，指的是例如叶、枝条轴、茎、根、下胚轴、营养芽、分生组织、胚、花药、胚珠或果实。植物“部分”是指一些植物器官的组合，例如花和种子，或者器官的一部分，例如茎的横切。植物“组织”是，例如，愈伤组织、贮藏组织、分生组织、叶组织、茎组织、根组织、植物肿瘤组织或生殖组织。植物“细胞”例如被理解为意指具有细胞壁的分离的细胞或它们的聚集体或者原生质体。
术语“抗性”应被广义地理解并涵盖从推迟疾病发展到完全抑制疾病发展的保护范围。重要的病原体的一个实例是甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)。本发明的抗性植物细胞或者本发明的抗性植物优选地实现对BNYVV的抗性。对病原体的抗性应等同于对该病原体引起的疾病的抗性，例如对BNYVV的抗性和对丛根病的抗性。
本文的“转基因植物”是指这样的植物，其基因组中已经整合了至少一个核酸。本文中所述至少一个核酸可以是异源核酸。所述核酸优选以稳定的方式整合，就是说所整合的核酸以稳定的方式被维持在所述植物中，能够被表达，并且也能够以稳定的方式传递至后代。
本发明公开了核酸分子，其包括多肽，所述多肽能够在表达该多肽的植物中赋予对病原体的抗性。所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
a)编码具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
b)包含SEQIDNO:1的DNA序列的编码序列的核苷酸序列；
c)与a)或b)的核苷酸序列的互补序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；
d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽通过a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而衍生自a)或b)的核苷酸序列编码的多肽；
e)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列；
f)核苷酸序列，其编码至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置168-227或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置182-241的核苷酸结合结构域(NBS)，至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置591-613或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置605-627的富含亮氨酸结构域(LRR)，和/或至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置1013-1072或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置1027-1086的内部重复结构域(IR)。
所述核酸分子可以是分离的核酸分子。其优选是DNA，且尤其优选是cDNA(编码DNA)。由本发明的核酸分子编码的多肽优选地赋予对引起植物丛根病的病毒性病原体“甜菜坏死黄脉病毒”(BNYVV)的抗性。此外，由本发明的核酸分子编码的多肽，尤其是在甜菜植物中，赋予对病原体的抗性。所述植物优选是甜菜(Betavulgaris)物种的植物，尤其优选是亚种Betavulgarissubsp.maritime或者Betavulgarissubsp.vulgaris的植物；这些包括，例如由糖用甜菜、甜菜根、饲料甜菜、叶甜菜、瑞士甜菜等组成的作物类型。
在本发明的核酸分子的一个实施方式中，所述核酸分子包含a)的核苷酸序列。所编码多肽的SEQIDNO:2的氨基酸序列和/或所编码多肽的SEQIDNO:3的氨基酸序列构成RZ-3基因的抗性蛋白。本文中，这是NBS-LRR类型的抗性基因蛋白，其由特定的结构基序表征。植物中这种抗性蛋白的一般结构已经被很好地研究过(Martinetal.2003)。然而，特别是被称为LRR结构域(对大多数未知的致病效应物而言是潜在的识别结构域)的结构形成的原理还不能被预测。因此，不可能纯粹基于已知结构基序鉴定BNYVV抗性赋予基因或蛋白。在图位克隆过程中鉴定RZ-3抗性基因，该过程需要对RZ-3抗性基因最初被怀疑的靶区域进行密集的遗传作图和精细定位。开发工作将在下面更详细地描述。
鉴定出的抗性蛋白属于NBS-LRR类型，并且具有对应于SEQIDNO:2氨基酸位置168-227或者SEQIDNO:3氨基酸位置182-241的核苷酸结合结构域(NBS，也被称为NB-ARC)(APAF-1、R蛋白和CED-4共享的核苷酸结合接头)，对应于SEQIDNO:2氨基酸位置591-613或者SEQIDNO:3氨基酸位置605-627的富含亮氨酸结构域(LRR)，和/或至少一个对应于SEQIDNO:2氨基酸位置1013-1072或者SEQIDNO:3氨基酸位置1027-1086的内部重复结构域(IR)。所述NBS结构域由SEQIDNO:1的核苷酸2019-2882编码，所述LRR结构域由SEQIDNO:1的核苷酸3288-3356编码，所述IR结构域由SEQIDNO:1的核苷酸4554-4871编码。NB-ARC结构域是中央核苷酸结合结构域。它很可能是功能性ATP酶结构域，预期其调控抗性蛋白的活性。NB-ARC结构域由三个亚结构域组成：NB、ARC1和ARC2。NB-ARC结构域的特征基序是被认为负责超敏反应的APAF-1(凋亡蛋白酶-激活因子-1)、hhGRExE、Walker-A-或P-环、Walker-B、GxP、RNBS-A至D和MHD(Ooijenetal.,2008)。所述的基序的一些可能已经被鉴定。在本发明的核酸分子的另一实施方式中，所述核酸分子包含b)中所述核苷酸序列。所述核苷酸序列包括SEQIDNO:1的DNA序列的编码序列，其编码SEQIDNO:2和3的氨基酸序列。
在所述核酸分子的另一实施方式中，所述核酸分子包含d)的核苷酸序列。该核苷酸序列编码多肽，其是a)或者b)的核苷酸序列编码的多肽的衍生物。所述多肽的衍生物包含衍生的氨基酸序列，其具有至少一个一或多个氨基酸的取代、缺失或添加，其中所编码的多肽/蛋白的功能性被保留。如果一氨基酸被取代成另一具有相同或相似的物理化学性质的氨基酸，指的是“保守交换”或者“半保守交换”。氨基酸的物理化学性质是例如疏水性或者电荷。本领域技术人员知晓何种氨基酸取代构成保守或半保守交换。本领域的公知常识进一步使本领域技术人员可以识别、鉴定和检测对于抗性蛋白RZ-3的功能性有害的氨基酸缺失和添加，以及这些的可能位置。本领域技术人员知晓，在对本发明的NBS-LRR蛋白的氨基酸序列的修饰(取代、缺失或添加一个或多个氨基酸)中，上述定义的保守的结构域的功能尤其必须得到保留，因此只有有限的上述类型的修饰可能在这些结构域中进行。当所述核苷酸序列与a)或者b)中描述的核苷酸序列同源或者有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％相同性时，该实施方式的核苷酸序列编码衍生物或者衍生的氨基酸序列。这种编码衍生物或者衍生的氨基酸序列的核苷酸序列，优选可以从对应于SEQIDNO:1或者本文公开的其他序列的全部长度或者至少部分的起始核苷酸序列直接地或者间接地产生(例如通过扩增或者复制步骤)。
在本发明的核酸分子的另一实施方式中，所述核酸分子包含e)的核苷酸序列。该核苷酸序列编码多肽，其具有与a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、97％、98％、99％相同的氨基酸序列。
在本发明的核酸分子的另一实施方式中，所述核酸分子包含f)的核苷酸序列。此处的核苷酸序列编码至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置168-227或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置182-241的核苷酸结合结构域(NBS)，至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置591-613或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置605-627的富含亮氨酸结构域(LRR)，和/或至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置1013-1072或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置1027-1086的内部重复结构域(IR)。所述核苷酸序列优选编码这样的多肽，其包含至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置168-227或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置182-241的核苷酸结合结构域(NBS)，至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置591-613或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置605-627的富含亮氨酸结构域(LRR)，和至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置1013-1072或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置1027-1086的内部重复结构域(IR)。这些结构域特别优选地在所述多肽中从N端到C端序贯地以NBS-LRR-IR的顺序排列，其中每一种情况里结构域之间可能存在一个或多个氨基酸。
本发明也涉及多肽，其可以在表达该多肽的植物中赋予对病原体的抗性，且其由本发明的核酸分子编码，其中所述病原体优选是BNYVV和/或所述植物优选是甜菜属植物，特别是Betavulgaris物种的植物。所述多肽特别优选具有SEQIDNO:2或者SEQIDNO:3的氨基酸序列。所述多肽可以是分离的多肽。
本发明另一方面涉及包含本发明的核酸分子的载体。所述载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或者表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体，它可以是双链的或者单链的、线性的或者环状的、或者可以以整合入基因组或在染色体外的方式转化原核生物宿主或真核生物宿主。本发明的核酸分子优选在表达载体中与一或多个调控序列可操作地连接以允许在原核或者真核宿主细胞中的转录和任选的表达。举例来说，所述核酸分子在合适的启动子或者终止子的调控下。合适的启动子可以是组成型诱导的启动子(例如，“花椰菜花叶病毒”来源的35S启动子(Odelletal.1985))，且特别合适的是病原体诱导的启动子(例如，欧芹来源的PR1启动子(Rushtonetal.,1996))。特别合适的病原体诱导的启动子是合成的或是嵌合的，其并不天然存在，由若干元件形成，含有最小启动子以及在最小启动子上游还具有至少一个顺式调控元件作为特定转录因子的结合位点。嵌合启动子是根据需要设计的，并且由不同的因素诱导或抑制。这种启动子的例子可以在WO00/29592、WO2007/147395和WO2013/091612中找到。合适的终止子的例子如nos终止子(Depickeretal.,1982)。
除了以上描述的载体之外，本发明还提供一种将所描述的载体导入宿主细胞的方法。所述载体可以通过如接合、动员(mobilisation)、基因枪转化、农杆菌传递转化、转染、转导、真空渗透或电穿孔的方法导入。本领域技术人员熟悉这些方法以及制备描述的载体的方法(Sambrooketal.2001)。
本发明的另一方面涉及包含本发明的核酸分子或本发明的载体的宿主细胞。从本发明的意义上说，宿主细胞可以是原核细胞(例如细菌细胞)或者真核细胞(例如植物细胞或者酵母细胞)。宿主细胞优选是带有本发明的核酸分子或载体的农杆菌(如根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes))或植物细胞。本领域技术人员熟知如接合和电穿孔的许多方法，通过其本领域技术人员可以将本发明的核酸分子或者载体导入农杆菌；本领域技术人员也熟知各类的转化方法(基因枪转化、农杆菌介导的转化)，通过其本领域技术人员可以将本发明的核酸分子或者载体导入植物细胞(Sambrooketal.2001)。
本发明的另一方面涉及包含本发明的核酸分子作为转基因或者包含本发明的载体的转基因植物细胞。这种转基因植物细胞例如，用本发明的核酸分子或者本发明的载体转化(特别是以稳定的方式)的植物细胞。在所述转基因植物细胞的优选实施方式中，所述核酸分子与一或多个调控序列可操作地连接以允许在植物细胞中的转录和任选的表达。来自本发明的核酸分子的全部构建体以及所述调控序列然后构成所述转基因。这种调控序列例如是启动子或者终止子。本领域技术人员已知许多植物中可用的功能性启动子和终止子。本发明的转基因植物细胞，特别是甜菜属植物的细胞，与非转基因的植物细胞相比，优选显示出对病原体(特别是BNYVV)更强的抗性。对于例如BNYVV的抗性水平可以在甜菜属植物中以判断分数评级的方法定性地定义(甜菜属植物的分数评级体系由现有技术可知，例如针对糖用甜菜Mechelke(1997))。较高抗性是指抗性被改善至少一个、两个、三个或者更多的分数评级。此外，本发明也涉及产生本发明的转基因植物细胞的方法，包括将本发明的核酸分子或本发明的载体导入植物细胞的步骤。例如，导入可以通过转化，优选通过稳定转化进行。这些合适的导入技术，例如基因枪转化、农杆菌介导的转化或者电穿孔，是本领域的技术人员所熟知的(Sambrooketal.2001)。
在另一方面，本发明涉及包含上述转基因植物细胞的转基因植物或其部分。这里的部分可以是细胞、组织、器官或者若干细胞、组织或器官的组合。若干器官的组合，例如是，花或种子。在一具体实施方式中，本发明涉及来自所述转基因植物的种子，所述种子包含本发明的核酸分子作为转基因。本发明的转基因植物，特别是甜菜属的植物，与非转化的植物(不含所述转基因的植物)相比，优选地具有对病原体(尤其是BNYVV)更高的抗性。对于例如BNYVV的抗性水平可以在甜菜属植物中以确定分数评级(ratingscore)的方法定性地定义(甜菜属植物的分数评级体系由现有技术可知，例如糖用甜菜Mechelke(1997))。更高的抗性是指抗性被改善至少一个、两个、三个或者更多的分数评级。本发明也涉及产生本发明中的转基因植物的方法，包括将本发明的核酸分子或本发明的载体导入植物细胞的步骤，以及任选存在的选择转基因细胞的步骤。此外，这种产生转基因植物的方法特征为包括从第一步中产生的转基因细胞再生转基因植物的后续步骤。本领域技术人员从现有技术已知再生的方法。
在另一方面，本发明还涉及一种用于在植物尤其甜菜属植物中赋予或提高对病原体特别是BNYVV的抗性的方法，包括用本发明的核酸分子或本发明的载体转化植物细胞。这种方法导致抗性改善至少1个分数评级，优选抗性改善2个、3个或更多分数评级。对甜菜属植物的分数评级方案是已知的技术，例如对于糖用甜菜mechelke(1997)
在另一方面，本发明涉及一种控制包含本发明的核酸分子的基因表达的启动子调控序列，其特征在于所述调控序列能够由于病原体感染而赋予或调节外源DNA序列的表达，并且所述调控序列包括具有SEQIDNO:1核苷酸1-1403的核苷酸序列的核酸分子。所述外源DNA序列优选是这样的核苷酸序列，其编码植物病原体防御组件(如：抗病基因(R-基因)或编码参与信号转移的酶如激酶或磷酸酶和G-蛋白的基因)，或其编码致病效应子(已知为无毒基因(avr))。此外，本发明包括重组DNA，其包含上述调控序列。所述重组DNA分子优选可操作地与异源DNA序列连接。
本发明另一方面涉及用上面描述的调控序列或用所述特定重组DNA分子转化的宿主细胞，且涉及包含所述调控序列或重组DNA分子作为转基因的转基因植物、植物组织或植物细胞。本发明还提供了一种产生转基因植物细胞的方法，其包括导入本发明的调控序列或重组DNA分子的步骤，以及任选存在的选择转基因植物细胞的步骤。本发明还提供了一种产生转基因植物的方法，其包括将本发明的调控序列或重组DNA分子导入到植物细胞中的步骤，以及任选存在的选择转基因植物细胞的步骤。这样的用于产生转基因植物的方法进一步表征为随后的从第一步产生的转基因植物细胞再生转基因植物的步骤。
正如上面已经提到的，RZ-3抗性基因是在图位克隆法中被鉴定的。所执行的方法例如包含以下步骤：遗传精细定位，物理定位，构建超过8000个F2剪接(splicing)后代的非常大的剪接群，重组体筛选，在靶区域开发标记(marker)，在抗性和敏感基因型中的比较BAC测序，生物信息学分析，蛋白预测和蛋白的比较。这样的艰苦的工作是非常高成本的并且不知道它是否的确成功地鉴别出基因。在来自Betavulgarissubsp.maritima的RZ-3基因座整合于甜菜属的植物特别是Betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima之后，开发了用于在精细定位中追踪RZ-3基因组区段的具有良好诊断价值的标记，这证明是特别困难的，因为靶区域在广泛的范围是重复性的。然而，令人惊讶的是，有可能成功开发几个诊断标志物，其也只和某一特定标记技术(如焦磷酸序列，即作为PSQ标记)发挥功能，或其为零等位基因。
尽管存在这些技术困难，通过使用这些标记的综合分析，有可能将RZ-3基因座限定在0.67cM的基因组区域。这相当于约340000bp的物理长度。尽管进行了重点开发，也仅仅可能在有限的程度上以标记辅助的方式进一步减少Betavulgarissubsp.maritime围绕所述基因的渐渗(introgression)，并鉴定RZ-3基因的候选基因。然而，，从育种的角度看在任何情况下都期望进一步缩短渐渗以消除任何潜在的与RZ-3基因紧密偶联的“连锁累赘(linkagedrag)”。最后，通过许多步骤的精细定位并结合来自物理图谱的序列信息，靶区域可以被限制在仅大约0.07cM。然而，只是因为共进行了8004个检测这才有可能，其中包括信息性的重组BC2S1或BS2S2植物，其在每一种情况下用90-180个后代进行了深入的分析。这是必要的，因为由于未知原因，抗性的表达不总是清晰的。这些后代被基因分型为个体植物并且平行进行表型分型。通过统计学方法(t-检验、功效分析)，检测信息性重组体的表型(纯合子抗性–RR；杂合子抗性–Rs；纯合子易感–ss)，并因此得出关于信息性重组体的基因型的结论。
在约38000bp的相对较小的靶区域，易感基因型中十个基因可以被注释。借助具体描述靶区域的新的标记，针对该靶区域从抗性BAC文库鉴定了重叠克隆，并进行了测序。由于靶区域的重复性，易感基因型的序列显示出具有未知序列内容的多个小部分。为此，组装RR和ss序列特别费力。然而，有可能鉴定出假定的抗性基因。这包括(尤其在几乎所有的ss基因型中)，在LRR结构域和IR结构域之间长度约8000bp的反转录转座子，其不能在RR基因型检测到。从假定的抗性基因序列预测的氨基酸序列显示该基因可能编码NB-ARC-LRR蛋白。可以假定，该反转录转座子的插入破坏了易感ss基因型中该基因的功能，因为它将内部重复结构域(IR)与其他两个结构域(NB-ARC和LRR)分开。
从图1、2和3可以推断，ss基因型的NBS-LRR基因与RR基因型的NBS-LRR基因的比较也显示出诊断多态性。基于该NBS-LRR基因中的这些多态性，开发标记并在一大组约100个ss和RR基因型中测试。标记模式，以及在靶基因中的比较测序，确认该插入实际上总是与易感性偶联。然而，发现几个ss基因型没有反转录转座子的插入且仍易感。但是，借助描述图1、2和/或3的诊断多态性的标记，这些ss基因型可以明确地与RR基因型区分开。
在所分析的群体中，在靶区域鉴定到显示NBS-LRR基因与下游邻接的经注释假定基因(可能编码锚蛋白重复序列蛋白)之间的重组的重组体。在两株植物的实例中，可以发现在NBS-LRR基因与上游邻接的经注释的假定基因之间的重组，该上游邻接的经注释的假定基因编码DUF565蛋白(未知功能蛋白)。通过对全部这些重组植物的后代的抗性分析(去除NBS-LRR基因的上游和下游的单基因)，可以相当清楚地证明位于锚蛋白重复基因和DUF565基因之间的基因，具体而言本文表征的NBS-LLR基因，负责RR基因型的抗性。图4显示RZ-3靶区域的物理图谱以及所开发的标记。图5所示的是8个密集重组系的基因型数据及其后代的统计学分析。
在另一方面，本发明涉及一种用于鉴别编码蛋白的核酸分子的方法，所述蛋白能够在表达该蛋白的甜菜属植物中赋予对病原体BNYVV的抗性。该方法包括检测所述核酸分子的编码核苷酸序列中不存在插入。该方法优选地包括检测所述核酸分子的编码核苷酸序列中不存在插入特别是反转录转座子。所述反转录转座子可以长例如约500bp、约1000bp、约2000bp、约4000bp、约8000bp或超过约8000bp。在所述方法的一个具体实施方式中，所述核酸分子是本发明前述的核酸分子，并编码抗性赋予的RZ-3基因或RZ-3的功能同源物。所述甜菜属植物优选是Betavulgarissubsp.maritima或Betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(糖用甜菜)。本领域技术人员知晓何种方法适于检测不存在插入。举例来说，知晓本文公开的本发明的核酸分子的本领域技术人员，可以能够开发分子标记检测在NBS-LLR基因的上述区域中插入的存在或不存在(见实施例中的示例性方法)。本发明包括这样的标记和其用于检测插入的存在或不存在的用途，以选择抗性(尤其是BNYVV抗性)植物，尤其是Betavulgarissubsp.maritima或Betavulgarissubsp.vulgarisvar.altissima(糖用甜菜)。这样标记优选描述位于所述反转录转座子插入点处的基因座。插入点指的是所述插入的5’和/或3’侧上基因组DNA和反转录转座子之间的转换点。转换点应宽泛定义，标记基因座可以以插入点上游或下游小于1000个核苷酸，优选小于800或600个核苷酸，特别优选小于400、200、150、50、40、30、100、20或10个核苷酸的距离排列在DNA上。或者，或除了检测所述核酸分子的编码核苷酸序列中插入的存在或不存在的步骤之外，该方法还可以包括使用鉴别多态性(特别是诊断多态性)的分子标记，检测本发明所述核酸分子的编码核苷酸序列中至少一种根据图1、2和/或3的多态性，优选至少2种或3种根据图1、2和/或3的多态性，尤其优选至少4种、5种或更多种根据图1、2和/或3的多态性。优选地，每种多态性(尤其是每种诊断多态性)使用至少一种分子标记进行该检测。本领域技术人员知晓应当应用何种标记技术检测相应的多态性，以及如何构建用于此的分子标记(文献)。此外，本发明包括描述或检测根据图1、2和/或3的多态性的分子标记，以及分子标记用于检测根据图1、2和/或3多态性的用途。此外，上述鉴别方法也构成选择具有对BNYVV的抗性的植物的方法。所述选择方法包括选择抗性植株的终止步骤。
此外，也可能表明，在所检查的RR基因型中，存在RZ-3(SEQIDNO:1)上游并邻接的根据SEQIDNO:4的基因组DNA序列部分，以及在RZ-3(SEQIDNO:1)下游并邻接的根据SEQIDNO:5的基因组DNA序列部分，其与RZ-3基因紧密偶联，并因此非常适合用于开发RZ-3诊断标记的DNA区域。因此本发明涉及一种选择具有BNYVV抗性的植物的方法。所述选择方法包括使用SEQIDNO:4的DNA序列上和/或SEQIDNO:5的DNA序列上的分子标记，以及选择抗性植物的终止步骤。本领域技术人员知道如何基于所公开的序列开发和使用标记。
对于新的甜菜属抗性植物品系的培育和开发，通过本发明可以获得如下进一步的优势：
序列信息以及所鉴别的多态性，其允许区分所公开的基因的抗性RR和易感ss等位基因，使得可能直接在所述基因中开发标记，对于植物栽培者而言这构成了一个重要的便利条件，特别是对于开发没有“连锁累赘”的经优化的良种品系。此外，序列结构的知识可以用于鉴别另外的抗性基因，尤其是针对丛根病的抗性基因，其例如是部分同源的。
本发明公开的抗性基因等位基因在顺式-或反式-遗传学方法中的应用，开辟了开发新的甜菜属抗性物种的可能性，其基于剂量效应而具有更高的抗性，或其中由于所公开的基因与其他抗性基因叠加(stack)的结果，可以避免抗性中断并可以优化抗性的表达。也可以设想通过TILLING或选择性工程化修饰所述基因用于开发新的抗性等位基因。
本发明还涉及所鉴定的抗性RZ3基因等位基因在与其他遗传学元件的遗传叠加或分子叠加中的应用，其可以在植物中赋予农艺学有益的特性。因此，可以显著地增加作物植物的经济价值，例如，通过增加产量表现或开发新的植物种植区域，所述区域之前不能种植这些植物，尤其由于生物因素如严重病原体压力或非生物因素如干燥。农艺学有益的特性，例如，是耐受除草剂，如草甘膦、草铵膦或ALS抑制剂。许多另外的除草剂及其适用性是本领域技术人员从现有技术已知的。所述人员可以参考现有技术以获得知识要使用何种遗传元件以及以何种方式以在植物中实现相应的耐受性。农艺学有益的特性的另一个例子是额外的病原体抗性，其中病原体可以是，例如，昆虫、病毒、线虫、细菌或真菌。举例来说，通过组合不同的病原体抗性/耐受性，可以实现植物的广谱病原体防御，因为遗传学元件可能具有相互补充的作用。对于该目的，本领域技术人员已知例如许多抗性基因作为遗传学元件。农艺学有益的特性的另一实例是耐低温或霜冻。具有该特性的植物可以在一年较早地播种，或例如可以在田间保留更久，甚至是在霜冻期间，其例如可以导致增加收益。此处，本领域技术人也可以参考现有技术以找到合适的遗传学元件。农艺学有益的特性的另外的实例是水利用效率、氮利用效率和收获。在现有技术中可以发现能够用来赋予这样的特性的遗传学元件。
本领域技术人员也知道针对病原体防御的许多修饰。除了频繁描述的R基因家族，Avr/R方法、Avr基因互补(WO2013/127379)、R-基因自激活(WO2006/128444)、HIGS(寄主诱导的基因沉默)方法(例如WO2013/050024)或VIGS(病毒诱导的基因沉默)方法也可以有利地使用。特别是R基因自激活可能对本发明具有重大意义。出于该目的，创建编码自激活的抗性蛋白到的核酸，所述蛋白用于在植物中产生对病原体的抗性。该核酸然后只具有NBS-LRR抗性基因如RZ3基因的有限的一部分，其从所述NBS-LRR抗性基因的编码区的5’端向下游延伸至所述NBS-LRR抗性基因的NBS结构域的起点，其中所述NBS-LRR抗性基因不是TIR-NBS-LRR抗性基因。
此外，本发明还包括用上文所述方法鉴别的抗性RZ3基因等位基因的用途，其用于与能够在植物中赋予一或多种农艺学有益的特性的上述修饰之一或上述遗传学元件组合。
本发明的变体及实施方式将以示例性的方式参考所附的附图和序列进行描述：
序列：
SEQIDNO:1抗性基因RZ-3的基因组DNA序列。该序列包括启动子调控区的核苷酸1至1403
SEQIDNO:2抗性蛋白RZ-3_1预测的蛋白序列
SEQIDNO:3抗性蛋白RZ-3_2预测的蛋白序列
SEQIDNO:4RZ-3(SEQIDNO:1)上游邻接染色体区域
SEQIDNO:5RZ-3(SEQIDNO:1)下游邻接染色体区域
SEQIDNO:6ss基因型中RZ-3基因的基因组序列的共有序列
SEQIDNO:7载体pZFN-C48-RNAi中RNAi构建体的RZ3基因的靶序列。
附图：
图1A-I：ss基因型中RZ3基因(SEQIDNO:6)和RR基因型中RZ-3基因(SEQIDNO:1)的基因组序列的共有序列之间的核苷酸序列比较。诊断多态性用灰色和粗体表示。非诊断多态性用下划线表示。所述基因潜在的转录起始点用箭头表示。它们导致两种多肽变体RZ-3_1和RZ-3_2。上面的黑色的三角形表示反转录转座子的位置。
图2A-L：来自RR基因型的预测的多肽(RZ-3_1；SEQIDNO:2)与22个不同ss基因型的多肽之间的氨基酸序列比较。诊断多态性用灰色和粗体表示。非诊断多态性用下划线表示。
图3A-L：来自RR基因型的预测的多肽(RZ-3_2；SEQIDNO:3)与22个不同的ss基因型的多肽之间的氨基酸序列比较。诊断多态性用灰色和粗体表示。非诊断多态性用下划线表示。
图4：RZ-3靶区域的物理图谱。5个基因被注释在示出的敏感参考基因型的靶区域中：(“2”(DUF565)、“3”(假定蛋白)、“4”(NBS-LRR候选基因)、“5”(反转录转座子)和“6”(锚蛋白重复序列))。在敏感参考序列中，所述NBS-LRR候选基因(“4”)包含反转录转座子(“5”)。该反转录转座子在抗性序列完全缺失，因此只有4个基因仍可以注释在抗性基因型中(“2”、“3”、“4”和“6”)。最密集的重组位置(重组体：具有数字“7”的111T_3515/ZR11007_03075和具有数字“8”的111PB3645/ZR08093_05621)标识在顶部。借助其帮助，可以限制较短的靶区域“1”。出于该目的从重组分析开发的标记在图下部作为黑色短线再现。从作为靶序列的结构域区域“10”部分选择的基因区段(“9”)用于在RNAi方法中针对抗性RZ-3等位基因的基因剪接对所述基因进行验证。
图5：RZ-3靶区域最密集重组体的标记分析(粗体框区小字母为计算机产生的标记数据)。8个重组体品系用总共1051个后代进行表型分型和基因分型。基于NBS-LRR候选基因中的标记数据，或如果NBS-LRR候选基因是纯合子RR和ss，基于剪接侧翼区的标记数据，将后代分为3组(RR抗性纯合子，Rs杂合子，ss敏感纯合子)。此外，再现了相应的ELISA值。后代的剪接和非剪接通过T检验和Wilcoxon统计进行检查。在所述结果的基础上，候选基因可以很清楚地界定于标记s3e5800s01和s3e5873s01之间。
图6：转化载体pZFN-C48-RNAi：d35S启动子；C48s：C48序列有义方向；AtAAP6内含子2：拟南芥氨基酸通透酶6内含子；C48as：C48序列的反义方向；Nos-t：nos终止子；LB侧翼位点：左边界侧翼位点；ZFN位点：锌指核酸酶识别位点(互补)；Pnos：Nos启动子；NPT：编码序列；新霉素磷酸转移酶(npt)基因；pAG7：pAG7终止子；Bvpal3'UTR：甜菜(Betavulgaris)Pal基因的3’非翻译区；LB：左边界；aadA：编码序列；氨基糖苷-3″-腺苷酰转移酶(AAD)；pVS1-REP：pVS1复制原点；ColE1ori：ColE1的复制起点；RB：右边界。
实施例：
RZ-3基因/遗传物理图谱的定位和精细定位
在借助定位和精细定位的多个步骤中将RZ-3抗性(也称为C48抗性或C48)定位于3号染色体上的57.1和57.8cM之间(内部参考图谱)，即在遗传图谱中两侧标记之间0.0714cM的遗传距离。为定位检测了S504(敏感基因型)XT74(抗性基因型)杂交的共8004株植物。平行于C48QTL定位，在每个定位步骤之后以朝向靶的方式开发新的信息性标记并用于缩小C48靶区域。
额外地用信息性重组体的后代的分析确认精细定位坐标。为此目的对信息性重组体BC2S1或BC2S2植物进行深入分析，每种使用90-180个后代。对这些后代平行地基于个体植株进行基因分型和表型分型。用统计学方法(t检验、功效分析)，检测信息性重组体的表型(纯合子抗性RR/杂合子Rs/纯合子易感ss)，并因此可以得出针对信息性重组体基因型的结论。由于后代中的纯合子类别(RR和ss)在抗性方面不同，所述基因存在于亲本植物的杂合子区域(Rs)；否则其存在于亲本的纯合子区域(RR或ss)。
通过将标记和其遗传位置投影至染色体序列上生成丛根病敏感基因型的物理图谱。通过对C48QTL区域的限制，基于参考序列和额外的抗性基因型比较测序(下一代测序和Sanger测序)的基础上开发新的信息性标记。
通过精细定位鉴别的区域包含在敏感参考序列中的37996个碱基对的序列长度(侧翼SNP标记的位置)。在靶区域中的遗传和物理图谱之间的共线性是一致的(12个标记序列在靶区域中)。
抗性BAC克隆的鉴定和测序
针对选定的RZ-3(C48)抗性基因型开发BAC文库。该BAC库通过C48QTL区域中所使用的标记进行抽样。针对上述鉴定的靶区域发现若干BAC克隆。其中，选择检测出完整靶区域的3个不同长度的BAC克隆用来测序。将BAC克隆测序并基于所得序列读段(read)进行“从头”装配。在获得的抗性序列重叠群中，最大的序列长110909bp(34537个读段)并包含完整的靶区域。
敏感性和抗性序列的比较——序列评价
使用不同的软件工具对两种ss和RR序列的共线性进行比较。对抗性和敏感性序列两者，使用Maker和Pedant软件进行基因注释。两种序列上的基因注释显示出假定基因的相同序列。然而令人惊讶的是，可以确定这些基因中的一个中的显著差异，特别是在本发明的基因(RZ-3)中。在敏感基因型中，一个反转录转座子可以被注释在该鉴定的NBS-LRR基因中。该转座子在LRR结构域和IR结构域的两个结构域域之间插入至所述基因。抗性基因型没有该插入并且示于SEQIDNO:1。此外，对预测的多肽序列进行比较和评价(部分示于图2和3)。
NB-ARC-LRR候选基因的比较测序
在两个步骤中比较性地测序NB-ARC-LRR候选基因。在共有92个抗性和敏感性基因型的基因型组中验证了反转录转座子插入点。该分析表明，抗性基因型中没有一个具有反转录转座子的插入。在这些敏感性基因型中，90％以上可以检测到所述插入。因此，所述插入的检出似乎与易感基因型偶联。然而，由于发现的不一致(约10％的剩余的易感基因型没有插入)，在第二步中用启动子区域将测序延伸至在插入点前的整个基因(SEQIDNO:1)。总的来说，测序和比较了31个选定的抗性和易感基因型，包括不一致的基因型。其结果是，所有的抗性基因型，分为七个不同的抗性来源，在所比较的约4100个碱基对是100％相同的。此外，在核苷酸序列发现完整的诊断多态性，其中一些导致蛋白序列中的氨基酸取代(见图1、2和3)。这些取代中的一些，特别是在结构域区域中，可能会导致ss基因型中所鉴别的抗性蛋白功能丧失。此外，在启动子区域也发现三个与抗性完全偶联(连锁不平衡＝1)的插入缺失(INDEL)(图1)。这些插入缺少也应被认为是功能缺失的潜在候选物。
通过密集重组体验证所述基因
在所分析的具有8004株植物的群体中，在靶区域(37996bp的精细定位区域)鉴别到16个重组体。在这些16种基因型中，9株植物含有NB-ARC-LRR蛋白和右手侧邻接的锚蛋白重复蛋白之间的重组。在两株植物中，重组位于NB-ARC-LRR蛋白与左侧邻接的DUF565蛋白(未知功能蛋白)之间。通过对所有这些重组植物后代的分析(与左侧和右侧的基因距离)，可以相当清楚地证明基因位于DUF565和锚蛋白重复蛋白之间，特别是证明只有NB-ARC蛋白负责抗性。
对不存在转座子插入的示例性检测
为了检测反转录转座子插入，开发了3种特定的主要引物组合。第一和第二引物组合可以检测插入，因为在每一种情况下，两个引物对中的一种引物位于反转录转座子中(转座子的左或右侧)，而第二种引物在反转录转座子之前或之后直接结合。第三种引物对检测不存在反转录转座子，由于所述引物的结合点在转座子之前和之后。然后，在标准条件下只有当反转录转座子不存在时才产生PCR产物，否则，存在反转录转座子，PCT产物会太大，在这种情况下不会产生扩增子。
通过RNAi方法验证所述基因
除了上述通过密集重组体方法验证所述基因，也通过RNA干扰进一步检测所述基因的抗性作用。为了这个目的，用DNA构建体转化抗性标准糖用甜菜基因型，所述DNA构建体编码双链发夹RNA。该dsRNA能够实现基因转录后沉默，这将减少或关闭抗性RZ-3基因等位基因的作用，从而之前抗性的糖用甜菜基因型变成对丛根病敏感。
为了提供合适的DNA构建体，选择抗性RZ3基因等位基因434个碱基对长的明确的靶序列区域(SEQIDNO:7；图4)，通过PCR扩增并以有义和反义方向两者克隆进载体pZFN，其适于发夹结构的合成(图6)。该载体具有双倍CaMV35S启动子、多克隆点/来自基因AtAAP6(编码拟南芥氨基酸通透酶)的内含子、另外的多克隆点和nos终止子。按Lindsey&amp；Gallois(1990)实验方法用提供的载体转化糖用甜菜，使用抗生素卡那霉素作为选择标记。在多个选择步骤后，通过PCR在转基因苗(shoot)上检查成功的转化，通过检测nptII基因、AAP6的内含子和两个t-DNA边界序列(LB/RB)的存在以及vir的不存在。阳性苗各自被体外克隆繁殖至30个苗，生根并各自转移到温室的土壤中。大约2周后，转基因糖用甜菜植物种植至丛根病污染的土壤中，在这里培养8到10周。作为对照，在相同条件下使用相同抗性遗传标准转化背景的非转化植物。为了检测丛根病的传播，收获糖用甜菜植物的茎并通过BNYVV攻击的ELISA试验进行定量，其中低ELISA值表示抗性，高的值表示敏感性(Mechelke1997、Clark&amp；Adams1977)。经转化的糖用甜菜的ELISA平均值为3.55，显著高于对照的ELISA值(对照也是抗性的，平均值1.27)，并与感性标准D108_ss匹配(表1)。ELISA试验的结果相应地表明，由于在转化背景中抗性RZ-3等位基因的特异性基因沉默，之前抗性的植物对BNYVV敏感。因此，本发明的基因可以清楚地证实为抗性基因RZ3。
表1：统计学分析后的ELISA试验结果(D108_ss＝敏感标准；6921_RR＝抗性转化背景；6921_RNAi＝具有针对RZ3基因的dsRNA的抗性转化背景)。
参考文献
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Claims (14)

1.一种编码多肽的核酸分子，所述多肽能够在表达该多肽的植物中赋予对病原体的抗性，其特征在于所述核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：
a)编码具有SEQIDNO:2或SEQIDNO:3的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；
b)包含SEQIDNO:1的DNA序列的编码序列的核苷酸序列；
c)与a)或b)的核苷酸序列的互补序列在严格条件下杂交的核苷酸序列；
d)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽通过a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸取代、缺失和/或添加而衍生自a)或b)的核苷酸序列编码的多肽；
e)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽具有与a)或b)的核苷酸序列编码的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列；
f)核苷酸序列，其编码至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置168-227或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置182-241的核苷酸结合结构域(NBS)，至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置591-613或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置605-627的富含亮氨酸结构域(LRR)，和/或至少一个对应于SEQIDNO:2的氨基酸位置1013-1072或者对应于SEQIDNO:3的氨基酸位置1027-1086的内部重复结构域(IR)。
2.一种载体，其包含权利要求1的核酸分子。
3.一种宿主细胞，其包含权利要求1的核酸分子或者权利要求2的载体。
4.一种多肽，其能够在表达该多肽的植物中赋予对病原体的抗性，并且由权利要求1的核酸分子编码。
5.一种转基因植物细胞，其包含权利要求1的核酸分子作为转基因，或包含权利要求2的载体。
6.一种转基因植物或其部分，其包括权利要求5的植物细胞。
7.权利要求6的植物的种子，其中所述种子包含权利要求1的核酸分子作为转基因。
8.一种用于生产转基因植物细胞的方法，其特征在于，所述方法包含将权利要求1的核酸分子或权利要求2的载体导入植物细胞的步骤。
9.一种生产转基因植物的方法，其特征在于所述方法包含以下步骤：
a)将权利要求1的核酸分子或权利要求2的载体导入植物细胞，和
b)从步骤a)的转基因植物细胞再生转基因植物。
10.一种启动子调控序列，所述启动子控制包含本发明核酸分子的基因的表达，其特征在于所述调控序列在病原体感染时能够赋予或调节异源DNA序列的表达，并且所述调控序列包含具有SEQIDNO:1的核苷酸1-1403的核苷酸序列的核酸分子。
11.一种重组DNA分子，其包含权利要求10的调控序列。
12.一种宿主细胞，其用权利要求10的调控序列转化或用权利要求11的重组DNA分子转化。
13.一种转基因植物、植物组织或植物细胞，其包含权利要求10的调控序列或权利要求11的重组DNA分子作为转基因。
14.一种用于鉴别编码蛋白的核酸分子的方法，所述蛋白能够在表达该蛋白的甜菜属植物中赋予对病原体BNYVV的抗性，其特征在于所述方法包括以下步骤：
i检测权利要求1的核酸分子的编码核苷酸序列中不存在插入，或
ii检测权利要求1的核酸分子的编码核苷酸序列中至少一个根据图1、2和/或3的多态性，其使用鉴别所述多态性的分子标记。
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