ES2953919T3 - Procedimiento e híbridos para la edición selectiva de ácido nucleico en plantas - Google Patents

Procedimiento e híbridos para la edición selectiva de ácido nucleico en plantas Download PDF

Info

Publication number
ES2953919T3
ES2953919T3 ES16724394T ES16724394T ES2953919T3 ES 2953919 T3 ES2953919 T3 ES 2953919T3 ES 16724394 T ES16724394 T ES 16724394T ES 16724394 T ES16724394 T ES 16724394T ES 2953919 T3 ES2953919 T3 ES 2953919T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
plant
nucleic acid
grna
target
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16724394T
Other languages
English (en)
Inventor
Hinrich Harling
Susana Martin-Ortigosa
Markus Niessen
Corinna Streitner
Nadine Schumann
Erik Jongedijk
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
KWS SAAT SE and Co KGaA
Original Assignee
KWS SAAT SE and Co KGaA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE102015006335.9A external-priority patent/DE102015006335A1/de
Priority claimed from DE102015014252.6A external-priority patent/DE102015014252A1/de
Application filed by KWS SAAT SE and Co KGaA filed Critical KWS SAAT SE and Co KGaA
Application granted granted Critical
Publication of ES2953919T3 publication Critical patent/ES2953919T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8213—Targeted insertion of genes into the plant genome by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/04—Stems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8203—Virus mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

La invención se refiere a métodos e híbridos para la modificación dirigida de una región objetivo de ácido nucleico en una estructura objetivo de una planta. La invención se refiere específicamente a métodos e híbridos para obtener directamente una planta o material vegetal que comprende una edición de un ácido nucleico introducido de manera dirigida en una célula meristemática. Los híbridos pueden introducirse de manera transitoria y/o estable. La invención también se refiere a nuevas estrategias de introducción optimizadas para las plantas. La invención se refiere además a un método para llevar a cabo un ensayo de detección in vitro con el fin de comprobar primero in vitro los candidatos de ARNg adecuados con respecto a su eficacia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento e híbridos para la edición selectiva de ácido nucleico en plantas
Campo técnico
La presente invención se refiere en particular a procedimientos para la producción de una planta de maíz, que comprende la preparación e inserción de por lo menos un ARNg así como de una nucleasa CRISPr o de un fragmento catalíticamente activo de ellos y/o de un dominio efector o por lo menos de un híbrido recombinante, que comprende un ARNg así como una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ellos y/o un dominio efector, o las secuencias se codifican para ello, así como por lo menos una secuencia reguladora y/o una secuencia de localización, en una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, mediante lo cual puede obtenerse directamente una planta de maíz, que comprende un cambio selectivo en una región objetivo de ácido nucleico, en donde el por lo menos un híbrido recombinante no está integrado de modo cromosómico o extracromosómico. Además, se divulgan híbridos recombinantes adecuados y vectores así como procedimientos para la inserción de estos híbridos y vectores en un estructura vegetal objetivo de interés. Finalmente, se divulga el uso de un híbrido recombinante, para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal, así como plantas, materiales de planta o una célula vegetal, que son obtenibles o son obtenidos mediante el procedimiento de acuerdo con la invención. Además, se divulga un procedimiento in vitro de clasificación, para poder determinar fácilmente como prueba anticipada, la funcionalidad de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg, respecto a la modificación selectiva de una región objetivo específica de ácido nucleico en una célula vegetal junto con una nucleasa CRISPR, que comprende entre otros, nucleasa cas y/o Cpf1 o variantes o fragmentos catalíticamente activos de ellos, o un fragmento catalíticamente activo de ellos, en elevado rendimiento. Los procedimientos divulgados en el presente documento son en particular adecuados para insertar, modificar o eliminar de manera selectiva un rasgo deseado en una planta, en particular en el marco del desarrollo selectivo de rasgos (trait development), para garantizar una edición de genoma altamente específica y eficiente.
Antecedente de la invención
La edición de genoma representa un procedimiento de biología molecular, mediante el cual pueden introducirse modificaciones selectivas como inserciones, eliminaciones o mutaciones puntuales o combinaciones de ellas en el genoma de un organismo vivo. Para ello se requieren instrumentos moleculares selectivos, que, por un lado, poseen una actividad de nucleasa, pero también pueden ser conducidos con suficiente especificidad hasta dar la secuencia objetivo que va a ser cambiada, para poder planear y ejecutar una mutagénesis selectiva y dirigida al sitio. En la biotecnología vegetal se ha desarrollado en los últimos años la edición selectiva de genoma, hasta dar una alternativa, en comparación con el cultivo clásico, y hasta aproximaciones transgénicas. Las herramientas disponibles hasta ahora, como nucleasas de dedo de zinc (ZFNs) o "nucleasas de efector similares al activador de transcripción" (TALENs) han sido usadas sin embargo sólo de manera limitada en el ámbito de la biotecnología vegetal, lo cual se debe a la eficiencia parcialmente baja, pero también al diseño complejo y laborioso de los híbridos.
Otra herramienta molecular, que se usó en los últimos años frecuentemente para la modificación del genoma de manera precisa y dirigida al sitio, son los sistemas a base de nucleasa CRISPR. Estas nucleasas, que contienen entre otras, nucleasa cas (genes asociados a CRISPR) y nucleasas Cpf1, son parte del sistema denominado desde ahora en la literatura como "CRISPR" (Clustered regularly interspaced short palindromic repeat). Este sistema fue identificado originalmente en 1987 por análisis del gen iap de E. coli, en donde se identificaron las secuencias de repetición que ocurren de modo natural en el genoma bacteriano. Posteriormente se detectó que estas secuencias de repetición de ADN palindrómico de 20 a 50 nucleótidos ocurren en un patrón. Posteriormente se acuñó el acrónimo CRISPR (Jansen, R. et al., "Identification of genes that are associated with ADN repeats in prokaryotes", Mol. Microbiol., 2002, 43(6), 1565-1575), en donde la investigación continúa enfocándose en bacterias. Finalmente, se describió que el sitio CRISPR representa un tipo de sistema bacteriano inmune y puede impartir inmunidad adquirida contra los fagos (Barrangou et al. "CRISPR provides acquired resistance against viruses in procaryotes" Science 2007, 315:1709.1712), en donde el ADN de fagos invasores es incorporado en primera instancia como protoespaciador en un sitio CRISPR, después se transcribe el sitio y finalmente se activa el mecanismo de silenciamiento mediado por CRISPR.
Mediante la caracterización funcional ocurrió también el aprovechamiento gradual del sistema como herramienta universal para la modificación genética de organismos superiores. Entre tanto, se describe una multiplicidad de sistemas CRISPR (véase por ejemplo Van der Oost et al. "Unravelling the structural and mechanistic basis of CRISPR-Cas systems" Nature 2014, 482:331-338, Makarova et al., "An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems", Nature Reviews Microbiology 13, 722-736), en donde los análisis están lejos de ser concluidos.
Mediante el descubrimiento y utilización del sistema CRISPR bacteriano de tipo II que está a disposición otro sistema de "edición de genoma", con un gran potencial.
Hasta la fecha se han descrito cinco tipos (I-V) de sistemas CRISPR (Barrangou et al., 2007, Science, 315(5819):1709-12.; Brouns et al., 2008, Science, 321(5891):960-4.; Marraffini y Sontheimer, 2008, Science, 322(5909):1843-5; Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 13, 722-736, 2015), en donde cada sistema comprende un grupo de genes (cas o también otros) asociados a CRISPR y un arreglo CRISPR correspondiente. Estos arreglos CRISPR característicos consisten en secuencias repetitivas (repeticiones directas, denominadas repeticiones), en las cuales se almacenan piezas cortas de secuencias no repetitivas ("espaciador"), en donde el espaciador desciende de fragmentos cortos de material genético extraño (protoespaciador). Los arreglos CRISPR son transferidos a continuación a ARNs CRISPR cortos (ARNcrs), en donde los ARNcrs dirigen las proteínas Cas u otras nucleasas efectoras de un sistema CRISPR a las respectivas moléculas de ácido nucleico objetivo, que es válido cortar, mediante pareamiento de bases de Watson-Crick. Los sistemas CRISPR de tipo I y tipo III usan complejos de proteínas Cas y ARNcrs, para alcanzar mediante ello el reconocimiento y escisión subsiguiente de ácido nucleico objetivo (Wiedenheft et al., 2011, Nature, 477(7365):486-9). Por el contrario, los sistemas CRISPR tipo II reconocen y escinden en su forma natural su ADN objetivo en cooperación con la nucleasa Cas9 dirigida por a Rn con dos ARNs que no codifican, el ARNcr así como un ARN con activación trans (traARNcr) (Garneau et al., 2010; Sapranauskas et al., 2011, Nucleic Acids Res., 39(21):9275-82; Deltcheva et al., 2011, Nature, 471(7340):602-7). Así mismo, se propuso un posible sistema CRISPR de tipo IV (Makarova et al., Biol. Direct, 6 (38), 2011).
La respuesta inmune mediada en sistemas naturales por CRISPR/Cas requiere por ello un denominado CRISPR-ARN (ARNcr), en donde la maduración de este ARN conductor, que controla la actividad selectiva de la nucleasa CRISPR, varía claramente entre los diferentes sistemas CRISPR caracterizados hasta ahora. En primera instancia, se integra el ADN invasor, que es denominado también como "espaciador", entre dos regiones de repetición adyacentes en el extremo proximal del sitio CRISPR. Los sistemas CRISPR tipo II codifican como enzima de llave para el paso de interferencia de una nucleasa Cas9, que requiere tanto un ARNcr como también un ARN con activación trans (traARNcr) como motivo principal. Éstos forman híbridos y forman regiones de ARN de cuerda doble (ds), que pueden ser reconocidas y escindidas por la ARNsa lll para formar ARNcrs maduros. A su vez, estos se asocian entonces con la molécula de Cas, para conducir la nucleasa de modo dirigido a la región objetivo de ácido nucleico.
Un sistema recombinante de CRISPR/Cas, o en general un sistema de CRISPR/nucleasa permite, mediante un pequeño ARN que no codifica adaptable individualmente (ARN guía o ARNg) en combinación con una nucleasa modificada de modo posible, generar un reconocimiento y/o enlace selectivo de ADN y opcionalmente una ruptura individual o de cuerda doble. Las moléculas de ARNg recombinante pueden comprender tanto el reconocimiento variable de ADN como también de la región de interacción de nucleasa y con ello, en función del ácido nucleico concreto objetivo y de la nucleasa deseada, ser diseñadas de manera selectiva (Jinek et. al., 2012, supra). Como otro mecanismo de seguridad, tienen que estar presentes en la región objetivo de ácido nucleico además PAMs (motivos adyacentes de protoespaciador), secuencias de ADN, las cuales en el sistema CRISPR de tipo II siguen por ejemplo directamente del complejo Cas9/ARN de ADN reconocido. De este modo, la secuencia PAM para la Cas9 de Streptococcus pyogenes suena por ejemplo "NGG" o "NAG" (código estándar de IUPAC de nucleótido) (Jinek et al., "A programmable dual-ARN-guided ADN endonuclease in adaptive bacterial immunity", Science 2012, 337: 816­ 821). La secuencia PAM para Cas9 de Staphylococcus aureus suena "NNGRRT" o "Nn Gr R(N)". Otras variantes de sistemas CRISPR/Cas9 son conocidos. De este modo, una Cas9 de Neisseria meningitidis corta para la secuencia PAM NNNNGATT. Una Cas9 de Streptococcus thermophilus corta para la secuencia PAM NNAGAAW. Mediante el uso de polipéptidos modificados por Cas se alcanzan además rupturas individuales selectivas. El uso combinado de nickasas Cas con diferentes ARNgs recombinantes puede inducir, mediante corte duplicado de ADN, así mismo rupturas de cuerda doble de ADN altamente selectivas. Mediante el uso de dos ARNgs puede además optimizarse la especificidad de la unión de ADN y mediante ello de la escisión de ADN.
Adicionalmente al sistema CRISPR/Cas se describieron recientemente también los denominados sistemas CRISPR/Cpf1, que son adecuados de manera análoga al sistema CRISPR/Cas como herramientas para la edición selectiva de genoma (véase Zetsche et al., "Cpf1 Is a Singel ARN-Guides Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163, pp. 1-13, octubre de 2015). El sistema CRISPR/Cpf1 es denominado también como sistema CRISPR tipo V (Makarova et al., Nature Rev. Microbiol., 2015, supra). A diferencia de una nucleasa Cas9 de un sistema CRISPR/Cas tipo II, una nucleasa Cpf1 no requiere una tracr-ARNs adicional con activación trans. Cpf1 reconoce secuencias PAM ricas en T y corta el ADN objetivo con la formación de los denominados "extremos pegajosos", es decir, de salientes, mientras Cas9 deja detrás los denominados "extremos romos". Como también las nucleasas Cas, las nucleasas Cpf1 contienen un dominio de endonucleasa similar a RuvC, mientras carecen de un segundo dominio de endonucleasa HNH (Makarova & Koonin, Methods Mol. Biol., 1311,47-75, 2015). Mientras los sistemas CRISPR de tipos I, III y IV son denominados actualmente como sistemas de clase 1, a los sistemas de tipo II y tipo V se asigna la clase 2 (véase Makarova et al., Nature Rev. Microbiol.,2015, supra).
Una ruptura de ADN de cuerda doble dentro de una célula vegetal, es reparada bien sea mediante "unión terminal no homóloga" (NHEJ) o "recombinación homóloga ((HR), también llamada "reparación dirigida por homología" (HDR)). Además, se describieron en plantas también llamadas rutas de unión terminal alternativas (AEJ) (Charbonnel C, Allain E, Gallego ME, White CI (2011) Kinetic analysis of DNA double-strand break repair pathways en Arabidopsis. DNA Repair (Amst) 10: 611-619).
Por ello, en el documento US 2015/082478 A1 se propone por ejemplo el uso de un vector de reparación de ADN HDR separado, para introducir una ruptura de cuerda doble, que fue alcanzada previamente mediante un sistema CRISPR/Cas recombinante. A diferencia del cambio genético del genoma bacteriano, la modificación de genomas eucariotas complejos representa un gran desafío, puesto que debido a la complejidad de estos genomas, tienen que suministrarse herramientas moleculares que causen una modificación del genoma exactamente selectiva, sin efectos indeseados fuera del intervalo, es decir, mutaciones o modificaciones indeseadas dentro del genoma o del ADN no genómico de la célula objetivo.
A partir del documento US 8,697,359 B1 se sabe que mediante el uso de la tecnología de CRISPR/Cas pueden cambiarse genomas eucariotas, en especial genomas de mamíferos y estos preferiblemente con propósitos terapéuticos. Para ello se suprime de manera programable la expresión de un gel objetivo, mediante introducción selectiva de una endonucleasa Cas9 así como de un ARN guía (ARNg). Este ARNg es un elemento esencial de cada sistema Cas9-CRISPR, puesto que conduce la verdadera nucleasa Cas dirigida al ADN objetivo (genómico). Para ello, para sistemas Cas9-CRISPR se divulga además una secuencia tracr (CRISPR ARN con activación trans) y una secuencia tracr pareja, que puede estar comprendida por el ARNg, en donde las secuencias tracr forma híbridos, para poder ser así reconocidas. Sin embargo no se divulga, el uso de la tecnología CRISPR para la modificación de genomas vegetales complejos así como de herramientas moleculares requeridas para ello.
Al contrario, el documento WO 2015/026885 A1 se dedica en especial a la aplicación de la tecnología CRISPR/Cas en plantas. Sin embargo, en este caso se divulgan exclusivamente una aproximación y herramientas moleculares adecuadas, que obligatoriamente requieren el subcultivo, selección y regeneración de kalli vegetal después de que ha ocurrido la introducción de las herramientas CRISPR/Cas y con ello no hace posible la obtención directa de una planta, o de material vegetal que contiene el cambio deseado de ADN, la cual contiene el cambio deseado de ADN.
Una vista sobre el estado actual del desarrollo de la aplicación de la tecnología CRISPR/Cas a la edición genómica de genomas vegetales, es encontrada en Bortesi & Fischer ("The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond", Biotechnology Advances, 33, páginas 41-52, 20.12.2014). En este caso, entre otros, se cubre el problema del suministro de ARNgs específicos para la focalización en maíz. Además, se aborda el problema de las elevadas tasas de mutación "fuera del intervalo", que se observan no sólo en la aplicación de CRISPR/Cas en células de mamíferos, sino también en la aplicación en células vegetales, en donde en este caso el diseño de las herramientas individuales CRISPR/Cas es decisivo para alcanzar en perspectiva célula objetivo/el respectivo organismo objetivo, un cambio selectivo dirigido al sitio sin efectos “fuera del intervalo". Además, Bortesi & Fischer reconocen que el sistema CRISPR/Cas puede ser usado también para el cambio epigenético de ADN, puesto que el sistema de CRISPR/Cas puede ser usado también para la escisión de ADN metilado, sin embargo determinan que para ello aún no se conocen aplicaciones en plantas.
Además, Guilinger et al. Fokl-Nucleasas, describen cómo se usan las nickasas, y con ello generan una elevada especificidad (Guilinger et al.; Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fokl nuclease improves the specificity of genome modification, doi:10.1038/nbt.2909). Sin embargo, Guilinger et al. presentan exclusivamente datos para células humanas, no para células vegetales.
Mali et al 2013 se refieren al uso del sistema CRISPR/Cas en células humanas, en donde en este caso se usan variantes cero nucleasa de Cas9 o ARNgs acoplados a aptámero, que pueden fusionarse con dominios activadores de transcripción (Mali, P., et al. (2013). "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering). Mali et al. sin embargo no mencionan como y en cual extensión podría usarse un sistema correspondiente en células vegetales.
En resumen, muchas de las aproximaciones usadas actualmente en el ámbito vegetal están limitadas sólo en el tiempo y/o espacio (transitorias) en el sentido de que pueden causar mutaciones en células ya diferenciadas, por ejemplo, en hojas, aunque estas mutaciones no son transmitidas por la línea germinal. Además, existen aproximaciones que requieren una integración estable de las secuencias que codifican, incluyendo las secuencias reguladoras no requeridas para ello, como promotores y terminadores en el genoma, entonces mediante estas puede generarse una mutación estable, que se hereda de generación a generación. Sin embargo, en este caso las herramientas CRISPR/Cas continúan presentes en el genoma de las plantas y con ello también en potenciales productos vegetales, frutas y semillas, lo cual es indeseable respecto a la evaluación del riesgo de los correspondientes productos.
De acuerdo con ello, la aproximación CRISPR/Cas en la biotecnología de plantas continúa caracterizándose por una baja eficiencia, pero también por un diseño complejo y laborioso de los híbridos, así como de la ocurrencia frecuente de efectos fuera del intervalo. Además, muchas de las aproximaciones actuales se basan en integrar CRISPR/Cas de manera estable en el genoma de una célula vegetal o introducirlo en células de un tejido diferenciado, por ejemplo, en hojas. En consecuencia, para la aproximación estable los descendientes heredan, por un lado, también las herramientas individuales como por ejemplo la Cas9, y no sólo los cambios de ADN selectivos causados por ellas. Para la transformación en células y tejidos diferenciados, la mutación introducida mediante la herramienta CRISPR/Cas es efectiva sólo en las respectivas células, aunque no puede ser transmitida por la línea germinal. Desde el punto de vista del desarrollo selectivo de los rasgos positivos en plantas, que comprenden resistencia, en particular frente a plagas e influencias del ambiente, como por ejemplo frío, sequedad, contenido de sal, una elevada cosecha o resistencia a los herbicidas, es de gran interés económico el suministro de procedimientos confiables para la activación y desactivación selectivas o para la modificación de material genómico, como también para silenciar el ARN dentro de una célula vegetal.
Respecto a la elección de ARNgs adecuados existen incluso ya primeras herramientas in silico, las cuales permiten identificar y después de ello producir ARNgs adecuados (véase por ejemplo: https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input), aunque actualmente no existen herramientas específicas, que puedan ser utilizables para la aplicación en plantas útiles importantes, que dispongan siempre de genomas complejos. Además, las herramientas disponibles no revelan la verdadera efectividad de un ARNg determinado in silico en la prueba subsiguiente in vitro o in vivo dentro de una célula vegetal.
Por ello, existe una necesidad sostenida por el establecimiento de procedimientos e híbridos transitorios que además puedan ser inducidos de manera opcional a base, entre otros, de ARNgs y nucleasas CRISPR o ARNgs y otros dominios efectores, para efectuar un cambio deseado de una secuencia objetivo en una célula vegetal objetivo, en donde a los descendientes pasa sólo el cambio de la secuencia objetivo, aunque no los híbridos. Además, existe una gran necesidad por la preparación de un procedimiento a base de CRISPR, que abra la posibilidad de ejecutar directamente un cambio de línea germinal en una célula vegetal o en un tejido vegetal, de modo que el cambio sea hereditario y puedan cosecharse semillas inmediatas en la planta que resulta de las células vegetales o de los tejidos modificados, semillas que contienen la modificación selectiva del genoma, sin tener que seguir laboriosos y costosos pasos intermedios. Finalmente, existe una necesidad por expandir el sistema de modificación de ADN dirigido por ARN, que es preparado mediante la herramienta CRISPR/Cas, en lo cual puedan modificarse de manera controlada no sólo estructuras genómicas objetivo, sino cualquier ácido nucleico como estructura objetivo, no sólo el genoma de una célula, sino también por ejemplo en el citosol o en plástidos. Para ello, existe además actualmente una necesidad por la preparación de un sistema adecuado de inserción, que permita la inserción selectiva en la herramienta CRISPR/Cas y por ello la modificación selectiva de una región objetivo dentro de una estructura vegetal objetivo.
Además, existe una necesidad por procedimientos eficientes de clasificación in vitro, que hagan posible comprobar y predecir de manera confiable la efectividad de un ARNg dentro de una célula vegetal en un ensayo in vitro con elevado rendimiento, para evitar con ello aproximaciones costosas y tediosas con materiales vegetales.
Finalmente, en particular durante la modificación de genomas eucariotas grandes, que comprenden genomas vegetales y genomas de organismos animales, es válido optimizar la precisión de una aproximación de edición de genoma, para alcanzar un bajo efecto fuera del intervalo, e idealmente alcanzar una reparación óptima de una estructura introducida selectivamente de cuerda doble mediante el suministro de un patrón de reparación junto con las verdaderas herramientas de modificación del genoma.
Sumario de la invención
Por ello, la presente invención basa el objetivo en suministrar procedimientos y herramientas moleculares, que permitan la transformación transitoria de tejidos vegetales o de células vegetales, en especial de células meristemáticas, y mediante ello permitir el cambio controlado de una región objetivo cualquiera de ácido nucleico en un compartimiento celular vegetal cualquiera. Así mismo, fue un objetivo suministrar procedimientos adecuados de inserción para las herramientas moleculares de acuerdo con la presente divulgación. Además, deberían suministrarse pruebas o ensayos adecuados de discriminación in vitro, de modo que puedan identificarse por anticipado ya in vitro ARNgs funcionales adecuados, para poder reducir de manera eficiente el esfuerzo subsiguiente en plantas o in vitro en tejidos vegetales.
Fue objetivo combinar las ventajas mencionadas anteriormente en un sistema, que sea ampliamente aplicable en la biotecnología vegetal.
En particular, fue válido suministrar herramientas, que faciliten el cultivo vegetal de diversas plantas mono- y dicotiledóneas, de modo que en un corto tiempo puedan introducirse o así mismo eliminarse o modificarse rasgos de interés en un genoma vegetal.
Este objetivo es logrado mediante los procedimientos suministrados en el presente documento, de acuerdo con el objeto de las reivindicaciones anexas y además, como se expone en el presente documento, en la descripción, las figuras y el protocolo de secuencia anexo. El objetivo es logrado en especial mediante el suministro de un procedimiento que comprende la transformación o transfección de por lo menos una célula meristemática. Además, el objetivo es logrado mediante la preparación de híbridos recombinantes, que comprenden herramientas de CRISPR modificadas selectivamente y/u otros dominios efectores. Finalmente, el objetivo es logrado mediante la preparación de secuencias reguladoras y secuencias de localización adecuadas, que permiten dirigir de manera controlada el híbrido recombinante de interés de cualquier compartimiento que pueda ser controlado, de una estructura vegetal objetivo de interés.
Mediante ello puede alcanzarse por lo menos un cambio selectivo en toda región objetivo de ácido nucleico, en un compartimiento cualquiera de una célula vegetal, en particular de una célula meristemática vegetal. Puesto que la por lo menos una célula meristemática cambiada de este modo puede pasar de manera inmediata y directa a sus descendientes el cambio selectivo en la región objetivo de ácido nucleico, mediante la subsiguiente división celular y diferenciación, y/o posee el potencial de que a partir de la célula meristemática madure un organismo vegetal completamente modificado, de este modo puede alcanzarse la producción de una planta o de material de planta o de una célula vegetal, sin tener que tomar otros complejos pasos de cultivo o de cruce y selección (sobre todo, regímenes complejos de cruce de retorno). Más bien, a partir de la por lo menos una célula meristemática objetivo cambiada de esta manera, puede tenerse de manera inmediata y directa una planta, material vegetal o una célula vegetal. Mediante ello, es posible producir o preparar o activar ARNg(s) y/o nucleasa(s) CRISPR(n) o uno o varios fragmento(s) catalíticamente activo(s) de ellos y/u otros dominios efector(es) sólo de modo transitorio en los meristemos, en donde estas macromoléculas recombinantes se degradan preferiblemente a continuación, es decir, después de que los ARNg(s) y/o nucleasa(s) CRISPR con uno o varios fragmento(s) catalíticamente activo(s) de ellos y/u otros dominios efector(es) han logrado el efecto deseado, puesto que no tiene lugar ninguna integración de ellos en el genoma o ADN extracromosómico endógeno, lo cual puede ser ventajoso debido aspectos regulatorios y la evaluación de riesgo del producto vegetal. Las nucleasas CRISPR o fragmento catalíticamente activo de ellas usados en el presente documento pueden contener también una o varias mutaciones en los dominios catalíticos, que son responsables por la escisión de ADN (de cuerda doble o individual). Esto da como resultado un amplio espectro de aplicación de la nucleasa CRISPR o de fragmento catalíticamente activo de ella y, por ejemplo en el caso de nickasas a base de Cas, en una especificidad más elevada de la unión, puesto que se usan dos híbridos CRISPR/Cas para escindir ambas cuerdas individuales de la cuerda doble de ADN en el sitio deseado. También se proponen en el siguiente documento, variantes de cero Cas así como su uso combinado con otros dominios efectores, para optimizar una edición selectiva de ácidos nucleicos.
Además, se encontró que mediante el aprovechamiento del mecanismo de acción de la herramienta CRISPR, también pueden usarse otros dominios efectores como polipéptidos o ácidos nucleicos que se unen a ADN o ARN o histona o que modifican ADN o ARN o histona, que comprenden por ejemplo todos los tipos de nucleasas monoméricas, diméricas o multiméricas, que comprenden nickasas, activadores y represores de la transcripción, fosfatasas, glicosilasas, o enzimas que pueden causar cambios epigenéticos, como metilasas, acetilasas, metiltransferasas o histona-deacetilasas, aptámeros, que comprenden secuencias de cuerda individual de ADN o de ARN así como péptidos, proteínas fluorescentes, proteínas para bioluminiscencia, secuencias de aminoácidos marcadores o de ácidos nucleicos marcadores y similares, y combinaciones de ellos de acuerdo con los procedimientos suministrados en el presente documento, mediante lo cual se amplía el espectro de la edición selectiva de genoma conocida hasta una edición general de ácidos nucleicos, que no está limitada per se al ADN genómico.
En relación con el aspecto divulgado en el presente documento de la edición de ADN genómico, también se prevé la preparación de un patrón de reparación de ADN o patrón de HDR, que pueden ser introducidos de manera selectiva junto con las herramientas CRISPR en una célula objetivo o estructura objetivo de interés, para mediante ello superar por un lado el sistema de reparación NHEJ endógeno propenso al error, y además poder introducir un ácido nucleico deseado en el sitio de una ruptura de cuerda doble. Los términos de patrón de reparación de ADN y patrón HDR son usados en el presente documento de manera intercambiable.
La presente divulgación ofrece con ello la posibilidad de expandir el mecanismo CRISPR/Cas con el propósito de hacer posible no sólo la escisión nucleolítica de ADN, sino también una modificación cualquiera del ADN genómico, por ejemplo el cambio epigenético, así como de ARN en células vegetales (como por ejemplo ARNm).
Mediante el uso de otras secuencias reguladoras, que comprenden promotores, terminadores, sitios de unión de factor de transcripción, o intrones, y/o de secuencias de localización, que comprenden secuencias de núcleo, de mitocondrias, y de localización de plástidos, la presente divulgación suministra además la posibilidad de modificar de manera selectiva toda región objetivo de ácido nucleico de una estructura vegetal objetivo, mediante lo cual por ejemplo el ADN mitocondrial y de plástidos puede actuar también como objetivo de la edición. Además, también abre la posibilidad del cambio selectivo de ARN, por ejemplo de ARNm, en donde también en este caso se explota el reconocimiento de secuencias dirigido por ARNg, que se basa en el sistema CRISPR/Cas, y de acuerdo con la presente divulgación es "reprogramado", para ampliar el ámbito de aplicación de la tecnología CRISPR/Cas.
En el presente documento se suministran también procedimientos e híbridos, en los cuales ARNg y/o nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos ya se enlaza con otro dominio efector en un híbrido recombinante.
Además, se suministra un procedimiento en el cual el por lo menos un ARNg así como la por lo menos una nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos y/o el por lo menos otro dominio efector son preparados separadamente en diferentes híbridos recombinantes. De acuerdo con este procedimiento, el componente de ARNg puede ser suministrado como ADN o ARN, la nucleasa CRISPR o variante de ellos o el fragmento catalíticamente activo de ellos puede ser suministrado como ADN o ARN o como secuencia de polipéptidos y el dominio efector puede ser suministrado como ADN o ARN o como secuencia de polipéptidos.
Además fue un objetivo, mediante el establecimiento de procedimientos e híbridos específicos de plantas, suministrar la posibilidad de preparar de manera selectiva híbridos de modo específico para tejidos u organelos, por ejemplo de modo inducible, y minimizar efectos indeseados fuera del intervalo. Finalmente, se presentó un objetivo de concebir procedimientos e híbridos, que ofrezcan no sólo la posibilidad de genes activados de modo más eficiente, sino por ejemplo también la posibilidad de genes desactivados más específicos, de inserciones de fragmentos genéticos, modificaciones genéticas más específicas, la introducción de mutaciones puntuales, acetilaciones, metilaciones, fosforilación, glicosilaciones, marcaciones mediante marcadores de resistencia o proteínas fluorescentes, activación o represión de la transcripción, escisión selectiva de ácidos nucleicos de cuerda doble o cuerda individual, la unión de ácidos nucleicos y similares, de modo que se abra un campo más amplio de uso en el cultivo de plantas. Desde el punto de vista del cultivador y el regulatorio, es deseable hacer posible tanto una característica hereditaria estable de un rasgo causado por la modificación, durante por lo menos una generación, con simultánea ausencia de los híbridos del sistema CRISPR/Cas requeridos para ello, en la planta resultante o las células vegetales resultantes.
Finalmente, fue un objetivo un procedimiento in vitro de clasificación para la identificación de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg, en un ensayo in vitro, para identificación de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg, que es adecuado para modificar de manera selectiva, junto con una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella, una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal.
A partir de la siguiente descripción detallada y de los ejemplos, las figuras, el protocolo de secuencia así como en particular las reivindicaciones anexas de patente, surgen como resultado aspectos concretos y formas de realización de la presente invención.
Corta descripción de los dibujos
Las figuras 1 A-F (Fig. 1 A-F) muestran embriones de maíz de diferente tamaño. en los embriones analizados en este caso, se reconoce claramente el meristemo como estructura en forma de disco en el centro del embrión. Dependiendo del tamaño y el estado de desarrollo de los embriones, el meristemo se desarrolla de manera diferente y puede ser bien reconocido de manera diferente. Adicionalmente, el meristemo está marcado por una estrella (*).
Las figuras 2 A y B (Fig. 2 A y B) muestran una comparación directa de los meristemos de un embrión de maíz de tamaño 0,5 mm (A) y uno de 1 mm de tamaño (B). En ambos casos el meristemo es reconocido como estructura en forma de disco en el centro del embrión, sin embargo en el embrión de tamaño de 1 mm, el meristemo ya está rodeado muy fuertemente por el tejido de la hoja. Esto dificulta la accesibilidad del meristemo, de modo que se prefieren los embriones más pequeños con un meristemo expuesto.
Las figuras 3 A-D (Fig. 3 A-D) reproducen meristemos preparados en brotes de maíz. Puesto que el meristemo en el brote está completamente rodeado por hoja, tiene que ser preparado libremente para hacerlo accesible a un bombardeo, microinyección, etc. Para ello se retiran completamente las estructuras externas del tejido, de modo que el meristemo (flechas) está libre.
Las figuras 4 A-C (Fig. 4 A-C) muestran meristemos preparados en plantas viejas de maíz. Puesto que en plantas viejas el meristemo, como también en brotes, está rodeado completamente por hojas, tiene que ser preparado, para que sea accesible a bombardeo, microinyección, etc. Para ello, las hojas externas tienen que ser retiradas completamente, de modo que esté libre el meristemo (flechas).
Las figuras 5 A y B (Fig. 5 A y B) muestran el bombardeo de prueba biolística del meristemo de embrión de maíz. En la figura 5 (A) se reproduce una imagen esquemática de un embrión con la estructura de meristemo en forma de disco (resaltado mediante un anillo doble y una flecha). La figura 5 (B) muestra la fluorescencia (regiones blancas en la imagen en blanco y negro) después del bombardeo de prueba. Para el bombardeo de prueba se usó un gen que codifica para una proteína fluorescente. Puede detectarse una clara expresión de la proteína en las regiones meristemáticas (anillo doble).
La figura 6 aclara la preparación de meristemos "de borla" en plantas adultas de maíz. Mediante una abertura de tipo ventana se revelan en media página los meristemos (flecha). Los híbridos recombinantes pueden ser introducidos entonces, por ejemplo, mediante bombardeo o microinyección y similares. Es ventajoso que la planta no esté fuertemente deteriorada y que los meristemos no estén completamente libres (por ejemplo 1-2 días después el "meristemo de borla" ya no se ve a través de la abertura, puesto que está desplazado hacia arriba) y mediante ello se reduce una oxidación y otros daños.
La figura 7 A y B (Fig. 7 A y B) muestra el bombardeo de prueba biolística de un meristemo "de borla" liberado de maíz. En la figura 7 (A) se reproduce un cuadro esquemático del tejido de meristemo del pabellón de maíz ("borla"). La figura 7 (B) muestra la fluorescencia (regiones blancas en la imagen de blanco y negro) después del bombardeo de prueba. Para el bombardeo de prueba se usó un gen que codifica para una proteína fluorescente. Es detectable una clara expresión de la proteína en el tejido meristemático.
La figura 8 muestra el resultado de un ensayo in vitro para la valoración de la eficiencia de un ARNg de interés. En este caso, la planta de partida es una planta de maíz, el gen objetivo es el gen hmg13 (factor 13 de transcripción de HMG; GRMZM2G066528). La figura representa el resultado de una separación en un gel al 1 % con el parámetro estándar de carrera de 100 V y visualización mediante fluorescencia mediada por bromuro de etidio. En las pistas 3, 6 10, 12 y 14 se encuentra el marcador de tamaño molecular (datos en pares de bases; GeneRuler 1kb plus ADN Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc, EE. UU.; SM1331) 20000, 10000, 7000, 5000, 4000, 3000, 2000, 1500, 1000, 700, 500, 400, 300, 200, 75 pb). En las otras pistas se muestran los resultados de izquierda a derecha para el ARNg 14 (SEQ ID NO:41), el ARNg 16 (SEQ ID NO:42), marcador molecular, ARNg 37 (SEQ ID NO:43), ARNg 38 (SEQ ID NO: 44), marcadores moleculares, ARNg 39 (SEQ ID NO: 45), ARNg 43 (SEQ ID NO: 46), ARNg 18 (SEQ ID NO: 47), marcador molecular, ARNg 52 (SEQ ID NO: 48), marcador molecular, ARNg 39 (SEQ ID NO: 45) y ARNg 43 (SEQ iD NO: 46). Los SEQ ID NOs indicados indican para los ARNgs en cada caso, la región diferenciada individualmente de protoespaciador, el resto de región del ARNg es idéntica para todos los otros ARNgs usados en este caso.
Las figuras 9 A y B (Fig. 9 A y B) muestran el resultado de un bombardeo de prueba de embriones de maíz mediante el uso de diferentes presiones (indicado en psi= libras por pulgada cuadrada). Los embriones de maíz fueron bombardeados 7-10 días después de la polinización y después de otros 2 días se ejecutaron los análisis por microscopía. Como plásmido se usó un vector de expresión el cual, entre otros, codifica un marcador de fluorescencia. La figura 9 (A) muestra en los seis cuadros individuales, el bombardeo con 1350 psi. La figura 9 (B) muestra en los cuatro cuadros individuales el bombardeo con 1550 psi. En la comparación, en los cuadros inferiores se ve claramente más fluorescencia, en este caso un brillo más intenso en la imagen en blanco y negro. Una elevada fluorescencia/brillo, es decir, una elevada eficiencia de la inserción, puede estar acompañada sin embargo con una germinación reducida de los embriones.
Las figuras 10 A y B (Fig. 10 A y B) muestran dos vistas de un embrión de maíz así como tejidos meristemáticos localizados allí. Inicialmente estos datos fueron visualizados mediante un marcador de fluorescencia. La acumulación de fluorescencia en el ensayo original está caracterizada en la figura 10 en el cuadro (A) y también (B), mediante estrellas. La figura 10 (A) es la vista superior sobre el embrión, la figura 10 (B) muestra una capa más profunda, en la cual también en la región meristemática es detectable la fluorescencia (marcada con estrellas). Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de barrido de láser, el vector usado para el bombardeo fue un vector de expresión el cual, entre otros, codifica una proteína fluorescente. Las capas de embrión fueron coloreadas con un colorante adecuado.
Las figuras 11 A y B (Fig. 11 A y B) muestran el bombardeo horizontal de los meristemos preparados libres en plantas viejas de maíz (brotes con 5-10 días de edad) de acuerdo con el ejemplo 3. Puesto que en plantas viejas, como también en brotes, el meristemo está completamente rodeado por hojas, tuvieron que ser preparados, para ser accesibles a un bombardeo, etc. Para ello se retiraron completamente las hojas exteriores. Las imágenes fueron tomadas un día después del bombardeo, con un microscopio de barrido por láser, el vector usado para el bombardeo fue un vector de expresión que codifica proteína de fluorescencia. La figura 11 (A) muestra una fotografía por microscopio del meristemo preparado, en vista lateral. La figura 11 (B) muestra la fluorescencia detectada en esta vista lateral (puntos blancos). Las capas de embrión fueron coloreadas con un colorante adecuado.
Las figuras 12 A-C (Fig. 12 A-C) muestran el bombardeo vertical de los meristemos preparados libres en plantas viejas de maíz (brotes de 5-10 días de edad) de acuerdo con el ejemplo 3. Puesto que en plantas viejas, como también en brotes, el meristemo está completamente rodeado por hojas, tuvieron que ser preparados para ser accesibles a un bombardeo, etc. Para ello, se retiraron completamente las hojas exteriores. Las imágenes fueron tomadas un día después del bombardeo, con un microscopio de barrido por láser, el vector usado para el bombardeo fue un vector de expresión que codifica proteína de fluorescencia. La figura 12 (A) muestra una fotografía por microscopio del meristemo preparado en la vista superior. La figura 12 (B) muestra la fluorescencia detectada en esta vista (puntos blancos). La figura 12 (C) muestra la región de la fluorescencia detectada en magnitud aproximada de 2 veces. Las capas de embrión fueron coloreadas con un colorante adecuado.
La figura 13 A y B (Fig. 13 A y B) muestra un embrión que germina, con fluorescencia transitoria, también en las regiones meristemáticas. En la figura 13 (A) se reconoce la estructura celular embrional, en la figura 13 (B) esta misma estructura celular, en donde la fluorescencia de la marca introducida se visualizó mediante microscopia de fluorescencia. La fluorescencia fue alcanzada en este caso mediante inserción de un marcador de fluorescencia adecuado. En la imagen en blanco y negro, las regiones blancas en la figura 13 (B) corresponden a las regiones en las cuales se detectó fluorescencia.
La figura 14 muestra una tarjeta ejemplar de vector del plásmido pJET1.2-hmg-exon3-5 de acuerdo con el ejemplo 1.
La figura 15 muestra una tarjeta ejemplar de vector del plásmido pJET1.2-hmg-3'part/parte de acuerdo con el ejemplo 1.
La figura 16 muestra una tarjeta ejemplar de vector del plásmido pEn Chimera-hmg-ARNg14 de acuerdo con el ejemplo 1.
Las figuras 17 A y B (Fig. 17 A y B) muestran una estrategia 2-ARNg, como se usó para el propósito del procedimiento divulgado en este documento. La fig. 17 A muestra la aplicación de dos ARNgs, ARNg-1 y ARNg-2, que activan una región del ADN genómico con el objeto de extirpar la región que está entre ellos, mediante una nucleasa CRISPR, por ejemplo una nucleasa Cas o cualquier otra nucleasa CRISPR, de una región de ADN genómico. RE: enzima de restricción. La Fig. 17 B muestra el resultado del análisis sobre un evento de edición después de la aplicación de la estrategia 2-ARNg en el genoma de una planta de maíz. Para ello, se aisló el ADN genómico de plantas de maíz y se amplificó con PCR el gen objetivo hmg13-Gen (factor 13 de transcripción HMG; GRMZM2G066528). La figura 17 B representa el resultado de una separación en un gel al 1% con el parámetro estándar de corrida de 100 V y la subsiguiente visualización mediante fluorescencia mediada por bromuro de etidio. En la pista 5 se encuentra el marcador de tamaño molecular (datos en pares de bases; GeneRuler 50 pb ADN Ladder (Thermo Fisher Scientific Inc, EE. UU.; SM0373) 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50 pb). En las pistas 1 y 2 se ve en cada caso el resultado para plantas de maíz no editadas, en la pista 4 se ve el resultado después de haber ocurrido la edición. El producto de PCR es más pequeño, puesto que la región entre los dos regiones objetivo ARNg fue extirpada.
La figura 18 muestra una parte del gen Nicotiana benthamiana NbTTGI. Las regiones objetivo ARNg son representadas como flechas sombreadas, los sitios de unión del cebador (fw: adelante, re: tras), como flechas negras. Además, se marcan los sitios de corte para enzimas de restricción, que se usan en el marco de los análisis sobre un resultado de edición.
La figura 19: El TRV alcanza en Nicotiana benthamina tejidos distales de hoja, no inoculados. La figura 19 muestra la inoculación de hoja de N. benthamiana con un híbrido de proteína con fluorescencia roja (RFP) así como un híbrido de control, mediante el uso de expresión mediada por virus de cascabel de tabaco (TRV). El híbrido pZFN-tDT-nptll actuó como control, que permitió exclusivamente la expresión del RFP en las hojas inoculadas, aunque no en las distales. En la imagen en blanco y negro de la Fig. 19 las regiones brillantes corresponden a la fluorescencia roja detectada originalmente, mientras las regiones negras reflejan las regiones en las cuales no pudo detectarse ninguna fluorescencia.
Las figuras 20 A-H (Figs. 20 A-H) muestran fotografías de microscopia de fluorescencia de diferentes estructuras de flores, que fueron infectadas con TRV, que pueden expresar una proteína con fluorescencia roja. Todas las figuras A a H muestran a la izquierda una fotografía de campo claro, en el centro una fotografía con filtro rojo y a la derecha una fotografía con filtro verde (GFP). Esta última sirve como control de la autofluorescencia. En la Fig. 20 A (fotografía original el blanco/negro) y B (equivalente a A con ajuste de contraste/brillo) se ve un meristemo de flores. En la Fig. 20 C (fotografía original en blanco/negro) y D (equivalente a C con ajuste de contraste/brillo) se ve un brote de flor. En la Fig. 20 E (fotografía original en blanco/negro) y F (equivalente a E con ajuste de contraste/brillo) se ve la fotografía de un pistilo. En la Fig. 20 G (fotografía original en blanco/negro) y H (equivalente a G con ajuste de contraste/brillo) se ve un pistilo preparado con ovarios abiertos.
La figura 21 muestra la cuantificación de títulos de TRV en N. benthamiana inoculada con pTRV1 (= control negativo), pTRV1 pTRV2-tDTco (= control positivo) o pTRV1 pTRV2-Cas9 10 dμl.
La figura 22 muestra la detección de proteína de Cas9 (160 kDa) expresada en y a continuación aislada de material de hoja de plantas transgénicas de maíz. Como estándar de tamaño se usó el PageRuler Prestained Protein Ladder (10-170 kDa; de arriba hacia abajo 170, 130, 100, 70, 55, 40, 35, 25, 15, 10 kDa). El tipo de iluminación fue de 30 minutos. Pista 1: marcador de proteína coloreado previamente; pista 2: 10 μg de proteína de maíz que expresa Cas9; pista 3: 15 μg de proteína de maíz que expresa Cas9; pista 4: 20 μg de proteína de maíz que expresa Cas9.
La figura 23 muestra de modo ejemplar una secuencia de virus (BMV). Las diferentes combinaciones de cebador, que son usadas para el sistema de cuantificación del ARNg, son dibujadas como flechas. "Fw" denomina cebador hacia adelante, "re" denomina cebador hacia atrás, que flanquean una secuencia de interés. El "hmg ARNg" denomina un ARNg específico para el gen de factor de transcripción de HMG, integrado en el híbrido de interés que va a ser analizado. El ARN quimérico representado ("Chimera ARN Mali et al.") describe un híbrido de ARN quimérico artificial basado en la divulgación de Mali et al., 2013 arriba, en donde los ARNgs descritos en el presente documento fueron ajustados como se ilustra en la parte de ejemplos, específicamente para el uso en células vegetales.
La figura 24 muestra una planta de maíz del genotipo A188 en el estado V7 (cuadro izquierdo), esta misma la planta después de introducción de una ventana artificial en la región que protege el tejido de borla (centro) y la subsiguiente inyección de una solución de Agrobacterium en la región de la borla liberada (cuadro derecho).
Las figuras 25 A-C (Fig. A-C) muestran embriones inmaduros (Fig. 25 A) de una planta de maíz, que fue aislada y a continuación bombardeada con un híbrido CRISPR/Cas9 así como un plásmido que expresa una proteína que tiene fluorescencia roja, mediante bombardeo de partículas. La fig. 25 B muestra el desarrollo de fluorescencia (regiones blancas y brillantes) el día 1 después del bombardeo. La fig. 25 C muestra una planta madura de maíz, que fue obtenida a partir de los embriones de las Figs. 25 A y B bombardeados de ese modo y a continuación cultivados de nuevo hasta la madurez.
La figura 26 muestra un embrión inmaduro de Beta vulgaris, obtenido de acuerdo con el procedimiento descrito en detalle posteriormente.
Las figuras 27 A y B (Figs. 27 A y B): Fig. 27 A: granos inmaduros de trigo después de la transformación del meristemo. Fig. 27 B: Corresponde a la fotografía de fluorescencia de la Fig. 27 A. Las regiones brillantes corresponden a la fluorescencia detectada (regiones blancas/brillantes en la fotografía en blanco y negro). Después de la transformación del meristemo pudo obtenerse plantas de trigo que germinan directamente a partir de los granos (A y B) de trigo tratados.
La figura 28 muestra en el cuadro izquierdo la localización de las inflorescencias inmaduras en trigo. El cuadro del centro y el cuadro derecho muestran de izquierda a derecha el desarrollo posterior de los tejidos meristemáticos transformados como se describe posteriormente.
Descripción detallada
Definiciones
El término planta o célula de planta, como se usa en la presente memoria, se refiere a organismos vegetales, órganos vegetales, tejidos vegetales diferenciados y no diferenciados, células vegetales, semillas y su progenie o descendientes. Las células vegetales comprenden, por ejemplo, células de semillas, embriones maduros e inmaduros, tejidos meristemáticos, brotes, tejidos de Kallus, hojas, flores, raíces, renuevos vegetales, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, protoplastos, macroalgas y microalgas.
El término planta fértil, como se usa en la presente memoria, se refiere a una planta fértil que está en posición de producir descendientes, es decir, una planta fértil es una planta que puede producir gametos masculinos y femeninos viables. De acuerdo con ello, una planta masculina estéril es una planta que no puede producir gametos masculinos viables, que sin embargo puede ser fértil de modo femenino. Una planta femenina estéril es una planta que no puede producir gametos femeninos viables, en donde la planta puede continuar siendo fértil de modo masculino.
Material vegetal, como se usa en la presente memoria, se refiere a todo material que puede ser obtenido de una planta en un estado cualquiera de desarrollo. El término comprende con ello células, tejidos y órganos vegetales, así como estructuras vegetales formadas, y así mismo componentes subcelulares como ácidos nucleicos, polipéptidos, y todos los materiales químicos vegetales que están presentes dentro de una célula vegetal y/o que pueden ser producidos a partir de ellos.
El término integrado de modo cromosómico o extracromosómico, como se usa en la presente memoria, se refiere a la inserción y/o la configuración transitorias de uno o varios híbrido/híbridos recombinante(s) de acuerdo con la presente divulgación, y con ello al destino subsiguiente del uno o los varios híbrido/híbridos recombinante(s) en una estructura vegetal objetivo, por ejemplo, una célula, en donde tanto el uno o los varios híbrido(s) recombinantes, como también las condiciones para la inserción de ellos, son mantenidos de modo que no tiene lugar ninguna integración del por lo menos un híbrido recombinante en el material de ácido nucleico endógeno de una estructura vegetal objetivo, que comprende el genoma o ácidos nucleicos extracromosómicos de la estructura vegetal objetivo, por ejemplo, de una célula, de modo que por lo menos un híbrido recombinante no se integra de modo cromosómico o extracromosómico en el ADN/ARN endógeno de la célula objetivo y con ello no pasa a los descendientes de la célula. El uno o los varios híbrido(s) recombinante(s) o sus productos de transcripción o de traslación están presentes activos en la célula objetivo sólo de modo temporal, es decir, transitorio, constitutivo o inducible, pero no son hereditarios para los descendientes de la célula objetivo, es decir, tampoco están presentes activos en los descendientes de una célula objetivo.
El término "recombinación homóloga" como se usa en la presente memoria, denomina un proceso, como ocurre en todos los organismos. Para ello son requerimiento segmentos de ADN de doble cuerda, homólogos. Por ello, homólogo significa que existe una gran similitud en las secuencias de dos secuencias de nucleótido. Para las interrupciones de doble cuerda que ocurren de modo natural, pueden repararse los daños mediante recombinación homóloga, por el uso como patrón de informaciones sobre el cromátido no dañado en el genoma de un organismo. En tanto, como también de acuerdo con la presente divulgación, se inserte una ruptura selectiva y precisa de la doble cuerda en el marco de la edición de genoma en una región objetivo de ácido nucleico de interés, también en este caso puede usarse la recombinación homóloga para reparar la ruptura surgida, en donde mediante ello puede hacerse la creación selectiva de un patrón de reparación de ADN para influir específicamente en la región objetivo de ácido nucleico de interés que va a ser reparada. Diferentes organismos, se diferencian respecto a la relación de recombinación homóloga y no homóloga, como ocurre de modo natural (véase arriba NHEJ). En general, la longitud de la región de homología influye en la frecuencia de eventos de recombinación homóloga: cuanto más larga es la región de homología, tanto mayor es la frecuencia. La longitud de la región de homología que es necesaria para alcanzar la recombinación homóloga depende además de la especie. En algunos casos puede ser necesario usar, por lo menos cinco kilobases (kb) de homología, pero se observaría recombinación homóloga también ya en una región de homología de sólo aproximadamente 25 pares de bases (pb).
La reparación dirigida a la homología (HDR) define un mecanismo celular, para reparar rupturas de ADN de cuerda doble e individual. La HDR comprende con ello elementos de la recombinación homóloga así como del denominado apareamiento de cuerda individual (SSA) (Lieber Michael et al., Annu.Rev.Biochem.79:181-211, 2010). La forma más frecuente de HDR en una célula es la recombinación homóloga, en donde este tipo de reparación requiere también la máxima homología de secuencias entre donador y aceptador de ADN. Otras formas de h Dr comprenden apareamiento de cuerda individual (SSA). El SSA es no conservador y ocurre de modo natural entre repeticiones directas de > 30 pb y da como resultado eliminaciones. La HDR en nicks es decir, en rupturas de cuerda individual, ocurre mediante otro mecanismo diferente a HDR en rupturas de cuerda doble (Davis y Maizels PNAS, 2014 E924-32). Puesto que, de acuerdo con la presente divulgación, se proponen tanto nucleasas CRISPR que inducen ruptura de cuerda doble, como también de cuerda individual, el término HDR o recombinación homóloga se refiere por ello a la reparación de una ruptura de cuerda individual, como también de cuerda doble, introducida de manera selectiva mediante el uso de un patrón de reparación adecuado.
La resistencia a los herbicidas o tolerancia a los herbicidas, como se usa en la presente memoria, denomina la capacidad de una planta o de una célula vegetal para ser resistente o tolerante frente al efecto de un herbicida o pesticida. esta propiedad es mediada usualmente por al menos una proteína o un ARN, la/el cual fue introducida(o) bien sea de modo artificial, por ejemplo, como transgen en una célula vegetal, o, que puede ser obtenida mediante modificación (selectiva) de un gen endógeno. El término progenie o descendientes, como se usa en la presente memoria, denomina en el contexto de un microorganismo recombinante, una planta o una célula de acuerdo con la presente divulgación, los descendientes de un organismo tal o de una célula tal, que por procesos de división celular y diferenciación de reproducción asexual natural, proceden del organismo original o de la célula original. En el campo de los expertos se sabe que en el curso de la división celular y diferenciación, pueden introducirse de manera natural mutaciones en el genoma de un organismo, mediante lo cual la progenie o la descendencia se diferencian genómicamente del organismo progenitor, aunque puede seguir asignándosele la misma (sub)especie. También tales descendientes modificados mediante procedimientos naturales, los cuales aparte del cambio introducido selectivamente portan otros cambios en otras regiones de ADN, están incluidos por ello en el término descendiente o progenie de acuerdo con la presente divulgación.
El término nucleasa CRISPR, como se usa en la presente memoria, se refiere en general a una nucleasa, como ocurre en un CRISPR de ocurrencia natural, así como modificaciones y mutantes y fragmentos catalíticamente activos de ellos. En el sitio de CRISPR que ocurre de modo natural, la nucleasa CRISPR presenta la molécula que forma la molécula de efector y en combinación con un ARNcr y opcionalmente con un tra ARNcr, o junto con un ARNg artificial, puede reconocer y/o escindir una estructura objetivo de ácido nucleico. Las nucleasas CRISPR comprenden por ello nucleasa Cas, Nucleasas Cpf1 u otros dominios de efector y/o nucleasa CRISPR, que comprenden Csf1 y combinaciones y variantes de ellos. Además, este término comprende también nucleasas modificadas selectivamente, que fueron convertidas por ejemplo en nickasas, para lograr rupturas de cuerda individual, o variantes de cero nucleasa, que fueron convertidas con propósito de enlace y reconocimiento, aunque no para alcanzar una ruptura de cuerda doble. Puesto que en la literatura se ha establecido provisionalmente el término CRISPR/Cas como sinónimo de todos los tipos de sistemas CRISPR, este término de acuerdo con la presente divulgación, cuando no se indica específicamente de otro modo, debería referirse también a todo sistema CRISPR tipo I-V así como la proteína efectora relacionada.
El término vector o sistema de vector, como se usa en la presente memoria, se refiere a un medio de transporte para poder introducir un híbrido recombinante, que comprende ácidos nucleicos o también polipéptidos así como dado el caso otras secuencias, como secuencias reguladoras o secuencias de localización, directa o indirectamente en una célula objetivo o estructura vegetal objetivo deseadas, en el compartimiento celular deseado. La inserción directa ocurre directamente en una célula vegetal objetivo o estructura vegetal objetivo, que contiene ácidos nucleicos, que debe ser cambiada selectivamente de acuerdo con la presente divulgación. La inserción indirecta comprende la inserción en una estructura, por ejemplo, células de hojas o de otros órganos y tejidos vegetales, e incluso no comprende directamente la célula vegetal objetivo de interés, mediante lo cual sin embargo se garantiza la propagación y redireccionamiento sistémicos de vector, que comprende un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, en la estructura vegetal objetivo, por ejemplo, tejidos o células meristemáticos o células nativas. el término vector o sistema de vector, como se usa en la presente memoria, comprenden el contexto de la transfección de secuencias de aminoácidos, agentes adecuados para la transfección de péptidos o proteínas como por ejemplo, mezclas de lípidos iónicos o agentes que son adecuados para la transfección de un ácido nucleico, como por ejemplo, materiales de soporte, mediante los cuales pueden introducirse en una célula secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos, mediante bombardeo de partículas, como por ejemplo, partículas de oro y de wolframio. Además, este término comprende, en especial en la aplicación de los procedimientos e híbridos aquí mencionados, también vectores virales, es decir, virus modificados, como por ejemplo aquellos que provienen de uno de los siguientes virus: virus de mancha del maíz (MSV), virus del mosaico de cinta de cebada (BSMV), virus del mosaico de bromo (BMV, números de acceso: ARN1: X58456; ARN2: X58457; ARN3: X58458), virus de cinta de maíz (MSpV), virus fino rayado de maíz (MYDV), virus enano amarillo de maíz (MYDV), virus del mosaico enano de maíz (MDMV), ARN de cuerda positiva de virus de la familia Benyviridae, por ejemplo, virus de vena amarillo necrótico de remolacha (números de acceso: ARN1: NC_003514; ARN2: NC_003515; ARN3: NC_003516; ARN4: NC_003517) o de la familia Bromoviridae, por ejemplo, virus del género del virus del mosaico de alfalfa (números de acceso: ARN1: NC_001495; ARN2: NC_002024; ARN3: NC_002025) o del género Bromovirus, por ejemplo, BMV (véase arriba), o del género Cucumovirus, por ejemplo, virus del mosaico de cohombro (números de acceso: a Rn 1: NC_002034; ARN2: NC_002035; ARN3: NC_001440), o del género Oleavirus, virus dsADN de la familia Caulimoviridae, en particular de las familias Badnavirus o Caulimovirus, por ejemplo, diferentes virus de mancha de banano (véase por ejemplo, números de acceso: NC_007002, NC_015507, NC_006955 o NC_003381) o virus del mosaico de coliflor (número de acceso: NC_001497), o virus de los géneros Cavemovirus, Petuvirus, Rosadnavirus, Solendovirus, Soymovirus o Tungrovirus, virus de ARN de cuerda positiva de la familia Closteroviridae, por ejemplo, de los géneros Ampelovirus, Crinivirus, por ejemplo, virus amarillo infeccioso de lechuga (número de acceso: ARN1: NC_003617; ARN2: NC_003618) o virus de clorosis de tomate (número de acceso: ARN1: NC_007340; ARN2: NC_007341), Closterovirus, por ejemplo, virus amarillo de remolacha (número de acceso: NC_001598), o Velarivirus, virus ADN de cuerda individual (+/-) de la familia Geminiviridae, por ejemplo, virus de las familias Becurtovirus, Begomovirus, por ejemplo, virus del mosaico amarillo dorado de judía, virus de disparo rizado de tabaco, virus de rizo de hoja moteada de tabaco, virus moteado clorótico de tomate, virus de hoja enana de tomate, virus del mosaico dorado de tomate, virus rizado de hoja de tomate, virus moteado de tomate, o virus de mancha amarilla de tomate, o Geminiviridae del género Curtovirus, por ejemplo, virus de parte superior realizada de remolacha, o Geminiviridae del género Topocuvirus, Turncurtvirus o Mastrevirus, por ejemplo, virus de mancha de maíz (véase arriba), virus enano amarillo de tabaco, virus enano de trigo, de ARN cuerda positiva de la familia Luteoviridae, por ejemplo, del género Luteovirus, por ejemplo, virus-PAV enano amarillo de cebada (número de acceso: NC_004750), o del género Polerovirus, por ejemplo, virus de enrollamiento de hojas de patata (número de acceso: NC_001747), virus de ADN de cuerda individual de la familia de virus Nanoviridae, que comprende los géneros Nanovirus o Babuvirus, virus de ARN de cuerda doble de la familia Partiviridae, que comprende entre otros las familias Alphapartitivirus, Betapartitivirus o Deltapartitivirus, viroides de la familia Pospiviroidae, virus de ARN de cuerda positiva de la familia Potyviridae, por ejemplo, que comprende los géneros Brambyvirus, Bymovirus, Ipomovirus, Macluravirus, Poacevirus, por ejemplo, virus del mosaico de Triticum (número de acceso: NC_012799), o Potyviridae del género Potyvirus, por ejemplo, virus del mosaico de remolacha (número de acceso: NC_005304), virus del mosaico enano de maíz (número de acceso: NC_003377), virus Y de patata (número de acceso: NC_001616), o virus del mosaico de Zea (número de acceso: NC_018833), o Potyviridae del género Tritimovirus, por ejemplo, virus del mosaico de mancha bromo (número de acceso: NC_003501) o virus del mosaico de mancha de trigo (número de acceso: NC_001886), virus de ARN de cuerda individual de la familia Pseudoviridae, por ejemplo, de los géneros Pseudovirus, o Sirevirus, virus de ARN de cuerda doble de la familia Reoviridae, por ejemplo, virus enano de arroz (números de acceso: ARN1: NC_003773; ARN2: NC_003774; ARN3: NC_003772; ARN4: NC_003761; ARN5: NC_003762; ARN6: NC_003763; ARN7: NC_003760; ARN8: NC_003764; ARN9: NC_003765; ARN10: NC_003766; ARN11: NC_003767; ARN12: NC_003768), virus de ARN de cuerda positiva de la familia Tombusviridae, por ejemplo, que comprende los géneros Alphanecrovirus, Aureusvirus, Betanecrovirus, Carmovirus, Dianthovirus, Gallantivirus, Macanavirus, Machlomovirus, Panicovirus, Tombusvirus, Umbravirus o Zeavirus, por ejemplo, virus de mancha necrótica de maíz (número de acceso: NC_007729), o virus de ARN de cuerda positiva de la familia Virgaviridae, por ejemplo, virus del género Furovirus, Hordeivirus, por ejemplo, virus del mosaico de cinta de cebada (números de acceso: ARN1: NC_003469; ARN2: NC_003481; ARN3: NC_003478), o del género Pecluvirus, Pomovirus, Tobamovirus o Tobravirus, por ejemplo, virus de cascabel de tabaco (números de acceso: ARN1: NC_003805; ARN2: NC_003811), así como virus de ARN de cuerda negativa del orden Mononegavirales, en particular de la familia Rhabdoviridae, por ejemplo, virus del mosaico rayado amarillo de cebada (número de acceso: KM213865) o virus amarillo necrótico de lechuga (número de acceso/Ejemplar: NC_007642/ AJ867584), virus de ARN de cuerda positiva del orden Picornavirales, en particular de la familia Secoviridae, por ejemplo, de los géneros Comovirus, Fabavirus, Nepovirus, Cheravirus, Sadwavirus, Sequivirus, Torradovirus, o Waikavirus, virus de ARN de cuerda positiva del orden Tymovirales, en particular de la familia Alphaflexiviridae, por ejemplo, virus del género Allexivirus, Lolavirus, Mandarivirus, o Potexvirus, Tymovirales, en particular de la familia Betaflexiviridae, por ejemplo, virus del género Capillovirus, Carlavirus, Citrivirus, Foveavirus, Tepovirus, o Vitivirus, virus de ARN de cuerda positiva del orden Tymovirales, en particular de la familia Tymoviridae, por ejemplo, virus del género Maculavirus, Marafivirus, o Tymovirus, y vectores bacterianos, como por ejemplo Agrobacterium spp., como por ejemplo Agrobacterium tumefaciens. Finalmente, el término comprende también medios adecuados de transporte para la introducción de ácidos nucleicos lineales (de cuerda individual o doble) en una célula objetivo. Para los expertos en el campo son conocidas todas las otras secuencias de los híbridos conocidos divulgados en el presente documento, de las que tiene que disponer un vector para ser funcional en una célula objetivo deseada. Los expertos en el tema también conocen la producción, procesamiento y aplicación corrientes de tales vectores.
El término sistema de vector, como se usa en la presente memoria, denomina un sistema que consiste en por lo menos uno o varios vector(es) o lo(s) contiene. De este modo, un sistema de vector puede exhibir un vector que contiene/codifica dos híbridos recombinantes diferentes, que comprenden secuencias de ácidos nucleicos y/o aminoácidos. Un sistema de vector puede contener además también varios vectores que por su lado contienen/codifican por lo menos una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de acuerdo con la presente divulgación.
El término sitio de rasgo cuantitativo o QTL, como se usa en la presente memoria, denomina una región de ADN, que está asociada con la expresión diferencial de un rasgo fenotípico cuantitativo en por lo menos un fondo genético definido, por ejemplo, en por lo menos una población de cultivo. La región de QTL comprende, o está estrechamente enlazada con el gen o los genes, que influyen en el rasgo incierto. De acuerdo con ello, un alelo de un QTL puede comprender varios genes o también otros factores genéticos dentro de una región genómica coherente, o un grupo de enlace, por ejemplo, un haplotipo. Un alelo de un QTL puede denominar un haplotipo dentro de una ventana determinada, en donde esta ventana representa una región genómica coherente, que puede ser definida y perseguida (de vuelta) con una frase de uno o varios marcadores polimórficos. un haplotipo puede ser definido por la huella digital única de alelos para cada marcador, dentro de la ventana determinada.
Como se cita en detalle posteriormente, a disposición de los expertos hay una multiplicidad de procedimientos, para identificar las estructuras vegetales objetivo, que comprenden por lo menos una célula meristemática o una planta completa, o un material vegetal o una célula vegetal de ellos, que portan un cambio selectivo en su ADN genómico en o cerca a una región objetivo de ácido nucleico, sin que se usen fenotipos marcadores verificables. Tales procedimientos se basan en el análisis directo de una región objetivo o secuencia objetivo de ácido nucleico de interés, para verificar cualquier cambio en esta región o secuencia de ácidos nucleicos, y comprenden, sin estar limitados a ellos, procedimientos PCR, procedimientos de determinación de secuencia, de gestión de nucleasa, manchas del sur, manchas del norte y cualquier combinación de ellos.
El término ácido nucleico o secuencia de ácido nucleico, como se usa en la presente memoria, se refiere a ácidos desoxirribonucleicos (ADN) y ácidos ribonucleicos (ARN) naturales y sintéticos, que pueden contener también análogos sintéticos de nucleótido. Los ácidos nucleicos, de acuerdo con la presente invención son usados para la síntesis de un producto deseado como proteína o ARN o para el control selectivo de ellos, por ejemplo, una nucleasa CRISPR, que comprende entre otros, una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, o un ARNg, puede ser, dado el caso "ajustada a la aplicación en una estructura vegetal objetivo". En una forma de realización, las secuencias mencionadas anteriormente pueden ser optimizadas por codón, es decir, el uso de codón de un gen o de un ARN es ajustado específicamente a la célula objetivo/el organismo objetivo. Los expertos en el campo saben que un gen objetivo deseado, que codifica una proteína de interés, puede ser modificado sin cambiar la secuencia de proteína trasladada, para tener en cuenta el uso de codón dependiente de la especie específica. De este modo, se ajustan/pueden ajustarse los ácidos nucleicos de la presente divulgación específicamente al uso de codón de Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Secale cereale, Triticale, Saccharum officinarium, Zea mays, Setaria italic, Oryza sativa, Oryza minuta, Oryza australiensis, Oryza alta, Triticum aestivum, Triticum durum, Hordeum bulbosum, Brachypodium distachyon, Hordeum marinum, Aegilops tauschii, Malus domestica, Beta vulgaris, Helianthus annuus, Daucus glochidiatus, Daucus pusillus, Daucus muricatus, Daucus carota, Eucalyptus grandis, Erythranthe guttata, Genlisea aurea, Nicotiana silvestris, Nicotiana tabacum, Nicotiana tomentosiformis, Solanum lycopersicum, Solanum tuberosum, Coffea canefora, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Morus notabilis, Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Arabidopsis arenosa, Crucihimalaya himalaica, Crucihimalaya wallichii, Cardamine flexuosa, Lepidium virginicum, Capsella bursa-pastoris, Olmarabidopsis pumila, Arabis hirsuta, Brassica napus, Brassica oleracea, Brassica rapa, Brassica juncacea, Brassica nigra, Raphanus sativus, Eruca vesicaria sativa, Citrus sinensis, Jatropha curcas, Glycine max, Gossypium ssp. o Populus trichocarpa. Además, de acuerdo con la presente divulgación, la secuencia del ARNg o la secuencia que codifica ARNg tienen que ser ajustadas a la región objetivo de ácido nucleico dentro de uno estructura vegetal objetivo. En otra forma de realización, el ARNg o la secuencia que codifica para ARNg puede ser ajustada además en la región que es responsable de la interacción o acoplamiento con una nucleasa Cas y/o un dominio efector.
El término secuencias, como se usa en la presente memoria, se refiere a secuencias de ácidos nucleicos y secuencias de aminoácidos, en donde las respectivas secuencias pueden contener, aparte de nucleótidos y aminoácidos naturales, también análogos sintéticos o uniones sintéticas como componentes.
Los términos polipéptido, secuencia de polipéptido, secuencia de proteína y secuencia de aminoácidos son usados en el presente documento de manera intercambiable.
El término fragmento catalíticamente activo, como se usa en la presente memoria, en particular en referencia a nucleasas CRISPR o variantes de ellas, se refiere a una secuencia núcleo de aminoácidos, que se deriva de una secuencia patrón dada de aminoácidos, con la condición de que el fragmento catalíticamente activo resultante comprenda la totalidad o parte del centro activo de la secuencia patrón y mediante ello continúe satisfaciendo la misma función enzimática de la secuencia patrón. Tales modificaciones, es decir, truncamientos, son bien conocidos por los expertos en el campo y en especial son significativas para enzimas con requerimientos estéricos, para suministrar enzimas truncadas estables y versátiles, que comprenden el fragmento catalíticamente activo.
El término secuencia reguladora, como se usa en la presen te memoria, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o una secuencia de proteína, que puede controlar la transcripción y/o traslación en cis o trans de la una secuencia de ácidos nucleicos divulgada.
El término híbrido o híbrido recombinante (usado en el presente documento de manera intercambiable), como se usa en la presente memoria, se refiere a un híbrido, que comprende entre otros, plásmidos o vectores de plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales de levaduras o bacterianos (YACs y BACs), fagémidos, vectores de bacteriófagos, un casete de expresión, secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de aminoácidos de cuerda individual o lineales, y vectores virales, es decir, virus modificados, que pueden ser introducidos en una célula objetivo de acuerdo con la presente divulgación. Un híbrido recombinante puede comprender herramientas CRISPR/Cas o partes de ellas, que comprenden por lo menos un ARNg o por lo menos una nucleasa variante de CRISPR y/o por lo menos otros dominios efectores, ya sea en la forma de un ácido nucleico o de una secuencia de aminoácidos. Además, el híbrido recombinante puede comprender secuencias reguladoras y/o secuencias de localización. El híbrido recombinante puede estar presente integrado por ejemplo en un vector de plásmidos y/o aislado de un vector de plásmido, por ejemplo, en la forma de una secuencia de polipéptido o un vector no plásmido enlazado a ácido nucleico de cuerda individual o de cuerda doble. Después de la inserción el híbrido está presente y preferiblemente de modo extracromosómico y no está integrado en el genoma, y usualmente en la forma de un ADN de cuerda doble o de cuerda individual, de un ARN de cuerda doble de cuerda individual o un polipéptido. un vector de plásmido, como se usa en la presente memoria, se refiere a un híbrido, que originalmente fue obtenido a partir de un plásmido. Para ello, se trata por regla general de elementos extracromosómicos circulares que se replican de modo autónomo en la forma de una secuencia de ácidos nucleicos de cuerda doble. en la técnica genética se cambian de manera selectiva estos plásmidos originales mediante el cual se introducen, entre otros genes de resistencia, ácidos nucleicos objetivo, secuencias de localización, secuencias reguladoras y similares. Por ello, se retienen los componentes estructurales del plásmido original, como el origen de replicación. Es obtenible comercialmente una multiplicidad de vectores de plásmido para la aplicación en una célula objetivo de interés y el experto conoce bien la modificación de ellos para estrategias propias de clonación. Tales vectores de plásmido conocidos son denominados en este caso como vectores estándar, en donde esto debería implicar que el vector base es obtenible comercialmente y puede ser ajustado fácilmente por el experto al correspondiente campo técnico, a los requerimientos del respectivo experimento.
El término de un potenciador o un elemento potenciador denomina una sucesión de bases/nucleótidos con secuencia característica. Un potenciador pertenece a los elementos reguladores cis y puede influir en la adición de un complejo de transcripción a un promotor y con ello en la actividad de transcripción de un gen. A su vez, un promotor denomina una secuencia de ADN que puede controlar la expresión de una secuencia que codifica o de un ARN funcional. La secuencia de promotor consiste en elementos proximales y distales en relación con la secuencia regulada, en donde frecuentemente esta última es denominada como potenciador. Los promotores pueden poseer un amplio espectro de actividad, sin embargo pueden estar activos o ser activables de modo específico al tejido o al desarrollo, por ejemplo, en células de raíces, semillas, célula meristemáticas etc. Así mismo existen promotores constitutivos activos y también inducibles, en donde la inducción puede ser estimulada por una multiplicidad de influencias ambientales. Existen promotores fuertes, que pueden activar una elevada transcripción de la secuencia regulada, y promotores débiles. Frecuentemente los promotores están fuertemente regulados. Un promotor de acuerdo con la presente divulgación puede denominar un promotor nativo presente de modo endógeno, o un promotor artificial (sintético/quimérico) o transgénico, que fue obtenido a partir de otra especie, o que es artificial o sintético/quimérico, es decir, no ocurre así en la naturaleza o esta compuesto por diferentes elementos promotores.
Los términos secuencia que no codifica en 3', terminador de transcripción, terminador o secuencia de terminación, como se usa en la presente memoria, se refieren a secuencias de ADN, que están localizadas corriente abajo, es decir en dirección 3' de una secuencia que codifica, y comprenden secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras, que están en capacidad de influir en el procesamiento de ARNm y/o la expresión de gen. La señal de poliadenilación se caracteriza usualmente porque causa la adición de polinucleótidos-A en el extremo 3' de un precursor de ARNm.
El término enlazado de modo funcional, como se usa en la presente memoria, se refiere a la unión de secuencias de ácidos nucleicos sobre un fragmento único de ácido nucleico, de modo que los fragmentos individuales están unidos físicamente a genes o secuencias reguladoras u otras regiones y pueden regular o hibridar o influir mutuamente en los segmentos o secuencias individuales. Por ejemplo, un promotor está enlazado funcionalmente entonces con una secuencia que codifica, en tanto esté en capacidad de regular la expresión de esta secuencia que codifica, es decir, la secuencia que codifica está bajo control de transcripción del promotor correspondiente. Además, las secuencias que codifican pueden estar enlazadas funcionalmente con secuencias reguladoras, bien sea en orientación en sentido o antisentido. Las regiones complementarias de ARN pueden incluso estar enlazadas, sea directa o indirectamente, en 5' con el ARNm objetivo, o en 3' con el ARNm objetivo, o dentro del ARNm objetivo, o una primera región de la complementariedad es enlazada funcionalmente en 5' y su complemento en 3' con el ARNm objetivo.
El término transformación estable o integración estable, como se usa en la presente memoria, se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico de interés, por ejemplo, en la forma de un patrón de reparación de ADN, o de una parte de él, o de un vector adecuado, en el genoma de una estructura vegetal objetivo de interés, en donde el genoma comprende tanto el genoma nuclear como también el extranuclear, por ejemplo el genoma de organelos, lo cual da como resultado un cambio genéticamente estable y por ello hereditario del genoma. Contrario a ello, el término transformación transitoria o introducción transitoria o integración transitoria, como se usa en la presente memoria, se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico de interés en un compartimiento vegetal de interés, que comprende el núcleo, organelos o el citoplasma u otro compartimiento dentro de una célula vegetal, por lo cual bien sea la transcripción y/o traslación o, para el caso de las moléculas de efector directo (ADN, ARN, o proteína), las moléculas o complejos introducidos, pueden desplegar su efecto dentro de la célula vegetal, aunque no ocurre una integración estable en el genoma de la célula y con ello no se heredan las correspondientes secuencias y/o moléculas de efector.
El término genoma, como se usa en la presente memoria, se refiere a la totalidad del material genético, que comprende genes y secuencias que no codifican, que están presentes en una célula de un organismo o de un virus o de un organelo, y por ello comprende tanto el genoma nuclear (en caso de que esté presente) como también el genoma extranuclear (en caso de que esté presente). Además, el término genoma, como se usa en la presente memoria, se refiere a la frase completa de cromosomas, que como unidad (haploide) es heredada de un organismo progenitor.
Una motivación para el desarrollo de marcadores moleculares cada vez más novedosos en especies vegetales, es el potencial de alcanzar una elevada eficiencia de los cultivos vegetales objetivo mediante selección soportada por marcadores (Marker Assisted Selection (MAS)). Los alelos de marcadores genéticos, o alternativamente los alelos de sitios de rasgos cuantitativos (QTL) representados anteriormente son usados para identificar plantas o material vegetal o una célula vegetal, que contiene un genotipo deseado en uno o varios sitio(s), y de los cuales se asume que pueden pasar el genotipo deseado junto con un fenotipo deseado, a sus descendientes. Los alelos de marcadores genéticos (o alelos QTL) pueden ser usados también para identificar plantas que contienen un genotipo deseado en un sitio, o en varios sitios enlazados o no enlazados, por ejemplo, un haplotipo, de los cuales se asume que pueden pasar los genotipos deseados junto con un fenotipo deseado, a sus descendientes. Con el propósito de la selección soportada por marcadores, el término marcador, como se usa en la presente memoria, puede por ello comprender tanto marcadores como también sitios QTL. Una vez se determinó para un fenotipo y un sitio cromosómico polimórfico deseados, por ejemplo, un sitio marcador o un QTL, que segrega conjuntamente, es posible usar estos sitios polimórficos para seleccionar en alelos que corresponden al fenotipo deseado. Este proceder es denominado como selección soportada por marcadores (MAS). Para ello se verifica una secuencia de ácido nucleico, que corresponde al ácido nucleico marcador, en una muestra biológica de una planta, que debería ser analizada. Esta verificación puede ocurrir en la forma de la hibridación de una sonda de ácido nucleico en un marcador, por ejemplo, mediante el uso de hibridación específica del alelo, análisis de mancha del sur, análisis de mancha del norte, hibridación in situ, hibridación de cebadores seguida por amplificación por PCR de una región del marcador, o similares, o mediante toda combinación cualquiera de ellos. Los expertos en el campo conocen una multiplicidad de procedimientos para la verificación de marcadores. Una vez confirmada la presencia o ausencia de un marcador específico en la muestra biológica de interés, que comprende por lo menos una célula vegetal, preferiblemente una célula meristemática, se elige la planta correspondiente, y a continuación puede usarse para obtener plantas descendientes mediante cultivo selectivo.
Así mismo, pueden usarse los procedimientos de acuerdo con la presente invención, para analizar in planta una célula meristemática cambiada selectivamente, respecto a la presencia o ausencia de un marcador específico. A partir de esta célula meristemática pueden obtenerse entonces preferiblemente gametos o células germinales masculinos o femeninos, en donde en particular puede usarse el polen de una planta cambiada de tal modo in planta, inmediatamente para el cultivo selectivo subsiguiente. Puesto que en el cultivo vegetal clásico existe una necesidad por introducir rasgos de interés en una planta objetivo, que codifiquen un elevado rendimiento y/u otros rasgos deseables, para desarrollar mediante ello tipos mejorados de planta, existe una gran necesidad de selección soportada en marcadores, para poder mediante ello acortar el tiempo de verificación costosa y laboriosa de un gran número de pruebas.
De acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación, pueden introducirse también de manera selectiva marcadores fenotípicos en una estructura vegetal objetivo de interés. Un marcador fenotípico, como se usa en la presente memoria, denomina un marcador seleccionable que facilita la verificación y trazabilidad de una célula vegetal o estructura objetivo de interés. Los marcadores fenotípicos comprenden en general marcadores seleccionables de modo positivo o negativo, por ejemplo marcadores ópticos o genes de resistencia (antibióticos). Puede usarse todo marcador vegetal, que es útil para una estructura vegetal objetivo de interés, en particular una célula meristemática. Los marcadores seleccionables o trazables comprenden usualmente segmentos de ADN, que permiten identificar una célula, o también una molécula marcada mediante una "baliza" dentro de una célula de interés, frecuentemente bajo determinadas condiciones. Tales marcadores pueden codificar una actividad que es elegida de entre, pero no está limitada a, la producción de ARN, péptido o proteína, o los marcadores pueden suministrar un sitio de unión para ARN, lípidos, proteínas, compuestos o composiciones orgánicos e inorgánicos y similares. Los marcadores ejemplares seleccionables comprenden, sin estar limitados a ellos, segmentos de ADN, que comprenden sitios de corte de enzima de restricción, segmentos de ADN que comprenden una sonda fluorescente, segmentos de ADN de codifican productos que son mediadores de la resistencia frente a compuestos de otro modo tóxicos, que comprenden antibióticos, como por ejemplo espectinomicina, ampicilina, kanamicina, tetraciclina, BASTA, neomicinafosfotransferasa II (NEO) e higromicina-fosfotransferasa (HPT), segmentos de ADN que codifican productos que carecieron de una célula vegetal objetivo de interés en algunas circunstancias naturales, por ejemplo, genes ARNt, marcadores auxotrópicos y similares, segmentos de ADN que codifican productos que son fácilmente identificables, en particular que son perceptibles ópticamente, por ejemplo, marcadores fenotípicos como p-galactosidasa, GUS, proteínas fluorescentes, como por ejemplo proteína con fluorescencia verde (GFP) y otras proteínas fluorescentes como por ejemplo proteínas con fluorescencia azul (CFP), amarilla (YFP), o roja (RFP) así como proteínas superficiales, en donde en particular tales proteínas fluorescentes son de interés, que muestran una elevada intensidad de fluorescencia, puesto que estas proteínas pueden ser identificadas también en capas profundas de tejidos, en tanto no debiera analizarse ninguna célula individual, sino una estructura vegetal objetivo compleja o un material vegetal o una planta que comprende varios tipos de tejidos o células, nuevos sitios de cebador para PCR, las fotografías de secuencias de ADN, que no pueden ser modificadas por endonucleasas de restricción u otras enzimas que modifican ADN o dominios efectores de acuerdo con la presente divulgación, secuencias de ADN que son requeridas para modificaciones específicas, por ejemplo, modificaciones epigenéticas, por ejemplo, metilaciones, así como secuencias de ADN que portan un motivo PAM que puede ser reconocido de un sistema CRISPR adecuado de acuerdo con la presente divulgación, así como secuencias de ADN, que carecen de un motivo PAM, como ocurre en una secuencia de genoma endógeno vegetal natural.
Los procedimientos de acuerdo con la presente invención pueden ser usados en especial para el cultivo de plantas, para introducir uno o varios rasgos transgénicos en una planta, la por lo menos una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula meristemática. En la actualidad se introducen en el genoma vegetal aleatoriamente rasgos transgénicos mediante sistemas de transformación, en donde esto ocurre con procedimientos físicos/mecánicos o por ruta biológica, que comprende por ejemplo el bombardeo biolístico de material vegetal o la transformación con Agrobacterium y/o vectores virales. En el curso de los últimos años, se establecieron más y más protocolos específicos para la inserción selectiva de transgenes en el genoma de células vegetales. Una tecnología importante es, por ejemplo, la integración específica del sitio (site-specific integration (SSI)), que permite la inserción dirigida de un transgen en el mismo sitio en un cromosoma, en el cual se introdujo también un transgen ya introducido anteriormente. Además, en el curso de los últimos años se establecieron más y más sistemas de nucleasa específicos del objetivo concebidos selectivamente, para soportar la escisión de un sitio objetivo cromosómico mediante estas nucleasas. Las nucleasas usadas frecuentemente en la actualidad para la edición genómica en genomas eucariotes comprenden por ejemplo, mega-nucleasas, meganucleasas de dedo de zinc, nucleasas de dedo de zinc, nucleasas de efector similar a activador de transcripción (TALENs) así como una familia siempre creciente de nucleasas CRISPR así como variantes modificadas y fragmentos catalíticamente activos de ellas. Incluso los sistemas de nucleasa a base de CRISPR han probado ser extraordinariamente convenientes para un cambio altamente preciso específico del objetivo y programable de región objetivo de ácidos nucleicos de interés. Puesto que el sistema CRISPR es conducido mediante un ARNg frecuentemente quimérico y no permite selección de objetivo y focalización puramente a base de proteína, mediante ello puede alcanzarse una elevada extensión de seguridad y una reducción de efectos fuera del intervalo indeseados. Además, la presente divulgación ofrece otra ventaja de los sistemas CRISPR que consisten intrínsecamente en dos componentes, es decir en el sentido de que un ARNg y/o una nucleasa CRISPR, o una variante, o un fragmento catalíticamente activo de ellos, puede ser dotado selectivamente con otro dominio efector, mediante lo cual puede ampliarse claramente la variabilidad y el ámbito de uso del sistema CRISPR. Mediante una reprogramación de una nucleasa CRISPR puede generarse por ejemplo una variante cero nucleasa, que ha perdido su actividad catalítica respecto a la escisión de ADN, pero retiene su función de reconocimiento de ADN. Mediante la combinación de una molécula cambiada de este tipo con un dominio efector, en particular un dominio efector que permite la modulación epigenética del genoma de una célula objetivo de interés, por ello mediante la introducción transitoria de un sistema CRISPR, que comprende por lo menos un ARNg, por lo menos una nucleasa CRISPR así como por lo menos un dominio efector, pueden introducirse cambios epigenéticos selectivos, por ejemplo, metilaciones, desmetilaciones, acetilaciones, desacetilaciones, fosforilaciones, desfosforilaciones, o ubiquitinaciones en una histonaproteina, u otra proteína cualquiera dentro de un nucleosoma en el núcleo celular de una célula eucariota de interés. Mediante ello, incluso cuando los sistemas CRISPR usados para ello son introducidos sólo de modo transitorio en una estructura vegetal objetivo de interés y con ello no son heredados en sí mismos, pueden causarse ajustes estructurales selectivos de regiones cromosómicas, para alcanzar estados cambiados de la activación, en donde estos ajustes estructurales son entonces potencialmente hereditarios.
Los sistemas CRISPR divulgados en la presente memoria así como en particular los procedimientos divulgados en la presente memoria para el cambio selectivo de por lo menos una célula meristemática, son adecuados en particular para la edición genómica de células u organismos vegetales, puesto que debido a la elevada precisión pueden evitarse cortes fuera del intervalo, que frecuentemente son letales para las células objetivo, o conducen a efectos secundarios indeseados.
En una forma de realización, el componente de nucleasa CRISPR del sistema CRISPR, o una variante, que comprende nickasas o variantes de cero nucleasa, o un fragmento activo de ellos, puede estar presente integrado de modo estable en un genoma vegetal. La expresión de la nucleasa CRISPR puede estar bajo el control de un promotor específico de la planta, en donde el promotor puede ser un promotor constitutivo, promotor específico del tejido o promotor inducible, por ejemplo, el promotor inducible por la temperatura, la tensión, el estado de desarrollo o químicamente. en ausencia de otro componente esencial del sistema CRISPR, es decir, de un ARNg artificial o de un ARNcr, la nucleasa Cas no está en capacidad de cortar y/o reconocer ADN, de modo que la auténtica presencia de la nucleasa Cas no tiene o tiene sólo pequeñas influencia en la célula vegetal de interés y su metabolismo. Por ello, es una ventaja del procedimiento divulgado en la presente memoria para el cultivo y el desarrollo vegetal, que pueden producirse y propagarse líneas celulares o líneas vegetales transgénicas, que pueden expresar de modo constitutivo o inducible una nucleasa Cas, o una variante o un fragmento catalíticamente activo de ellos, sin que esto tenga consecuencias negativas sobre la integridad celular o la viabilidad celular. Para alcanzar la actividad de una nucleasa CRISPR, ya sea preparada de modo transitorio o integrada de modo estable como se representó anteriormente, como otro mecanismo de seguridad es necesaria siempre la presencia de un ARNg o de un ARNcr, que puede ser introducido en modo transitorio o estable, mediante una multiplicidad de procedimientos, en una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática de interés. el ARNg puede ser introducido como un vector en la célula, por ejemplo como híbrido de ADN que puede ser transcrito en forma de un híbrido genético, en donde entonces, bajo el control de un promotor adecuado, el ARNg puede ser transcrito de modo constitutivo o inducible y con ello puede ser preparado de modo viable. Alternativamente, el ARNg puede ser introducido también directamente como ARN en una estructura vegetal objetivo de interés. La nucleasa CRISPR y el ARNg pueden ser introducidos con ello simultáneamente o a lo largo del tiempo, en donde se prefiere que el ARNg y la nucleasa CRISPR sean preparados espacial y temporalmente de modo que el ARN poco estable y la proteína nucleasa CRISPR puedan interactuar en composiciones ideales estequiométricas en el compartimiento celular de interés. En tanto el objetivo del cambio selectivo sea un ARN, entonces el compartimiento de interés es el citoplasma de una célula objetivo. En tanto la región objetivo de ácido nucleico de interés sea ADN genómico o el nucleosoma, entonces el compartimiento de interés es el núcleo celular de una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática. en esta configuración, puede ser necesario que ARNg y/o nucleasa CRISPR estén enlazados de modo funcional con secuencias adecuadas de localización de núcleo, con lo cual las moléculas de CRISPR o el complejo CRISPR de ARNg y nucleasa CRISPR así como opcionalmente los dominios efectores asociados con ellos, pueden alcanzar su sitio de acción. En otra forma de realización, en tanto la región objetivo de ácido nucleico esté localizada en un organelo, en particular plástido, puede ser necesaria la presencia de secuencias de localización de plástidos, por ejemplo, secuencias mitocondriales de localización o secuencias de localización de cloroplastos, para dirigir la herramienta CRISPR de acuerdo con la presente divulgación, al sitio de acción.
Un ARNg de acuerdo con la presente divulgación puede representar una molécula individual, o puede ser usado o estar presente en forma de dos ARNs separados, que corresponden a ARNcr y/o traARNcr.
Recombinante, como se usa en la presente memoria, significa un arreglo de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, como no ocurre de modo natural en particular en su totalidad. Además, el término recombinante comprende también aquellos arreglos de secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, como incluso ocurren naturalmente respecto de sus secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos, aunque fueron obtenidos mediante una modificación o síntesis selectivas, como por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos obtenidas mediante síntesis, o secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos obtenidas mediante biotecnología, por ejemplo, procedimientos fermentativos, que incluso ocurren en la naturaleza, aunque fueron producidas selectivamente en uno diferente al organismo original.
El término epigenética o de modo epigenético, como se usa en la presente memoria, describe el ajuste estructural de regiones cromosómicas, para codificar, señalizar, conservar estados modificados de la activación y potencialmente heredar a los descendientes de una célula. De acuerdo con ello, mediante cambios que no están codificados en sí mismos en el ADN genómico, se alcanzan cambios estructurales y potencialmente hereditarios.
Cuando quiera que la presente divulgación considere homologías de secuencia o identidades de secuencia o de secuencias de ácidos nucleicos o de proteínas, en forma de datos en porcentaje, estos datos se refieren a valores, como pueden calcularse mediante el uso de EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (nucleótidos), (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/nucleotide.html) para secuencias de ácidos nucleicos o, EMBOSS Water Pairwise Sequence Alignments (proteína), (http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/) para secuencias de aminoácidos. Con herramientas puestas a disposición por el European Molecular Biology Laboratory (EMBL) European Bioinformatics Institute (EBI), para alineaciones de secuencias locales usan un algoritmo modificado de Smith-Waterman (véase http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ y Smith, T.F. & Waterman, M.S. "Identification of common molecular subsequences" Journal of Molecular Biology, 1981 147 (1):195-197). Además, en este caso durante la ejecución de la respectiva alineación pareada de dos secuencias, mediante el uso del algoritmo modificado de Smith-Waterman, se hace referencia al parámetro predeterminado indicado actualmente por EMBL-EBI. Éste dice (i) para secuencias de aminoácidos: matriz = BLOSUM62, penalidad de brecha abierta = 10 y penalidad de brecha extendida = 0,5 y (ii) para secuencias de ácidos nucleicos: matriz = ADN completo, penalidad de brecha abierta = 10 y penalidad de brecha extendida = 0,5.
En el sentido de la presente invención, se entiende por "secuencias homólogas" u "homólogos" o términos comparables, secuencias de ácidos nucleicos que tienen el mismo origen filogenético. Preferiblemente, las proteínas que son codificadas por estas secuencias de ácidos nucleicos ejercen la misma función. Las secuencias homólogas de ácidos nucleicos exhiben por lo menos 70 %, preferiblemente por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 % o por lo menos 90 %, de modo particular preferiblemente por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 % o por lo menos 99 % de identidad de secuencia.
Región objetivo de ácido nucleico, como se usa en la presente memoria, se refiere a todo ADN o ARN genómico y extracromosómico, en particular ARNm, de un organismo objetivo o de una célula objetivo, cuya modificación es deseable y que puede ser causada mediante los procedimientos e híbridos divulgados en el presente documento y no está limitado de modo intencional a las regiones de gen, es decir, regiones que portan la información para la transcripción de un ARNm. Estas regiones objetivo son con ello regiones objetivo naturales o endógenas, en donde en este concepto los términos endógeno y natural son usados de modo intercambiable. Además, el término región objetivo de ácido nucleico no está limitado a una secuencia endógena. En el caso de que se haya introducido una región objetivo artificial de ácido nucleico previamente en una célula objetivo de una estructura objetivo, el término región objetivo de ácido nucleico puede referirse en ello también a una región objetivo de ácido nucleico introducida de modo artificial.
Complementario o complementariedad, como se usa en la presente memoria, describe la relación entre dos regiones de ácido nucleico de a Dn o de ARN, que debido a sus nucleobases, ajustan mutuamente de acuerdo al principio de llave y cerradura y llegan a formar puentes de hidrógeno entre ellas (forman híbridos). En este caso, de acuerdo con el pareamiento de bases de Watson-Crick, son válidas como complementarias las bases adenina y timina/uracilo o guanina y citosina. También otros pareamientos de no Watson-Crick, como pareamientos inversos de Watson-Crick, de Hoogsteen, inversos de Hoogsteen y pareamientos de Wobble, están comprendidos en el término complementario, en tanto los correspondientes pares de bases formen mutuamente puentes de hidrógeno, es decir, puedan formar híbridos mutuamente dos diferentes cuerdas de ácido nucleico, debido a su complementariedad.
Bajo "hibridar" o "hibridación" se entiende un procedimiento en el cual una molécula de ácido nucleico de cuerda individual se deposita en una cuerda de ácido nucleico con la más amplia complementariedad, es decir, llega a pareamientos de bases. Los procedimientos estándar para la hibridación son descritos por ejemplo en Sambrook et al. 2001. Preferiblemente se entiende por ello que por lo menos 60 %, más preferiblemente por lo menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o 85 %, de modo particular preferiblemente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases de la secuencia de ácidos nucleicos llegan a un pareamiento de bases con la cuerda de ácido nucleico, con la más amplia complementariedad. La posibilidad de una deposición tal depende de la exigencia de las condiciones de hibridación. El término "exigencia" se refiere a las condiciones de hibridación. Se da una elevada exigencia entonces cuando se complica un pareamiento de bases, baja exigencia, cuando se facilita un pareamiento de bases. La exigencia de las condiciones de hibridación depende por ejemplo de la concentración de sal o la fuerza iónica y la temperatura. En general, puede elevarse la exigencia mediante una elevación de la temperatura y/o una disminución del contenido de sal. Se entiende por "condiciones exigentes de hibridación" aquellas condiciones en las cuales tiene lugar una hibridación predominantemente sólo entre secuencias homólogas de ácidos nucleicos. El término "condiciones de hibridación" se refiere al respecto no sólo a las condiciones prevalentes durante la verdadera deposición de los ácidos nucleicos, sino también a las condiciones prevalentes durante los pasos subsiguientes de lavado. Las condiciones exigentes de hibridación son por ejemplo condiciones bajo las cuales hibridan predominantemente sólo aquellos ácidos nucleicos, que exhiben por lo menos 70 %, preferiblemente por lo menos 75 %, por lo menos 80 %, por lo menos 85 % o por lo menos 90 %, de modo particular preferiblemente por lo menos 95 %, por lo menos 96 %, por lo menos 97 %, por lo menos 98 % o por lo menos 99 % de identidad de secuencia. Son condiciones exigentes de hibridación por ejemplo: hibridación en 4 x SSC a 65 °C y subsiguiente lavado múltiple en 0,1 x SSC a 65 °C durante un total de aproximadamente 1 hora. El concepto "condiciones exigentes de hibridación" usado en este caso puede significar también: hibridación a 68 °C en fosfato de sodio 0,25 M, pH 7,2, SDS 7 %, EDTA 1 mM y BSA 1 % durante 16 horas y subsiguiente lavado dos veces con 2 x SSC y SDS 0,1 % a 68 °C. Preferiblemente, una hibridación tiene lugar bajo condiciones exigentes.
Descripción detallada
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una planta de maíz como se define en la reivindicación 1.
Las células meristemáticas pertenecen a un tipo de tejido dentro de una planta, que es denominado como meristemo o también tejido de formación. como también las células nativas en organismos animales, las células vegetales meristemáticas poseen como células diferenciadas la capacidad de diferenciarse, dependiendo de la influencia del ambiente, hasta todo tipo de célula especializada.
En todas las formas de realización, los componentes individuales pueden ser introducidos simultánea o sucesivamente en los mismos o en diferentes híbridos. en algunas formas de realización de la inserción transitoria, puede ser ventajoso introducir en primera instancia el híbrido, el cual porta uno o varios componentes de proteína del sistema, es decir, nucleasa CRISPR, variante o fragmento catalíticamente activo de ellas y opcionalmente un dominio efector. Opcionalmente, cuando se trata de un híbrido de ADN, este por lo menos un híbrido puede ser trasladado en primera instancia desde la célula. A lo largo del tiempo pueden introducirse entonces los híbridos, que portan ARNg y los otros opcionales patrones de reparación de ADN y/o dominios efectores. Mediante ello puede asegurarse que el ARNg más inestable puede interactuar inmediatamente con la nucleasa CRISPR de interés y que ninguna degradación del ARNg impida una edición eficaz de ADN.
Por ello, de acuerdo con la presente invención se suministra un procedimiento especial, el cual puede activar directa o indirectamente de manera selectiva la baja población de células meristemáticas en una planta, como estructura vegetal objetivo. La por lo menos una célula meristemática objetivo puede ser activada directa o indirectamente, es decir, por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación puede ser introducido directamente en la por lo menos una célula meristemática objetivo, o el por lo menos un híbrido recombinante puede ser introducido con ayuda de un vector adecuado en una célula vegetal cualquiera o un tejido vegetal cualquiera, en donde el por lo menos un híbrido recombinante puede ser transportado a continuación hasta la estructura vegetal objetivo. Esto ocurre por ejemplo mediante la propagación sistémica de por lo menos un híbrido recombinante introducido mediante un vector, en una célula vegetal o en un tejido vegetal.
Una estructura vegetal objetivo, como se usa en la presente memoria, comprende por lo menos una célula vegetal meristemática, que puede estar presente como tejido, material vegetal, como planta completa o como célula aislada, en donde la célula vegetal meristemática contiene además por lo menos una región objetivo de ácido nucleico. La por lo menos una región objetivo de ácido nucleico contenida en la estructura vegetal objetivo comprende secuencias de ADN y de ARN y puede estar presente dentro de la estructura objetivo de modo cromosómico o extracromosómico. Los procedimientos a base de CRISPR dirigidos al objetivo para el cambio de una región objetivo de ácido nucleico de interés pueden al respecto ser usados durante la modificación de ADN genómico, que comprende la modificación epigenética de ADN genómico, o la modificación de ADN de plástidos o mitocondriales, así mismo como durante la modificación, por ejemplo en forma de silenciamiento, de ARN.
En un aspecto de la presente invención, que se refiere a la introducción de un cambio selectivo de ácido nucleico en una estructura celular no cromosómica, el término estructura vegetal objetivo, como se usa en la presente memoria, comprende por lo menos una célula vegetal que puede estar presente como tejido, material vegetal, como planta completa o como célula aislada, en donde la célula vegetal contiene además por lo menos una región objetivo de ácido nucleico, que comprende ADN y ARN.
De acuerdo con la presente invención, se cambia por lo menos una región objetivo de ácido nucleico en una célula meristemática vegetal como estructura celular, mediante herramientas CRISPR/Cas y/o dado el caso otros dominios efectores, introducidos de modo transitorio. Puesto que la por lo menos una célula meristemática así cambiada puede pasar el cambio selectivo en la región objetivo de ácido nucleico, mediante la subsiguiente división celular y diferenciación, inmediata y directamente a sus descendientes, el procedimiento de acuerdo con la presente invención no requiere otros pasos de cruce y selección, para suministrar una planta, material vegetal o una célula vegetal con el cambio selectivo deseado. Más bien, a partir de los meristemos embrionales o así mismo de los secundarios, como por ejemplo, polen u ovarios, mediante la ejecución de una autofecundación o fecundación externa, opcionalmente pueden obtenerse organismos vegetales o estructuras vegetales objetivo, que portan el cambio introducido de modo localizado.
Al respecto, el procedimiento de acuerdo con la presente invención ofrece como otras ventajas que la herramienta CRISPR/Cas y/o dado el caso otros dominios efectores son introducidos sólo transitoriamente en la estructura vegetal objetivo, es decir, una célula meristemática o un tejido meristemático, de modo que no ocurre una integración estable de la herramienta CRISPR/Cas como nucleasa CRISPR y ARNg y dado el caso secuencias reguladoras así como dado el caso otros dominios efectores, en los ácidos nucleicos endógenos cromosómicos o endógenos extracromosómicos de la estructura vegetal objetivo.
De acuerdo con la presente divulgación se encontró que mediante el aprovechamiento del mecanismo de acción de la modificación de ADN dirigida por ARN de las herramientas CRISPR-Cas, también pueden usarse otros dominios efectores, de acuerdo con el procedimiento suministrado en la presente memoria, mediante lo cual se amplía el espectro de la edición selectiva del genoma. Pueden enlazarse con un dominio efector la variante de nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos o el ARNg o ambos de ellos.
Un dominio efector, como se usa en la presente memoria, comprende polipéptidos o ácidos nucleicos que modifican ADN o ARN o que enlazan ADN o ARN, que comprenden todos los tipos de nucleasas monoméricas, diméricas o multiméricas, como por ejemplo, nucleasas TALE, meganucleasas, nucleasas de dedo de zinc, ribonucleasa, desoxirribonucleasas, exonucleasas, endonucleasas y endonucleasas de restricción de los tipos I, II, III o IV y similares y que comprenden nickasas, activadores y represores de transcripción, fosfatasas, glicosilasas, o enzimas que pueden causar cambios epigenéticos, como por ejemplo acetilasas, metilasas, metiltransferasas, proteínas que pueden enlazar ADN metilado, o histona-desacetilasas, aptámeros, que comprende secuencias de cuerda individual de ADN o de ARN así como péptidos, proteínas fluorescentes, secuencias de ácidos nucleicos marcadores o de aminoácidos marcadores, y similares, y combinaciones de ellos. Respecto a enzimas o polipéptidos en general, el término "dominio efector" comprende también un dominio catalítico o un dominio de núcleo de la respectiva enzima o polipéptido, por ejemplo, una proteína de enlace, en donde el dominio catalítico o dominio de núcleo continúa en capacidad de satisfacer la función enzimática o de unión de la respectiva enzima o polipéptido nativos. Los expertos en el campo conocen el concepto de tales dominios truncados y su ajuste a la función deseada.
En este caso se suministran procedimientos e híbridos de los cuales ARNg y/o nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos son preparados ya enlazados con otro dominio efector como o sobre un híbrido recombinante. El ARNg y/o la nucleasa CRISPR, que comprende por lo menos un dominio efector, son entonces introducidos en por lo menos un híbrido recombinante en una estructura objetivo, para poder ensamblar allí después de la transcripción y opcionalmente traslación, a un complejo funcional.
En otra forma de realización, se suministra un procedimiento en el cual el por lo menos un ARNg así como la por lo menos una nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos y/o por lo menos otro dominio efector, son preparados separadamente sobre diferentes híbridos recombinantes. De acuerdo con este procedimiento, los componentes de ARNg pueden ser preparados como ADN o ARN, la nucleasa CRISPR o variante o el fragmento catalíticamente activo de ellos pueden ser preparados como ADN o ARN o como secuencia de polipéptidos, y el dominio efector puede ser preparado como ADN o ARN o como secuencia de polipéptidos. El ARNg y la nucleasa CRISPR, que comprenden opcionalmente por lo menos un dominio efector, pueden con ello ser ensamblados previamente in vitro y después ser introducidos en una estructura objetivo.
De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, que comprende la inserción simultánea de por lo menos un ARNg así como por lo menos una variante de nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ellos, junto con por lo menos un dominio efector, el dominio efector puede estar enlazado con el ARNg o la variante de nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos, mediante un agente de enlace de ácido nucleico o de aminoácido, para garantizar un arreglo ideal de los dominios uno respecto a otro y mediante ello su funcionalidad, por flexibilidad adecuada de los dominios. De acuerdo con una forma de realización, se prefiere que para la producción de una planta optimizada selectivamente, de un material vegetal o de una célula vegetal, aparte de un ARNg y una nucleasa CRISPR, por ejemplo también una nucleasa Cas o Cpf1, que puede comprender independientemente una de otra un dominio efector, se prepare también un patrón de reparación de ADN. Esta forma de realización es preferida en especial, en tanto se use una nucleasa CRISPR, o un fragmento catalíticamente activo de ellos, que está en capacidad de catalizar la introducción de una ruptura selectiva de ADN de cuerda doble en una región objetivo de ácido nucleico de interés. La preparación adicional de un patrón de reparación de ADN, bien sea en la forma de ADN de cuerda doble o de cuerda individual, puede superar el mecanismo de reparación de NHEJ natural y falible de una célula vegetal, para causar mediante ello una precisión aún mayor de la edición del genoma, así como la posibilidad de la introducción selectiva de inserciones, mutaciones o eliminaciones. El patrón de reparación de ADN puede ser preparado en este caso en la forma de un híbrido recombinante, sea separadamente o sobre el mismo híbrido, el cual es usado para la inserción del ARNg y/o de la nucleasa CRISPR. Alternativamente, el patrón de reparación de ADN puede ser introducido directamente en una célula objetivo o estructura objetivo de interés, mediante transfección o transformación. Usualmente un patrón de reparación de ADN está configurado de modo que comprende brazos derecho e izquierdo de homología, que flanquean la posición que es escindida por una nucleasa CRISPR. Los dos brazos de homología pueden comprender una longitud de varios cientos, por ejemplo, por lo menos 100, por lo menos 200, por lo menos 300, por lo menos 400 o por lo menos 500 pares de bases (pb) hasta 1 kilobase (kb) o más. Una región de homología, es decir, una región de la coincidencia de secuencia, puede comprender por lo menos 5-10, 5­ 15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5- 50, 5-55, 5-60, 5-65, 5- 70, 5-75, 5- 80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 5-200, 5-300, 5-400, 5-500, 5-600, 5-700, 5-800, 5-900, 5-1000, 5-1 100, 5-1200, 5-1300, 5-1400, 5-1500, 5-1600, 5-1700, 5-1800, 5-1900, 5-2000, 5-2100, 5-2200, 5-2300, 5-2400, 5-2500, 5-2600, 5-2700, 5-2800, 5-2900, 5-3000, 5-3100 o más bases, con lo cual la región de homología posee suficiente homología para permitir una recombinación homóloga con la correspondiente región genómica. En este contexto, suficiente homología significa que dos polinucleótidos disponen de suficiente similitud estructural y con ello pueden servir como sustrato para una recombinación homóloga. De acuerdo con ello, también puede variar el grado de homología de dos respectivos brazos de homología de un patrón de reparación de ADN respecto a la correspondiente región objetivo de ácido nucleico. En general, para las longitudes menores de la región de homología, es necesario un mayor grado de homología, para alcanzar una deposición adecuada de secuencias complementarias de ácido nucleico. De acuerdo con ello, el grado de homología, es decir, la identidad de secuencia puede ser de por lo menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 %. Además, el patrón de reparación de ADN comprende un híbrido localizado centralmente, que porta una secuencia que va a ser introducida, por ejemplo un transgen, o una modificación que va a ser introducida. La ocurrencia de la inserción de un cambio selectivo, en una estructura objetivo de ácido nucleico puede ser verificada continuación mediante procedimientos (cuantitativos) por PCR. Mediante una PCR a través de cebador, específicamente para los dos brazos de homología, puede amplificarse un híbrido correspondiente, cuya secuencia puede entonces ser determinada, para establecer por un lado si la reparación ocurrió mediante la maquinaria NHEJ propia de la célula, o mediante recombinación homóloga, asistida por el patrón de reparación de ADN.
De acuerdo con otra forma de realización, se prevé que en primera instancia se prepare por lo menos la primera planta, primer material vegetal o una célula vegetal que comprenda por lo menos una nucleasa CRISPR, preferiblemente una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, en donde la nucleasa CRISPR está integrada de modo transitorio. Esta forma de realización es especialmente ventajosa, en tanto ésta por lo menos primera planta, material vegetal o una célula vegetal deba ser usada posteriormente con por lo menos una segunda planta, en donde la segunda planta, o por lo menos una célula vegetal meristemática de ella, comprenda un ARNg que puede interactuar con la nucleasa Cas de la primera planta y mediante ello pueda causar una edición selectiva del genoma. La inserción exitosa de un cambio selectivo en una región objetivo de ácido nucleico de interés de acuerdo con la presente invención, puede ser verificada fácilmente por el experto con ayuda de procedimientos como cadena de reacción de polimerasa y similares, dado que se conoce la región objetivo de ácido nucleico de interés, y con ello la región en la cual puede depositarse cebador PCR y ya fue relevante para el diseño de un ARNg y/o de un patrón de reparación de ADN.
Los activadores y represores que pueden usarse de acuerdo con la presente invención comprenden preferiblemente SEQ ID NOs: 1-4 y secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias las cuales, a pesar de la modificación, satisfacen la misma función que las secuencias con los correspondientes SEQ ID NOs.
En consecuencia, un cambio selectivo de acuerdo con la presente divulgación puede comprender (i) el intercambio de por lo menos un nucleótido de una región objetivo de ácido nucleico; (ii) la eliminación de por lo menos un nucleótido de una región objetivo de ácido nucleico; (iii) la inserción de por lo menos un nucleótido de una región objetivo de ácido nucleico; (iv) el cambio epigenético selectivo en la región que es responsable de la regulación de por lo menos una región objetivo de ácido nucleico; (v) la unión y/o visualización en/de por lo menos un nucleótido de una región objetivo de ácido nucleico o (vi) la interacción con y/o la escisión de por lo menos una región objetivo de ácido nucleico a Rn o cualquier combinación de (i) a (vi). Los procedimientos de acuerdo con la presente invención pueden ser usados en particular para el desarrollo preciso y eficiente de rasgos en una planta, en material vegetal o en una célula vegetal.
En otra forma de realización del primer aspecto de la presente invención, se suministra un procedimiento para la producción de una planta, de un material vegetal o de una célula vegetal, en el cual se prepara por lo menos una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, por lo menos un ARNg, por lo menos una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ellos y/o un dominio efector así como por lo menos un patrón de reparación de ADN, en donde el cambio selectivo en la región objetivo de ácido nucleico de interés consiste en que por lo menos una secuencia heteróloga, es decir, no endógena, que comprende un gen que es elegido de entre el grupo consistente en un gen reportador, un marcador de selección, un gen mediador de resistencia contra enfermedades, un gen mediador de resistencia contra los herbicidas, un gen mediador de resistencia contra insectos o nemátodos, un gen que está involucrado en el metabolismo de los carbohidratos, un gen que está involucrado en el metabolismo de ácidos grasos, un gen que está involucrado en el metabolismo de aminoácidos, un gen que participa el desarrollo de la planta, un gen que participa en la regulación del crecimiento de la planta, un gen que participa en el mejoramiento del rendimiento de un material vegetal de interés, un gen que es partícipe en la mediación de resistencia contra la sequedad, un gen que es partícipe en la mediación de la resistencia al frío, un gen que es partícipe en la mediación de la resistencia al calor, un gen que es partícipe en la mediación de la resistencia contra una sal o sales, o un gen que codifica un ARN funcional, en donde el ARN es elegido de entre el grupo consistente en un ARNml, un ARNsi, u otro ARN, que puede formar una estructura de repetición invertida, por ejemplo, un híbrido ddARNi, el cual codifica tanto una cuerda en sentido como también una contra sentido (sentido y antisentido) y codifica un bucle de horquilla que une la cuerda sentido y la antisentido, es introducida en el genoma de una estructura vegetal objetivo de interés que comprende por lo menos una célula meristemática.
Además, son adecuados los procedimientos de acuerdo con la presente divulgación, para formar un sitio complejo de rasgos. Un sitio complejo de rasgos representa un segmento cromosómico, que dispone de por lo menos dos regiones cambiadas de ácido nucleico y puede ser integrado en una región objetivo de ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación, en un paso o secuencialmente, en donde las por lo menos dos regiones cambiadas de ácido nucleico están enlazadas una a otra genéticamente. Las por lo menos dos regiones cambiadas de ácido nucleico descienden en este caso de un sitio endógeno de planta, o el cambio denomina una mutación o eliminación de ADN cromosómico, o las por lo menos en dos regiones cambiadas de ácido nucleico representan secuencias transgénicas, o una combinación de ellas. Puesto que el patrón de reparación de ADN de acuerdo con la presente divulgación es adecuado para regular un híbrido localizado centralmente con una longitud de por lo menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 1000, 2000, 3000, 4000 pb o más, los procedimientos de acuerdo con la presente divulgación son adecuados para introducir un sitio complejo de rasgos en una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, y mediante ello introducir con elevada precisión y eficiencia un rasgo complejo en una estructura vegetal objetivo, directamente por el uso de un sistema CRISPR. Puesto de acuerdo con el procedimiento de la presente invención puede producirse directamente por lo menos una planta, por lo menos un material vegetal o por lo menos una célula vegetal, se abre la posibilidad de poner a disposición en corto tiempo células vegetales, material vegetal o plantas cambiados selectivamente y adecuados para otro cruce, cultivo o para otro cambio selectivo. En una forma de realización, por ejemplo una primera planta fértil, que contiene en su genoma un primer cambio selectivo, puede ser cruzada con una segunda planta, que contiene en su genoma un segundo cambio selectivo, de modo que los cambios selectivos pueden estar unidos físicamente, es decir, ser parte de la misma molécula de ácido nucleico, en donde por lo menos la primera o la segunda o ambas plantas fueron obtenidas de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación. Mediante las propiedades intrínsecas del sistema CRISPR y conocimiento sobre motivos PAM y la interacción de un ARNg artificial con una nucleasa CRISPR, pueden introducirse en un sitio de manera selectiva también sitios de reconocimiento artificiales en forma de una región objetivo de ácido nucleico cambiada, para generar a continuación un sitio complejo intercalado, que comprende más de un cambio selectivo.
En otra forma de realización, puede introducirse también un sitio de rasgo complejo directamente en una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática. Puesto que puede aumentarse la escala del sistema CRISPR de acuerdo con la presente divulgación en el sentido de que comprende varias nucleasas CRISPR, varios ARNgs ajustados dado el caso específicamente a la nucleasa CRISPR y/o una región objetivo de ácido nucleico de interés, así como por lo menos un patrón de reparación de ADN, el cual aparte de brazos adecuados de homología comprende por lo menos un rasgo de interés que debe estar integrado en el genoma de una estructura vegetal objetivo, con ello mediante el procedimiento divulgado en la presente memoria puede influirse de manera selectiva no sólo en un rasgo. Más bien, es posible introducir un rasgo genotípico complejo de manera estable en una estructura vegetal objetivo de interés, rasgo que se refleja en por lo menos un rasgo fenotípico.
Por ello, en una forma de realización de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación, se divulga un procedimiento para la fabricación de un sitio de rasgo complejo en una planta, un material vegetal o una célula vegetal, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos: (a) elección de una región genómica objetivo de ácido nucleico de interés en una planta, en donde la región genómica objetivo de ácido nucleico comprende por lo menos una primera secuencia objetivo de ácido nucleico y una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico; (b) puesta en contacto de por lo menos una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, con por lo menos un primer ARNg, un segundo ARNg, y opcionalmente por lo menos un patrón de reparación de ADN, y por lo menos una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ellos, en donde el primer y el segundo ARNg y la por lo menos una nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos pueden formar un complejo, que permite a la por lo menos una nucleasa CRISPR introducir una ruptura doble o en el caso de una nickasa una ruptura individual, en por lo menos la primera y una segunda región objetivo de ácido nucleico, en donde opcionalmente el por lo menos un ARNg o la por lo menos una nucleasa CRISPR comprende además un dominio efector, o puede estar asociado con por lo menos un dominio efector; (c) identificación de una célula del paso (b), que comprende por lo menos un primer cambio selectivo en la primera secuencia objetivo de ácido nucleico, así como un segundo cambio en una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico; y opcionalmente (d) obtención de una primera planta fértil de la por lo menos una célula meristemática del paso (c), en donde la planta fértil comprende el primer cambio selectivo de ácido nucleico y el segundo cambio selectivo de ácido nucleico, en donde el primer cambio selectivo de ácido nucleico y el segundo cambio selectivo de ácido nucleico están unidos físicamente, es decir, están localizados en la misma cuerda de ácido nucleico.
En otra forma de realización, el procedimiento comprende un procedimiento para la producción de un sitio de rasgo complejo, en el cual se modifican por lo menos dos secuencias objetivo de ácido nucleico cambiado en una región genómica objetivo de ácido nucleico de interés, en una planta, un material vegetal o una célula vegetal, que comprende los siguientes pasos: (a) elección de una región objetivo genómica en una planta, un material vegetal o una célula vegetal, que comprende por lo menos una célula meristemática, en donde la región objetivo genómica comprende una primera secuencia objetivo de ácido nucleico y una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico; (b) puesta en contacto de la por lo menos una célula vegetal, que comprende por lo menos una célula meristemática con un primer ARNg, una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ellos y opcionalmente un primer ADN donador en la forma de un patrón de reparación de ADN, en donde el primer ARNg y la primera nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ellos pueden formar un complejo, que permite a la nucleasa CRISPR introducir una ruptura de cuerda doble en la primera región objetivo de ácido nucleico, en donde el ARNg y/o la nucleasa CRISPR pueden comprender opcionalmente un dominio efector, o pueden estar asociados con un dominio efector; (c) identificación de la por lo menos una célula meristemática de (b), que comprende el primer cambio selectivo de la primera secuencia objetivo de ácido nucleico; (d) obtención de una primera planta fértil a partir de la célula de acuerdo con el paso (c), en donde la primera planta fértil comprende el primer cambio selectivo; (e) puesta en contacto de por lo menos una planta, un material vegetal o una célula vegetal, que comprende por lo menos una célula meristemática, con un segundo ARNg, una segunda nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ellos, y opcionalmente un segundo ADN donador en la forma de un patrón de reparación de ADN; (f) identificación de una célula del paso (e), en donde la célula comprende por lo menos un segundo cambio selectivo en una segunda secuencia objetivo de ácido nucleico; (g) obtención de una segunda planta fértil a partir de la célula de acuerdo con el paso (f), en donde la segunda planta fértil comprende el segundo cambio selectivo; y (h) obtención de los descendientes fértiles de la segunda planta fértil del paso (g), en donde las plantas descendientes fértiles comprenden el primero y el segundo cambios selectivos en una región objetivo de ácido nucleico de interés, en donde el primer cambio selectivo y el segundo cambio selectivo están unidos físicamente.
Las herramientas y procedimientos divulgados en el presente documento representan por ello herramientas valiosas para alcanzar de manera dirigida al objetivo y con elevada eficiencia, mediante el aprovechamiento de las herramientas CRISPR y la recombinación homóloga selectiva como mecanismo de reparación, una edición del genoma en plantas superiores. En particular, mediante el procedimiento divulgado en la presente memoria, puede superarse la evasión del mecanismo no homólogo de unión terminal (NHEJ) de reparación de ADN propenso al error de modo natural, que frecuentemente conduce a mutaciones o eliminaciones cromosómicas.
Los rasgos elegidos, que de acuerdo con la presente divulgación pueden ser introducidos en una planta o que pueden ser causados en la planta en forma de un cambio selectivo mediante edición genómica, comprenden, sin limitarse a ellos, resistencias, que comprende resistencias frente a los herbicidas así como a las plagas, que comprende plagas eucariotas y procariotas así como virus, por ejemplo, bacterias, hongos, protozoarios, virus patógenos a las plantas, nemátodos, insectos u otros organismos animales, el logro de un elevado rendimiento, en donde en donde el rendimiento puede referirse a todo producto vegetal deseado de la planta, por ejemplo, un elevado rendimiento en semillas, frutos, hidratos de carbono, proteínas o grasas, u otros productos del metabolismo celular, que comprenden otros metabolitos primarios o metabolitos secundarios, y similares. Un objetivo de la edición genómica puede ser por ejemplo el gen endógeno de sintetasa de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS). De modo natural, la EPSPS cataliza la conversión de fosfoenolpiruvato y 3-fosfoshikimato en fosfato y 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato mediante la introducción de mutaciones selectivas en este gen endógeno, puede obtenerse en un gen mutado que codifica EPSPS, el cual es mediador de la resistencia frente al herbicida N-fosfonometilglicina, o cualquier sal de ella.
Además, los procedimientos de acuerdo con la presente divulgación pueden ser usados para introducir rasgos selectivos en una planta, o para modificar de manera selectiva rasgos indeseados. De este modo, existe por ejemplo mayor necesidad por alimentos, productos alimenticios, que contengan una baja proporción de acrilamida. La acrilamida, que está clasificada como carcinógeno, surge como producto secundario indeseado de la denominada reacción de Maillard entre los aminoácidos asparagina y glutamina durante la reacción con azúcares reductores como aldosas (por ejemplo, glucosa) o aciloinas, a temperaturas desde aproximadamente 170 °C. Por ejemplo en productos vegetales ricos en almidón, por ejemplo productos de patata, existe por ello un gran interés en disminuir el contenido de reactivos que son potenciales formadores de acrilamida, por ejemplo asparagina, para de ese modo suministrar alimentos más seguros. Mediante el procedimiento divulgado en la presente memoria puede por ello crearse de manera dirigida al objetivo, una planta de patata que fue cambiada selectivamente con el propósito de influir en genes del metabolismo de asparagina, por ejemplo mediante la influencia de un gen de sintetasa de asparagina o de otro gen que esté involucrado en el metabolismo de asparagina.
Otro gen objetivo endógeno de interés en el genoma de una célula vegetal, mediante cuya modificación puede mediarse en una tolerancia o resistencia a los herbicidas, es el gen de sintetasa de aceto-hidroxiácido (AHAS). Los herbicidas inhibidores de AHAS representan a nivel mundial un herbicida importante en la agricultura. Mediante la modificación de por lo menos un alelo de un gen endógeno de AHAS con el procedimiento divulgado en la presente memoria, puede por ello generarse selectivamente una célula vegetal resistente o tolerante al herbicida, a partir del cual mediante la aproximación divulgada en el presente documento, puede obtenerse la focalización en una célula meristemática dentro de tiempo más corto en una planta fértil, o material vegetal o una célula vegetal de ellos.
Son de importancia cada vez mayor también las plantas, en particular plantas útiles para la producción de energía y nutrientes, que sean resistentes frente a diversas influencias del medio ambiente. A estas influencias del medio ambiente pertenecen el calor, sequedad, frío, naturaleza del suelo, oferta de nutrientes, salinidad y similares, asociados con ella. En consecuencia, existe una gran necesidad por el suministro de plantas que puedan prosperar también bajo influencias cambiantes de modo correspondiente y frecuentemente no en condiciones ambientales óptimas para el crecimiento óptimo. En consecuencia, tales rasgos son propiedades que pueden ser introducidas de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, de manera selectiva en una planta, en particular una planta útil, o que pueden ser producidas mediante cambios selectivos de por lo menos una región objetivo de ácido nucleico en por lo menos una estructura vegetal objetivo de interés.
En especial, respecto a la optimización de rasgos agronómicamente relevantes en una planta, puede ser además de interés cambiar y mediante ello controlar selectivamente, las secuencias endógenas que actúan en una planta como secuencias reguladoras, que comprenden promotores.
Por ello, en una forma de realización de acuerdo con la presente invención un procedimiento para la producción de una planta, un material vegetal o una célula vegetal, que comprende por lo menos un cambio selectivo en por lo menos una célula meristemática de interés, en donde el cambio selectivo es el cambio de un promotor endógeno. El cambio selectivo del promotor puede comprender el intercambio del promotor, o de un fragmento de él por otro promotor o un fragmento de él, en donde el cambio del promotor puede dar como resultado una cualquiera de las siguientes combinaciones: una elevada actividad de promotor, una elevada especificidad del tejido por el promotor, una elevada actividad del promotor inducible por un patógeno, una actividad disminuida del promotor, una actividad disminuida del tejido por el promotor, una actividad disminuida del promotor inducible por el patógeno, una nueva actividad del promotor, una actividad inducible del promotor, una actividad del promotor inducible por un patógeno, un espectro ampliado de la posible expresión del gen, que es controlada por el promotor, una modificación de la expresión del gen de una región objetivo de ácido nucleico, temporal, de localización o dependiente del estado de desarrollo, en este caso un gen vegetal de interés, mediante lo cual puede ser activo por ejemplo sólo en un estado específico del desarrollo del promotor activo, así mismo en otro estado de desarrollo, considerado desde el punto de vista del sitio, en otro tejido, o una mutación de elementos de unión de ADN, y/o la eliminación o adición de elementos de unión de ADN. El promotor o el fragmento suyo, que debería ser modificado de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación, puede ser un promotor o un fragmento suyo, que es endógeno en la célula vegetal de interés, pero puede tratarse así mismo de un promotor artificial o de un promotor transgénico, que está presente en una estructura vegetal objetivo de interés, la cual comprende por lo menos una célula meristemática. Preferiblemente el promotor o el fragmento suyo que debería ser cambiado, está integrado en el genoma cromosómico o extracromosómico de una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula meristemática. Sin embargo, el promotor que va a ser cambiado o su fragmento pueden estar presentes también en un híbrido extracromosómico integrado de modo no genómico, por ejemplo, un plásmido.
Otros rasgos interesantes representan aquellos genes endógenos que codifican proteínas relevantes de metabolismo, de información y/o de transducción de señal, por ejemplo, quinasas, factores de transcripción, proteínas de dedo de zinc o de choque por calor. Un cambio selectivo de estos genes y con ello de la proteína codificada, permiten un engranaje en una multiplicidad de procesos fisiológicos y abre por ello la posibilidad de controlar de manera selectiva procesos metabólicos. Además, estos genes y los elementos de ADN reguladores relacionados y las regiones que codifican las proteínas reguladoras, representan regiones objetivo de ácido nucleico interesantes, que son responsables de la fertilidad y/o esterilidad de una planta.
Otros factores condicionados de modo biótico y abiótico, las posibilidades de reacción sobre las cuales puede modificarse mediante cambio selectivo una planta objetivo, de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación, comprenden escasez de nutrientes, reacción a la exposición frente a metales tóxicos, elementos traza, calidad, en particular calidad de las semillas o de la cosecha, contenido optimizado de nutrientes, cantidad y calidad del almidón, tamaño de las semillas o granos, contenido total de carbohidratos, que comprenden almidones, sacarosa y otros mono-, di- y polisacáridos, fijación y uso de nitrógeno, contenido de ácidos grasos y/o aceite y/o la composición de las grasas/aceites, que comprenden grasas saturadas e insaturadas, una elevación en el contenido de lisina, u otros aminoácidos o azufre en un producto vegetal, o también una combinación de los rasgos mencionados. Los genes ejemplares que pueden elevar el rendimiento de cereales son por ejemplo deshidrogenasas de glutamato inducibles por amonio. Los genes que influyen en la biosíntesis de aminoácidos son por ejemplo, sintetasas de antranilato (EC 4.1.3.27).
En una forma de realización, la región objetivo de ácido nucleico que va a ser cambiada selectivamente puede ser un promotor, en donde el cambio selectivo comprende el intercambio de un promotor nativo de EPSPS1 por un promotor vegetal de ubiquitina.
En otra forma de realización, la región objetivo de ácido nucleico que va a ser cambiada selectivamente puede ser un promotor, en donde el cambio selectivo del promotor comprende el intercambio de un promotor endógeno de NPK1 de maíz, por un promotor de maíz RAB17 inducible por el estrés.
En una forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, la región objetivo de ácido nucleico de interés puede ser un promotor, en donde el promotor que debería ser cambiado selectivamente es elegido de entre el grupo que comprende promotor PEPC1 de Zea mays (Kausch et al, Plant Molecular Biology, 45:1-15, 2001), un promotor de ubiquitina de Zea mays (UBI1ZM PRO, véase Christensen et al, Plant Molecular Biology 18:675 - 689, 1992), un promotor de Rootmet 2 de Zea mays, un promotor de actina de arroz (US-ACTIN PRO, McElroy et al, The Plant Cell, entrega 2, 163 -171, febrero de 1990), un promotor RCC3 del mijo, un promotor GOS2 de Zea mays, un promotor ACO2 de Zea mays, o un promotor de oleosina de Zea mays.
Puesto que los procedimientos divulgados en el presente documento, como se representó anteriormente, son también adecuados para introducir inserciones selectivas en una región objetivo de ácido nucleico de interés mediante la combinación de un sistema CRISPR, en particular la combinación de por lo menos una nucleasa CRISPR específica, o una variante o un fragmento activo de ella, junto con un ARNg específico así como un patrón de reparación de ADN, otra forma de realización de la presente divulgación se dirige al suministro de un procedimiento para la inserción de un promotor o de un elemento promotor en una región genómica objetivo de ácido nucleico de interés en una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, en donde la inserción de promotor conduce a uno cualquiera de los siguientes cambios fenotípicos: una elevada actividad de promotor, es decir, una elevada fuerza de promotor, una elevada especificidad de tejido por el promotor, una nueva actividad de promotor, una actividad inducible de promotor, un espectro ampliado de la expresión de gen del gen que es regulado por el promotor, o que es colocado por introducción de un promotor exógeno bajo el control de este promotor recientemente introducido, un cambio de la expresión de gen que depende del tiempo, del sitio o del estado de desarrollo, una mutación de elementos de unión de ADN y/o la adición de elementos de unión de ADN. Los elementos elegidos de promotor, que pueden ser introducidos de acuerdo con el procedimiento de la presente invención en una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática de interés comprenden, sin estar limitados a ellos, elementos de núcleo de promotor, como por ejemplo caja CAAT, una caja, una caja de Pribnow, un elemento de unión mediador de carácter inducible por patógeno como una caja W, caja S o caja D y/o una caja TATA, secuencias reguladoras, que pueden influir en la traslación, y/o un sistema represor para el logro de una expresión inducible, como, por ejemplo un elemento tetoperador/represor/inductor, o un elemento represor/operador/inductor de sulfonilurea. Otros sistemas regulables de promotor/operador, que pueden ser introducidos con el propósito de la presente divulgación en una estructura vegetal objetivo de interés, son conocidos por los expertos en el campo. Un promotor ejemplar, que puede ser introducido como promotor exógeno en una estructura vegetal objetivo de interés, es por ejemplo el promotor DRE. Este promotor fue descrito por Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki (1994), Plant Cell 6, 251 - 264 como elemento promotor que actúa de modo cis en el promotor rd29A de resistencia contra la sequedad, que contiene una secuencia núcleo conservada que comprende nuevos pares de bases, TACCGACAT. La introducción de un promotor DRE en un promotor endógeno de un gen vegetal cualquiera puede por ello mediar la expresión inducible del gen regulado por este promotor hacia el estímulo de aridez/sequedad. Otro ejemplo son elementos responsables de ABA, que contienen una secuencia de consenso (c/T) ACGTGGC y que fueron encontrados en numerosos ABA y/o genes regulados por tensión (Busk & Pages (1998), Plant Mol. Biol. 37:425 - 435). La inserción de potenciador 35 S o de potenciador MMV en una región promotora endógena en una célula vegetal puede así mismo elevar la expresión del gen regulado. Mediante el cambio selectivo y preciso de un promotor o de una parte de él de acuerdo con la presente divulgación, puede por ello influirse selectivamente en la expresión de un gen regulado por el promotor y el cambio selectivo inducido de tal modo puede ser heredado directamente a los descendientes, puesto que la célula objetivo primaria de acuerdo con la presente invención es una célula meristemática, de modo que puede obtenerse una planta fértil o material vegetal o una célula vegetal de ellos, que en su genoma porta el cambio deseado del promotor y además exhibe un rasgo fenotípico deseado, como es el resultado por la manifestación cambiada del gen regulada por el promotor.
En otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación se suministra un procedimiento que busca el cambio selectivo de un terminador, mediante uso del procedimiento divulgado en la presente memoria. En consecuencia, la región objetivo de ácido nucleico de interés puede ser un terminador en una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática, en donde el cambio comprende el intercambio del terminador o de un fragmento suyo por otro terminador o un fragmento suyo, en donde el intercambio del terminador puede implicar uno o varios de los siguientes cambios fenotípicos de rasgos: una elevada actividad del terminador, una elevada especificidad del tejido por el terminador, una actividad disminuida del terminador, una especificidad disminuida del tejido por el terminador, una mutación de elementos de unión de ADN y/o una eliminación o la adición de elementos de unión de ADN. El terminador (o el fragmento suyo), que debería ser cambiado selectivamente, puede ser un terminador (o fragmento suyo) de un gen endógeno, aunque así mismo puede ser un terminador artificial o quimérico o sintético, o ser un terminador transgénico. Así mismo, el intercambio de terminador, por consiguiente del terminador o del fragmento suyo, que debería ser introducido por el procedimiento divulgado en la presente memoria en el genoma de una estructura vegetal objetivo de interés, puede ser un terminador endógeno, un terminador artificial, que comprende un terminador quimérico, o un terminador transgénico. Los terminadores ejemplares pueden ser elegidos de entre el grupo consistente en un terminador ARGOS 8 o SRTF18 de maíz, un terminador PIN-II de tomate, un terminador de actina de mijo, un terminador SB-GKAF de mijo, un terminador T28 de arroz, un terminador AT-T9 o un terminador GZ-W64-A. De acuerdo con una forma de realización preferida de la presente invención, se usa el elemento del terminador que intercambia a través de la combinación de por lo menos un ARNg ajustado a por lo menos una nucleasa CRISPR, así como una región objetivo de ácido nucleico de interés junto con un patrón de reparación de ADN, en donde el elemento central del patrón de reparación de ADN sirve como secuencia donadora para la inserción de un terminador o elemento del terminador de interés, en una región genómica objetivo de ácido nucleico de una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática.
En otra forma de realización, se aplica el sistema de ARNg/nucleasa CRISPR/patrón de reparación de ADN divulgado en la presente memoria, en una célula objetivo meristemática, para eliminar mediante ello de manera específica un terminador o un elemento de terminador, como está presente anclado de modo genómico en una estructura vegetal objetivo de interés.
Aparte de promotores y terminadores, en el genoma de células eucariotas existen aún otras secuencias reguladoras, que son de gran importancia para la regulación de la transcripción de un gen o de un ARN funcional. En una forma de realización de acuerdo con la presente divulgación se usa el sistema CRISPR divulgado en la presente memoria, para cambiar o intercambiar de manera selectiva tales secuencias reguladoras, para anclar este cambio selectivo o el intercambio, de manera estable en el genoma de una estructura vegetal objetivo de interés, impartir a los descendientes éste mediante las células meristemáticas modificadas inicialmente y poder observar un cambio fenotípico selectivo en el material vegetal o células vegetales de ellos obtenidos con ello. Las secuencias reguladoras ejemplares de acuerdo con la presente divulgación comprenden, sin estar limitadas a ellas, regiones 3'UTR (no trasladadas), regiones 5'UTR, activadores de transcripción, potenciadores o represores de transcripción, represores de traslación, factores de entre tejido, ARNmis, ARNsi, ARNmis artificiales, ARNInc, elementos promotores, potenciador CaMV 35S, elementos de potenciador MMV, elementos SECIS, señales de poliadenilación y sitios de poliubiquitinación.
En algunas formas de realización, la edición genómica, es decir, el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico, comprende el cambio selectivo o el intercambio de elementos reguladores, lo cual da como resultado uno o varios de los siguientes efectos y/o manifestaciones fenotípicas: cambio en la traslación de proteína, escisión de ARN, unión de ARN, terminación de la transcripción o cambios posttranslacionales. En una forma de realización, la región objetivo de ácido nucleico de interés, que debería ser cambiada selectivamente en una célula meristemática, es un sitio de poliubiquitinación, en donde el cambio selectivo del sitio de poliubiquitinación da como resultado una modificación de la tasa de degradación de proteína de una proteína objetivo de interés. La baliza de ubiquitina marca proteínas, de modo que éstas son degradadas a continuación en el proteasoma o mediante un proceso denominado autofagia. Los inhibidores de proteasoma son conocidos de modo correspondiente, para que puedan causar la sobreproducción de proteína. El cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico de interés, que codifica una proteína de interés, puede por ello conducir también a por lo menos una modificación de aminoácidos de la proteína de interés, en donde la modificación permite la subsiguiente poliubiquitinación de la proteína, es decir, un cambio posttranslacional, que conduce a un cambio de la degradación de la proteína o de la tasa de degradación de proteína de la proteína de interés.
En una forma de realización, la secuencia genómica de interés que debería ser cambiada es un sitio de poliubiquitinación de un gen que EPSPS de maíz, en donde el cambio selectivo del sitio de poliubiquitinación da como resultado un contenido elevado de proteína, puesto que la correspondiente proteína se degrada con una tasa menor.
En otra forma de realización, la secuencia genómica objetivo de ácido nucleico dentro de una célula meristemática, que debería ser modificada selectivamente de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, es un sitio Intron, en donde el cambio selectivo consiste en la introducción de un motivo impulsor de Intron en el Intron, lo cual da como resultado una modulación (elevación/disminución) de la actividad de transcripción del gen, que comprende este Intron.
En otra forma de realización, la región objetivo de ácido nucleico de interés dentro del genoma de una estructura vegetal objetivo, que debería ser modificada selectivamente, es un sitio Intron, en donde el cambio selectivo consiste en que se intercambia un Intron específico, por ejemplo, un lntron EPSP1 de granos de soja, por otro Intron, por ejemplo, un lntron-1 de ubiquitina de granos de soja.
En una forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, la secuencia objetivo de ácido nucleico de interés, que debería ser cambiada selectivamente en el genoma de una célula meristemática de una planta de interés, es un sitio Intron o sitio UTR, en donde el cambio selectivo consiste en que se inserta por lo menos un micro ARN en este sitio Intron o sitio UTR, mediante lo cual la expresión del gen que comprende el Intron o el sitio UTR, también conduce a la expresión de este micro ARN insertado, lo cual a su vez conduce a que todo gen objetivo de interés, bien sea un gen endógeno vegetal o el gen de una plaga de plantas, pueda ser "silenciado" mediante el micro ARN así transcrito, sin influir en la expresión de gen del gen que porta el Intron. El silenciamiento del gen o la suspensión del gen es un procedimiento en el cual se disminuye o deshabilita la expresión del gen. En este caso la regulación del gen ocurre por inhibición de la transferencia de una información genética desde el ADN al ARNm, o de la subsiguiente traducción (Translation) de la información almacenada en el ARNm a una proteína. Como silenciamiento posttranscripcional del gen son denominados los procesos que tienen lugar justo después de la transcripción de la información genética desde el ADN al ARNm que hace la transferencia. Estos fenómenos son denominados frecuentemente como interferencia de ARN o ARNi, en donde se trata de procesos reguladores con participación de moléculas de ARN específico, como micro ARNs y ARNsis o híbridos artificiales de horquilla de ddARNi. El silenciamiento posttranscripcional del gen puede conducir a una degradación intensiva de un ARNm objetivo de interés, mediante lo cual se impide la formación del producto de gen (de la proteína). Mediante ello pueden suspenderse de manera selectiva proteínas tanto endógenas como también extrañas, por ejemplo mediante un proceso denominado silenciamiento del gen inducido por huésped (host-induced gen-silencing o HIGS) o pueden ser trasladadas en frecuencia claramente menor.
En una forma de realización, se usa el procedimiento divulgado en la presente memoria para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico dentro de una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática, mediante el uso de la combinación de una nucleasa c R iSPR y de un ARNg y opcionalmente por lo menos un dominio efector, para cambiar selectivamente un factor de transcripción, es decir, mutar, eliminar un factor de transcripción, o insertar un factor de transcripción en una región objetivo de ácido nucleico de interés mediante el uso de un híbrido de donador adecuado en la forma de un patrón de reparación de ADN. Los factores ejemplares de transcripción son el factor de transcripción de dedos de zinc o el factor tapetal development and function (TDF; DE 10 2015004 187 A1). La inserción de un par de bases individuales en la secuencia que codifica un factor de transcripción puede conducir a una mutación de desplazamiento de marco, que a su vez produce una nueva proteína, que continúa mostrando actividad de unión de ADN, aunque ha perdido su capacidad de activación de la transcripción. De acuerdo con ello, por ejemplo la proteína de factor de transcripción de dedos de zinc mutado competirá con la unión en promotores de gen de citoquinina-oxidasa y bloqueará la expresión de citoquinina-oxidasa. La reducción de la expresión de citoquinina-oxidasa puede por ejemplo elevar el nivel de citoquinina en plantas de arroz y promover el crecimiento de panoja, mientras en maíz puede elevarse el crecimiento de espigas y en general puede elevar el rendimiento de un producto vegetal de interés en una multiplicidad de plantas. Por el contrario, el TDF mutado puede por ejemplo, conducir en trigo a una esterilidad masculina, que puede ser usada ventajosamente para la generación de plantas híbridas de trigo.
En otra forma de realización, los procedimientos de acuerdo con la presente divulgación pueden ser usados para cambiar de manera selectiva sitios selectivos de empalme en una región genómica objetivo de ácido nucleico de interés, en una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática, o alternativamente introducir sitios de empalme en la región genómica objetivo de ácido nucleico de interés. En células eucariotas se usa ARNm para la síntesis o expresión de proteínas, que desciende de moléculas de preARNm y a continuación atraviesa un proceso de maduración. Las moléculas de preARNm son protegidas, empalmadas y a continuación estabilizadas mediante la adición de una cuerda poli-A. Las células eucariotas han desarrollado un procedimiento complejo para el denominado empalme, que en variantes alternativas resulta en una molécula original de preARNm. En células de maíz, el proceso de empalme puede ser influenciado por ejemplo por sitios de empalme en los sitios de unión Exon-Intron. Un ejemplo de un sitio canónico de empalme es AGGT. Las secuencias que codifican genes pueden contener una multiplicidad de sitios alternativos de empalme, que pueden influir en la eficiencia total del proceso de maduración del pre-ARNm y con ello pueden limitar de manera decisiva la agrupación de proteínas. Los pares de nucleasa ARNg/CRISPR divulgados en la presente memoria, junto con dominios efectores y un patrón de reparación de ADN, que puede ser usado entonces para introducir un patrón específico de modificación en una estructura vegetal objetivo de interés, pueden ser usados para modificar una región genómica objetivo de ácido nucleico de interés, al efecto de que se inserte o se produzca con alta precisión un sitio canónico de empalme en una posición específica. Para ello, en una forma de realización puede influirse por ejemplo en un gen EPSPs vegetal, en donde el cambio selectivo del gen consiste en que se cambien tales sitios alternativos de empalme de modo que esta edición genómica selectiva resulta en una producción elevada de productos de transcripción de gen funcionales y productos de gen.
En tanto el procedimiento divulgado en la presente memoria tenga un gen vegetal endógeno como región objetivo de ácido nucleico, mediante el cambio selectivo pueden alcanzarse uno o varios de los siguientes efectos: una elevada actividad de proteína/enzima, una elevada funcionalidad de una proteína de interés, una actividad disminuida de proteína, una funcionalidad disminuida de proteína, una mutación dirigida al sitio, el intercambio de un dominio de proteína, una desactivación de proteína, una nueva funcionalidad de proteína o una funcionalidad modificada de proteína.
En una forma de realización, la desactivación de proteína puede consistir en que se introduce un codón de detención en la secuencia que codifica de interés.
En otra forma de realización, la desactivación de proteína puede consistir en que se elimina un codón de inicio de una secuencia que codifica de interés.
En otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, pueden usarse los procedimientos divulgados de la presente memoria, de manera selectiva para silenciar un gen.
En una forma de realización, el objetivo del silenciamiento del gen es un gen vegetal endógeno, otra forma de realización es el gen objetivo cuya expresión debería ser cambiada selectivamente, ningún gen vegetal endógeno, sino el gen de un patógeno de planta, que comprende un gen bacteriano, un gen eucariota, que comprende el gen de protozoos, nemátodos, hongos, insectos u otros depredadores animales o patógenos de plantas o un gen viral. El proceso denominado como ARNi de silenciamiento de los genes tiene lugar en el citoplasma de una estructura objetivo de interés, puesto que allí están presentes las proteínas y complejos de proteína en su forma funcional requeridas para ello. Los procedimientos divulgados en la presente memoria pueden con ello ser usados de acuerdo con dos formas de realización diferentes: (1a) mediante el procedimiento divulgado en la presente memoria, pueden insertarse fragmentos de gen invertidos selectivamente, en una región objetivo de ácido nucleico de interés. Estos fragmentos de gen pueden ser transcritos a continuación, lo cual conduce a una estructura de ARN de cuerda doble, por ejemplo una estructura de horquilla de ARN, que a continuación puede silenciar un gen endógeno o exógeno. Alternativamente, de acuerdo con esta primera forma de realización, como se citó anteriormente, puede introducirse también selectivamente una secuencia de ácido nucleico en una región genómica objetivo de ácido nucleico, que codifica para un ARNmi o un ARNsi como ARN funcional, en donde el híbrido de ARNsi o de ARNmi es a continuación mediador del silenciamiento del gen o de la suspensión del gen. (2a) En una segunda forma de realización, las nucleasas CRISPR divulgadas en la presente memoria así como los ARNgs relacionados, pueden ser modificados de modo que el sistema de CRISPR artificial es específico para ARN como estructura objetivo de ácido nucleico. Para ello, también otros dominios efectores pueden asociarse con el ARNg y/o las nucleasas CRISPR de interés modificadas. Esta aproximación es ventajosa en particular cuando no debiera modificarse selectivamente en ninguna región genómica objetivo, sino más bien cuando directamente debiera cambiarse directamente ARN en el marco de una aproximación de silenciamiento del gen.
En otra forma de realización, los procedimientos divulgados en la presente memoria son adecuados para apoyar el mapeo de los rasgos en el curso del cultivo vegetal. Respecto a los rasgos cualitativos, los procedimientos divulgados en la presente memoria pueden ser usados para eliminar selectivamente genes candidatos en las regiones cromosómicas identificadas para, con base en ello, determinar si la eliminación de un gen influye o no en la expresión de un rasgo de interés. En el caso de rasgos cuantitativos, la expresión de un rasgo de interés es controlada por múltiples sitios de rasgos cuantitativos o quantitative trait loci (QTL) de diferentes y fuertemente variables tamaño, complejidad y significancia estadística, que también pueden estar localizados en varios cromosomas, dispersos en el genoma de una planta. Por ello, un QTL es una sección de un cromosoma, o una sección de varios cromosomas, que tiene una influencia sobre la manifestación de un rasgo fenotípico cuantitativo determinado de interés. A diferencia de los rasgos discretos, en plantas por ejemplo los colores de las flores, que están presentes en varios estados diferentes delimitados unos de otros, los rasgos cuantitativos o continuos son medibles sin escalonamiento en una escala continua. En el caso de una influencia negativa de regiones QTL, que determinan un rasgo complejo, los procedimientos divulgados en la presente memoria pueden por ello ser usados en una forma de realización para eliminar, mediante el mapeo apoyado por marcadores, regiones cromosómicas completas dentro de una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática de interés para, mediante ello marcar regiones específicas para la eliminación selectiva, o también para una reubicación.
En otra forma de realización de la presente divulgación, los procedimientos divulgados en la presente memoria pueden ser usados para cambiar una región genómica de interés, que es flanqueada por dos diferentes regiones objetivo de ácido nucleico de acuerdo con la presente divulgación, mediante dos pares independientes de nucleasa ARNg/CRISPR, con el uso opcional de un patrón de reparación de ADN. Esta modificación puede ocurrir simultánea o sucesivamente. Preferiblemente el recorte ocurre simultáneamente o al mismo tiempo, y el evento de eliminación causado por ello puede a continuación ser reparado, opcionalmente por el uso de un patrón de reparación de ADN, mediante la unión de dos extremos cromosómicos sin la región objetivo de ácido nucleico de interés eliminada.
En una forma de realización alternativa, una región objetivo de interés puede ser modificada mediante inversiones, mutación en el sitio de corte o duplicación de una región de interés.
Las proteínas ejemplares con resistencia a los herbicidas o genes de acuerdo con la presente divulgación comprenden los inhibidores de sintetasa de acetolactato (ALS), en particular en tanto el herbicida sea del tipo de sulfonilurea, genes que codifican para una resistencia contra los herbicidas, que inhiben el efecto de sintetasa de glutamina, como por ejemplo fosfinotricina o BASTA, glifosato, por ejemplo, genes EPSPS y los genes GAT, inhibidores de HPPD, por ejemplo, los genes HPPD y similares. De este modo por ejemplo el gen bar codifica la resistencia frente al herbicida BASTA, mientras el gen nptII es mediador de la resistencia contra los antibióticos kanamicina y geneticina (G418) y los mutantes de gen ALS codifican o son mediadores de resistencia frente al herbicida clorosulfurona.
Los genes ejemplares de acuerdo con la presente divulgación, que son mediadores de la resistencia frente a enfermedades o patógenos de las plantas, puede ser mediadores de la resistencia frente a plagas de plantas, como la broca de raíz de maíz, el escarabajo marrón y negro o larvas de ellos, el piral europeo de maíz y similares. Los genes de resistencia a las enfermedades y/o genes de resistencia a los insectos, como por ejemplo lisozimas o cecropinas para la protección ante microorganismos, o proteínas, como por ejemplo defensinas, glucanasas o quitenasas para la protección ante hongos patógenos, o endotoxina de Bacillus thuringiensis, inhibidores de proteasa, colagenasas, lectinas o glicosidasas para el control de nemátodos o insectos.
Además, los procedimientos de acuerdo con la presente divulgación pueden - como ya se insinuó anteriormente, ser usados para generar plantas estériles masculinas o femeninas. El suministro de plantas de maíz masculinas estériles puede ser de gran ventaja, puesto que una planta así no requiere eliminación manual o mecánica de las espiguillas, es decir de los estados masculinos de flores que producen polen, lo cual puede ser intensivo en tiempo y costes. Los genes de esterilidad masculina ejemplares son por ejemplo MS26, MS45, o MSCA1. Las plantas de maíz pueden ser cultivadas tanto mediante técnicas de polinización propia como también externa. Las planta de maíz disponen de flores masculinas que se encuentran en la espiguilla, y de flores femeninas que se localizan en la espiga, en donde se encuentran flores masculinas y femeninas en la misma planta. Por ello, una planta de maíz puede ser propagada mediante polinización propia, como también externa o cruzada. Los programas de cultivo combinan rasgos deseables de dos o varias fuentes en líneas de cultivos, o de diferentes fuentes en denominados grupos de cultivos, de los cuales proceden nuevas líneas innatas o líneas DH (haploides dobles), que son desarrolladas mediante autofertilización y subsiguiente selección de los fenotipos deseados. Un tipo de maíz híbrido es un cruce de dos de tales líneas innatas o DH, en donde cada una de las dos líneas progenitoras innata o DH porta una o varias características deseables, que faltan en las otras líneas progenitoras, o que pueden complementar la otra línea. Las nuevas innatas o DHs son entonces cruzadas con otras líneas innata o DH, y se examinan los híbridos de estos cruces para identificar tales plantas con potenciales intereses económicos y agronómicos. Los descendientes híbridos de la primera generación (así como descendientes de la primera generación en general) son denominados como F1. El híbrido F1 es más fuerte y más robusto que sus progenitores. Este efecto, también denominado como heterosis, puede expresarse de manera variada, por ejemplo un crecimiento vegetativo fortalecido o un rendimiento elevado. Las semillas de maíz híbrido pueden ser generadas mediante uso de un sistema masculino estéril, empleando eliminación manual o mecánica de las espiguillas. Como consecuencia de la eliminación de las espiguillas masculinas, los estados femeninos de flores de una línea innata pueden ser fertilizados sólo con polen de una línea innata masculina de interés. Por ello, las semillas resultantes son híbridas (F1) y producirán plantas híbridas. Sin embargo, frecuentemente no es fácil controlar que incluso en ensayos de campo se autopolinicen plantas femeninas. Como resultado se cosechan entonces semillas de una línea femenina innata junto con semillas híbridas. como ya se expuso anteriormente, las semillas de una línea femenina innata o DH no es económicamente tan interesante como las semillas F1, puesto que no ocurre ningún efecto de heterosis. Por ello, en los cultivos de plantas existen una gran necesidad por plantas masculinas estériles, que sean producidas para la producción de semillas híbridas para plantas de interés agronómico, como por ejemplo maíz o trigo, y que esto pueda ser logrado idealmente con bajos costes de producción y trabajo. Las mutaciones que causan esterilidad masculina, por ejemplo en plantas de maíz o de trigo, fueron descritas en el estado de la técnica por una multiplicidad de procedimientos, como por ejemplo rayos X, o irradiación con UV, tratamiento químico, o mediante la inserción de elementos que pueden ser transpuestos (Chaubal et al, 2000 Am. J. Bot. 87: 1193-1201). Sin embargo, persiste una gran necesidad por nuevos genes, que influyan en la fertilidad masculina de una planta de interés, para introducir estos genes, o un cambio selectivo de interés, de manera exactamente precisa en el genoma de una planta de interés. Los genes ejemplares, que son responsables de la esterilidad masculina, comprenden el gen de microesporas abortadas (AMS) de Arabidopsis, el gen MS1 de Arabidopsis, el gen NEF1, el gen AtGPAT1 de Arabidopsis, la mutación dde2-2 de Arabidopsis, el gen 1 de polen sin cara de Arabidopsis (flp1), el gen 1 de muerte de meiocito masculino de Arabidopsis, el gen de dedo de zinc específico de Tapetum (TAZ1), el gen 1 determinante de Tapetum y gen de desarrollo y función tapetal (TDF).
Puesto que los procedimientos divulgados en la presente memoria son adecuados tanto para la integración estable como también para la transitoria de un cambio selectivo en una región objetivo de ácido nucleico de una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática, mediante ello puede obtenerse por ejemplo también directamente una planta masculina o femenina estéril o material vegetal, puesto que el cambio selectivo, como puede introducirse en una célula meristemática de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, es pasado directa e inmediatamente a los descendientes de esta célula. Mediante el uso de las tecnologías in vivo divulgadas en la presente memoria puede por ello obtenerse, sin otro cruce, una planta estéril masculina o femenina, en particular una planta de maíz.
En una forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, se suministra un procedimiento que es adecuado para seleccionar o determinar una planta, un material vegetal o una célula vegetal, que comprende por lo menos un cambio selectivo en una región objetivo de ácido nucleico, que comprende una región genómica objetivo o una región objetivo de ARN, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos:
a) obtener una primera planta, que comprende por lo menos una nucleasa CRISPR, o una variante o un fragmento catalíticamente activo de ellos, en por lo menos una célula meristemática, en donde la nucleasa CRISPR está en capacidad de introducir una ruptura de cuerda doble o individual en una región genómica objetivo o en una región objetivo de ácido nucleico ARN de interés;
b) obtener una segunda planta que comprende por lo menos un ARNg, que está en capacidad de formar un complejo con la nucleasa CRISPR, la variante o el fragmento catalíticamente activo de ellos del paso a),
c) cruzar la primera planta del paso a) con la segunda planta del paso b);
d) verificar los descendientes o las células de ellos del paso c) respecto a cambios en una región objetivo de ácido nucleico de interés y
e) elegir una planta descendiente, un material vegetal o una célula vegetal, que comprende el cambio selectivo deseado en por lo menos una región objetivo de ácido nucleico de interés.
En otra forma de realización de este procedimiento de selección de acuerdo con la presente divulgación, el ARNg y/o la nucleasa CRISPR comprenden además por lo menos un dominio efector, que está asociado o puede asociarse con el ARNg y/o la nucleasa CRISPR y/o, en el caso en que el ARNg y/o la nucleasa CRISPR así como el por lo menos un dominio efector sean preparados sobre un híbrido recombinante, una secuencia que codifica para un dominio efector. El dominio efector puede estar unido o asociado de modo covalente o no covalente con el ARNg y/o la nucleasa CRISPR.
En otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, se suministra un procedimiento para la selección de una planta, un material vegetal o una célula vegetal de interés, que comprende una región objetivo de ácido nucleico cambiada selectivamente, bien sea en su genoma o su transcriptor, es decir, la totalidad de todos los genes o ARNs funcionales transcritos en una célula en un determinado momento, en donde el procedimiento comprende los siguientes pasos:
(a) obtener una primera planta que comprende por lo menos una nucleasa CRISPR o una variante o un fragmento catalíticamente activo de ellos, que está en capacidad de causar una ruptura de cuerda doble, una ruptura de cuerda individual y/o una unión de ADN específica de/en una región objetivo de ácido nucleico;
(b) obtener una segunda planta que comprende un ARNg, en donde el ARNg está en capacidad de formar un complejo con la nucleasa CRISPR, la variante o el fragmento catalíticamente activo de ellos, en donde la nucleasa Cas, la variante o el fragmento catalíticamente activo de ellos así como el ARNg son preparados directamente o en la forma de por lo menos un híbrido recombinante, y en donde el ARNg y/o la nucleasa CRISPR, la variante o el fragmento catalíticamente activo de ellos están asociados o pueden asociarse con por lo menos un dominio efector o una secuencia que codifica para un dominio efector; y en donde la primera planta de (a) o de segunda planta de (b) comprende además un patrón de reparación de ADN, que como componente central comprende por lo menos un ADN de donador, en donde el patrón de reparación de a Dn fue introducido o es introducido de manera inmediata, por ejemplo mediante transformación o transfección, o recombinante en la forma de por lo menos un híbrido recombinante en la primera o segunda plantas, el material vegetal o la célula vegetal;
(c) cruzar la primera planta del paso (a) con la segunda planta del paso (b) y opcionalmente preparar por lo menos un ARNg y/o un patrón de reparación de ADN, en tanto este no haya sido integrado de modo estable en el genoma de la primera y/o de la segunda planta;
(d) evaluar los descendientes de las plantas del paso (c), o de las células vegetales de ellas, en el sentido de si puede observarse un cambio selectivo en la por lo menos una región objetivo de ácido nucleico de interés, y
(e) elegir o seleccionar una planta descendiente, un material vegetal o una célula vegetal de ellos, que comprende una inserción deseada insertada en la por lo menos una región objetivo de ácido nucleico de interés, en donde la inserción fue insertada mediante el ADN de donador como parte del patrón de reparación de ADN.
Por ello, los procedimientos divulgados en la presente memoria son adecuados para mediar una focalización de gen altamente precisa de un gen trans de interés y/o para ello, producir sitios de rasgos transgénicos complejos puesto que, como se ilustró anteriormente, de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación, pueden introducirse también genes trans múltiples, simultánea o sucesivamente, en una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula meristemática. Un sitio de rasgo complejo de gen trans denomina un sitio genómico, que porta una multiplicidad de genes trans, que están unidos mutuamente de modo genético. Por la inserción de genes trans independientes dentro de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1, 2 o incluso hasta 5 centimorgan (cM) uno de otro, pueden formarse los genes trans como único sitio genético (véase por ejemplo el documento US 2013/0263324 A1). Un centimorgan denomina en este caso la distancia entre dos genes, marcadores, regiones objetivo de ácido nucleico o sitios o un par cualquiera de ellos enlazados, en donde 1 % de los productos de la meiosis son recombinantes. Por ello, 1 centimorgan es un equivalente de una distancia, que corresponde a 1 % de frecuencia promedio de recombinación entre los dos genes, marcadores, regiones objetivo de ácido nucleico, sitios o cualquier parte de ellos, enlazados. Después de la selección de la planta del material vegetal o de la célula vegetal de interés, que comprende el gen trans de interés, pueden cruzarse las plantas que contienen por lo menos un gen trans, para producir una planta F1, material vegetal o célula vegetal, que contiene los dos genes trans. los descendientes de estas plantas F1 serían recombinados entonces en 1/500 descendientes de dos genes trans diferentes, en el mismo cromosoma. El sitio complejo puede ser usado entonces para el otro cultivo, como único sitio genético con ambos rasgos transgénicos. Este procedimiento puede ser repetido tan frecuentemente como se desee de acuerdo con el procedimiento divulgado en la presente memoria, para acumular así en un sitio complejo tantos rasgos como sea posible o se desee. A continuación pueden identificarse entonces intervalos cromosómicos, que tienen correlación con un fenotipo o rasgo de interés. El experto en el campo dispone de una multiplicidad de procedimientos, para poder identificar intervalos cromosómicos. Los límites de tales intervalos cromosómicos son trazados de tal modo que comprenden marcadores que están enlazados con el gen que controla el rasgo de interés. En otras palabras, los intervalos cromosómicos son trazados o definidos de modo que cualquier marcador que está dentro del intervalo que comprende los marcadores terminales que definen los límites del intervalo, pueden ser usados como marcadores. En una forma de realización, el intervalo cromosómico puede comprender por lo menos un QTL o más de un QTL. Sin embargo, una cercanía fuertemente pronunciada de los múltiples QTLs en el mismo intervalo puede encubrir en el diagnóstico la correlación de un marcador específico con un QTL específico, puesto que un marcador puede mostrar un enlace a más de un QTL. A la inversa, algunas veces para el caso en que dos marcadores en estrecha vecindad muestran segregación con el rasgo fenotípico deseado, no es claro si cada uno de estos marcadores identifica los mismos QTL o si identifican dos QTLs diferentes. Además, divulga una planta, un material vegetal o una célula vegetal, que es obtenible o puede ser obtenido de acuerdo con uno de los procedimiento representados anteriormente de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención.
Los expertos en el campo conocen procedimientos para el cultivo de los microorganismos y virus que pueden ser usados como vectores de acuerdo con la presente divulgación.
En una forma de realización se introduce en la estructura vegetal objetivo, el híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, con ayuda de por lo menos un vector o un sistema de vectores.
En otra forma de realización se introduce en la célula objetivo el híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación directamente sin un vector adicional, preferiblemente mediante procedimientos mecánicos, mediante transfección o mediante aprovechamiento de endocitosis. Así mismo, de acuerdo con una forma de realización de la presente invención, se prevé la inserción de por lo menos un híbrido recombinante en una estructura vegetal objetivo. Los vectores y sistemas de vectores de la presente divulgación comprenden aquellos que son elegidos de entre el grupo consistente en las SEQ ID NOs: 12-15 y 25-38, así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia con estas secuencias que, a pesar de la modificación, cumplen aún la misma función que en cada caso el vector o sistema de vectores no modificado con la correspondiente SEQ ID NO. Los vectores y sistemas de vector mencionados pueden comprender híbridos recombinantes optimizados de codón o truncados, o pueden contener mutaciones puntuales selectivas, para garantizar su actividad en diferentes células objetivo. La secuencia de acuerdo con SEQ ID NO:31 es una secuencia híbrida en la cual la región entre los sitios de corte BcII y BssHIl del segmento ARN3 de festuca de virus mosaico de bromo (véase NCBI: DQ530425) fue reemplazada por la sección correspondiente del fragmento R_BMV_ARN3_SI13'A/G (Hernia & Kao 2004, Journal of Virology). Además, de acuerdo con la presente divulgación, también se mira Agrobacterium spp. como vector y puede ser usado sólo o en combinación con otros medios de inserción o vectores. De acuerdo con una forma de realización, se usan los vectores y sistemas de vector mencionados anteriormente de acuerdo con SEQ ID NOs:12-15 y 25-38 o secuencias con la homología secuencia mencionada anteriormente, como estructura de armazón para introducir los híbridos recombinantes, que comprenden por lo menos un ARNg y por lo menos una nucleasa CRISPR y/o por lo menos un dominio efector, en una estructura vegetal objetivo. Los métodos y procedimientos de biología molecular requeridos para ello son conocidos por los expertos en el campo.
Los híbridos recombinantes de acuerdo con la presente divulgación comprenden aquellos que son elegidos de entre el grupo consistente en SEQ ID NOs: 23 y 24 así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia con estas secuencias que, a pesar de la modificación, cumplen la misma función que el híbrido recombinante no modificado en cada caso con la correspondiente SEQ ID NO. Los híbridos recombinantes mencionados pueden comprender por ejemplo secuencias optimizadas de codón o truncadas, o pueden contener mutaciones puntuales selectivas, para garantizar o modificar su actividad o propiedades de unión en diferentes células objetivo. En la SEQ ID NO:23, las posiciones 16239-16258 corresponden a la posición para el respectivo ARNg de interés, que puede y tiene que ser modificado dependiendo de la secuencia objetivo de ácido nucleico. En la SEQ ID NO:24, las posiciones 16645-16664 corresponden a la posición para el respectivo ARNg de interés, que puede y tiene que ser modificado dependiendo de la secuencia objetivo de ácido nucleico.
En un aspecto, la presente divulgación se refiere a procedimientos para la producción de una planta, de un material vegetal o de una célula vegetal, en donde el híbrido recombinante es elegido de entre SEQ ID NOs: 23 y 24, así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias.
En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una planta, un material vegetal o una célula, obtenible u obtenidos mediante un procedimiento que comprende la introducción de un híbrido recombinante de acuerdo con SEQ ID NOs: 23 y 24, así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias, en una estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática.
En todavía otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con SEQ ID NOs: 23 y 24, así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias, para el cambio selectivo de por lo menos una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal.
Para la aplicación en la presente invención son adecuadas todas las secuencias de polipéptido de Cas así como secuencias de ácidos nucleicos que codifican Cas, que fueron optimizadas en especial sobre el uso en una célula vegetal o cuyos híbridos que codifican portan secuencias reguladoras adecuadas, que pueden causar la transcripción y/o traslación adecuadas en una célula vegetal en el compartimiento celular previsto para ello, que comprende el núcleo celular, el citosol, una mitocondria, un plástido, que comprende un cloroplasto. Además, las respectivas nucleasas CRISPR tienen que disponer, en una forma de realización, de su función intrínseca de nucleasa. Como nucleasa CRISPR de acuerdo con la presente divulgación, puede usarse por ello también un fragmento catalíticamente activo derivado de una nucleasa CRISPR nativa, en tanto el fragmento catalíticamente activo continúe satisfaciendo la misma función de catálisis enzimática, de la enzima nativa de la cual se deriva.
Alternativamente, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación pueden usarse también nickasas Cas o fragmentos catalíticamente activos de ellas, es decir, polipéptidos de Cas, que fueron cambiados al efecto de que escindan sólo una cuerda de ADN y no generen una ruptura de ADN de cuerda doble, como una nucleasa CRISPR nativa. Esto ofrece, por un lado, la posibilidad de una mayor especificidad, puesto que para alcanzarse una ruptura de cuerda doble tienen que usarse dos híbridos recombinantes que comprende en cada caso una nickasa Cas. Por otro lado, se ofrece la posibilidad de introducir una ruptura de cuerda doble desplazada selectivamente, en lugar de un corte "romo".
Finalmente, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, también pueden usarse nucleasas cero Cas o fragmentos catalíticamente activos de ellas, es decir, variantes que ya no disponen de actividad de nucleasa. Con ello, se abre la posibilidad de usar de acuerdo con la presente divulgación, la nucleasa CRISPR junto con otro dominio efector de acuerdo con la presente divulgación, por ejemplo, otro polipéptido o ácido nucleico que modifica ADN o ARN o que se une a ADN o ARN, mediante lo cual se amplía el espectro de la introducción de cambios selectivos en una estructura vegetal objetivo.
Los expertos en el campo conocen la introducción de mutaciones selectivas en el dominio catalítico de una nucleasa CRISPR de interés, para "reprogramar' ésta hasta una nickasa o también hasta una variante de cero endonucleasa.
Las secuencias que codifican para nucleasas CRISPR ejemplares o fragmentos catalíticamente activos de ellas o nucleasa CRISPR o fragmentos catalíticamente activos de ella, para la aplicación en la presente divulgación son divulgadas en SEQ ID NOs 16-22 y como UniProtκΒ/Swiss-Prot Datenbankzugang Q99ZW2.1 (SEQ ID NO: 39) y comprenden también aquellas secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias que, a pesar de la modificación, satisfacen la misma función que las respectivas secuencias no modificadas, con la correspondiente SEQ ID NO o accesibles bajo el mencionado número de registro del banco de datos.
Aún otro aspecto de la presente invención usa el mecanismo de acción, que se basa en el sistema CRISPR/Cas, de la modificación de ADN controlada por ARN al efecto de que un dominio efector en lugar de o junto con la nucleasa CRISPR mediante un ARNg ajustado selectivamente, sea dirigido a la posición deseada de una región objetivo de ácido nucleico en una estructura vegetal objetivo, de modo que el dominio efector pueda ser colocado de manera selectiva para provocar la edición deseada de ácido nucleico.
En una forma de realización de este aspecto, la región objetivo de ácido nucleico es un ADN genómico.
En otra forma de realización de este aspecto, la región objetivo de ácido nucleico es un ADN mitocondrial o de plástido, en donde el híbrido recombinante comprende una secuencia de localización, que comprende la localización del híbrido recombinante en el correspondiente compartimiento objetivo, por ejemplo, una mitocondria o un cloroplasto.
En una forma de realización, la nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella o la secuencia que codifica para la nucleasa CRISPR o para el fragmento catalíticamente activo de ella y/o el dominio efector o la secuencia que codifica para el dominio efector, comprende adicionalmente una secuencia elegida de entre una secuencia de localización del núcleo, una secuencia de localización de plástido, preferiblemente una secuencia de localización de mitocondria y una secuencia de localización de cloroplastos. Una secuencia de localización de núcleo puede ser elegida de entre SEQ ID NO: 49-58, que divulga las siguientes secuencias: virus 40 de simio (SV40) monopartita: MAPKKKRKV; A. tumefaciens VirD2 (pTiA6): KRPRDRHDGELGGRKRAR; A. tumefaciens VirD2 (pTiC58): KRPREDDDGEPSERKRER; A. tumefaciens VirE2 (pTiA6) #1: KLRPEDRYVQTERYGRR; A. tumefaciens VirE2 (pTiC58) #1: KLRPEDRYIQTEKYGRR; A. tumefaciens VirE2 (pTiA6) #2: KRRYGGETEIKLKSK; A. tumefaciens VirE2 (pTiC58) #2: KTKYGSDTEIKLKSK; A. rhizogenes GALLS (pRi1724): KRKRAAAKEEIDSRKKMARH; A. rhizogenes GALLS (pRiA4): KRKRVATKEEIEPHKKMARR; A. rhizogenes VirD2 (pRiA4): KRPRVEDDGEPSERKRAR.
Puede(n) combinarse una o varias secuencias de localización de núcleo con por lo menos un dominio efector, que se juntan preferiblemente en un vector de plásmido.
En otra forma de realización, el ARNg o la secuencia que codifica para ARNg comprende adicionalmente una secuencia elegida de entre una secuencia de localización de núcleo, una secuencia de localización de plástido, preferiblemente una secuencia de localización de mitocondrias y una secuencia de localización de cloroplastos.
En todavía otra forma de realización de este aspecto, la región objetivo de ácido nucleico es un ácido ribonucleico (ARN) en un compartimiento vegetal cualquiera, por ejemplo, el citosol. De acuerdo con esta forma de realización, puede prepararse un ARNg modificado selectivamente, que está en capacidad de interactuar con una estructura objetivo de ARN. El ARNg puede comprender además otro dominio efector, por ejemplo, un aptámero.
El experto en el campo sabe que el diseño del correspondiente por lo menos un ARNg, que se usa junto con por lo menos una nucleasa CRISPR y/o con por lo menos un dominio efector, depende de la especificidad y en especial de las propiedades de unión y reconocimiento de la nucleasa CRISPR y/o del dominio efector usados en cada caso, así como de la región objetivo de ácido nucleico, que debiera ser cambiado selectivamente.
Las nucleasas CRISPR de tipo silvestre, en especial del tipo Cas9, generan una ruptura "roma" de cuerda doble en la secuencia objetivo de ADN, es decir, sin voladizo de ADN de cuerda individual. Además, estas nucleasas pueden legar también voladizos de nucleótido individual, lo cual ocurre por ejemplo mediante escisión desplazada ("offset") de las dos cuerdas individuales de una cuerda doble de ADN. Mediante ello se activan mecanismos de reparación de ADN propios de la célula de la célula objetivo, que comprenden la denominada reparación no homóloga (nonhomologous end joining o NHEJ). Sin embargo, este mecanismo es falible, en particular, puesto que en este caso pueden introducirse inserciones y eliminaciones (INDELs) en el sitio de una ruptura de cuerda doble. Puede ocurrir por consiguiente para el establecimiento de mutaciones, en los sitios de reunión repetida de las cuerdas individuales de ADN. Por medio de NHEJ pueden mediarse por ejemplo desactivaciones simples o múltiples de gen, en donde después de la ruptura selectiva de ADN por mecanismos propios de la célula, las cuerdas de ADN son reunidas de nuevo con una secuencia cambiada, lo que da como resultado un desplazamiento de marco u otra mutación, que puede impedir la expresión funcional de uno o varios genes de interés. Otro mecanismo de reparación es la reparación dirigida por homología (homology-directed repair (HDR) o recombinación homóloga (HR)). Estos mecanismos usan ADN homólogo como modelo o patrón, del cual puede copiarse información de secuencia para, mediante ello, reparar una ruptura de ADN. Mediante la preparación selectiva de un patrón de reparación de ADN, que sobre una cierta longitud dispone de homología respecto a una región de ADN genómico, en la cual debería inducirse una ruptura de ADN dentro de una célula objetivo de interés, puede ocurrir por lo menos una edición, inserción o intercambio de gen precisos. Los cambios precisos así logrados no incluyen mutaciones indeseadas o no controlables, lo cual es siempre deseable en cualquier frase de edición de gen. Ambos mecanismos de reparación, NHEJ y HDR/HR representan mecanismos que ocurren naturalmente para la reparación de ADN, que ocurren en cualquier célula divulgada en la presente memoria.
En una forma de realización de acuerdo con todos los aspectos de la presente divulgación, se suministra por ello un patrón de reparación de ADN o un modelo de reparación, la ruptura de cuerda individual o doble dirigida al sitio y precisa, que fue introducida previamente mediante una nucleasa CRISPR, o una variante o un fragmento catalíticamente activo de ella, y/o un dominio efector, en una región objetivo de ácido nucleico de interés.
Es decisiva para la introducción, dirigida al sitio, del cambio de una región objetivo de ácido nucleico, de acuerdo con el mecanismo representado anteriormente del sistema CRISPR/Cas tipo II, la elección selectiva y el diseño selectivo de las secuencias de ARNg, para evitar la escisión de regiones fuera del intervalo, diferentes a la región objetivo. La identificación de motivos PAM adecuados en función de la herramienta CRISPR/Cas y opcionalmente otros dominios efectores usados, y el uso de esta información para el diseño de híbridos recombinantes adecuados, son conocidos por los expertos en el campo.
De acuerdo con una forma de realización de la presente invención, por ello en primera instancia se examina el genoma o la región objetivo extracromosómica de ácido nucleico de una célula de acuerdo con secuencias PAM adecuadas, para poder crear así selectivamente un ARNg pertinente.
El término ARN guía o ARNg, como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico de cuerda individual o de cuerda doble o de cuerda parcialmente doble, que puede consistir en ARN natural o sintético y/o en ADN natural o sintético y dispone de la función de poder formar un complejo con una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella, mediante lo cual la nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella permite reconocer una región objetivo de ácido nucleico. Además un ARNg puede disponer, aparte del dominio de interacción de la nucleasa CRISPR, de la función de un dominio de reconocimiento, para la hibridación selectiva en una molécula complementaria de ácido nucleico objetivo. Por ello, un ARNg comprende un ARNcr y opcionalmente un traARNcr como se representó anteriormente. Por ello, el ARNg puede ser una molécula dual sintética, que combina varias funcionalidades, o el ARNg puede comprender exclusivamente una funcionalidad. La longitud del ARNcr y/o del traARNcr puede estar en el intervalo de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más nucleótidos. En consecuencia, los ARNgs pueden formar una región intrínseca de horquilla mediante el pareamiento complementario de bases, mediante el cual se imita la estructura de horquilla de traARNcr/ARNcr natural (véase Jinek et al., 2012 arriba) y además, dependiendo de la secuencia objetivo deseada, comprende un dominio adecuado de reconocimiento. En tanto como nucleasa CRISPR se elija una nucleasa Cpf1, el ARNg puede consistir en un ARNcr, que no comprende ninguna estructura relacionada con traARNcr (véase Zetsche et al., 2015, arriba). De acuerdo con ello, un ARNg de acuerdo con la presente divulgación puede comprender uno o varios dominios. El ARNg puede comprender adicionalmente una o varias regiones de separación o espaciadoras, que no sirven a la interacción con un asociado de unión o molécula objetivo, sino al pliegue y orientación correctos del ARNg o a la unión de un ARNcr y un traARNcr. Este espaciador puede consistir en A d N y/o ARN y comprender una longitud de por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nucleótidos. Un ARNg de acuerdo con la presente divulgación comprende al menos una región parcial, que consiste en ARN, en donde el ARN puede estar formado por nucleótidos naturales o sintéticos. Si se desea, un ARNg de interés puede portar una modificación, preferiblemente en su extremo 5' o -3', en donde la modificación es elegida de entre la adición de un grupo consistente en acridina, amina, biotina, azul cascada, colesterol, Cy3 @, Cy5 @, Cy5.5@ daboilo, digoxigenina, dinitrofenilo, Edans, 6-FAM, fluoresceina, o derivados de ellos, 3'- glicerilo, HEX, IRD-700, IRD-800, JOE, fosfatos, psorales, rodamina, ROX, tiol (SH), espaciadores, TAMRA, TET, AMCA-S", SE, BODIPY<0>, azul marina®, azul pacífico®, verde Oregón®, verde rodamina®, rojo rodamina®, verde rodol® y rojo Texas®, un ácido nucleico bloqueado (LNA), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2'-flúor A, 2'-flúor U, 2'-O-metil ARN, uno o varios fosforotioato(s) como esqueleto, una unión de polietilenglicol, o un enlace 5'-3' covalente, que da como resultado la circularización, o combinaciones de ellos. Para formas específicas de realización puede ser de interés reducir de manera selectiva la longitud del ARNg, para diseñar ARNgs que comprenden menos de 100 nucleótidos, menos de 95 nucleótidos, menos de 90 nucleótidos, menos de 85 nucleótidos, menos de 80 nucleótidos, menos de 75 nucleótidos, menos de 70 nucleótidos, menos de 65 nucleótidos, menos de 60 nucleótidos, menos de 55 nucleótidos, menos de 50 nucleótidos, menos de 45 nucleótidos, menos de 40 nucleótidos, menos de 35 nucleótidos o menos de 30 nucleótidos para, mediante el acortamiento, alcanzar una mayor especificidad de la nucleasa CRISPR. En otras formas de realización, el ARNg de acuerdo con la presente divulgación puede comprender por lo menos un dominio efector, como por ejemplo, un aptámero, o una molécula que modifica ADN o ARN, o un sitio de unión para una proteína o péptido, para ampliar de ese modo la funcionalidad del ARNg.
En otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, el por lo menos un ARNg puede estar asociado adicionalmente con por lo menos una molécula de ácido nucleico, in vitro o in vivo, que sirve para la reparación de ADN orientada hacia la inducción de una ruptura de cuerda doble a través de una nucleasa CRISPR. Este patrón de reparación (ADN) o patrón HDR, puede ser introducido en una estructura objetivo de interés, como ADN de cuerda individual y/o cuerda doble, directamente en la forma de por lo menos un híbrido recombinante. El patrón de reparación permite con ello la recombinación homóloga dirigida al objetivo, mediante lo cual puede ampliarse claramente la especificidad y también el campo de aplicación de la edición del genoma.
De acuerdo con la presente divulgación, pueden usarse ARNgs que fueron ajustados en especial al uso en una célula vegetal.
De acuerdo con la presente invención se adquirió además que un ARNg cualquiera como se describe en el presente documento, adicionalmente a por lo menos un dominio efector, como por ejemplo un aptámero, puede ser acoplado o introducido junto con el dominio efector, para ampliar de ese modo la funcionalidad del ARNg. El híbrido recombinante que comprende un ARNg y por lo menos un dominio efector puede ser introducido como híbrido de ADN o de ARN en la estructura vegetal objetivo, usando un híbrido recombinante y/o vector adecuados. Además, el dominio efector puede consistir no sólo en un ácido nucleico, sino también puede estar presente como polipéptido, o una secuencia que codifica para ello.
En una forma de realización, el ARNg acoplado a la nucleasa CRISPR o al fragmento catalíticamente activo de ella y/o al dominio efector, por ejemplo, el polipéptido o ácido nucleico que modifica ADN o que modifica ARN o que se une a ADN o a ARN, es introducido en la estructura vegetal objetivo.
En otra forma de realización, el ARNg, independientemente de la nucleasa CRISPR y/o del dominio efector, por ejemplo, el polipéptido o ácido nucleico que modifica al ADN o al ARN o que se une al ADN o al ARN, es introducido en la estructura vegetal objetivo como híbrido recombinante.
El ARNg puede ser introducido como molécula de ADN o de ARN en la estructura vegetal objetivo. De este modo, los ARNgs pueden ser introducidos en la célula objetivo, de acuerdo con una forma de realización, directamente en forma de un ácido nucleico sintético, por ejemplo, como ARN, opcionalmente también en el complejo con una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella o, en otra forma de realización, en forma de un híbrido de ADN recombinante, activable y que puede ser transcrito. Además, de acuerdo con la presente divulgación puede usarse un ARNg individual, o pueden introducirse simultáneamente en una célula ARNgs duales o múltiples en uno o varios híbrido(s) recombinante(s), en donde los ARNgs disponen de las mismas o individuales secuencias reguladoras. La elección de ARNgs adecuados para la inserción en una célula objetivo puede ocurrir de acuerdo con el aspecto ilustrado posteriormente en detalle de acuerdo con la presente divulgación, en donde este aspecto suministra un procedimiento in vitro de discriminación para la identificación de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg.
Puesto que el dominio de interacción de un ARNg CRISPR/Cas clásico siempre puede interactuar con la misma nucleasa CRISPR, mediante el uso de ARNgs individuales, que como otros componentes portan una secuencia de reconocimiento diferente, en una aproximación del alcanzarse una multiplexación, es decir, el cambio selectivo de varias regiones objetivo en una aproximación. En este caso, puede siempre ser necesario que adyacente a o dentro de la región objetivo, se encuentre una secuencia PAM. El diseño de un ARNg adecuado puede ser determinado in silico por los expertos en el campo que conocen la nucleasa CRISPR usada, la región objetivo de ácido nucleico, el tipo de cambio deseado del ácido nucleico, elegido de entre mutación, inserción o eliminación, así como de la célula objetivo deseada. La eficacia in vivo de estos ARNgs así como los posibles efectos fuera del intervalo tienen que ser evaluados sin embargo separadamente para cada ARNg. Además, para sistemas no establecidos, como en transformación transitoria de células de meristemo vegetal, es válido establecer vectores y procedimientos adecuados para la inserción de por lo menos un ARNg, junto con por lo menos una CRISPR adecuada y/o por lo menos un dominio efector adecuado, por ejemplo, un polipéptido o ácido nucleico que modifica al ADN o al ARN o uno que se une a ADN o a ARN, para garantizar la actividad concertada de ambas moléculas en la célula objetivo. Es complicado, aparte del diseño puro y de la síntesis o reparación del ARNg, sin embargo el hecho de que incluso los genomas vegetales son muy complejos, y hasta la fecha no hay procedimientos confiables para pruebas anticipadas, que permitan una propuesta sobre si un ARNg elegido e interacción con la nucleasa CRISPR deseada o el fragmento catalíticamente activo de ella, puede modificar realmente de manera eficaz una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal. En una forma de realización de la presente invención, el procedimiento de acuerdo con la invención y por ello las plantas, materiales vegetales o células generados con él, descansan en el mecanismo de reparación de ADN que ocurre de modo natural en la célula objetivo.
En otra forma de realización de acuerdo con los aspectos de la presente divulgación, se remedia la reparación de una ruptura de ADN de cuerda individual o de cuerda doble, que fue mediada previamente por una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella y/u otro dominio efector, mediante uno o varios patrón(es) HDR en forma de un patrón de reparación de ADN, que no ocurre(n) de modo natural, sino que fue(ron) introducido(s) en la célula objetivo.
Por ello, en el marco de la presente divulgación, en una forma de realización se divulga un patrón de reparación de ADN, que opcionalmente puede ser introducido en una célula objetivo junto con o lo largo del tiempo a los CRISPR/híbridos y/o a otro por lo menos un dominio efector, para inducir selectivamente un mecanismo HDR y mediante ello insertar secuencias selectivas de ácidos nucleicos en el sitio de la ruptura de cuerda doble. Mediante ello pueden causarse tanto ediciones genómicas, que comprenden activaciones, como también la reparación selectiva de la lesión de ADN, para impedir una mutación indeseada en el sitio de la ruptura de ADN. Una activación puede significar la inserción selectiva de por lo menos un nucleótido, por lo menos 2 nucleótidos, por lo menos 3 nucleótidos, por lo menos 4 nucleótidos, por lo menos 5 nucleótidos, por lo menos 6 nucleótidos, por lo menos 7 nucleótidos, por lo menos 8 nucleótidos, por lo menos 9 nucleótidos, por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos 15 nucleótidos, por lo menos 20 nucleótidos, por lo menos 50 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos o por lo menos 1.000 nucleótidos, en el ácido nucleico objetivo en la célula vegetal. Además, una activación puede comprender también la introducción de un casete completo de expresión de gen, que puede comprender hasta 10.000 nucleótidos. Una edición de genoma puede significar también el intercambio selectivo de por lo menos un nucleótido por otro nucleótido. Además, puede alcanzarse una activación también mediante dos, tres, cuatro o más intercambios o una combinación de inserción e intercambio. Las inserciones significan la inserción selectiva de por lo menos un nucleótido, por lo menos 2 nucleótidos, por lo menos 3 nucleótidos, por lo menos 4 nucleótidos, por lo menos 5 nucleótidos, por lo menos 6 nucleótidos, por lo menos 7 nucleótidos, por lo menos 8 nucleótidos, por lo menos 9 nucleótidos, por lo menos 10 nucleótidos, por lo menos 15 nucleótidos, por lo menos 20 nucleótidos, por lo menos 50 nucleótidos, por lo menos 100 nucleótidos, por lo menos 200 nucleótidos, por lo menos 500 nucleótidos, por lo menos 1000 nucleótidos, por lo menos 2000 nucleótidos, por lo menos 5000 nucleótidos, por lo menos 10000 nucleótidos o por lo menos 15000 nucleótidos, en el ácido nucleico objetivo de la célula vegetal. Una secuencia de ácidos nucleico como inserción puede ser una secuencia, o una parte de ella, un sitio de unión de factor de transcripción, una secuencia reguladora, una secuencia que codifica para polipéptido, una secuencia de Intron, una secuencia que codifica para un ARN que no codifica (por ejemplo, IncARN), un casete de expresión, una secuencia que no codifica, por ejemplo para la aplicación como marcador, en particular un marcador que puede ser seleccionado, por ejemplo, un marcador para la selección soportada por marcador en el marco del cultivo, o un híbrido ARNi. Además, en este caso una activación puede también ser precipitada por la eliminación de secciones de secuencia, que interfieren con la funcionalidad de un gen (por ejemplo la eliminación de inserciones de transposon). El patrón de reparación de ADN ser introducido como ácido nucleico de cuerda individual o de cuerda doble, en la estructura vegetal objetivo de interés.
En una forma de realización, se desactiva (Knock-Out) selectivamente un ácido nucleico objetivo en una célula vegetal, es decir, se impiden la transcripción y dado el caso traslación del ácido nucleico. Esto puede ocurrir mediante la inserción, mutación o eliminación selectivas de una secuencia reguladora, como secuencia de promotor o de terminador de un ácido nucleico objetivo, o mediante la mutación o eliminación selectivas del ácido nucleico objetivo en sí mismo o una parte de él. Además, también mediante la mutación o eliminación selectivas, que cambian el áster lector de un ácido nucleico, o mediante mutación o eliminación selectivas de señales de empalme potencial, puede alcanzarse una desactivación. En una forma de realización, esta desactivación ocurre sin uso de un patrón HDR a través del cual alcanza la ruta NHEJ, en otra forma de realización en este caso adicionalmente a los híbridos CRISPR y/u otro dominio efector, se introduce un patrón HDR o patrón de reparación de ADN en la célula objetivo. Una mutación selectiva es por ejemplo un intercambio de por lo menos un nucleótido por otro nucleótido, preferiblemente con la consecuencia de que el codón afectado codifica entonces para otro aminoácido. Un ácido nucleico objetivo desactivado selectivamente en una célula vegetal, exhibe por lo menos una mutación o eliminación selectiva, pero puede exhibir también dos, tres, cuatro o más mutaciones y/o eliminaciones selectivas.
En formas de realización de acuerdo con las cuales en una célula objetivo de interés se introducen Cas o un gen Cpf1 u otra nucleasa de efector en la forma de ADN sobre un híbrido correspondiente, el gen que codifica la nucleasa puede comprender un promotor adecuado, que está unido funcionalmente con la secuencia que codifica para la nucleasa, para mejorar su transcripción. Los promotores pueden ser constitutivamente activos, o puede tratarse de promotores inducibles, que son activados justo después de la adición/efecto de un estímulo correspondiente (químico o físico, que comprende luz, temperatura etc.). Así mismo, un híbrido, que codifica un ARNg, puede comprender un promotor adecuado. Los promotores adecuados para células vegetales de acuerdo con la presente divulgación pueden ser elegidos de entre el grupo consistente en un promotor Ubi-Intron de maíz (SEQ ID NO:7), un promotor U3 de maíz (SEQ ID NO:10), un promotor de polimerasa III U6 vegetal, por ejemplo, un promotor U6 de trigo (SEQ ID NO:8 ), un promotor U6 derivado de maíz (véase Mikami et al., Plant Mol. Biol. 2015, 88 (6 ), 561-572), o un promotor U6-26 derivado de Arabidopsis thaliana, un promotor U3 de arroz (SEQ ID NO: 9) y un promotor EF1 de Brachipodium (SEQ ID NO: 40), o un promotor 35S simple o doble derivado del virus del mosaico de coliflor, que comprende, entre otros, un promotor 35SPPDK (véase Yoo et al. Nature Protocols 2, 1565-1572 (2007), aunque los promotores no están limitados a ellos, puesto que la elección del promotor depende de la respectiva célula vegetal de interés.
En todavía otra forma de realización, el mecanismo NHEJ de una célula vegetal puede ser suprimido deliberadamente por adición de un inhibidor correspondiente o por una desactivación selectiva de una secuencia endógena de ácidos nucleicos, que está involucrada en el proceso NHEJ, mediante lo cual puede facilitarse la introducción de un cambio selectivo en una secuencia de ácido nucleico objetivo, puesto que mediante ello puede reprimirse el mecanismo NHEJ de una célula. En una forma de realización de la presente divulgación, en la cual la estructura vegetal objetivo es una célula meristemática de un brote/planta o de un embrión vegetal o células meristemáticas liberadas de una planta en un estado de desarrollo posterior, las estructuras vegetales objetivo que comprenden las célula meristemáticas, son cultivadas antes, durante y después de la inserción del por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, de modo que se previene una oxidación de las estructuras aisladas. En una forma de realización, esto comprende la adición de un antioxidante.
La siguiente tabla 1 cita medios adecuados para el cultivo de diferentes estructuras vegetales objetivo, que comprenden células meristemáticas. Otras condiciones de reacción adecuadas como amortiguador, adiciones, condiciones de temperatura y pH así como, dado el caso, otras adiciones necesarias, pueden ser determinadas fácilmente por los expertos en el campo, que conocen un procedimiento e híbridos divulgados en la presente memoria, de acuerdo con un aspecto cualquiera de la presente divulgación.
Figure imgf000036_0001
La introducción transitoria de los híbridos divulgados en la presente memoria, en células meristemáticas o tejidos ofrece como ventaja que partir de estos se desarrollan tejidos de reproducción, mediante los cuales puede pasar el cambio selectivo, entonces de manera estable a la siguiente generación, en donde la siguiente generación está libre de los híbridos introducidos previamente. Los procedimientos e híbridos divulgados en la presente memoria permiten además cosechar semillas directamente en las plantas cambiadas de ese modo, semillas que portan el cambio estable de ADN, sin atravesar como paso intermedio un cultivo celular en forma de producción y regeneración de Kallus, con lo que también pueden evadirse los pasos de selección y regeneración necesarios para ello, así como los medios y adiciones necesarios para ello.
En una forma de realización, la secuencia de ácido nucleico, que es usada para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico, comprende por lo menos una o varias secuencias reguladoras.
En una forma de realización, la secuencia de ácido nucleico que es usada como secuencia reguladora para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico, comprende por lo menos uno o varios promotor(es), opcionalmente un promotor específico de la planta y el tejido, un promotor fenotípico, un promotor constitutivo o inducible, que es adecuado para la inducción de la transcripción en una célula objetivo deseada. Un promotor es una región de ácido nucleico, que hace parte del reconocimiento y de la unión de polimerasas de ARN y de otras proteínas, para controlar la transcripción. Los promotores adecuados para el ARNg o la secuencia que codifica la nucleasa CRISPR o que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella son bien conocidos por los expertos en el campo. La inducción de un promotor inducible puede ocurrir por estímulos como la temperatura, sustancias químicas, pH, luz, señales endógenas de planta, por ejemplo, liberadas después del uso de la planta, y similares. Los promotores ejemplares son elegidos de entre el grupo consistente en SEQ ID Nos:5-11, y comprenden también aquellas secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias, que a pesar de la modificación satisfacen todavía la misma función que la secuencia no modificada en cada caso con la correspondiente SEQ ID NO. Otros promotores ventajosos son elegidos de entre el grupo consistente en promotores de las quinasas asociadas a la pared (WAKs) 1 y 2 (véase por ejemplo, Wagner TA, Kohorn BD. Wall-Associated Kinases Are Expressed throughout Plant Development and Are Required for Cell Expansion. The Plant Cell.2001;13(2):303-318 así como por ejemplo NCBI entrada: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), un promotor del gen SCARECROW1 (scr1) (véase por ejemplo Tissue Specificity and Evolution of Meristematic WOX3 Function; Rena Shimizu, Jiabing Ji, Eric Kelsey, Kazuhiro Ohtsu, Patrick S. Schnable y Michael J. Scanlon Plant Physiology febrero de 2009 vol. 149 no. 2841-850 y así como por ejemplo, NCBI entrada: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), un promotor de los genes FAF2 y FAF4 (véase por ejemplo The FANTASTIC FOUR proteins influence shoot meristem size in Arabidopsis thaliana Vanessa Wahl, Luise H Brand, Ya-Long Guo, Markus Schmid Wahl et al. BMC Plant Biology 2010, 10:285 http://www.biomedcentral.com/1471-2229/10/285 así como por ejemplo, NCBI entrada: NCBI Reference Sequence: NC_003070.9), un promotor del gen OSH1 (véase por ejemplo Sato et al. (1996) Proc.Natl. Acad. Sci. EE. UU., 93: 8117-8122 así como por ejemplo, entrada del banco de genes: GenBank: CP002688.1 o GenBank: AP008209.2) o un promotor de un gen de metaloproteína, por ejemplo, de arroz (por ejemplo, GenBank: BAD87835.1). Los promotores de la presente divulgación pueden ser promotores de ocurrencia natural, sintéticos o quiméricos, o una combinación de ellos. un promotor referido de acuerdo con la presente divulgación es un promotor activo en una célula meristemática vegetal o un promotor activo en plástidos de una célula vegetal. En una forma de realización, la secuencia de ácido nucleico que es usada para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico, comprende además por lo menos un terminador como secuencia reguladora.
En una forma de realización, la secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos, que es usada para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico, que comprende un ARNg y una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella, o una secuencia que codifica para ella, comprende por lo menos una o varias secuencia(s) de localización de núcleo (KLS), que causan la localización de núcleo de los ácidos nucleicos y polipéptidos usados para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico.
En una forma de realización, el híbrido recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico o de aminoácidos, que es usada para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico, comprende un ARNg y una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella, o una secuencia que codifica para ella, una o varias secuencias de localización de plástidos (PLS), por ejemplo una secuencia de localización de mitocondrias o de cloroplastos (MLS o CLS), que causan la localización de los ácidos nucleicos y polipéptidos usados para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico en los correspondientes plásticos vegetales.
En una forma de realización, la secuencia de ácido nucleico, que codifica para una nucleasa CRISPR divulgada en la presente memoria o un fragmento catalíticamente activo de ella, o una nucleasa CRISPR divulgada en la presente memoria o un fragmento catalíticamente activo de ella comprende además una baliza de secuencia. Una baliza de secuencia es una sección de ácido nucleico o proteína, que puede estar localizada antes y/o después y/o dentro de la secuencia de la nucleasa CRISPR o el ARNg, o la secuencia de ácido nucleico que codifica la nucleasa CRISPR o el ARNg, para hacer posible opcionalmente entre otros su localización, visualización dentro de una célula objetivo. De modo particular se prefieren las baliza de secuencias elegidas de entre la siguiente lista: baliza de polihistidina(His), glutation-S-transferasa baliza de (GST), baliza de tioredoxina, baliza de FLAG, una baliza con propiedades de fluorescencia, elegida de entre una proteína que tiene fluorescencia verde baliza de (GFP)-, una baliza de DsRed, una baliza de mCherry y similares, una baliza de estreptavidina o baliza strep, baliza de proteína de unión a maltosa (MPB), péptido transitorio de cloroplastos, péptido transitorio de mitocondrias, una baliza Snap y/o una baliza de secreción.
En otra forma de realización se proponen híbridos de fusión, que pueden usarse en el procedimiento de acuerdo con la presente invención. Estos híbridos de fusión comprenden, por un lado, proteínas de fusión, y por otro ácidos nucleicos de fusión. Las proteínas de fusión pueden consistir en una nucleasa CRISPR, una variante o un fragmento catalíticamente activo de ella, o la secuencia que codifica para la nucleasa CRISPR o la variante o el fragmento catalíticamente activo de ella, como un elemento, así como opcionalmente una de las balizas mencionadas anteriormente, así como un dominio efector, o una secuencia que codifica el dominio efector. Mediante ello es posible introducir en una estructura vegetal objetivo de interés, como unidad unida físicamente, dominios efectores y/o una o varias nucleasas CRISPR iguales o diferentes, variantes o fragmentos catalíticamente activos de ellas divulgados en la presente memoria, o expresarla en una estructura vegetal objetivo de interés. Preferiblemente se fusiona el dominio efector que comprende opcionalmente una secuencia de aminoácidos enlazador en el extremo N o en el C de la nucleasa CRISPR o de la variante o del fragmento catalíticamente activo de ellas. La secuencia de aminoácidos de enlazador opcionalmente presente, o la secuencia de ácido nucleico que codifica esta secuencia de enlazador sirven para que tanto la nucleasa CRISPR como también el dominio efector, sin que de modo recíproco se influya estéricamente, puedan ubicarse idealmente de modo que tanto el dominio efector como también la nucleasa CRISPR puedan desplegar su actividad. Una secuencia de aminoácidos de enlazador puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8 , 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20 o más y hasta 50 o 100 aminoácidos, y en casos individuales puede ser más larga. Además se divulgan también ácidos nucleicos de fusión, en donde se reúne de modo covalente un ARNg de interés con un dominio efector de interés. Además, se divulgan también ácidos nucleicos de fusión no covalentes, que comprenden tanto ARNg como también un dominio efector y/o un patrón de reparación de ADN, en donde la unión no covalente puede ocurrir en una asociación de los respectivos componentes mediante hibridación, es decir, mediante pareamiento de bases de regiones complementarias. Además, se divulgan híbridos de fusión, en los cuales ARNg y/o una nucleasa CRISPR de interés se unen químicamente in v itro / ex vivo con un dominio efector de interés y a continuación son introducidos en una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula meristemática, mediante lo cual ésta molécula de efector ya está presente unida y con ello se eleva la disponibilidad dentro de una célula vegetal de interés, mediante lo cual puede elevarse la eficiencia del procedimiento divulgado en la presente memoria. Además, la asociación de un ARNg con una molécula de efector y/o un patrón de reparación de ADN conduce a que no sólo el dominio efector y/o el patrón de reparación de ADN cumplan su función en el marco de la edición de genoma, sino que además pueda elevarse también la estabilidad de un ARNg. Incluso en formas de realización en las cuales el ARNg es insertado directamente mediante transformación o transfección en una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula objetivo meristemática, esto puede elevar claramente la degradación del ARNg por ARNsas celulares, antes de que éste pueda ejercer su función.
Como también el ARNg y/o la nucleasa CRISPR, que comprende entre otras una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, los híbridos de fusión descritos anteriormente, que comprenden proteínas de fusión y ácidos nucleicos de fusión, y/o proteínas de fusión mixtas, que comprenden ácidos nucleicos y proteínas, pueden ser introducidos también como híbridos recombinantes de manera estable o transitoria en una estructura vegetal objetivo de interés, o al menos una de las moléculas puede ser introducida directamente como ARN, ADN, o proteína en una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula meristemática. Por ejemplo, un gen que codifica para una nucleasa CRISPR de interés, puede ser utilizado en primera instancia mediante codón. Este gen puede ser introducido entonces en forma de un híbrido recombinante de manera transitoria en una estructura vegetal objetivo de interés. Alternativamente, la nucleasa CRISPR puede ser trasladada también in vitro y a continuación insertada directamente como proteína en una estructura vegetal objetivo de interés. en una forma de realización, puede introducirse entonces un ARNg directamente en una estructura vegetal objetivo de interés en la forma de ARN. Esto puede ocurrir, como se ilustra en detalle posteriormente, por ejemplo mediante bombardeo con partículas u otro procedimiento de transfección, que son conocidos por los expertos. Asimismo, los híbridos de fusión representados anteriormente son introducidos en consecuencia bien sea como híbrido recombinante o directamente en una región objetivo de ácido nucleico de interés.
En una forma de realización de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, puede introducirse una expresión transitoria del sistema CRISPR divulgado en la presente memoria, que comprende por lo menos un ARNg, una nucleasa CRISPR, preferiblemente también por lo menos un dominio efector y opcionalmente un patrón de reparación de ADN, de modo transitorio mediante bombardeo con partículas en una estructura vegetal objetivo de interés, que comprende por lo menos una célula meristemática. Para ello pueden recubrirse por ejemplo partículas de oro o de wolframio con polietilenimina (PEI). Para ello, en primera instancia se lavan las partículas de oro y después de centrifugación y lavado opcional en etanol, se suspenden de nuevo en etanol y se almacenan a - 20 °C. Para recubrir las partículas con PEI (Sigma # P3143), se sometió a centrifugación en etanol la mezcla lavada de partículas de oro y se descartó el etanol. Después se lavaron las partículas una vez en ddH2O, para eliminar el alcohol residual y se añadieron entonces 250 μl de una solución 0,25 mM de PEI, seguido por un tratamiento de ultrasonido de pulso para suspender las partículas. Se sometió el recipiente sellado a congelación de choque en una mezcla de hielo seco/etanol y después se sometió la suspensión a liofilización durante la noche. En este punto pueden almacenarse las partículas de oro recubiertas secas, a - 80 °C durante por lo menos tres semanas. Antes del uso posterior, se enjuagan las partículas tres veces con en cada caso 250 μl de amortiguador HEPES 2,5 mM, pH 7,1, seguido por un tratamiento de ultrasonido de pulso y después se pasa brevemente por el Vortex, antes de someterlas a centrifugación.
Las partículas fueron entonces suspendidas en un volumen final de 250 |jl de amortiguador HEPES. Se transfirió una parte alícuota de 25 μl de partículas a un recipiente de reacción fresco, antes de que ocurriera el anclaje de ADN. Para anclar el ADN no recubierto a las partículas de oro, se trataron las partículas con ultrasonido de pulso y se añadió un microgramo de ADN (en 5 μl de agua libre de nucleasa) y la mezcla fue aspirada y expulsada algunas veces cuidadosamente con la pipeta, antes de ser incubada durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se sometieron a centrifugación las partículas brevemente, por regla general durante 10 segundos, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 60 μl de etanol fresco. Se lavaron en 60 μl de etanol dos veces las partículas con ADN precipitado con PEI, se sometieron entonces a centrifugación las partículas y se descartó el sobrenadante, después de lo cual se suspendieron de nuevo las partículas en 45 μl de agua. Para anclar un segundo ADN (ADN-2), se usó una precipitación mediante el uso de un reactivo de transfección de lípidos, catiónico, soluble en agua. Se trataron brevemente con ultrasonido 45 μl de la suspensión de partículas de ADN, correspondiente a las partículas de oro que se habían anclado al primer ADN, y después se agregaron 5 μl de un ADN-2 de l0-nanogramos/microlitro así como 2,5 μl del reactivo de transfección de lípidos, catiónico, soluble en agua. Se incubó la solución en un sacudidor orbital durante 10 minutos y a continuación se sometió a centrifugación a 10.000 g durante 1 minuto. A continuación se descartó el sobrenadante y las partículas fueron suspendidas de nuevo en 60 μl de etanol. La solución pudo ser transferida a macroportador y las partículas de oro a las cuales se anclaron secuencialmente el primero y el segundo ADN, fueron entonces transfectadas en una célula meristemática de interés, usando un protocolo estándar para el bombardeo de partículas mediante un aparato PDS-1000. Los protocolos estándar para un aparato PDS-1000 son obtenibles del fabricante (Bio-Rad).
En una forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, el procedimiento para la producción de una planta, de un material vegetal o de una célula vegetal comprende además un paso de discriminación. En este paso se verifica mediante procedimientos para el análisis de la secuencia de ácidos nucleicos de una región objetivo, por ejemplo, mediante reacción en cadena de polimerasa o mediante sondas, si la inserción, activación y subsiguiente reacción del por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, conduce al cambio selectivo deseado de una región objetivo de ácido nucleico. Los procedimientos para ejecutar esta discriminación son conocidos por los expertos en el campo para cualquier estructura vegetal objetivo y región objetivo de ácido nucleico. Sin embargo actualmente no existen procedimientos estándar, que permitirían probar la interacción efectiva de un ARNg, de una nucleasa CRISPR o un fragmento catalítico de ella así como de una región objetivo de ácido nucleico de interés respecto a la verdadera eficacia de un ARNg de interés para una región objetivo específica de ácido nucleico, en particular una región objetivo de ácido nucleico dentro de una célula vegetal, en un procedimiento de discriminación in vitro, para con ello verificar el esfuerzo en tiempo y costes durante la aplicación de híbridos CRISPR/Cas, en especial en un procedimiento de alto desempeño. Además, la mayoría de herramientas in silico disponibles (véase por ejemplo https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/input) se especializa en E. coli, levaduras o genomas animales o plantas modelo, aunque no en plantas útiles importantes monocotiledóneas o dicotiledóneas, que frecuentemente se diferencian de manera significativa de plantas modelo, por ejemplo la distribución de pA m en regiones genómicas.
Por ello, en un aspecto de la presente divulgación, un procedimiento in vitro de discriminación para la identificación de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg en un ensayo in vitro, para la identificación de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg, que es adecuado, junto con una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella, para modificar de manera selectiva una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal, que comprende los siguientes pasos: (i) preparación de una o varias regiones objetivo de ácido nucleico de una planta, de un material vegetal o de una célula vegetal; (ii) inserción de la una o las varias regiones objetivo de ácido nucleico en por lo menos un vector; (iii) preparación de por lo menos un ARNg; (iv) preparación de por lo menos una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella; (v) puesta en contacto del por lo menos un ARNg y de la por lo menos una nucleasa CRISPR o del fragmento catalíticamente activo de ella con el por lo menos un vector, in vitro bajo condiciones de reacción adecuadas que permiten la interacción de un ARNg con una nucleasa CRISPR y mediante ello la actividad catalítica de la nucleasa CRISPR o del fragmento catalíticamente activo de ella, en donde el por lo menos un vector es puesto en contacto en cada caso con exactamente un ARNg y exactamente una nucleasa CRISPR o un fragmento catalíticamente activo de ella en una carga separada de reacción; (vi) análisis de los productos de reacción del paso (v); y (vii) identificación de un ARNg o de una secuencia que codifica para un ARNg, que está en capacidad, junto con una nucleasa CRISPR especifica o un fragmento catalíticamente activo de ella, de modificar de manera selectiva una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal.
De acuerdo con este aspecto de la presente divulgación, el término in vitro es entendido de modo que la por lo menos una región objetivo de ácido nucleico no está presente dentro de su medio natural, es decir, una célula vegetal, sino que en primera instancia es transferida a un vector adecuado con el propósito de la discriminación in vitro. Mediante esta discriminación anticipada puede generarse entonces dentro de corto tiempo una multiplicidad de resultados, que revelan la idoneidad de por lo menos un ARNg en la interacción con la correspondiente nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella, para la modificación selectiva de una región objetivo de ácido nucleico dentro de una célula vegetal intacta. Los candidatos así determinados pueden ser usados entonces con una tasa de éxito claramente mayor, tanto in vitro como también in vivo, que comprenden en planta.
En una forma de realización, el producto de amplificación de PCR de la región objetivo de ácido nucleico se deriva de acuerdo con este aspecto de ADN genómico, en donde el ADN genómico comprende, aparte del genoma nuclear, también el genoma de plástidos, como mitocondrias y cloroplastos. En otra forma de realización, el producto de amplificación de PCR de la región objetivo de ácido nucleico, de acuerdo con este aspecto se deriva ARN vegetal.
El por lo menos un vector de acuerdo con este aspecto de la presente divulgación, es preferiblemente un vector de plásmido, aunque también pueden usarse todos los otros vectores divulgados en la presente memoria, que son adecuados para la clonación y mantenimiento estable de un producto de amplificación de PCR de una región objetivo de ácido nucleico de interés. La clonación de una o varias región(es) objetivo de ácido nucleico en por lo menos un vector es conocida por los expertos en el campo. El vector puede comprender idealmente más de una región objetivo de interés, de modo que puede analizarse una multiplicidad de genes objetivo de interés. Alternativamente, pueden prepararse también varios vectores, que comprenden por lo menos una región objetivo de ácido nucleico de interés.
El ARNg para la aplicación de acuerdo con este aspecto, tiene que ser aplicado en forma activa de ácido ribonucleico, es decir, el ARNg puede ser preparado, opcionalmente de modo adicional modificado. sintéticamente. Alternativamente, el ARNg puede ser preparado también de modo recombinante, es decir, mediante transcripción in vitro o in vivo y opcionalmente por un paso de purificación.
La nucleasa CRISPR, o el fragmento catalíticamente activo de ella, es preparada como secuencia de aminoácidos. Para ello puede usarse una nucleasa CRISPR obtenible comercialmente o una variante de ella. Alternativamente, en otra forma de realización puede producirse la nucleasa CRISPR o el fragmento activo de ella, de modo recombinante y opcionalmente puede ser aislada y/o purificada, antes de ser usada en el procedimiento in vitro de discriminación de acuerdo con la presente divulgación.
En otra forma de realización, la nucleasa CRISPR preparada o el fragmento activo de ella, está presente acoplada a por lo menos un dominio efector. Para los posibles dominios efectores y sus potenciales ventajas y ámbitos de aplicación, es válido de modo correspondiente lo dicho anteriormente en esta divulgación. La inclusión de los dominios efectores/híbridos Cas ya en un procedimiento in vitro de discriminación ofrece como ventaja que posibles efectos indeseados, positivos o sinérgicos del respectivo dominio efector, que influyen desde el punto de vista estérico y químico/físico en el híbrido Cas o -Cpf1, pueden ser analizados ya en la fase de prueba anticipada. Esto se refiere, sobre todo, a un posible efecto del por lo menos un dominio efector sobre la interacción ARNg-Cas, así como la subsiguiente unión y modificación en la región objetivo de ácido nucleico de interés, de modo adicional/alternativo a la verdadera región de uso del respectivo dominio efector.
La puesta en contacto in vitro del por lo menos un ARNg y de la por lo menos una nucleasa CRISPR o del fragmento catalíticamente activo de ella, con el por lo menos un vector ocurre bajo condiciones adecuadas de reacción. En este contexto, se entienden las condiciones que permiten tanto la unión del ARNg a la respectiva nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella, como también la interacción del complejo ARNg/Cas con la región objetivo de interés, así como la actividad catalítica de la nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella. Las condiciones adecuadas de reacción como amortiguador, adiciones, cofactores especiales, que son requeridas, condiciones de temperatura y pH así como, dado el caso, otras adiciones necesarias, pueden ser determinadas de acuerdo con un aspecto cualquiera de la presente divulgación, fácilmente por el experto en el campo, que conoce un procedimiento divulgado en la presente memoria e híbridos divulgados en la presente memoria.
De acuerdo con una forma de realización, el análisis de los productos de reacción ocurre cualitativamente de acuerdo con el procedimiento in vitro de discriminación. De acuerdo con otra forma de realización, el análisis de los productos de reacción ocurre de modo cuantitativo, de acuerdo con el procedimiento in vitro de discriminación. De acuerdo con todavía otra forma de realización, el análisis de los productos de reacción ocurre tanto de modo cuantitativo como también cualitativo, de acuerdo con el procedimiento in vitro de discriminación.
En una forma de realización, el procedimiento in vitro de discriminación ocurre como procedimiento de alto desempeño, es decir, pueden probarse simultáneamente varios ARNgs y/o varias nucleasas CRISPR o los fragmentos catalíticamente activos de ellas y/o varias regiones objetivo de ácido nucleico, en uno o varios vectores en recipientes separados de reacción. Este elevado aumento de escala es una ventaja particular para obtener rápidamente una multiplicidad de datos sobre pares de candidatos ARNg/Cas adecuados, para la respectiva por lo menos una región objetivo de ácido nucleico de interés. Alternativamente, puede analizarse como variable la pregunta, sobre qué pares de candidatos ARNg/Cas cooperan de modo particularmente eficiente, en especial cuando se investiga el uso de nuevas nucleasas CRISPR o fragmentos catalíticamente activos de ellas. Como otra pregunta, puede investigarse fácilmente en el rendimiento elevado, si la adición de un dominio efector a una nucleasa CRISPR o al fragmento catalíticamente activo de ella, tiene una influencia sobre la interacción ARNg/Cas o la subsiguiente actividad catalítica de la nucleasa CRISPR o del fragmento catalíticamente activo de ella.
De acuerdo con la presente divulgación, pueden introducirse los vectores y/o híbridos recombinantes para el cambio selectivo de una región objetivo de ácido nucleico en una célula vegetal mediante procedimientos mecánicos, entre otros, bombardeo de partículas, microinyección y electroevaporación, o mediante endocitosis inducida, vectores adecuados, transfección directa, y similares. En una forma de realización de la presente divulgación, los vectores y/o híbridos recombinantes son introducidos en la célula objetivo o estructura vegetal objetivo mediante bombardeo de partículas. Para ello, en primera instancia se precipitan los vectores por ejemplo, sobre partículas de oro o de wolframio y después la célula objetivo/estructura vegetal objetivo es bombardeada mediante un aparato adecuado, con las partículas así obtenidas, dado el caso, con procesamiento adicional.
En otra forma de realización de la presente divulgación, se introducen directa o indirectamente los vectores y/o híbridos recombinantes, mediante microinyección en la célula objetivo o estructura vegetal objetivo.
En otra forma de realización de la presente divulgación, se introducen los vectores y/o híbridos recombinantes mediante atomización con subsiguiente absorción, por ejemplo, en el curso de una infección viral, o infiltración en la célula objetivo o estructura vegetal objetivo.
De acuerdo con una forma de realización, los vectores y/o híbridos recombinantes son introducidos en una célula meristemática mediante bombardeo de partículas. Este método es adecuado tanto para la inserción de híbridos recombinantes que comprenden ADN de plásmido de cuerda doble, ADN lineal de cuerda individual o cuerda doble, ARN de cuerda individual o cuerda doble y de polipéptidos así como de combinaciones de ellos, para todos los tipos de meristemos vegetales en diferentes estados de desarrollo de una planta. Como material de soporte para los híbridos recombinantes pueden usarse, entre otros, oro y wolframio. En otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, la inserción de los vectores y/o de los híbridos recombinantes ocurre por microinyección directamente en la célula objetivo o el compartimiento deseado de una célula objetivo.
De acuerdo con esta otra forma de realización, los vectores y/o híbridos recombinantes son introducidos en una célula meristemática mediante microinyección. Este tipo de la inserción es adecuado para todos los tipos de meristemos (véase el ejemplo 2 abajo). Además, la inserción de acuerdo con esta forma de realización es adecuada tanto para la inserción de híbridos recombinantes, que comprende ADN de plásmido de cuerda doble, ADN lineal de cuerda individual o cuerda doble, ARN de cuerda individual o cuerda doble, y de polipéptidos así como las combinaciones de ellos.
En todavía otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, la inserción de los vectores ocurre por electroporación mediante pulsos de alto voltaje.
En todavía otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, la inserción de los vectores ocurre por endocitosis, es decir, un mecanismo propio de la célula, mediante el cual puede recibirse en la célula material extraño a la misma.
En una forma de realización, el vector es un vector viral, que comprende el por lo menos un híbrido recombinante. La inserción por un vector viral ofrece la posibilidad de propagar el vector y el por lo menos un híbrido recombinante contenido. Los vectores virales adecuados, que pueden ser usados o modificados para la aplicación de acuerdo con la presente divulgación, son elegidos de entre el grupo que comprende, pero no están limitados a SEQ ID NOs: 12-15 y 25-38 y comprenden también aquellas secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias. El experto en el campo sabe que la secuencia de un virus de ocurrencia natural, que debería ser usado como vector viral, tiene que ser ajustado de modo correspondiente al híbrido recombinante deseado que va a ser introducido, así como a la estructura vegetal objetivo de interés. En otra forma de realización, los híbridos recombinantes son introducidos en una estructura vegetal objetivo mediante transformación mediada por Agrobacterium spp., en particular mediada por Agrobacterium tumefaciens o por Agrobacterium rhizogenes. Este tipo de la inserción es bien conocido en general por el experto en el campo, para diferentes plantas objetivo, así como para diferentes estructuras vegetales objetivo.
El experto en el campo sabe que la elección del tipo de inserción puede depender, entre otros, de la correspondiente célula vegetal objetivo así como del híbrido que va a ser introducido, y por ello dependiendo de la célula objetivo, puede ser necesario otro tipo de inserción.
En otra forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, la inserción de los vectores y/o híbridos recombinantes ocurre por una combinación de los métodos de inserción mencionados anteriormente. De este modo, por ejemplo un vector viral, que contiene el por lo menos un híbrido recombinante de interés, puede ser introducido en la estructura vegetal objetivo a través de Agrobacterium tumefaciens como otro vector, o por ejemplo mediante bombardeo de partículas o microinyección.
En un aspecto del presente documento, se divulgan procedimientos especiales para la inserción de vectores y/o híbridos recombinantes de acuerdo con la presente divulgación, en células y tejidos de plantas meristemáticas. Para la transformación o transfección de células y tejidos meristemáticos, su accesibilidad es un factor decisivo, en donde la accesibilidad de los diferentes tipos de meristemo vegetal se diferencian notablemente en los diferentes estados de desarrollo de una planta.
En una forma de realización de acuerdo con la presente divulgación, se divulga por ello un procedimiento para la preparación de una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, en donde en la estructura vegetal objetivo puede introducirse por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación. El procedimiento de acuerdo con esta forma de realización comprende como paso decisivo, el darle accesibilidad a la estructura meristemática de interés, que aún no comprende células meristemáticas diferenciadas.
Si la estructura vegetal objetivo es un meristemo en el embrión, es esencial elegir un embrión vegetal del tamaño correcto, y activar las célula meristemáticas más profundas, es decir que están en el interior, como objetivo de una transformación o transfección con por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, puesto que las célula meristemáticas que se encuentran en las capas exteriores pueden ya haber alcanzado un cierto grado de diferenciación y con ello pueden ya no ser adecuadas de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente los embriones vegetales son elegidos respecto a su tamaño, de modo que están dotados con un meristemo expuesto. Para embriones de maíz eso significa que los embriones de menos de 1,5 mm como diámetro máximo, preferiblemente de menos de 1 mm como diámetro máximo, de modo particular preferiblemente de menos de 0,7 mm como diámetro máximo y de modo muy particular preferiblemente de menos de 0,5 mm como diámetro máximo, pueden ser usados de manera ventajosa de acuerdo con la invención. En el sentido de la presente invención, una célula meristemática es con ello una célula meristemática cuyo grado de diferenciación permite todavía que, después del cambio selectivo de una región de ácido nucleico de interés, a partir de la célula puedan surgir todavía todos los tipos deseados de células vegetales, en particular aquellos tipos a partir de los cuales puede regenerarse directa o indirectamente una planta fértil.
En otra forma de realización, se divulga un procedimiento para la preparación de una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, en el cual puede introducirse por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, en donde la célula meristemática es una célula de un brote o de una planta vieja.
De acuerdo con esta forma de realización, el meristemo tiene que ser preparado completamente o casi completamente libre. Además, tiene que cuidarse que las célula meristemáticas ubicadas más profundamente, es decir, ubicadas en el interior, sean activadas como objetivo de una transformación o transfección con por lo menos un híbrido recombinante de acuerdo con la presente divulgación, puesto que las célula meristemáticas que se encuentran en las capas exteriores pueden haber alcanzado ya un cierto grado de diferenciación y con ello ya no ser adecuadas de acuerdo con la presente invención. De acuerdo con esta forma de realización, los meristemos liberados son expuestos a una oxidación. Para impedir un deterioro de las célula meristemáticas, por ello se aplican preferiblemente medidas adecuadas de protección antioxidante, como por ejemplo, el uso de un agente antioxidante u otra medida protectora, para garantizar otro desarrollo de la estructura vegetal objetivo que comprende por lo menos una célula meristemática. Protocolo de secuencia-texto libre
Los siguientes datos reproducen la traducción al español de los datos contenidos en el protocolo de secuencia como texto libre (índice numérico <223>), citados en cada caso para el correspondiente índice de secuencia. Todas las secuencias citadas contienen bajo el índice numérico <213> la indicación a una "secuencia artificial ".
SEQ ID NO:1
<223> secuencia que comprende activador VP16
SEQ ID NO:2
<223> activador VP16
SEQ ID NO:3
<223> activador VP64 con espaciadores de glicina serina
SEQ ID NO:23
<223> vector 1_TaU6
SEQ ID NO:24
<223> vector 1_ZmU3
SEQ ID NOs: 41 a 48
ARN 14 guía de región de protoespaciador, ARN 16 guía de región de protoespaciador, ARN 37 guía de región de protoespaciador, ARN 38 guía de región de protoespaciador, ARN 39 guía de región de protoespaciador, ARN 43 guía de región de protoespaciador, ARN 18 guía de región de protoespaciador o ARN 52 guía de región de protoespaciador. Ejemplos
La presente invención es ilustrada en más detalle mediante los siguientes ejemplos, que no deben ser vistos como limitantes.
Ejemplo 1: Preparación de híbridos de CRISPR/Cas
La preparación de los híbridos ocurre sobre la base de la publicación de Mali et al. 2013. Los promotores fueron sustituidos selectivamente por promotores vegetales específicos y los ARNg fueron ajustados a los respectivos genes objetivo.
Híbridos para plantas monocotiledóneas:
Como promotores se usaron, entre otros, el promotor Ubi-Intron de maíz (SEQ ID NO:7), el promotor U3 de maíz (SEQ ID NO:10), el promotor U6 de trigo (SEQ iD NO:8 ), el promotor U3 de maíz (SEQ iD n O: 9) y el promotor EF1 de Brachipodium (SEQ ID NO: 40). un híbrido usado de modo ejemplar tiene la SEQ ID NO: 23 (Vector1_TaU6 estándar).
Híbridos para plantas dicotiledóneas (no de acuerdo con la invención):
En este caso, como promotores se usaron un promotor Ubi4 de perejil (SEQ ID NO:5) y un promotor U6 de Arabidopsis (SEQ ID NO:6 ). Un híbrido usado de modo ejemplar tiene la SEQ iD No :24 (Vector1_ZmU3 estándar).
Los diferentes ARNgs fueron preparados específicamente para el respectivo gen objetivo y clonados en la posición correspondiente en los vectores indicados anteriormente. La posición de la secuencia de ARNg corresponde a los nucleótidos designados como "n" en SEQ ID NOs: 23 y 24.
Para disminuir el número de diferentes ARNgs que tienen que ser introducidos en las plantas para lograr una edición del genoma, se estableció un ensayo in vitro, para probar los candidatos de ARNgs e introducir en las plantas sólo los candidatos más adecuados.
Para ello, mediante análisis in silico se definieron en primera instancia ARNgs potencialmente adecuados. Debido a la función dual del ARNg, esta definición es, como se menciona en la parte introductoria de la descripción, dependiente de la región objetivo de ácido nucleico de interés, en especial un motivo PAM, como también de la nucleasa CRISPR deseada o del fragmento catalíticamente activo de ella, que debería ser usada.
Para probar los diferentes ARNgs para diferentes genes, en un primer paso se aplicaron las regiones objetivo de ácido nucleico de interés, o zonas parciales de ellas, mediante PCR y se clonaron en vectores estándar. En este sentido, los vectores estándar denominan vectores o sistemas de vector obtenibles comercialmente, que pueden ser ajustados por medios conocidos por el experto, fácilmente a los requerimientos del ensayo deseado, en particular, en lo cual pueden actuar como esqueleto para la clonación de ácidos nucleicos de interés. Los vectores ejemplares pueden ser elegidos de entre: pJet (Thermo Fisher Scientific, Inc, EE. UU.), pGEM-T (Promega BioSciences, LLC, EE. UU.) o pBluescript (Addgene, EE. UU.). Estos vectores sirven como sustrato en el ensayo in vitro recientemente desarrollado. En un segundo paso se prepararon los diferentes ARNgs mediante transcripción in vitro (Invitrogen MAXlscript T7 Kit; No. de cat. AM1312M).
En un ensayo in vitro se probaron a continuación los ARNgs y se eligieron los candidatos potencialmente mejores y se usaron para los otros ensayos in planta. Para ello, entre otros, se identificó como región objetivo ejemplar de ácido nucleico de interés un gen A188hmg13 de plantas de maíz (factor 13 de transcripción HMG; véase gen GRMZM2G066528 de acuerdo con EnsemblePlants o base de datos de genoma de maíz). Éste fue amplificado mediante PCR y clonado en coincidencia en el sitio de clonación múltiple de pJET1.2, por un lado a la parte que comprende Exon 3-5 (hmg-fw4 y hmg-re2, véase la figura 14), por otro lado a la parte hmg-3' (hmg-fw3 y hmg-re1, véase la figura 15). Para ello, se convirtieron en lineales los plásmidos mediante digestión con Pvul, y para impedir la recircularización se desfosforiló el esqueleto del vector. El producto obtenido fue aplicado sobre un gel preparativo, con lo cual se realizó extracción y purificación del producto, después de correr gel. A continuación se midió la concentración del vector transformado en lineal obtenido. Para un ensayo común se usaron aproximadamente 3 μl de un vector 30 nM como sustrato para la digestión de Cas, se ejecutaron en cada caso por lo menos en triplicado. Para la preparación de las variantes de ARNg que iban a probarse, se clonaron éstas en el vector de quimera pEn (véase a modo de ejemplo la figura 16 para el ARNg14). La clonación en este vector ocurre de acuerdo con procedimientos estándar de biología molecular, como se representa a modo de ejemplo a continuación. La secuencia de quimera de pEn se encuentra en SEQ ID NO: 59. Sobre ésta se encuentra una quimera de ARN, que se especifica de modo relativamente simple a través de Bbsl Oligo. Después de ello son transferidos mediante una reacción Gateway LR al pDe-CAS9. La quimera de ARN está bajo el control del promotor AtU6-26. El vector obtenido fue después sometido a digestión con Ncol y Xbal, en donde el fragmento resultante comprende el ARNg de interés. El fragmento deseado que comprende el ARNg fue separado, sometido a extracción y purificado mediante procedimientos comunes de gel. Para los ensayos se usó en cada caso aproximadamente 1 μg del fragmento obtenido, como patrón para transcripciones in vitro (kit Invitrogen MAXlscript T7; No. de cat. AM1312M). Una carga ejemplar comprendía: patrón de 10 μl (1 μg); 2 μl de amortiguador de transcripción 10 x (Invitrogen); 1 μl de ATP 10mM; 1 μl de CTP 10mM; 1 μl de GTP 10mM; 1 μl de UTP 10mM; 2 μl de polimerasa T7-ARN (Invitrogen); 4 μl de H2O. La carga fue incubada como es usual durante 2 h a 37 °C. Se le añadió 1 μl de ADNsa TURBO y se incubó la carga durante otros 15 min a 37 °C. Se añadió H2O a un volumen de 100 μl y se purificó el ARN obtenido, de acuerdo con los datos del fabricante (Qiagen RNeasy Kit). Después de la elusión (dos veces con 50 μl de H2O), se determinó el volumen exacto así como la concentración del ARN obtenido. Para los otros ensayos, se usó en cada caso aproximadamente 15 ng/μl del producto de transcripción in vitro de un ARNg, para un ARN con longitud de 140 nucleótidos corresponde a aproximadamente 300 nM. A continuación se ejecutó una digestión in vitro, como sigue: la carga de reacción era típicamente de 30 μl.
Para garantizar una eficiencia óptima de escisión es importante respetar una relación molar de Cas9 y ARNg respecto a la respectiva región objetivo de ácido nucleico, en la relación 10:10:1 o mayor. Por último, se prepararon 300nM de los respectivos ARNg que iban a someterse a prueba. Además, se prepararon en cada caso 30 nM de ADN sustrato, que comprendía que en cada caso una única región objetivo de ácido nucleico. La carga de reacción fue combinada en el siguiente orden:
Figure imgf000044_0001
Se mezcló esto cuidadosamente y se sometió brevemente a centrifugación, antes de incubar la carga durante otra hora a 37 °C. De modo opcional, ocurrió un tratamiento con Proteinase K por adición de 1 μl de enzima e incubación durante 15-30 min a 37 °C. Mediante ello pudo ocurrir el análisis de fragmento (véase la figura 8 ).
En la figura 8 se encuentran los resultados para 10 ARNgs elegidos, en este caso de modo ejemplar en cooperación con una nucleasa Cas9. De este resultado se desprende de manera inequívoca que existe diferencia cualitativa y cuantitativa en la eficiencia de los respectivos ARNg y la nucleasa CRISPR asociada, respecto a la eficiencia de escisión de una región objetivo de ácido nucleico de interés.
Se ejecutaron experimentos adicionales (datos no mostrados) con nucleasas CRISPR de origen diferente a S. pyogenes y con nucleasa Cas, que portan por lo menos una mutación puntual, por ejemplo: una nickasa Cas para, mediante ello, probar in vitro la eficiencia de estas otras nucleasas Cas sobre una región objetivo vegetal de ácido nucleico de interés, en cooperación con el respectivo ARNg. Además, se ejecutaron experimentos in vitro iniciales exitosos, que muestran que los pares de interés de nucleasa Cas-ARNg, que fueron identificados en una discriminación anticipada, son adecuados para modificar de manera selectiva ARN y ADN vegetal mitocondrial o de plástido, lo cual prueba el amplio espectro de aplicación del presente ensayo.
Para probar la amplia aplicabilidad del procedimiento para otras plantas útiles importantes, se ejecutó así mismo el procedimiento de discriminación in vitro representado anteriormente como novedoso, mediante el uso de regiones objetivo de ácido nucleico derivadas de otras plantas útiles, como Beta vulgaris, Brassica napus y Sorghum bicolor.
Para ello, fue necesario, sobre la base de la particularidad del genoma vegetal, ejecutar nuevos análisis in silico, para poder definir regiones objetivo y con ello ARNgs adecuados. Además, en el marco del desarrollo del procedimiento, se trabajó también con otras nucleasas Cas, nickasas Cas, endonucleasas Cpf y fragmentos derivados de ellas, enzimáticamente activos, que además portan un dominio efector. Además, también podrían usarse proteínas Cas alternativas, o proteínas Cas con, por ejemplo, mutaciones puntuales y mediante ello probar las eficiencias de las diferentes proteínas Cas. Sobre todo, también en cooperación directa con los ARNgs probados.
Mediante ello deberían responderse varias preguntas: (1a) cuáles ARNgs muestran actividad particularmente elevada?; (2a) cómo repercuten las modificaciones en el ARNg, por ejemplo diferentes longitudes del protoespaciador o disparidades?; (3a) Cuáles proteínas Cas interactúan mejor con cuáles ARNgs?; (4) cual nucleasa CRlSPR, es decir, nucleasa Cass o nucleasa Cpf1, o cuáles mutaciones tienen un efecto en una nucleasa CRISPR sobre el efecto enzimático de la enzima?; y (5) influye el acoplamiento de un dominio efector, y con ello la preparación de un híbrido Cas estéricamente demandante, en la interacción con el correspondiente ARNg y con ello en la eficiencia de la modificación selectiva de una región objetivo de ácido nucleico de interés? En el curso de esta serie de experimentos avanzados se enfatizó hasta ahora que, en especial, la reducción de una nucleasa CRISPR a un fragmento mínimo catalíticamente activo de ella es ventajosa desde el punto de vista de la eficiencia de escisión alcanzada. Además, se encontró que es posible el anclaje de dominios efectores a la nucleasa CRISPR o el ARNg. Justo en ese caso fue sin embargo imperativa la discriminación in vitro, puesto que la eficiencia de estas nucleasas CRISPR o ARNgs modificadas fue en verdad menor, debido al mayor requerimiento estérico por el dominio efector y por ello condicionado por una interacción difícil de Cas y ARNg para los pares probados. Sin embargo, se identificaron también en este caso pares de dominios de efector Cas-ARNg eficaces.
De modo sorprendente se encontró que los resultados de la prueba in vitro anticipada, es decir, de la discriminación, tienen correlación también con la eficacia en ensayos de seguimiento.
En otro ensayo se probaron entonces todos los ARNgs mostrados en la figura 8 , respecto a su eficiencia durante la verdadera modificación orientada al sitio en un meristemo vegetal. En el resultado, el ensayo in vitro para la evaluación de la eficiencia del ARNg usado mostró ser notablemente útil, porque no en todos los ARNgs usados ocurrió un corte en el patrón, in vivo o in vitro. Incluso para los pares Cas-ARN, que han probado ser particularmente eficientes en el ensayo in vitro de discriminación, probaron ser eficientes también en los ensayos de seguimiento, en los cuales se trabajó con material vegetal, sea in vitro o in vivo. Una planta de maíz actuó como planta de partida para estos estudios de seguimiento, y como objetivo en especial el gen hmg13 objetivo.
Ejemplo 2: Inserción de híbridos CRISPR/Cas
Los híbridos descritos anteriormente en el Ejemplo 1 fueron introducidos mediante diferentes procedimientos en los meristemos. La base para ello es la accesibilidad de los meristemos que, dependiendo del material usado, fue garantizada mediante diferentes procedimientos (véase Ejemplo 4).
Se usaron los siguientes procedimientos:
- Bombardeo de partículas:
El bombardeo de partículas puede ser aplicado en todos los meristemos usados. Se bombardea con ADN de plásmido ds, ADNds lineal, ARN y proteínas, y partículas del virus. Como material de soporte pueden usarse, entre otros, oro y wolframio. Como prueba se hicieron bombardeos del meristemos de embrión (Fig. 5) y meristemos “borla" (Fig. 7), con ayuda de la proteína que tiene fluorescencia roja pudo probarse que es posible introducir ADN en estas células, mediante bombardeo de partículas. Al respecto, es importante considerar que los ajustes adecuados de bombardeo son usados en función del material respectivo. De este modo, un bombardeo más fuerte puede conducir a una transfección transitoria elevada (para las imágenes al respecto, véase la figura 9), pero por ejemplo, por ello puede también deteriorar fuertemente los embriones, lo cual hace imposible una germinación y desarrollo. Por consiguiente, en función del material vegetal de interés, que sirve como estructura objetivo, requiere cierto trabajo previo para ajustar las condiciones adecuadas del bombardeo de partículas, a las respectivas necesidades del experimento.
Por ello, es imperativo el establecimiento de procedimientos adecuados de bombardeo, en función del material vegetal usado y también del efecto deseado (inserción transitoria versus inserción estable), con lesión simultáneamente baja del tejido de planta o la destrucción del híbrido que va a ser introducido.
- Microinyección:
La microinyección puede tener lugar en todos meristemos, preferiblemente mediante el uso de un microscopio con micromanipulador. Debido al tamaño de determinadas estructuras de meristemo, como meristemos preparados de “borla" y de "oreja", la microinyección puede ser ejecutada sin embargo también bajo control con microscopio. La microinyección puede tener lugar bajo diferentes procedimientos y, como ya se indicó para el bombardeo de partículas (Ejemplo 1), con diferentes moléculas. Por un lado, se inyectan en la célula meristemática, ADN de plásmido ds, ADN ds lineal, ARN y proteína, así como partículas de virus en solución líquida, mediante una microcánula o nanocánula, por otro lado se aplican ADN de plásmido ds, ADN ds lineal, ARN y proteína sobre microagujas o nanoagujas y se transfieren con las agujas pinchando la célula meristemática.
Un perfeccionamiento de esta tecnología está en el uso de una combinación de pelos de carburo de silicio (SiC) (por ejemplo, pelo de carburo de silicio Silar®) y microinyección. Para ello se precipita ADN de plásmido ds, ADN ds lineal, ARN, proteína o partículas de virus sobre el pelo de carburo de silicio (SiC) y mediante cánula de microinyección se inyecta en el meristemo.
Esto ofrece como ventaja que puede transferirse no sólo una célula meristemática individual, sino que mediante la diseminación el pelo tiene la posibilidad de penetrar paralelamente diferentes células. Puesto que no tiene que pincharse la célula con la cánula y los pelos son claramente más pequeños, las lesiones de las células son claramente menores.
Inserción/inoculación vascular por punción (VPI):
La infección o inoculación vascular por punción es un procedimiento descrito en Benavente, 2012 (Virus-Induced Gene Silencing in Diverse Maize Lines Using the Brome Mosaic Virus-based silencing vector) y Louie, 1995 (Louie R, 1995. Vascular puncture of maize kernels for the mechanical transmission of maize white line mosaic virus and other viruses of maize. Phytopathology 85: 139-143), que es usado para introducir virus, partículas de virus, agrobacterias y ADN desnudo en granos intactos de maíz. Esta técnica hace posible la introducción selectiva en la cercanía del embrión y del tejido meristemático. Ofrece como ventaja que no se requieren pasos de preparación y las semillas eliminadas pueden ser usadas directamente. Mediante ellas se minimiza una lesión del tejido y el desarrollo de la planta es perturbado sólo levemente. Este procedimiento fue modificado y usado como sigue: las semillas, que contienen una región objetivo de ácido nucleico de interés, fueron empapadas en agua durante 4 h a 30 °C. Después las semillas fueron incubadas durante la noche en paños húmedos a temperatura ambiente. A continuación se transfirió con pipeta un plásmido o una mezcla de plásmidos o un virus de interés, al lado del grano de semilla que porta el embrión. Comúnmente se preparó una mezcla de 100 μl de plásmido, en una concentración de 37,5 μg/100μl o 1,5 μg/4 μl por cada plásmido. Con ayuda de una herramienta de incisión se movió el inóculo 1-2 mm en el escutelo a lo largo del embrión en dirección del haz vascular. Pines de retención en el ángulo de 45 ° respecto la superficie del grano que va a ser tratado. Ocurrieron 2 inoculaciones en distancia de 1 mm respecto al embrión para no lesionar el embrión. Se dejaron entonces las gotas sobre el grano.
Ejemplo 3: Transformación meristemática transitoria de brotes de maíz (no de acuerdo con la invención) y/o tratamiento de embriones/de acuerdo con la invención de los tejidos meristemáticos
La accesibilidad de los meristemos se diferencia notablemente en los estados individuales. De este modo, en el embrión (Fig. 1 y 2) los meristemos son relativamente bien accesibles, asumiendo que se usan embriones del tamaño correcto. Es importante transformar las células de los meristemos ubicadas más profundamente, puesto que las células superiores ya han pasado a través de una cierta diferenciación y ya no son adecuadas. Las figuras 10 y 11 muestran dos vistas de un embrión de maíz, así como la localización de tejidos meristemáticos marcados allí con estrellas. Inicialmente, estos datos fueron visualizados con un marcador de fluorescencia. A partir de ello es evidente que mediante el suministro del procedimiento recientemente encontrado, se hace posible la focalización enfocada en células meristemáticas y tejidos vegetales. Mediante ello se hace posible un procedimiento novedoso para la inserción de híbridos de ácido nucleico, por ejemplo, vectores, pero en especial también de ARNs y aminoácidos en una célula vegetal objetivo. El espectro de aplicación comprende al respecto una multiplicidad de posibles híbridos para el cambio selectivo por técnicas genéticas de una célula vegetal, por ejemplo híbridos CRISPR/Cas, vectores virales, híbridos de ARNi y similares, para alcanzar mediante ello activaciones, desactivaciones selectivas o mutaciones puntuales localizadas en la región objetivo de ácido nucleico de la célula vegetal.
Los meristemos en brotes y plantas viejas tienen que ser preparados completamente libres, puesto que ya están rodeados de tantas capas de tejido que no son accesibles para un bombardeo o una microinyección. Las Figs. 3 y 4 muestran los meristemos preparados, que pueden ser usados para la transformación. También en este caso, como para los meristemos del embrión, es válido que las células superiores ya han atravesado una cierta diferenciación y ya no son adecuadas. Por consiguiente, las células tienen que ser transformadas en el interior de los meristemos. Los meristemos preparados libremente pueden ser bombardeados tanto horizontal como también verticalmente. Mediante estudios de detalle se encontró que mediante el bombardeo vertical se eleva claramente la relación de golpe que en las regiones meristemáticas adecuadas (véanse las Figs. 11 y 12). Esto revela nuevamente que el bombardeo de partículas representa concretamente un procedimiento establecido y conocido, cuya aplicación eficaz para una pregunta específica durante la transformación de tejidos vegetales específicos, requiere sin embargo la optimización de diversos parámetros (híbrido que va a ser introducido, forma y estado del material que va a ser transformado, presión, orientación, etc.).
Puesto que los meristemos aislados están libres y por ello son abandonados a una fuerte oxidación y una necrosis resultante de ello, fueron tratados con un agente antioxidante, para hacer posible un desarrollo adicional del brote hacia la planta.
Para hacer accesible el meristemo de “borla", se desarrolló un procedimiento para deteriorar tan poco como sea posible la planta y los meristemos. Para ello, a la altura del meristemo de “borla" se cortó un tipo de ventana a través de la hoja (Fig. 6 ). Esto garantiza que la hoja no se necrotiza y que la planta se desarrolla de modo muy normal, y que el meristemo permanece protegido por el resto de la hoja. Adicionalmente, el meristemo se mueve muy rápidamente (dentro de pocas horas/días) de nuevo hacia arriba, de modo que queda de nuevo protegido completamente. Esto disminuye la posibilidad de una oxidación y con ello una necrosis del meristemo. Mediante este procedimiento es posible garantizar un desarrollo casi normal de las flores y obtener polen para una autofecundación o polinización. A su vez, esto ofrece como ventaja que ya pueden obtenerse células reproductivas modificadas selectivamente en la planta, lo cual hace superfluos los pasos tediosos de cultivo in vitro.
La transfección tiene lugar entonces mediante los procedimientos indicados anteriormente (véase el Ejemplo 2). Los embriones germinan y las plantas son cultivadas hasta la autofecundación y cosecha. Los resultados son comparables para los brotes y las plantas adultas, sólo sin germinación.
Ejemplo 4: Verificación por técnicas genéticas del cambio selectivo ocurrido
La verificación es posible mediante diferentes procedimientos y en diferentes puntos del tiempo:
La presencia del cambio selectivo deseado de una región objetivo de ácido nucleico puede ser analizada en fases prematuras del brote, de las plantas desarrolladas y el polen, de modo que ya se obtienen indicativos sobre las mutaciones ocurridas. Sin embargo, se obtiene un resultado inequívoco sólo cuando se analizan los descendientes de la autofecundación, puesto que esto aporta el indicativos sobre una mutación heredada.
- PCR de enriquecimiento:
Este procedimiento es aplicado cuando, mediante la mutación selectiva, se destruye un sitio de corte de la enzima de restricción. Se realiza entonces digestión con la enzima sobre ADN aislado genómico o extracromosómico, la cual corta en este sitio, de modo que se corta ADN de tipo silvestre. A continuación sigue una PCR con cebadores que están genómicamente corriente arriba y corriente abajo del sitio de corte de la enzima de restricción. En el caso ideal se obtiene sólo un producto, cuando ha tenido lugar una mutación y el ADN no fue cortado en el sitio. Puesto que por regla general la digestión del ADN genómico o del extracromosómico no es de 100 %, el producto de amplificación por PCR obtenido es sometido de nuevo a digestión con enzima para asegurar que ha tenido lugar una mutación y el sitio de corte de la enzima de restricción ha mutado. Los fragmentos no digeridos son a continuación clonados y se determina su secuencia, para ejecutar un análisis exacto de la mutación. Si la región objetivo de ácido nucleico debiese ser un ARN, en primera instancia esta puede transcrita en ADN mediante procedimientos conocidos por los expertos, antes de que ocurra una PCR de enriquecimiento.
- Determinación de la secuencia:
Si no fuese posible una PCR de enriquecimiento, mediante una aproximación de Determinación de Secuencia de Nueva Generación (NGS) se determina la secuencia de la región específica y se investigan las secuencias obtenidas respecto a sus mutaciones.
- Determinación de secuencia de genomas completos (WGS) para la identificación de efectos fuera del intervalo: para excluir la ocurrencia de mutaciones indeseadas, se realiza una WGS de los candidatos con las mutaciones deseadas. Son análisis adicionales, la verificación de ausencia de los híbridos y virus usados, mediante sistemas específicos de PCR y qPCR.
Ejemplo 5: Vectores virales (no de acuerdo con la invención)
Los virus ofrecen como ventaja que pueden ser introducidos en una estructura vegetal objetivo como partículas listas de virus, pero también como A d N o ARN. La introducción de los virus ocurre mediante los procedimientos de entrega indicados bajo el Ejemplo 2. Mediante ello se alcanza una introducción selectiva en las respectivas regiones meristemáticas objetivo de interés.
Adicionalmente, los virus ofrecen la posibilidad de la propagación en las células. Para ello se requiere que esta función no destruya mediante la modificación, su secuencia de ARN/ADN. Esto tiene como ventaja que, por un lado, no tiene que infectarse directamente el meristemo, o puede ser suficiente infectar sólo pocas células y, a pesar de ello, ocurrir la propagación en varios tipos de células o de tejidos.
Para esta aplicación, adicionalmente a los procedimientos de entrega descritos bajo el Ejemplo 2, existen aún otras posibilidades para introducir virus o partículas de virus.
Mediante frotamiento en la hoja y mediante infiltración (al vacío y no vacío), se introdujeron partículas de virus, productos de transcripción in vitro de los virus, o agrobacterias, que portan un ADN-T que codifican para los virus, para generar una infección primaria. Mediante una propagación sistémica ocurre entonces la infección de los respectivos células objetivo y tejidos objetivo.
Adicionalmente, para la infección se usó también savia con un elevado título de virus de plantas. Para ello se infectaron tabaco o espinaca con los virus, y a continuación se aisló la savia con los virus y se usó para la infección de las plantas de maíz.
Aparte del amplio espectro de posibilidades de infección y de la capacidad de propagación, los virus de ADN ofrecen como ventaja el poner a disposición patrones de ADN para la h R. En este caso, mediante la replicación del virus dentro de una o varias células, se pone a disposición una cantidad muy grande de patrones para la recombinación homóloga después de la inserción de la ruptura de cuerda doble. Mediante ello, con una elevada frecuencia ocurre la recombinación homóloga y la combinación del fragmento de patrón.
Por ello, en una serie de ensayos BMV diferentes (véanse SEQ ID NOs: 25-31 o número de depósito DSMZ: inóculo de virus BMV: PV-0945; referencia para plásmidos de BMV (C13/F1+F2 & C13/F3-13m): Benavente et al., Maydica, Vol 57, No 3 (2012): "Virus-Induced Gene Silencing in Diverse Maize Lines Using the Brome Mosaic Virus-based silencing vector.") y BSMV (que comprende por lo menos una secuencia elegida de entre SEQ ID NOs: 32-37 o número de depósito DSMZ: inóculo de virus BSMV: PV-0330; referencia para plásmidos BSMV (pCaBS-a & pCaBS-p & pCaybLlC): Yuan, C., et al. (2011). PLoS One 6(10): e26468."A high throughput barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots."), se introdujeron partículas de virus, plásmidos de virus, o mezclas de plásmidos de virus en una planta o células vegetales de interés. Se infectaron, entre otros, Nicotiana benthamiana, maíz A188, maíz Va35 y Spinacia olerácea con correspondientes virus, plásmidos o una mezcla de plásmidos. Se usó una inoculación por frotamiento, infección/inoculación vascular por punción o transformación mediada por Agrobakterium.
Para la inoculación por frotamiento se preparó, para la inoculación primaria, una mezcla de plásmidos de ADN, que contenía concentraciones similares de diferentes plásmidos. Por ejemplo, se usó cada plásmido en una concentración de 6 μg/|-il. Los diferentes plásmidos con la misma concentración fueron mezclados entonces en la misma relación de volumen. Por cada hoja, se hicieron gotear sobre la superficie de la hoja en cada caso 6 μl de mezcla de plásmido, hoja sobre la cual ya previamente se había esparcido el carborundo. La mezcla de plásmidos es entonces frotada con los dedos sobre la superficie de la hoja. Alternativamente, como material de partida puede usarse una savia infectada con virus. Para la segunda inoculación, durante este procedimiento se muelen en un homogeneizador hojas de plantas infectadas con virus, frescas o congeladas, y el producto/polvo obtenido es disuelto en 3-4 ml de amortiguador de inoculación (0,2406 g de KH2PO4 0,543 g de Na2HPO4 en 500 ml de agua desionizada). Para ello, la mezcla de plásmidos o la savia se añade una pequeña cantidad de carborundo. La mezcla de plásmidos o la savia son introducidas mediante frotamiento en las superficies superior e inferior de la hoja, en donde esto ocurre porque se sumergen en el inóculo uno o varios dedos y después se aplica el inóculo cuidadosamente en forma manual sobre por lo menos una hoja, en donde la hoja es soportada preferiblemente con la otra mano. La inoculación por frotamiento puede ser combinada también con una lesión precedente de una hoja de planta (incisión), en donde en este caso las hojas de interés son cortadas en primera instancia con un escalpelo y la inoculación por frotamiento ocurre entonces directamente en la hoja herida.
Para la transformación mediada por Agrobakterium (Ab), se preparan en primera instancia cultivos Ab durante la noche a 28 °C en 30 ml de caldo Luria líquido, que comprende un antibiótico adecuado, MES 10 mM y ACE 200 jM , al día siguiente se someten a centrifugación estos cultivos, a 4.400 rpm durante 15 min. Se descarta el sobrenadante y la pella es sometida nuevamente a centrifugación a 4.400 rpm durante 2 min. Se descarta el sobrenadante remanente y la pella es suspendida nuevamente en medio de resuspensión (5 ml de H2O, MES 10 mM, MgCh 10 mM ACE 20jM). Se ajusta a 1,5 la densidad óptica OD600 de la suspensión, mediante el uso del medio de resuspensión. La suspensión Ab y diluida es entonces incubada durante 4 h a temperatura ambiente. La infiltración de la suspensión Ab ocurre entonces preferiblemente sobre el lado inferior de una hoja de interés, por ejemplo, una hoja de Nicotiana benthamiana, en donde usualmente se inoculan 2 hojas de cada planta.
La siguiente tabla 2 muestra resultados ejemplares para virus y especies de plantas elegidos, mediante el uso de diferentes procedimientos de transformación:
Tabla 2: Vista general a los experimentos de infección con virus (Sdi: semanas después de la infección)
Figure imgf000048_0001
Figure imgf000049_0001
El depósito blanco en la tabla 2 indica que para este experimento pudo alcanzarse una infección sistémica. Un depósito gris claro denomina una infección local, mientras un depósito gris oscuro indica una baja tasa de infección.
La verificación de la infección exitosa como ocurrió a través de ELISA o mediante RT-PCR.
Ejemplo 6 : Estrategia 2-ARNg
Para activar selectivamente ADN genómico y extirpar específicamente del genoma una región objetivo de ácido nucleico de interés mediante el uso de una nucleasa CRISPR, se estableció una denominada estrategia 2-ARNg (véanse las fig. 17 A y B). Como también se aclara en la Fig. 17 A, para ello en primera instancia se aisló ADN genómico y se realizó digestión con una enzima de restricción (RE) de interés, cuyo sitio de corte está dentro del producto de PCR de interés. Puede usarse cualquier RE, que pueda cortar entre las dos regiones objetivo de ARNg. De este modo ocurre un enriquecimiento en ADN potencialmente editado, puesto que allí ya no está presente la región entre las regiones objetivo de ARNg y la enzima de restricción elegida no puede cortar este ADN. A continuación ocurre una amplificación por PCR con cebadores, que unen corriente arriba y corriente abajo las dos regiones objetivo de ARNg, es decir, bajo condiciones adecuadas de reacción pueden unirse mediante hibridación. Dado el caso, puede ejecutarse una nueva PCR de RE con un conjunto de cebador intercalado ("nested'). Después de la edición exitosa surge un producto de PCR más pequeño, comparado con el producto de ADN no editado (véase 17 B). La imagen Fig. 17 B muestra el resultado del análisis en una edición después de la aplicación de la estrategia 2-ARNg con ADN genómico de una planta de maíz. A partir de plantas de maíz se aisló el a Dn genómico y se amplificó con PCR el gen objetivo hmg13 (factor 13 de transcripción HMG; GRMZM2G066528). La secuencia del gen 13 de factor de transcripción HMG sin una edición es mostrada en SEQ ID NO: 60.
Las posiciones 1-98 de nucleótido de la SEQ ID NO: 60 así como las posiciones 912-1023 de nucleótido de la SEQ ID NO: 60 corresponden a la región del gen hmg, que permanece presente después de una edición exitosa. Las posiciones 82-101 de nucleótido de la SEQ ID NO: 60 así como las posiciones 909-928 de nucleótido de la SEQ ID NO: 60 son en cada caso las regiones objetivo de ARNg.
La Fig. 17 B representa el resultado de una separación en un gel al 1 % con el parámetro 100 V de carrera estándar y visualización mediante fluorescencia mediada por el bromuro de etidio, en diferentes rendiciones de contraste. En las pistas 1 y 2 se ve el resultado para plantas de maíz no editadas, en la pista 4 se ve el resultado después de la edición exitosa. El producto de PCR es más pequeño, puesto que la región entre las dos regiones objetivo de ARNg fue extirpada. Con ello, esta aproximación representa una estrategia rápida y eficiente, para poder confirmar experimentalmente una edición exitosa del genoma.
La SEQ ID NO: 61 muestra el resultado de la determinación de secuencia de producto pequeño de PCR, después de edición de hmg13 con la estrategia 2-ARNg. Entre las dos bases C y T las posiciones 98 y 99 de la SEQ ID NO: 61 ha tenido lugar la eliminación a través de una edición selectiva.
Ejemplo 7: Edición de genoma en tabaco (no de acuerdo con la invención)
Como gen objetivo en Nicotiana benthamiana se eligió NbTTG1 para el trabajo de edición del genoma, cuyo ortólogo en Arabidopsis thaliana por incapacidad funcional conduce a un fenotipo de tricoma. Para el correspondiente gen AtTTG1 de Arabidopsis (AT5G24520) se describen mutantes:
Figure imgf000049_0002
Figure imgf000050_0001
El ortólogo en Nicotiana benthamiana fue identificado mediante comparación de secuencia y se amplificó el sitio genómico mediante PCR. En la figura 18 se muestra la sección correspondiente. Mediante esta secuencia se eligieron ARNgs pertinentes como se describió anteriormente. Los componentes para la edición del genoma fueron introducidos en la planta mediante TRV (virus de cascabel de tabaco) (véase el ejemplo 8 abajo). También en este caso se usó la estrategia 2-ARNg delineada arriba en el Ejemplo 6 , para el análisis de una edición exitosa.
Como es evidente en la tabla 3 abajo, mediante diferentes combinaciones de en cada caso dos ARNgs pudieron generarse eliminaciones de diferente tamaño en el gen NbTTG1. Para este ensayo se usó una nucleasa Cas9, sin embargo la aproximación puede ser usada para cualquier nucleasa CRISPR.
Tabla 3:
Figure imgf000050_0002
Ejemplo 8 : Expresión de CRISPR-Cas mediada por virus de cascabel de tabaco (TRV) en Nicotiana benthamiana (no de acuerdo con la invención)
Para la inoculación de la hoja de tabaco se prepararon en primera instancia cultivos de Agrobacterium (Ab) durante la noche a 28 °C en 30 ml de medio líquido de caldo Luria (LB), que contenía un antibiótico selectivo. Al siguiente día se sometieron a centrifugación estos cultivos a 4.400 rpm durante 15 min. Se descartó el sobrenadante y la pella fue sometida de nuevo a centrifugación a 4.400 rpm durante 2 min. Se descartó el sobrenadante remanente y se suspendió de nuevo la pella en 5 ml de medio de resuspensión (MES 10 mM, MgCh 10 mM, ACE 20 j M). Se ajustó a 0,8 la densidad óptica a 600 nm (OD600) de la suspensión, mediante el uso del medio de suspensión. Después se incubó a temperatura ambiente durante 4 h la suspensión Ab diluida. A continuación ocurrió la infiltración de la suspensión Ab, con ayuda de una jeringa sin cánula sobre el lado inferior de una hoja de interés, por ejemplo, una hoja de Nicotiana benthamiana, en donde usualmente se inocularon 3 hojas de cada planta. Para visualizar la eficiencia de propagación sistémica de TRV, se inocularon hojas con un RFP/pTRV2 (marcador que tiene fluorescencia roja TRV como vector viral) así como controles con pZFN-tDT-nptll. Como se desprende de la figura 19, es detectable una clara fluorescencia RFP en las hojas inoculadas directamente, así como en las distales no inoculadas (la fluorescencia roja original corresponde a las regiones claras y/o blancas en la Fig. 19). El híbrido pZFN-tDT-nptll actúa como control, que permite exclusivamente la expresión del RFP en las hojas inoculadas, aunque no en las hojas distales.
Además, se confirmó que mediante este procedimiento mediado por TRV pueden activarse incluso tejidos meristemáticos, lo cual permite un cambio selectivo de este tipo de tejido mediante el procedimiento CRISPR específico. Para ello, se infectaron plantas de Nicotiana benthamiana con t Rv , en donde el híbrido comprende un gen que codifica una proteína que tiene fluorescencia roja, por ejemplo, tdT o similar. Mediante la detección de la fluorescencia roja a través de medios adecuados (microscopio o binoculares de fluorescencia) puede hacerse seguimiento a donde se encuentra el TRV en la planta. Para ello, puede ser ventajoso usar marcadores de fluorescencia con una elevada intensidad, puesto que éstos también pueden ser bien detectados en capas profundas del tejido. En las Fig. 20 A a H se ven representaciones que muestran la absorción de un meristemo de flores, de un botón de flores, de un pistilo o de un pistilo preparado con ovarios abiertos. Todas las representaciones demuestran la expresión exitosa del marcador de fluorescencia en la respectiva célula vegetal o tejido meristemáticos como estructura objetivo, y con ello la eficiencia del procedimiento elegido de inserción.
Finalmente, se cuantificaron los títulos de TRV en hojas de tabaco inoculadas y no inoculadas, mediante ELISA sándwich de anticuerpo doble estándar (DAS).____Como material de partida para el ELISA se cosecharon 10-12 dμl de material de hoja de cada una de las plantas que iban a ser analizadas, en donde para cada planta se prepararon las siguientes muestras de mezcla: (i) muestra mixta de en cada caso dos hojas inoculadas con TRV; (ii) muestra mixta de cada caso dos hojas no inoculadas. Se prensó el material de hoja cosechado y se usó la savia colectada en una dilución de 1:50 en el DAS-ELISA. El DAS-ELISA fue ejecutado usando un antisuero policlonal de conejo. El antisuero es adquirido de la compañía Loewe®y tiene la denominación "Tobacco Cascabel Tobravirus BroadRange.TRV" (No. de cat. 07152S). La evaluación del ELISA ocurrió 60 min después de la aplicación del sustrato 4-nitrofenilfosfato mediante medición fotométrica de la OD405. De este modo se cuantificó concretamente el título de TRV en N. betamiana inoculada con (i) pTRVI (= control negativo); (ii) pTRVI pTRV2-tDTco (= control positivo) y (iii) pTRVI pTRV2-Cas9. En la figura 2 l se representan los resultados.
Ejemplo 9: Cuantificación de herramientas CRISPR
A modo de ejemplo, se verificaron los productos de transcripción de Cas9 mediante RT-PCR. Para ello, como material de partida para el ELISA se cosecharon 10-12 dμl de material de hoja de cada una de las plantas que iba a ser analizada, en donde para cada planta se prepararon las siguientes muestras mixtas: (i) muestra mixta de en cada caso dos hojas inoculadas con TRV y (ii) muestra mixta de en cada caso dos hojas no inoculadas (véase el ejemplo 8 ). En primera instancia, se realizó extracción del ARN del material de hoja cosechado, mediante el uso de un RNeasy Mini Kit (Qiagen). A continuación, mediante el uso del kit de síntesis RevertAid H Minus First Strand cDNA (Thermo Fisher Scientific), se transcribieron en cada caso 500 ng de ARN en ADNc. El ADNc sirvió como patrón en una subsiguiente PCR, para la detección de Cas9. Se usaron cebadores específicos de Cas9.
A partir de material de hoja de plantas de maíz transgénicas se prepararon además extractos de proteína y se separaron sobre un gel de gradiente SDS-PAGE 4-20 %. La detección de la Cas9 del tamaño de 160 kDa ocurre con un anticuerpo monoclonal de ActiveMotif (número de catálogo 61577). La documentación de este sistema de detección es representada en la Fig. 22.
Para la cuantificación de ARNgs y para analizar si, partiendo de un virus, tiene lugar una expresión de ARNgs mediada por un promotor subgenómico, se establecieron sistemas RT-PCR cuantitativos a base de verde SYBR. Durante la amplificación con la misma eficiencia de PCR, mediante comparación de la cantidad de ARNg con el nivel de transcripción de proteína viral, puede hacerse una cuantificación. Este sistema es representado a modo de ejemplo en la figura 23 para el virus del mosaico de bromo (BMV).
Ejemplo 10: sistemas de expresión viral (no de acuerdo con la invención)
Aparte de los vectores virales descritos anteriormente, las herramientas CRISPR y procedimientos de esta divulgación pueden ser introducidos así mismo de modo viral en otros sistemas vegetales. Dependiendo de la planta objetivo de interés así como del tipo de transformación y del tejido objetivo que va a ser infectado, pueden usarse diferentes procedimientos. Para células de endospermo de maíz como estructura primaria objetivo, es adecuado por ejemplo el sistema de Ugaki et al. (1991, Nucleic Acids Res., Replication of a geminivirus derived shuttle vector in maize endosperm cells). Sobre la base del virus enano de trigo (WDV) como vector, puede obtenerse con ello un cultivo infectado, mediante transformación de protoplastos de cultivos de endospermo de maíz. Con este propósito se usa un virus modificado, que en el sitio de la proteína de recubrimiento (CP) porta un gen II de neomicina fosfotransferasa (nptll). Para plantas objetivo de Triticum puede usarse un sistema de replicación transitoria con el virus enano de trigo como carga, de acuerdo con Matzeit et al. (1991, Nucleic Acids Res., 19(2), 371-377). Para ello se transfectan protoplastos derivados de cultivos en suspensión de Triticum. De nuevo se reemplaza el gen CP del virus por un gen marcador de interés.
Además, pueden usarse sistemas a base de virus de mancha de maíz, que son conocidos por los expertos en el campo y descritos por ejemplo en Palmer & Rybicki (2000, Archives of Virology, 146 (6 ), 1089-1104). Para ello se infectan plantones de 3 días de edad en los nódulos coleoptilares y puede alcanzarse una expresión transitoria de un híbrido recombinante de interés. Mediante el intercambio de los genes CP y MP virales puede impedirse una propagación sistémica del virus, de modo que se infectan sólo las 2 o 3 primeras hojas.
Como se citó interiormente, el virus del mosaico de tira de cebada (BSMV) es adecuado como vector viral. El genoma de BSMV fue remodelado de modo intensivo, para mediante ello establecer un vector de protoplastos vegetales conocido (véase Joshi et al., 1991, EMBO J., 9(9), 2663-2669.). Este vector, que de acuerdo con Joshi et al. 1990 porta un gen de reporte de luciferasa (luc), es adecuado para la transfección de protoplastos, de protoplastos de maíz y de tabaco.
BSMV (véase también Manning et al., 2010, New Phytologist, 187 (4), 1034-1047), WDV, Wheat Strike Mosaic Virus (WSMV) (Choi et al., 2000, Plant J., 23(4), 547-55), virus de rizo de hoja amarilla de tomate (TILCV) (Peretz et al., 2007, Plant Physiol., 145 (4), 12514-1263) y virus del mosaico de bromo (BMV) (French et al., 1986, Science 231(4743), 1294-7) son adecuados además como sistemas para la transfección de protoplastos, plantones, peciolos y otros tejidos o células vegetales en trigo, pero también cebada y tabaco, como se describe detalladamente en la literatura. En especial los vectores BSMV (véase Manning et al., 2000 arriba) son adecuados en forma modificada como vectores para el silenciamiento de gen inducido por virus. Para ello, se modificó el genoma de BSMV mediante mutagénesis dirigida al sitio, mediante inhibición de la expresión de la proteína de recubrimiento viral. Se atenuó TILCV (véase Peretz et al., arriba o el documento EP 2 436 769 A1)) y se le hizo accesible para el uso como vector transbordador viral para plantas y para E. coli, en el sentido de que en la proteína de recubrimiento viral se elimina una secuencia que comprende 60 pares de base cerca al extremo N del gen.
Así mismo se conocen aproximaciones específicas para la transformación de remolacha azucarera a base de vectores virales. Para ello son adecuados en particular el virus Beat Curly Top (BCTV) (Kim et al., Plant Mol. Biol., 2007, 64(1-2):103-12), el virus amarillo de remolacha (BYV) (Prokhnevsky et al., Molecular Biotechnology, 57 (2), 101-110, 2015), virus del mosaico de remolacha transmitido por el suelo (BSBMv ) (Dach et al., 2015 ASSBT Proceedings Tagungsband 47° encuentro anual del grupo de trabajo "Viruskrankheiten der Pflanzen", Section C), o virus de vena amarilla necrótico de remolacha (BNYVV) (Hamza et al., 2015, ASSBT Proceedings). Estos vectores son adecuados no sólo como vectores para la caña de azúcar, sino además para otras dicotiledóneas, por ejemplo, espinaca.
Para el tabaco como planta modelo, así mismo están disponibles muchos procedimientos para la transformación mediante vectores virales. Muchos de estos procedimientos se basan en infiltración mediada por Agrobacterium. Los virus adecuados comprenden virus del mosaico de tabaco (TMV), virus X de patata (PVX), virus del mosaico de frijol de ojo negro (CPMV), virus enano amarillo de frijol (BeYDV), virus de la Sharka (PPV) (para ello véase por ejemplo Gleba et al., 2014 o Salzar-Gonzalez et al., 2015, Plant Mol. Biol., 87:203-217). Además, se describen otros diversos sistemas, que como virus usan por ejemplo virus de rizo de hojas de repollo (CaLCuV) (Yin et al., 2015, Nature Scientific Reports, 5:14926, 2015), virus cascabel de tabaco (TRV) (Ali et al., 2015, Genome Biology, 16:238) o virus gemelo enano amarillo de tabaco (TYDV) (Dugdale et al., 2014, Nat. Protoc., 9(5), 1010-27).
Todos los vectores mencionados anteriormente contienen sitios de clonación para la introducción de genes objetivo de interés. Sin embargo, los sitios específicos de corte pueden ser introducidos en un genoma viral de interés, también de modo simple mediante procedimientos disponibles de mutagénesis.
Ejemplo 11: Procedimiento optimizado para el establecimiento de ventanas de plantas (no de acuerdo con la invención)
Para optimizar todavía la inserción selectiva de los híbridos CRISPR y con ello el efecto de la edición del genoma, se mejoraron aún los procedimientos representados anteriormente en el Ejemplo 3. El procedimiento original comprendía el cierre de la ventana introducida artificialmente con un cierre, como por ejemplo un papel de tejido especial. Sin embargo, dependiendo de la exposición, esto puede estar asociado con la desventaja de que el tejido de planta lesionado y que permanece abierto es accesible más fácilmente a la infección con hongos, o que una parte de la borla expuesta, la parte bombardeada, entra en fuerte contacto con el aire, mediante lo cual puede ocurrir un secado de las estructuras de borla liberadas o de los estados inmaduros de flor, y por ello unas ramificaciones individuales de borla. Por ello, en un primer paso se cubrió el tejido de borla liberado y transformado como se describió anteriormente, con una paleta o tejido de algodón humedecido. Mediante ello pudo disminuirse claramente el secado, aunque también este procedimiento es propenso a posibles infecciones con hongos. Para abordar este problema se aplicaron ceras o sustancias similares a la vaselina al sitio herido (después de la transformación). Se probaron diversas sustancias, que comprenden vaselina, mezclas de ceras naturales con vaselina y otros productos obtenibles comercialmente, que se ofrecen para la curación de heridas, en especial en árboles. Esta forma de proceder es bien conocida por los expertos, especialmente en el ámbito de los injertos. Adicionalmente, se envolvió el sitio herido con cinta especial para injertos o parafilm, lo cual mejoró significativamente el cierre de las heridas y por ello la protección ante infecciones por hongos, y pudieron desarrollarse los tejidos meristemáticos transformados, completamente hasta su madurez. Mediante esta estrategia optimizada pudieron desarrollarse una gran parte de las borlas en forma transformada hasta su madurez. Con ello se alcanzaron tasas de éxito de 75 % y más, es decir, eventos en los cuales pudo desarrollarse el tejido de borla liberado y transformado hasta su total madurez.
Ejemplo 12: Inyección de Agrobacterium (no de acuerdo con la invención)
Para ensanchar más la amplitud del ámbito posible de uso, se ejecutaron los procedimientos delineados en el Ejemplo 3 enmendados de modo que, en lugar del bombardeo de partículas, se usó transformación mediada por Agrobacterium (Ab). En un ensayo anticipado, en primera instancia se probó la susceptibilidad de tejido inmaduro de borla para Ab. Para ello se transformó in vitro una proteína que tiene fluorescencia roja en tejido inmaduro de borla, que había sido aislado previamente de la planta. En el momento del aislamiento las plantas correspondientes estaban en el estado V6-V7 y las borlas tenían una longitud de aproximadamente 2-3 cm. Se ajustó Ab a una OD600 de 1,0 y se incubaron las borlas durante 10 min con la suspensión de Ab. 2 días después de la infección, se observó una fluorescencia roja. Se observaron varios puntos con fluorescencia roja en las borlas, lo cual probó la idoneidad de la infiltración con Ab para la transformación de tejidos de borla. En una etapa siguiente se usaron entonces las plantas en el estado V6-V7 y se abrieron ventanas en las plantas, como se describió anteriormente en la región del tejido inmaduro de borla. Los Ab, que contenían un híbrido de expresión de fluorescencia roja, fueron inyectados directamente en el tejido de borla en una OD de 0,7. Se inyectaron aproximadamente 100-200 μl de la suspensión de Ab por cada borla. En la figura 24 se muestra el procedimiento de abertura de la ventana y la inyección de Ab. Para ello, se cubrieron las borlas con vaselina/parafilm, como se describió anteriormente, y se vigiló el desarrollo de fluorescencia roja 2 días después de la inyección. Para prevenir un crecimiento intensivo de Ab, después de 2 a 7 días después de la inyección inicial, se aplicó una solución de antibiótico (por ejemplo, timentina, carbenicilina, Cefotaxim, etc.) al tejido infectado. Las borlas tratadas pudieron avanzar hasta la madurez y se realizó una autofecundación. Los análisis moleculares en la generación T1 confirman la transformación exitosa. Para ello, se confirmó que es adecuado un procedimiento in planta para transformar células meristemáticas in planta, sin perjudicar el desarrollo adicional de la borla, de modo que pudo obtenerse el polen resultante directamente sin procedimientos de cultivo (in vitro) tediosos de las plantas transformadas, y pudo ser usado de inmediato para la polinización.
Ejemplo 13: Aplicabilidad de diferentes genotipos de maíz
Los experimentos de transformación de borlas representados anteriormente fueron probados para diferentes genotipos de maíz, es decir, A188, Va35 y A632. Para cada genotipo, el estado vegetativo en el cual puede transformarse el tejido de borla, es naturalmente diferente. Sin embargo, esto puede ser determinado fácilmente. En A188 el estado es por ejemplo V6-V7, mientras A632 fue enfocado por ejemplo en el estado V7 a V9. En todos estos genotipos fue posible liberar de manera adecuada la borla, es decir, generar ventanas en las plantas sin deteriorar éstas o al tejido de borla, y obtener maduros los anteros que producen polen.
Ejemplo 14: Bombardeo del meristemo del embrión
Para optimizar adicionalmente el procedimiento descrito en la presente memoria, se estableció un denominado bombardeo de meristemo de embrión, que permite que puedan obtenerse plantas de manera eficiente directamente de embriones inmaduros, sin cultivo celular que consume tiempo y es propenso a la contaminación, como paso intermedio. Para ello, se ejecutó en el modo de tubería el bombardeo de partículas de regiones de meristemo de embriones inmaduros para los genotipos A188 y A632. Se bombardearon aproximadamente 100 embriones (Fig. 25 A) con híbridos CRISPR/Cas9 junto con un plásmido que expresa una proteína que tiene fluorescencia roja. Un día después del bombardeo se observó el desarrollo de fluorescencia (Fig. 25 B). Numerosos embriones mostraron fluorescencia y con ello la inserción exitosa y funcional de los híbridos CRISPR. Posteriormente se trabajó con los embriones transformados exitosamente. Después de la germinación se analizó 25 % de las plantas en el nivel molecular. Todas las plantas restantes con fluorescencia positiva fueron dejadas creciendo en el invernadero hasta la madurez. Una vez las plantas alcanzaron el estado reproductivo, se tomó una muestra de la borla así como de la espiga y se investigó la actividad de CRISPR/Cas9. Una vez se identificó un resultado exitoso, por ejemplo mediante PCR, se usaron las plantas para la auto fecundación y así mismo se analizaron los descendientes resultantes.
Las plantas producidas de este modo rindieron semillas para los dos genotipos y eran fértiles. Las plantas mostraron un crecimiento lento así como una estatura ligeramente atrofiada (Fig. 25 C), aunque mediante este procedimiento pudo obtenerse sin más una planta fértil, cuyo polen pudo ser incorporado de inmediato en otros experimentos. Este tipo de transformación representa con ello así mismo un procedimiento altamente eficiente para introducir de manera rápida y eficaz híbridos de CRISPR o las ediciones de genoma mediadas por ellos, en un tejido meristemático o una célula de interés, para poder después directamente a partir de este tejido, obtener y utilizar adicionalmente tejidos reproductivos.
Ejemplo 15: Acceso al meristemo en diferentes tipos de planta
Como se mencionó anteriormente, es deseable preparar una transformación in planta para una multiplicidad de diferentes plantas y combinar ésta con el procedimiento divulgado en la presente memoria, de modo que pueda alcanzarse un cambio selectivo de una multiplicidad de estructuras objetivo meristemáticas a través de los sistemas CRISPR. Incluso la inserción transitoria de híbridos de CRISPR de interés en una estructura vegetal objetivo meristemática es de gran interés, puesto que mediante ello puede cambiarse de manera selectiva una estructura objetivo de ácido nucleico de interés y a continuación transmitirse este cambio, aunque no los híbridos de CRISPR en sí mismos.
Los tejidos que pueden desarrollarse in planta para órganos reproductivos, son limitados. El más importante de ellos es el meristemo de brote. Este meristemo está definido por el grupo de células, que pueden diferenciarse en todos los órganos y células vegetativos así como órganos y células regenerativos por encima del suelo. Consiste en un número limitado de células, que pueden ser (re)programadas, para diferenciarse en todos los órganos de una planta. Este meristemo tiene por regla general una forma de cúpula. La línea exterior de las células, denominada capa L1, forma la base para todos los tejidos epidérmicos. Las capas interiores (L2 y L3) del meristemo forman el resto del órgano y con ello son interesantes para el propósito de la presente invención. El meristemo se forma muy temprano en el desarrollo del embrión. Después del crecimiento vegetativo, se desarrolla el meristemo en el meristemo de las flores, para generar los órganos reproductivos de las plantas. Los tejidos que dan como resultado órganos reproductivos modificados son: (1 ) el meristemo de brote del embrión, (2 ) el meristemo de brote de plantas o de plantas en el estado vegetativo y (3) el meristemo de flores o los botones de flores.
Cuando la información genética de estos tejidos es modificada por aproximaciones no virales (pistola de genes, microinyección, Agrobacterium, etc.), puede ser que no se cambien de manera selectiva todas las células de estos meristemos. Como consecuencia, se modifican algunos de los órganos de planta que se diferencian y algunos retienen el genotipo silvestre. Con ello surgen las quimeras.
Una alternativa para manipular de manera selectiva una multiplicidad de diferentes plantas de cereales es transformar microesporas (polen inmaduro) o granos de polen. Estos tejidos pueden ser usados entonces para polinizar otras plantas y obtener descendientes modificados. Existen sólo pocos ejemplos en la literatura, la mayoría de ellos en el contexto de bombardeo y análisis de expresión transitoria de los genes introducidos (Twell et al., 1989, Obert et al.
2008). Sin embargo, también se refina la tecnología para mediante ello madurar de manera selectiva microesporas o polen y, mediante subsiguiente polinización, obtener descendientes modificados. El procedimiento para esa tecnología es muy similar para las diferentes plantas de cultivo. La focalización de microesporas puede ocurrir directamente en anteros inmaduros, o mediante la liberación de las microesporas en un medio de cultivo. Esta focalización puede ocurrir por ejemplo mediante bombardeo o microinyección. Esta técnica fue usada de manera exitosa para la producción de plantas de tabaco con genes trans (Touraev et al., 1997) y algodón (Gounaris et al., 2005). Como para la focalización de polen maduro, puede tratarse polen recientemente obtenido, mediante bombardeo o sonido (Eapen (2011)) y de inmediato ser usado para la polinización de, por ejemplo, espigas de maíz (Horikawa et al., 1997). Los descendientes pueden ser entonces analizados respecto a la presencia de genes trans o eventos en únicos introducidos selectivamente.
Beta vulgaris:
Para la transformación de tejidos meristemáticos en remolacha azucarera pueden obtenerse embriones inmaduros, como se describe en Zhang et al (2008). Se obtuvieron espigas de flores de plantas cultivadas en el invernadero, 14 días después de la antesis. Fueron esterilizadas en agente blanqueador al 30 % durante 30 min. Se aislaron embriones inmaduros (lEs), a continuación fueron cultivados durante 4 semanas en un medio MS sólido con diferentes reguladores de crecimiento de plantas. En la figura 26 se encuentra una representación de un embrión inmaduro tal. En estos embriones inmaduros pueden tratarse directamente selectivamente los meristemos apicales de brote (como en la microinyección), en donde con ayuda de un microscopio se activan selectivamente las regiones del meristemo. Alternativamente, pueden usarse tecnologías de focalización aleatoria, como bombardeo. Después de la focalización ocurre la maduración adicional. Esta maduración del embrión ocurre en un incubador, en la oscuridad en un intervalo de temperatura de aproximadamente 20-30 °C. La duración de la maduración es de aproximadamente 1 a 4 semanas. Una vez ha madurado el embrión y comienza a germinar, es transferido a medio MS sólido a la luz, con lo cual pueden desarrollarse las plántulas. Cuando estas plántulas están suficientemente robustas, son transferidas a la tierra, después de una fase de aclimatación de aproximadamente 1 a 4 semanas. Estas plantas son entonces recolectadas y se analizan los descendientes.
La focalización de embriones inmaduros de remolacha azucarera requiere la eliminación de la vaina dura de la semilla (Hermann et al. 2007). El embrión se encuentra en el centro y el meristemo apical del brote es accesible. Antes de la eliminación del pericarpio, tiene que ejecutarse una esterilización de la semilla mediante blanqueo y el uso de etanol. Después, con ayuda de escalpelos u otras herramientas afiladas, puede eliminarse el pericarpio y se libera el embrión. Este embrión es entonces transferido a un medio adecuado para el método específico de la transformación de interés. el meristemo del embrión maduro o de la totalidad del embrión puede ser sometido entonces directamente a una transformación mediante el uso de un microscopio, que de manera aleatoria activa las regiones del meristemo. Después de una fase de reposo de aproximadamente 1 a 10 días en un incubador en la oscuridad (20-30 °C), germina el embrión y pueden plantarse las plantas. A continuación se cultiva la planta de remolacha azucarera hasta la madurez y se analizan los descendientes.
El meristemo de brote en retoños de remolacha azucarera puede ser focalizado mediante cortes selectivos en la región del meristemo (Artschwager 1926). Estos tipos de meristemos de brote fueron focalizados ya de modo selectivo, por ejemplo mediante bombardeo de partículas. Antes de la prueba de la expresión del gen, se ejecutaron ensayos de penetración de partículas. Se detectó expresión transitoria de GUS en la primera y segunda capas de células del meristemo. Las células que se dividen con actividad de GUS mostraron que las células soportan vitales el bombardeo (Mahn et al. 1995). Adicionalmente, se propuso que pudiesen usarse los meristemos con cepas atenuadas de Agrobacterium para la transformación con Beta vulgaris (Kerns et al 1988). Para ello pueden usarse diferentes métodos (microinyección, Agrobacterium) y diferentes tejidos vegetales en diferentes estados de desarrollo. Para el propósito de la presente divulgación, se ejecutó un bombardeo de tejidos meristemáticos de plantones que fueron multiplicados in vitro. Se retiró el material de hoja hasta que estaba expuesto el tejido meristemático. Las regiones meristemáticas fueron entonces cortadas verticalmente, o se suministraron las regiones verticalmente sin cortes. Después del bombardeo con un cañón de genes, se dejó in vitro el material explantado. Un día después del bombardeo de las células se verificó que las células mostraban actividad de beta-glucuronidasa, la cual fue introducida como marcador en las células, lo cual prueba que las regiones meristemáticas de la remolacha azucarera son adecuadas para el bombardeo de partículas y con ello para la inserción de herramientas de edición genómica, por ejemplo, herramientas CRISPR.
Además puede cambiarse selectivamente la inflorescencia de remolacha azucarera, mientras se desarrolla, bien sea antes de la formación de las flores o directamente en las flores inmaduras. Las flores pueden entonces madurar adicionalmente y después de la polinización cosecharse las semillas, y analizarse los descendientes. En Beta vulgaris, la inflorescencia consiste en un eje principal abierto con muchas inflorescencias ramificadas cerradas, dicasiales y simpodiales. La flor terminal de cada unidad de inflorescencia y las flores laterales se funden hasta dar un estado posterior desarrollo. Los cinco primordios del estambre descienden uno de otro, y surgen en el curso del desarrollo de flores mediante la formación de un anillo (intra)estaminal de un meristemo anular que se intercala (Olvera et al. 2008).
Triticum aestivum:
Para trigo como planta objetivo, se desarrolló otra aproximación. Para ello se recolectaron granos inmaduros de espigas inmaduras, 5 a 20 días después de la floración. Estos granos fueron esterilizados mediante tratamiento superficial con agente de blanqueo y etanol. Los embriones inmaduros fueron entonces extraídos con un escalpelo bajo un microscopio. Estos embriones mostraron un meristemo expuesto con diferente manifestación. Estos meristemos fueron sometidos entonces a diferentes métodos de transformación, como se describe en Sautter et al. (1995). En las Figs. 27 A y B se encuentran representaciones de ello. Una vez los embriones fueron tratados de este modo, fueron cultivados adicionalmente, es decir en un medio de maduración del embrión, como se describe en Matthys-Rochon et al. (1998). Las plántulas que germinan (Fig. 27 C) fueron transferidas entonces, después de aclimatación, al invernadero. Las plantas fueron cultivadas de manera regular y a continuación se analizaron los descendientes.
Así mismo, en trigo el meristemo de brote puede ser seleccionado para las transformaciones, como se describe en Sautter et. al 1995. Para ello, para la producción de meristemos de brote vegetativos apicales, se esterilizaron y lavaron semillas empapándolas en etanol al 70 % durante 2 min, seguido por tratamiento con hipoclorito de sodio y cuatro enjuagues con agua. Las semillas estériles son entonces sembradas en tubos pequeños de vidrio, en medio MS suplementado con 100 mg/l de Cefotaxim, 2 % de sacarosa y 0,8 % de agar Difco. A continuación, se liberan meristemos apicales de brote de plantas de 6 a 10 días de edad, mediante eliminación de los coleoptilos y las primeras tres a cinco hojas. Se recortaron entonces raíces en aproximadamente 5 mm. Los materiales explantados son suplementados para ello con diferentes concentraciones de sacarosa (óptima: 10 %) y depositados en medio MS base (0,8 % de agarosa). Después del bombardeo de partículas, se transfirieron los materiales explantados después del bombardeo para otro cultivo sobre agarosa de MS.
Además, en trigo pueden focalizarse también los órganos de flores. El meristemo de brote en trigo se diferencia muy temprano en el desarrollo hacia espigas o retoños inmaduros, pocas semanas después de la siembra. Estas espigas inmaduras se encuentran en el lado inferior del pértigo (véase la fig 28 imagen izquierda). En estas espigas inmaduras, mediante un corte del retoño se introdujo una ventana. Mediante esta ventana pudieron alcanzarse los tejidos meristemáticos con diferentes técnicas de transformación. Después de la transformación, se cerró la herida y la planta transformada fue cultivada adicionalmente hasta la madurez de las semillas (véase la fig 28 centro a la izquierda y derecha así como imagen derecha) y a continuación se analizaron los descendientes. Alternativamente, las espigas inmaduras pueden desprenderse de la inflorescencia, ser esterilizadas in vitro y soltadas selectivamente. La maduración y producción de semillas pueden ser ejecutadas in vitro, entonces siguiendo a Barnabas et al 1992.
Además, para trigo se mostró que es posible la focalización en inflorescencias inmaduras mediante el uso de una pistola de genes (Leduc et al. 1994, Sautter et al. 1995). Después del bombardeo, se mostró que las células pueden expresar genes de reporte introducidos en el tejido tratado de este modo, y dividirse adicionalmente.
Brassica napus:
También para colza se mostró que el meristemo apical de brote ya se desarrolla en el denominado "estado de corazón". En Huang et al., 2009 se describe un procedimiento de transformación para colza en este estado, el cual puede ser usado también con el procedimiento divulgado en la presente memoria.
Además, en colza puede transformarse selectivamente como planta objetivo el meristemo de brote, también en un estado posterior a la germinación, o cuando las plantas han alcanzado el estado de hoja 2-8. Para ello, se retiran cuidadosamente con un escalpelo los primordios de hoja que cubren el meristemo. Los meristemos liberados son tratados entonces preferiblemente con un antioxidante, para protegerlos. A continuación, pueden transformarse las regiones meristemáticas, mediante diferentes técnicas de transformación. También en este caso pueden criarse las plantas a continuación hasta la madurez de los órganos reproductivos, y los descendientes obtenidos pueden ser analizados respecto a la presencia del cambio selectivo introducido.
También pueden focalizarse las flores de colza. Las flores en una inflorescencia de colza son producidas continuamente. En la punta del racimo de flores se producen nuevas flores. Si debieran transformarse los órganos de flores de colza, pueden seguir dos aproximaciones. Por un lado, pueden activarse de manera selectiva flores inmaduras abiertas in situ y tejidos reproductivos. Después del tratamiento, se retiran inflorescencias y vainas no tratadas y se cubren entonces las inflorescencias para promover la autofecundación. Se cosechan las semillas y se analizan los descendientes. En la segunda aproximación se eliminan meticulosamente todas las flores diferenciadas del racimo/panoja de flores y se deja expuesto el meristemo de flores. Estos meristemos son entonces tratados mediante diferentes tipos de transformación. Se cubren entonces los meristemos, con ello puede continuar el desarrollo normal. Se cosecharon todas las vainas/envolturas y se probaron los descendientes de modo correspondiente por biología molecular y por los fenotipos.
Glycine max:
Para la transformación de granos de soja pueden así mismo activarse selectivamente regiones meristemáticas.
Los meristemos de brote de embrión fueron transformados y expuestos como describe McCabe (McCabe et al., 1988). Para ello, se esterilizan superficialmente semillas maduras de soja (BR-16, Doko RC, BR-91 y Conquista) en etanol al 70 % (1 min) seguido por inmersión en hipoclorito de sodio al 1 % durante 20 min y después enjuague por tres veces en agua destilada estéril. Se empaparon las semillas en agua destilada durante 18-20 h. Se extirparon los ejes embrionales de las semillas y se expusieron los meristemos apicales por retiro de las hojas primarias. Se colocaron los ejes embrionales en medio de bombardeo (BM: MS (Murashige y Skoog 1962) sales basales, 3 % de sacarosa y 0,8 % de Phytagel Sigma, pH 5,7), alineados hacia arriba de modo apical en placas de cultivo de 5 cm con 12 ml de medio de cultivo. Una vez los renuevos derivados de los ejes embrionales alcanzaron una longitud de 2-3 cm, se tomó una sección de 1 mm de longitud de la base de cada hoja, para el análisis de la GUS (beta-glucuronidasa) (McCabe et al. 1988). Los renuevos o brotes, que expresaban el ADN exógeno, fueron transferidos individualmente a una maceta plástica, que contenía 0,2 I de tierra fertilizada (vermiculita (1 :1 )) pasada por autoclave, y después se mantuvo en el invernadero, cubierta con una bolsa plástica sellada con una banda de caucho. Después de 1 semana se retiró la banda de caucho. Después de otra semana así mismo se retiró la bolsa plástica. Una vez las plantas aclimatadas alcanzaron una longitud de aproximadamente 10 cm, fueron transferidas a una maceta con 5 I de tierra fertilizada, hasta que alcanzaron a desarrollarse las semillas (McCabe et al. 1988). Cuando las plantas crecieron, se tomaron muestras de las hojas para los análisis. Se cultivaron adicionalmente las plantas hasta su madurez, para analizar los descendientes de ellas, respecto al cambio selectivo introducido.
Alternativamente, se activó selectivamente el meristemo de los embriones inmaduros, para la transformación. Para ello, 5 a 20 días después de la floración se cosecharon las vainas y con ayuda de un escalpelo y una herramienta de sujeción, se extrajeron los embriones entre el estado de corazón o de cotiledón. Estos embriones fueron llevados al medio de maduración del embrión y se transformó selectivamente el meristemo apical de brote, con diferentes procedimientos de liberación/transformación. Los embriones fueron entonces cultivados en la oscuridad durante 1 a 10 semanas hasta la maduración completa, como se describe en Buchheim et al. (1989) y recibieron luz para la germinación del embrión. Los plantas cultivadas de este modo fueron cultivadas en el invernadero, hasta la madurez. Se cosecharon las semillas y se analizaron los descendientes. La inserción selectiva de híbridos recombinantes en los meristemos de brote de las plantas de soja que estaban en germinación fue ejecutada como se describe (Chee et al. 1989). Se esterilizaron semillas de Glycine max L. Merr. (Cv A0949) durante 15 min mediante inmersión en una solución de Clorox al 15 %, seguida por varios enjuagues con agua destilada estéril. Para la germinación, se humedecieron las semillas durante 18 a 24 h sobre pañuelos de papel estériles humedecidos, en cápsulas de Petri a 26 °C en la oscuridad. Se retiraron las envolturas de las semillas, y se retiró uno de los dos cotiledones de cada semilla germinada, y se inocularon las mitades de semilla con el botón de brote del brote (plumula), los nódulos de los cotiledones y tejidos adyacentes a los cotiledones, durante la noche con cultivos líquidos de cepa C58Z707 avirulenta de Agrobacterium, que contiene el plásmido pGA482G binario. La transformación de Agrobacterium puede ser reemplazada también por otros procedimientos de inserción o de transformación. Otra aproximación es descrita por ejemplo en Chowrira et al. 1995. En este caso, se expone el botón terminal de plantas (7-10 días de edad) mediante eliminación del tejido circundante de hoja. Se inyecta ADN extraño con una jeringa, que contiene también Lipofectin como agente de transfección, y después de ello se realiza electroevaporación del meristemo con la mezcla. Las plantas son cultivadas sin selección hasta el madurez y a continuación de esta manera pueden obtenerse plantas quiméricas. Después se analizan los descendientes de ellas.
Se ganó acceso a los estigmas de las flores de soja que iban a ser polinizadas, como se describe en Shou et al (2002). Dicho brevemente, todos los experimentos fueron ejecutados al final de la tarde con flores que habían sido polinizadas en la misma mañana de manera natural. Se retiraron dos pétalos y un pétalo de la quilla, para exponer a la luz los estigmas/ estigmas de flores de soja. Se desprendieron los estigmas en el límite entre el ovario y el estigma, y se aplicó ADN de plásmido (concentraciones de 25, 80, 100 o 150 μg/ml) sobre el estigma expuesto. Se identificaron mediante etiquetado las flores tratadas y se eliminaron las flores y botones no tratados del mismo nódulo. Se cosecharon individualmente las vainas que se desarrollaron a partir de las flores tratadas. Alternativamente, puede transformarse de modo selectivo el meristemo de las flores de la inflorescencia de soja, antes de que se desarrolle de modo terminal, para lo cual se retiran los primordios, o, cuando las flores comienzan a desarrollarse adicionalmente. Esta exposición fue lograda mediante escisión de los primordios con un escalpelo. Una vez el meristemo de las flores ha sido transformado, es cubierto. Después de que pudo desarrollarse la inflorescencia y ocurrió la autofecundación, pudieron cosecharse las vainas de las plantas tratadas, se procesaron las semillas, y pudieron probarse los descendientes respecto a un cambio genómico selectivo.
Gossypium sp.:
Para algodón, pueden ejecutarse experimentos de acuerdo con la presente divulgación para la inserción de un cambio selectivo de interés, para lo cual se tratan los meristemos de embriones, como se describe en Aragao et al (2005). Para ello se cosecharon manualmente semillas (var. 7mH, CD-401, Antares y ITA94) y se retiran las pelusas mediante tratamiento con ácido. Se añadió ácido sulfúrico concentrado, y se mezclaron vigorosamente las semillas (3 ml/g de semilla) durante 1 min con una barra de vidrio. Se transfieren de inmediato las semillas 5 I de agua, se enjuagan tres veces con agua destilada y se secan sobre un paño de papel. Las semillas maduras son esterilizadas superficialmente con etanol al 70 % durante 10 min, seguido por 1 min de tratamiento en hipoclorito de calcio al 2,5 % y son enjuagadas 3 veces en agua destilada estéril. Después se empaparon las semillas en agua destilada durante 24 h, con lo cual las semillas pudieron germinar durante 16 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Se extirparon los ejes embrionales de las semillas y se expusieron los meristemos apicales mediante eliminación de los cotiledones. Se transfirieron los materiales explantados al medio MS, que contenía 3 % de glucosa (5 mg/l de bencilaminopurina (BAP), 0,8 % de Phytagel (Sigma)). Antes de llevarlo al autoclave, se ajustó el valor de pH a 5,7. Se prepararon los ejes embrionales como se describió anteriormente y se colocaron en medio de bombardeo (sales base de medio MS, 3 % de glucosa, 5 mg/l de BAP y 0,8 % de Phytagel Sigma, pH 5,7), de modo apical hacia arriba, en placas de cultivo de 5 cm con 12 ml de medio de cultivo. Para ello pueden transformarse o transfectarse los meristemos. Se cultivaron en la oscuridad los meristemos apicales tratados. Los meristemos que mostraron crecimiento fueron transferidos a una cámara de crecimiento. Se transfirieron las plantas al invernadero y se cultivaron hasta la madurez. Se analizaron los descendientes.
Alternativamente, se transformaron los meristemos de embriones, como se describe en Rajasekaran (2013).
En otra aproximación, se focalizaron in vitro los meristemos de embriones inmaduros de acuerdo con el protocolo descrito por Mauney (1961). El medio de cultivo usado estaba compuesto por mezcla nutritiva blanca con todos los componentes cinco veces la concentración habitual y suplementos (40 mg/l de sulfato de adenina, 250 mg/l de hidrolizado de caseína, 150 ml/l de leche de coco, y 7 g/l de NaCl). Se endureció el medio con 8 g/l de Bacto-Agar y 20 g/l de sacarosa como fuente de carbohidrato. El rasgo más importante de este medio para el éxito del procedimiento de cultivo es el ajuste de la presión osmótica a un nivel elevado, lo cual puede ser alcanzado mediante adición de 7 gm/l de NaCl. Una vez los embriones crecieron en este medio durante 3-4 semanas, fueron transferidos a un medio con una presión osmótica media (3 g/l NaCl en lugar de 7 g/l) y, después de otro periodo de crecimiento de 2 semanas, se transfirieron entonces a un medio sin NaCl. Los embriones cultivados exitosamente en el último medio germinaron y fueron plantados en tierra.
Para transformar meristemos de brote en plantas de algodón, en una primera aproximación se transformaron meristemos como se describe en Zapata et al. (1999). Se esterilizaron superficialmente semillas con ácido sulfúrico concentrado (1 h), a 50 rpm en equipo de sacudimiento por rotación (50 % de Clorox (1 h)) y se en enjuagó por lo menos tres veces con agua doblemente destilada estéril. Las semillas fueron llevadas entonces a medio solidificado con 0,15 % (peso/vol) de gelrite, pH 5,7, que contiene las sales inorgánicas de Murashige y Skoog (MS) (Murashige y Skoog 1962) y 2 % de sacarosa para la germinación. Se incubaron las semillas durante 3-4 días a 28 °C en la oscuridad. Las puntas de renuevo fueron aisladas y después transferidas en MS de sales inorgánicas (Murashige y Skoog 1962 con 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de tiamina/ HCl, 0,5 mg/l de ácido nicotínico, 0,5 mg/l de piridoxina/HCl, 3 % de sacarosa y 0,15 % (peso/vol)) de gelrite a pH 5.7. Después del aislamiento, puede realizarse la liberación de un híbrido recombinante de interés y a continuación puede transferirse el material vegetal a nuevo medio. Los ápices transformados vitales son transferidos a medio fresco. Después de ello se transfieren los ápices sobrevivientes al mismo medio, aunque sin canamicina. Una vez pudieron formarse raíces se transfieren las plantas con raíces (T0) a tierra y se dejan crecer hasta la madurez en el invernadero. Los descendientes pueden ser analizados entonces.
Alternativamente, se transformaron los meristemos de algodón como se describe en Keshamma et al. (2008). Para ello se remojaron semillas de una línea de cultivo NC-71, durante la noche en agua destilada y se esterilizó la superficie, primero con 1 % de Bavastin durante 10 minutos y después con 0,1 % de HgCh durante algunos segundos, y a continuación se lavó en cada caso cuidadosamente con agua destilada. Las semillas pudieron germinar posteriormente a 30° C en la oscuridad sobre cápsulas de Petri. Se usaron brotes de dos días de edad como material explantado. Se infectaron los brotes con plumula/botón de brote resultante, en lo cual se separaron los cotiledones, sin dañarlos, de modo que fue visible el meristemo. Después puede aplicarse un procedimiento de transfección o de transformación de interés. A continuación se transfirieron los brotes a Soilrite (equivalente de vermiculita) pasado por autoclave, se humedecieron con agua y para la germinación se llevaron bajo condiciones asépticas, cubiertos a una cámara de crecimiento, 5 plantones por maceta. Después de 5 a 6 días se transfirieron los brotes en macetas con Soilrite y se les dejó crecer durante por lo menos 10 días, antes de poder ser transferidos al invernadero. Después las plantas maduras pudieron ser analizadas.
En otra aproximación se transformaron meristemos de algodón de acuerdo con el protocolo descrito en McCabe et al. (1993).
En todavía otra aproximación pueden transformarse selectivamente flores de algodón de acuerdo con el procedimiento de Gounaris et al. (2005). Para ello se usan plantas de algodón de la variedad Christina para la transformación. Las flores que deberían ser usadas como receptoras de polen tienen que para ello ser liberadas dos días antes del momento previsto de la dehiscencia de células masculinas de germinación. En la mañana del día de la polinización, se recolectan flores donadoras con estambres intactos, 1-2 horas después de brotar. Cada flor donadora puede ser tratada entonces con un procedimiento de transformación o de transfección de interés. Estas inflorescencias fueron usadas para la posterior polinización de flores receptoras (anticipado: eliminación de las células masculinas de germinación). Las flores polinizadas pueden desarrollarse adicionalmente y producir semillas. Los descendientes pueden ser analizados entonces por biología molecular. En otra aproximación pueden modificarse genéticamente de modo selectivo meristemos de flores o flores inmaduras. Para ello, el meristemo que forma la rama formadora de fruto, expone el botón de fruto y la floración inmadura, mediante eliminación de los primordios y de las brácteas. Sobre los tejidos expuestos puede entonces aplicarse un método de liberación (transformación, transfección, biológico, químico o mecánico) de interés de acuerdo con la presente divulgación. Después de ello, se cubrieron las zonas tratadas y se les dejó crecer adicionalmente. Después se cosecharon los frutos. Los descendientes pueden ser analizados por biología molecular así como opcionalmente por vía de los fenotipos.
Oryza sativa:
En tanto la planta objetivo de interés sea arroz, pueden usarse los siguientes procedimientos para introducir un cambio genómico selectivo en una estructura objetivo meristemática.
De acuerdo con el procedimiento de Naseri et al. 2014 se esterilizan semillas de arroz (O. sativa var Hashemi) remojándolas en etanol al 90 % (1 min) y lavándolas tres veces con agua. Se colocan las semillas estériles durante dos días a 22 °C sobre algodón húmedo. En este estado ocurrió la inoculación con A. tumefaciens en meristemos embrionales apicales de las semillas remojadas, en la región de la superficie de la semilla, donde se desarrollará posteriormente un brote. Se pincha la superficie dos veces hasta una profundidad de aproximadamente 1 a 1,5 mm con una aguja (O 0,7 mm, previamente sumergida en inóculo de A. tumefaciens). Se colocaron las semillas inoculadas entonces en frascos, tapados con lámina de aluminio, sobre papel de filtro sobre perlita húmeda y se incubó durante nueve días a 23 °C en la oscuridad. Germinaron 70 a 75 % de las semillas inoculadas. Para matar A. tumefaciens se sumergieron los brotes a temperatura ambiente en una solución acuosa (1000 ppm) de Cefotaxim durante 1 h. Para la formación de raíces se colocaron los brotes en solución de Yoshida. Finalmente, se plantaron los brotes en macetas y se cultivaron hasta la madurez (T0) bajo condiciones no estériles. Se hizo posible la autofecundación y con ello la producción de una generación T1.
En otra aproximación, se activaron los meristemos de embriones inmaduros para el cambio selectivo con las herramientas CRISPR divulgadas en la presente memoria. Las semillas inmaduras fueron cosechadas 3-12 días después de la polinización. Los embriones inmaduros son colocados en el medio de maduración (Ko et al. 1983), y pueden aplicarse los procedimientos de interés de transformación/transfección. Se llevaron hasta la madurez los embriones, como se describe en Ko et al. (1983). Se cosecharon las semillas, y se realizaron los descendientes mediante biología molecular.
Se trataron meristemos de plántulas de arroz como se describe en Muniz de Péadua et al (2001). Para ello se esterilizaron superficialmente semillas de arroz y se hicieron germinar in vitro. Después de aproximadamente 4 días se extirpan los ápices de los brotes de la parte distal del primer internodio del epicotilo y del coleóptilo. Después de la exposición puede aplicarse un sistema de liberación de interés. Se hace posible entonces la formación de raíces. Las plántulas obtenidas fueron transferidas al invernadero y se cultivaron adicionalmente, y los descendientes fueron finalmente analizados.
Para la focalización de órganos de flores se tratan espiguillas inmaduras de arroz como se describe en Rod-in et al,. (2014). Las inflorescencias son usadas en el estado 51 (comienzo del desarrollo de panoja: punta de la inflorescencia de fuera de la envoltura) de acuerdo con la escala BBCH (Lancashire et al., 1991) y pueden después ser tratadas y a continuación pueden analizarse los descendientes obtenidos. Además, pueden activarse los meristemos de las flores. Para ello, tienen que liberarse los meristemos mediante retiro del tejido circundante y a continuación son transformados, cultivados adicionalmente, y finalmente se analizan los descendientes. Además, las espiguillas inmaduras pueden ser tratadas mediante transformación o transfección, antes de la diferenciación o una vez se ha eliminado el primordio circundante. Las espiguillas tratadas podrían desarrollarse entonces adicionalmente. Se cosecharon las semillas resultantes de las correspondientes flores y se investigaron los descendientes respecto a eventos de edición selectiva (Itoh et al., 2005).
Ejemplo 16: Procedimiento de transformación transitoria
En especial para la transformación in planta de tejidos meristemáticos, existe un gran interés en el suministro de procedimientos de transformación transitoria, en particular para la introducción de herramientas CRISPR de interés, puesto que mediante ello a los descendientes de una célula pasa sólo el cambio que va a ser introducido de modo selectivo, aunque no la herramienta en sí misma. Tales procedimientos controlados y controlables son, debido a determinaciones regulatorias y condicionado por consideraciones de seguridad, cada vez más importantes en el ámbito de los cultivos de plantas. Los procedimientos de transformación, tanto transitorios como estables, tienen que naturalmente ser ajustados al tejido que va a ser transformado. Por ello se ejecutaron los siguientes ensayos, que algunos son aplicados de modo amplio y general, y algunos para tejidos específicos (polen, meristemo, flores, etc.).
Cas9:
Cas9 fue adquirido de New England Biolabs (NEB), PNA BIO, ToolGen, LDBIOPHARMA o ABM, o Cas9 fue purificado como se describe en Liu et al. (2015).
Transcripción in-vitro de sARNgs:
La transcripción in vitro fue ejecutada como describen Zuris et al. (2015). Los fragmentos lineales de ADN, que contienen un sitio T7 de unión de promotor seguido por la secuencia objetivo de sARNg de 20 pb, fueron transcritos in vitro usando el kit T7 ARN High Yield Synthesis (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN transcrito in vitro fue precipitado con etanol purificado mediante electroforesis en gel sobre un gel de urea 10 % de poliacrilamida Criterion TBE (Bio-Rad). Los fragmentos de gel extirpados fueron sometidos a extracción en 420 μl de NaCl 300 mM sobre una superficie de sacudidor a 4 °C. El sARNg purificado con gel fue precipitado con etanol y disuelto de nuevo en agua, y finalmente se cuantificó la concentración de sARNg mediante absorción UV. El sARNg puede entonces ser sometido a congelación de choque y almacenado a -80 °C. Alternativamente, se obtuvieron ARNgs como se describe en Kim et (2014). Para ello se transcribió in vitro ARN mediante reacciones de escorrentía de polimerasa ARN T7 mediante el uso del kit MEGAshortscript T7 (Ambion). Se generaron patrones de sARNg o ARNcr por acumulación y alargamiento de dos oligonucleótidos complementarios. El ARN transcrito fue purificado por extracción con fenol:cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. El ARN purificado fue cuantificado mediante espectrometría.
Alternativamente, puede ejecutarse otro protocolo (descrito en Ramakrishna et al. 2014). Para ello se transcribió in vitro ARN mediante reacciones de escorrentía por la polimerasa ARN T7. Se generaron patrones para la transcripción de sARNg mediante apareamiento por puentes de hidrógeno/hibridación y alargamiento de dos oligonucleótidos complementarios. El ARN transcrito fue separado sobre un gel PAGE-urea al 8 % desnaturalizante. El ARN fue recibido en agua libre de nucleasa, y a continuación fue purificado y obtenido mediante extracción con fenol:cloroformo, extracción con cloroformo y precipitación con etanol. El ARN purificado fue cuantificado mediante espectrometría.
Formación de complejo de proteína Cas9 y ARNg:
Como se describe en Zuris et al. (2015) para la introducción de complejo Cas9:sARNg se mezclaron 1 μl de proteína Cas9200 μM con 2 μl de sARNg 50 μM y se incubaron durante 5 min a temperatura ambiente, antes de la mezcla del complejo con 3 μl, bien sea de ARNiMAX o de Lipofectamine 2000, y se incubó por otros 30 min antes de la inyección. Alternativamente, se ejecutó la formación de complejo como describen Kim et al 2014. Para ello, se mezcló previamente proteína Cas9 (4,5-45 mg) con sARNg transcrito in vitro (6-60 mg). Se disolvió proteína Cas9 en amortiguador de almacenamiento (HEp Es 20 mM pH 7,5, KCI 150 mM, DTT 1 mM y 10 % de glicerina) con sARNg en agua libre de nucleasa, se mezcló y se incubó durante 10 min a temperatura ambiente.
Agrobacterium (Ab)
Transformación de polen con Ab:
La transformación de polen fue ejecutada como se describe en Li et al. (2004). Para ello se recolectaron flores con anteros recientemente desarrollados y expuestos. Se transfirió una alícuota de una solución de Ab a tubitos estériles de 1,5 ml y se sometieron a centrifugación durante 10 min a 3.000 rpm. Se suspendió de nuevo la pella (en medio de germinación de polen con aproximadamente 50 mg de polen/ml) y se aplicó vacío (-80 Pa) durante 30 min y a continuación se liberó lentamente. A continuación, la suspensión fue sometida a centrifugación a 3.000 rpm durante 5 min y se usaron de inmediato las pellas, es decir, el polen, para la polinización.
Transformación de meristemo apical de brote con Ab:
Se transformaron meristemos de brote sobre la base del protocolo de Chee et al. 1989. Para ello se ejecutaron inoculaciones en tres sitios diferentes, introduciendo una aguja de calibre 30'/2 en la plumula, nódulos de cotiledones y regiones adyacentes, y se inyectaron aproximadamente 30 ml de las células Ab en cada punto de inyección. Continuó el proceso de germinación de las semillas infectadas con Ab, en lo cual se transfirieron las semillas a papel estéril humedecido y se incubaron adicionalmente a 26 °C (en la oscuridad, durante aproximadamente 4 h). Para el desarrollo completo se introdujeron después los brotes en el suelo. Alternativamente, puede aplicarse el protocolo descrito en Keshamma et al. (2008). Se infectan los brotes, una vez surge la plumula, mediante separación de los cotiledones, sin deteriorarlos, de modo que es visible el meristemo. A continuación se pinchan los meristemos con aguja de coser estéril y a continuación se sumergen durante 60 min en un cultivo de Agrobacterium. Después de la infección, se lavaron brevemente los brotes con agua estéril y posteriormente se transfirieron a Soilrite pasado por autoclave.
Bombardeo de partículas:
El bombardeo de meristemos de embrión fue ejecutado como sigue: Se colocaron embriones en el estado coleoptilar o de corazón 0-6 horas antes del bombardeo, en medio de maduración del embrión suplementado con osmótico, como se describe en Vain et al. (1993). La preparación y procesamiento de partículas fueron ejecutados de acuerdo con una precipitación rutinaria de ADN con cloruro de calcio y espermidina. En el caso de mezclas de proteína/ARN se ejecutó el protocolo de Martin-Ortigosa et al (2014), en donde se seca o liofiliza la mezcla junto con las partículas de oro. Después de 16-24 h luego del bombardeo, se llevaron los embriones al medio de maduración sin osmótico.
Bombardeo de los anteros:
El bombardeo de los anteros puede ser realizado de acuerdo con Twell et al., 1989. Para ello, se esterilizan los anteros de plantas 1d antes de la liberación de polen, en Clorox al 10 % durante 10 min y se enjuagan en agua destilada estéril. Los anteros fueron cortados transversalmente con una cuchilla de afeitar estéril y se colocaron 20 secciones de antero sobre un medio MSO sólido con una superficie de 4 cm2 con mostradores expuestos.
En otra aproximación se bombardearon anteros como describe Obert (Obert et al. 2008). Para ello, se cosecharon puntas/espigas, una vez las microesporas estaban en el estado de desarrollo medio mononuclear. En estos estudios se usaron dos tratamientos previos diferentes, junto con el uso de material no tratado previamente. Para un tratamiento previo en frío se almacenó el material vegetal en un papel de filtro humedecido en una cámara fría a 5 °C (Dedicova et al. 1999). Después del tratamiento previo del material (14 días en la cámara fría), se eligieron las partes específicas de las espigas, que contienen las microesporas, en el estado exacto adecuado y se usaron como otro material experimental. Se esterilizó superficialmente el material (en alcohol al 70 % (vol./vol.)) y se lavó 3x con agua destilada estéril. Para el tratamiento previo con manitol se esterilizaron superficialmente (en alcohol al 70%) las partes adecuadas de las espigas frescas, que contienen las microesporas en el estado correcto, y se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Los anteros fueron aislados bajo condiciones estériles y para el tratamiento previo fueron colocados en medio líquido (manitol 0,3 M o agua) y almacenados en una cámara fría a 5 °C. Los anteros fueron aislados frescos antes del bombardeo o, después de un tratamiento previo, fueron colocados sobre la superficie de un medio de cultivo (FHG Medien Kasha et al., 2001). Las condiciones de bombardeo fueron: distancia (macroportador -anteros en cápsula de Petri) 9 cm; ajustes de presión de 650, 900 y 1.100 psi. Los cultivos de anteros fueron cultivados entonces a 26 °C en la oscuridad en una cámara de crecimiento de cultivo de tejido.
En otra aproximación (Touraev et al. (1997)) se bombardean microesporas unicelulares y granos de polen en el estado bicelular medio, inmediatamente después del aislamiento en el respectivo medio de cultivo. Se colocó la suspensión (0,7 ml), que contenía aproximadamente 5*105 células, homogéneamente sobre un papel de filtro (Whatman No. 1) estéril y en una cápsula de Petri de 10 cm (Sterilin, Gran Bretaña). Se usó el sistema de liberación de partículas PDS-1000/He operado con helio (Bio-Rad, EE. UU.) para la transformación biolística. El bombardeo fue ejecutado esencialmente como describen Sanford et al. (1993). Se precipitó plásmido de ADN sobre partículas de oro (Bio-Rad, EE. UU.) con un promedio de diámetro de 1,1 μm. La transformación comprendía tres bombardeos. Las microesporas o granos de polen semibicelulares bombardeados fueron lavados del papel de filtro e incubados en el respectivo medio de maduración.
Bombardeo de flores:
Siguiendo un protocolo de Twell et al., 1989, se bombardearon grupos de 10 flores con pétalos curvados en forma intacta, en donde se suspendieron en agua destilada los tallos de las flores cortados.
Bombardeo de polen:
Siguiendo un protocolo Protokoll de Twell et al., 1989 se recolectó polen de flores maduras en tubitos estériles de microcentrífuga. Antes de bombardeo se suspendieron muestras de polen seco en medio MSO líquido, en una densidad de aproximadamente 106 granos por ml. La suspensión de polen (1 ml) fue de inmediato transferida con pipeta a la superficie de una cápsula de Petri de 9 cm, que contenía medio MSO solidificado con agar, a la cual se había añadido previamente un papel de filtro Whatman Nr. 1 estéril con una membrana de nylon (criba de genes, NEN). El bombardeo fue ejecutado en un periodo de 60 min después de la transferencia del material vegetal al medio MSO. La precipitación del plásmido de ADN sobre microproyectiles de wolframio y el bombardeo ocurrieron como describen Klein et al.. Después del bombardeo, se incubaron cápsulas de Petri o flores intactas en agua destilada a 26 °C a la luz.
En otra aproximación se ejecutó bombardeo de polen como describen Horikawa et al. (1997). Para ello, se recolectaron granos maduros de polen de las borlas extrudidas. Los siguientes pasos de tratamiento previo para el bombardeo fueron ejecutados muy rápidamente, puesto que la viabilidad del polen disminuye dentro de un tiempo muy corto. Se sumergió el polen en medio MS líquido, que contenía 30 g/l de sacarosa (pH 5,8). Los 4.0*105 granos de polen (en 1 ml de medio) fueron adsorbidos sobre la superficie de una pieza de microfiltro (tamaño de poro 0,45 um, Fuji Film Co., Tokio) mediante filtración al vacío. El microfiltro fue colocado sobre placas de agar al 1 % en una cápsula de Petri, en preparación para el bombardeo con un cañón de partículas.
Bombardeo por el polen tratado:
Para la polinización con el polen bombardeado, se ejecutó el protocolo descrito en Touraev et al 1997. Para ello, se extirparon flores maduras justo antes de la floración con anteros todavía cerrados, un día antes de la polinización. El polen madurado in vitro fue lavado varias veces en medio GK sin quercetina y después se transfirió en gotitas de 3 μl sobre los estigmas. Se eligieron aquellos estigmas para la polinización con pipeta, que mostraron una buena producción de secreción estigmática. Para impedir la polinización cruzada, se eliminaron todos los otros botones de flor en la cámara climática, el día anterior a la abertura. Se recolectaron cápsulas/envolturas de semillas maduras después de 3-4 semanas.
En otra aproximación se aplicó el procedimiento descrito en Horikawa et al. (1997). Para ello, se llevó polen en 1 ml de medio MS líquido. El polen fue usado para la polinización de inmediato transfiriendo con pipeta a los filamentos de una espiga (previamente: cubierto con bolsas de espiga), 3 días después del desarrollo de los filamentos. Los tratamientos de polinización fueron ejecutados para 20 espigas. Como control, se polinizó polen con una muestra sin ADN.
Bombardeo de flores con HELIOS:
El bombardeo de flores o inflorescencias fue ejecutado con la pistola manual Helios de Bio-Rad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Una vez las inflorescencias o flores estuvieron expuestas, fueron bombardeadas con 1 a 5 disparos a 50-300 psi de presión. Después se cubrieron los meristemos expuestos y la inflorescencia o la floración pudieron madurar adicionalmente.
En otra aproximación se ejecutó el protocolo descrito por Gounaris et al 2005. Las flores, que deberían servir como receptores de polen fueron extirpadas dos días antes del momento esperado de la polinización. En la mañana del día en que iba a realizarse la polinización, se recolectaron de las flores donadoras estambres intactos, 1-2 horas después de su aparición. Cada flor donadora fue tratada con 4-5 disparos del cañón de partículas, mientras que ésta yacía en una superficie plana en una cápsula de Petri y cubierta con una red de nylon. El cañón de partículas fue operado bajo una presión de helio de 400 libras por pulgada cuadrada (psi) y estaba equipado con una pantalla de difusión de partículas. La pureza del gas helio era de la clase 4.5 (99,994 %). Cada inflorescencia bombardeada fue usada para polinizar aproximadamente 15-20 flores receptoras extirpadas. Las flores polinizadas pudieron desarrollarse adicionalmente y después producir semillas.
Microinyección: ADN/ARN/proteína y combinaciones
Microinyección de embrión:
Para la microinyección de embrión se usa el procedimiento descrito en Neuhaus et al., 1987. Para ello, por control óptico con un microcapilar conducido manualmente unido con una manguera de silicona, se eligieron individualmente embriones ubicados sobre un cubreobjetos, y para la microinyección se transfirieron como gotitas de aproximadamente 2 |jl en medio sobre un portaobjetos (Spangenberg et al., 1986 a). La microinyección se ejecutó fijando los embrioides con un capilar de retención y realizando la microinyección en la respectiva célula. El ADN exógeno fue inyectado como mezcla 1:1 de moléculas convertidas en lineales (mediante corte de los plásmidos por fuera de los genes insertados) y altamente enrolladas, en aproximadamente 0,5 μg/μl en NaCl 50 mM, Tris-HC1 50 mM pH 7,8.
Microinyección de meristemos de brote con Agrobacterium (Ab):
La microinyección de meristemos de brote con Ab fue ejecutada como describen Sivakumar et al (2014). Se tomaron 100 μl del cultivo en una jeringa de insulina y se realizó la microinyección en el meristemo apical de brote embrional de semillas de algodón germinadas. La microinyección del cultivo se realizó 1-5 veces (0,5-1,0 mm de profundidad), para verificar el efecto del número de microinyecciones en y alrededor del meristemo apical de brote embrional. Se eliminó el exceso de cultivo bacteriano empapando las semillas infectadas sobre papel de filtro estéril (Whatman No.
1). Las semillas fueron cocultivadas en medio MS de A fuerza durante dos días en la oscuridad. Después del cocultivo se lavaron los plantones con Cefotaxim (200 mg/l) y se transfirieron a medio selectivo con antibiótico, que contenía Cefotaxim e Higromicina-B.
Microinyección de ADN en meristemos de brote:
La microinyección fue ejecutada como describen Lusardi et al (1994). Se lavaron las semillas secas, maduras durante 20 segundos en alcohol absoluto, seguido por esterilización con blanqueador comercial (NaClO al 2,5 %), complementado con Tween 800,01 % (20 minutos sacudiendo). Las semillas fueron enjuagadas entonces de cuatro a cinco veces con agua destilada estéril. Se indujo la germinación mediante incubación de las semillas en una cápsula de Petri de 9 cm, entre papel de filtro con agua destilada estéril, a 27 °C, en la oscuridad durante 3-4 días. Durante este tiempo explotó el brote a través del integumento del grano y alcanzó una longitud de aproximadamente 0,8 a 1,0 cm. En este momento se retiró el brote de la semilla en el nivel del nódulo escutelar. Bajo el estereomicroscopio se retiraron los coleóptilos y las cinco o seis hojas seminales embrionales. Después de la preparación de las hojas embrionales se expusieron los ápices no cubiertos, rodeados por dos unidades de hoja, en diferentes estados de desarrollo. Los ápices aislados fueron cultivados en cápsulas de Petri de 9 cm en medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 2 % de sacarosa y solidificado con agar Difco Bacto al 0,8 % (Difco Lab., Detroit), y cultivado adicionalmente con un régimen de temperatura de 27 °C/22 °C y un periodo de luz claridad/oscuridad 16/8 h. Dentro de un periodo de 10 días se desarrollaron plantas normales. Durante los siguientes 15-20 días éstas alcanzaron un tamaño suficiente para la transferencia a macetas y al invernadero. Para la microinyección, se disolvieron los plásmidos para la inyección en amortiguador de inyección (Tris-HCl 10 mM y EDTA 0,1 M, pH 7,5). Se filtró el amortiguador de inyección a través de unidad de filtración de una vía de 0,2 jm (Schleicher y Schuell, Alemania), para esterilizar la solución y evitar contaminaciones de las partículas. Todas las inyecciones fueron ejecutadas bajo condiciones estériles. Los meristemos de brote de maíz aislados fueron transferidos a cápsulas de Petri de 9 cm, el medio MS fue complementado con 2 % de sacarosa y solidificado con agar Difco Bacto 0,8 %. Los ápices fueron alineados sobre el medio, de modo que los domos apicales eran claramente visibles. Las células de las capas L2 de los meristemos fueron inyectadas con un estereomicroscopio (dotado con elevada magnificación) con un sistema separador de embrión de Research Instruments (Reino Unido) (magnificación de hasta 200 veces; SV 8 , Zeiss, Alemania). En algunos experimentos se usó una coinyección de dextrano FITC, para poder identificar mejor las células inyectadas (Neuhaus et al., 1993; Schnorf et al., 1991). El micromanipulador mecánico del sistema porta un capilar de inyección (diámetro de punta de menos de 1 jm ), que está unido con un microinyector (Eppendorf 5242 Microinjector), el cual entrega aproximadamente 3 μl a las células en volumen constante (Neuhaus et al., 1986. 1987; Schnorf et al., 1991). Para la estabilidad y movimiento de los ápices durante la inyección, se usó el segundo manipulador del sistema separador de embriones. Con ese propósito, este manipulador estaba dotado también con una microaguja, para mover y poder fijar el meristemo apical, de modo que éste pueda ser tratado en la posición correcta.
Pelos
La liberación mediada por pelos en los diferentes meristemos fue ejecutada como se describe en Frame et al. (1994). Los tejidos expuestos fueron tratados con 40 μl de suspensión al 5 % de pelos y 25 μl de ADN de plásmido. En primera instancia, se mezcló suavemente el contenido del recipiente de reacción y se colocó verticalmente en una cabeza de muestra múltiple sobre un mezclador Vortex Genie II (Scientific Industries Inc., Bohemia, NY), o se ubicó horizontalmente en el retenedor de un mezclador de amalgama Mixomat (Degussa Kanada Ltd., Burlington, Ontario).
La transformación fue ejecutada durante 60 segundos mediante mezcla con velocidad completa (Vortex Genie II), o con velocidad predeterminada durante 1 segundo (Mixomat).
Alternativamente se cargaron pelos junto con ADN/ARN o pelos-mezcla de proteína en la pipeta de un micromanipulador y se macroinyectaron en tejido meristemático. Péptidos que penetran la célula: ADN/ARN/proteína y combinaciones de ellos
Mezclas de péptidos que penetran la célula y proteína Cas9 y ARNg:
Para el uso de péptidos que penetran la célula se usó un protocolo seguido por Ramakrishna et al., 2014. Un día después de la colocación en placa, se lavaron sucesiva o simultáneamente las células con Opti-MEM y con Cas9-M9R y sARNg:9R. El complejo sARNg:9R fue formado durante una incubación de 30 min de 10 mg de sARNg y 30­ 50 mg de péptido 9R en 250 ml (para el tratamiento secuencial) o 100 ml (para el tratamiento simultáneo) de medio Opti-MEM, a temperatura ambiente.
Embrión:
Se usaron los péptidos Tat (Tat, Tat2, M-Tat) para la inserción de enzima GUS en embriones de trigo. El péptido Tat y la enzima g Us fueron preparados en primera instancia en tubitos separados de microcentrífuga. Se añadió péptido Tat no marcado (4 μg) a agua estéril (volumen final: 100 jl). Así mismo, se añadió 1 μg de la enzima GUS (Sigma Aldrich) en agua estéril, para alcanzar un volumen final de 100 jl. Se mezcló el contenido de los dos tubitos, lo cual dio una relación 4:1 de péptido:proteína en la mezcla. Se incubó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente y después se añadió a los embriones inmaduros aislados (en un tubito de microcentrífuga de 2 ml) en presencia o ausencia del agente permeabilizante (tolueno/etanol 1:40, vol/vol referido al volumen total de la mezcla péptido:proteína). Después de incubación durante 1 h a temperatura ambiente, se lavaron los embriones dos veces con el amortiguador, se sometieron a una permeabilización y un tratamiento con tripsina (1:1 (vol/vol) de amortiguador de permeabilización), durante 5 min a temperatura ambiente. Se lavaron los embriones dos veces con amortiguador de permeabilización, seguido por un análisis histoquímico de GUS de los embriones. Para la liberación se transfectó 1 μg de la enzima GUS mediante el kit de transducción de proteína Chariot (Active Motif, Carlsbad, CA, EE. UU.), siguiendo los datos del fabricante. Los embriones permeabilizados y no permeabilizados por incubados durante una hora con complejo Chariot-GUS. Todos los pasos posteriores a la incubación pueden los mismos descritos para los partidos Tat.
Transformación de microesporas:
La transformación de microesporas mediante uso de péptidos que penetran la célula fue ejecutada de acuerdo con Shim et al. (2012 ). La extracción de las microesporas fue realizada de acuerdo con Eudes y Amundsen (2005), y todos los pasos del aislamiento de microesporas fueron efectuados mediante el uso de medio líquido NPB-99 (Zheng et al.
2001; Eudes y Amundsen 2005). Después del lavado de las microesporas con NPB-99, se colocaron en capas 2-3 ml de solución de microesporas sobre 2 a 3 ml de solución al 30 % de Percoll que contenía manitol 400 mM y MES 10 mM, pH 7,0. Se sometieron a centrifugación las microesporas durante 5 min a 100 * g a 4 °C. Las células, que habían formado una cinta en el sitio de corte de Percoll/NPB-99, fueron diluidas en un nuevo tubito de 15 ml de centrífuga con NPB-99 hasta 15 ml y después fueron sometidas de nuevo a centrifugación. Se decantó del residuo y se suspendieron de nuevo las microesporas en aproximadamente 1 ml de medio NPB-99. La concentración de microesporas fue determinada usando un hemocitómetro y fue ajustada a 2,5*105 células/ml. Se aplicaron cinco tratamientos, incluyendo los controles, a suspensiones de la misma extracción de microesporas, y concretamente como sigue: T1, tratamiento de control, consistente en 200 μl de agua estéril; T2 , 1 μg de ADNds en 100 μl de agua estéril fueron añadidos a 4 μg de Tat2, diluido en 100 μl de agua estéril y se mezcló suavemente, lo cual dio como resultado una relación 1:4 de ADNds a Tat2 (ADNdsTat2); T3, se mezclaron juntos 1 μg de ADNds, diluido en 100jl de agua estéril, y 6 μl de Chariot (Active Motif, Carlsbad, CA), diluidos en 100 μl de agua estéril (ADNds-Pep1); T4, se mezclaron juntos 4 μg de RecA (MJS Biolynx, Brockville, Canadá; # UB70028Z) en 50 μl de agua estéril y 1 μg de ADNds en 50 μl de agua estéril durante 15 min y se añadieron 6 μl de Chariot en 100 μl de agua estéril a la solución de ADNds-RecA, para obtener un volumen final de 200 μl en un tubito de microcentrífuga de 2 ml (ADNds-RecA-Pep1); T5, se mezclaron juntos μg de RecA en 50 μl de agua estéril y 1 μg ADNds en 50 μl de agua estéril durante 15 min. Se añadieron 4 μg de Tat2 en 100 μl de agua estéril a la solución de ADNds-RecA, para llegar a un volumen final de 200 μl en un tubito de microcentrífuga de 2 ml (ADNds-RecA-Tat2). Después de la incubación durante 15 min a temperatura ambiente (TA), se añadieron 5 μl de Lipofectamina (Invitrogen, Carlsbad, CA; # 11.668 a 019) a todas las cargas y se incubó durante otros 5 min a TA. Se añadieron las mezclas entonces de inmediato a 50.000 microesporas en pella en tubitos de microcentrífuga de 2 ml y se incubaron durante 15 min. A continuación se añadieron 100 μl de NPB-99 por tubito y se incubó durante 45 min a TA. Las microesporas transfectadas fueron convertidas en pellas, se descartó el sobrenadante y se lavaron las células dos veces con NPB-99. Después se añadió 1 ml NPB-99 por tubito de microesporas, se mezcló cuidadosamente y se tomaron con pipeta alícuotas de 500 μl en cápsulas de Petri de 35 mm, que contenían 3 ml de NPB-99 10 % de Ficoll (Sigma, St. Louis, MO; F4375 ; NPB-99-10F) y 100 mg/l del antibiótico Cefotaxim (Sigma;. # C7039).
Electroevaporación
Transformación de polen:
La transformación de polen mediante electroevaporación fue ejecutada de acuerdo con el protocolo establecido por Shi et al (1996). Para ello, se sometieron a electroevaporación polen maduro, polen en germinación o polen sin capa de exina con una fuerza de campo de 750-1250 V/cm con un impulso constante de 13 ms.
Tratamiento con ultrasonido
Ultrasonido a polen:
La transformación de polen mediante tratamiento con ultrasonido fue ejecutada como describen Wang et al (2000). Para ello, en la mañana se recolectaron 0,3 g de polen fresco y se mezclaron en 20 ml de una solución con 5 % de sacarosa con aproximadamente 10 ug del ADN de plásmido de interés. La solución fue tratada con ultrasonido, tanto antes como también después de haberse añadido el ADN de plásmido. Durante el uso de un aparato de ultrasonido JY92-II de Ningbo Xinzi Scientific Instrument Institute, los parámetros usados para la aplicación de ultrasonido fueron: intensidad del sonido de 300 W, tratamientos 8 veces para en cada caso intervalos de 5 s y 10 s. A continuación con el polen tratado se polinizaron sedas cortadas de maíz.
Parte de ejemplos de lista de citaciones:
Aragao, F. J., et al. (2005). "Germ line genetic transformation in cotton (Gossypium hirsutum L.) by selection of transgenic meristematic cells with a herbicide molecule." Plant Science 168(5): 1227-1233 / registro #: 2408 Artschwager, E. (1926). "Anatomy of the vegetative organs of the sugar beet." J. agric. Res 33: 143-176 / registro #: 2352
Barnabas, B., et al. (1992). "In vitro pollen maturation and successful seed production in detached spikelet cultures in wheat (Triticum aestivum L.)." Sexual Plant Reproduction 5(4): 286-291 / registro #: 2374
Buchheim, J. A., et al. (1989). "Maturation of Soybean Somatic Embryos and the Transition to Plantlet Growth." Plant Physiology 89(3): 768-775 / registro #: 2402
Chee, P. P., et al. (1989). "Transformation of soybean (Glycine max) by infecting germinating seeds with Agrobacterium tumefaciens." Plant Physiology 91(3): 1212-1218 / registro #: 2392
Chowrira, G., et al. (1995). "Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristemsin planta." Molecular Biotechnology 3(1): 17-23 / registro #: 2393
Eapen, S. (2011). "Pollen grains as a target for introduction of foreign genes into plants: an assessment." Physiology and Molecular Biology of Plants 17(1): 1-8 / registro #: 2384
Frame, B. R., et al. (1994). "Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation." The Plant Journal 6 (6 ): 941-948 / registro #: 1755
Gounaris, Y., et al. (2005). "Pollen-mediated genetic transformation of cotton with the Arabidopsis thaliana hmgr cDNA using the particle gun." Journal of Food Agriculture and Environment 3(2): 157-160 / registro #: 2330 Grandjean, O., et al. (2004). "In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical meristem in Arabidopsis." The Plant Cell 16(1): 74-87 / registro #: 2387
Hermann, K., et al. (2007). "1-Aminocyclopropane-1-carboxilic acid and abscisic acid during the germination of sugar beet (Beta vulgaris L.): a comparative study of fruits and seeds." Journal of Experimental Botany 58(11): 3047-3060 / registro #: 2370
Horikawa, Y., et al. (1997). "Transformants through pollination of mature maize (Zea mays L.) pollen delivered bar gene by particle gun." Journal of Japanese Society of Grassland Science (Japan) / registro #: 2383
Huang, Y., et al. (2009). "Probing the endosperm gene expression landscape in Brassica napus." BMC Genomics 10(1): 256 / registro #: 2377
Itoh, J.-I., et al. (2005). "Rice Plant Development: from Zygote to Spikelet." Plant and Cell Physiology 46(1): 23-47 / registro #: 2416
Keshamma, E., et al. (2008). "Tissue culture-independent in planta transformation strategy: an Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer method to overcome recalcitrance in cotton (Gossypium hirsutum L.)." Journal of Cotton Science 12(3): 264-272 / registro #: 2405
Kim, S., et al. (2014). "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome Research 24(6): 1012-1019 / registro #: 2288
Ko, S.-W., et al. (1983). "A simplified method of Embryo culture in rice of Oryza sativa L." Bot. Bull. Acad. Sin 24: 97­ 101 / registro #: 2415
Krens, F. A., et al. (1988). "Transformation and regeneration in sugar beet (Beta vulgaris L.) induced by 'shooter' mutants of Agrobacterium tumefaciens." Euphytica 39(3): 185-194 / registro #: 1426
Leduc, N., et al. (1994). "Gene transfer to inflorescence and flower meristem using ballistic micro-targeting." Sexual Plant Reproduction 7(2): 135-143 / registro #: 2345
Li, X., et al. (2004). "Improvement of cotton fiber quality by transforming the acsA and acsB genes into Gossypium hirsutum L. by means of vacuum infiltration." Plant Cell Reports 22(9): 691-697 / registro #: 2419
Liu, J., et al. (2015). "Efficient delivery of nuclease proteins for genome editing in human stem cells and primary cells." Nat. Protocols 10(11): 1842-1859 / registro #: 2421
Lusardi, M. C., et al. (1994). "An approach towards genetically engineered cell fate mapping in maize using the Lc gene as a visible marker: transactivation capacity of Lc vectors in differentiated maize cells and microinjection of <i>Lc</i> vectors into somatic Embryos and shoot apical meristem." The Plant Journal 5(4): 571-582 / registro #: 82 Mahn, A., et al. (1995). "Transient gene expression in shoot apical meristem of sugarbeet seedlings after particle bombardment." Journal of Experimental Botany 46(10): 1625-1628 / registro #: 2367
Martin-Ortigosa, S., et al. (2014). "Proteolistics: a biolistic method for intracellular delivery of proteins." Transgenic Research: 1-14 / registro #: 2260
Matthys-Rochon, E., et al. (1998). "In vitro development of maize immature Embryos: a tool for Embryogenesis analysis." Journal of Experimental Botany 49(322): 839-845 / registro #: 2285
Mauney, J. R. (1961). "The Culture in vitro of Immature Cotton Embryos." Botanical Gazette 122(3): 205-209 / registro #: 2409
McCabe, D. E., et al. (1993). "Transformation of elite cotton cultivars via particle bombardment of meristemo." Nature Biotechnology 11(5): 596-598 / registro #: 2404
McCabe, D. E., et al. (1988). "Stable transformation of soybean (Glycine max) by particle acceleration." Nature Biotechnology 6 (8 ): 923-926 / registro #: 2391
Muniz de Péadua, V., et al. (2001). "Transformation of Brazilian elite Indica-type rice (Oryza sativa L.) by electroporation of shoot apex explants." Plant Molecular Biology Reporter 19(1): 55-64 / registro #: 2412
Naseri, G., et al. (2014). "In planta transformation of rice (Oryza sativa) using thaumatin-like protein gene for enhancing resistance to sheath blight." African Journal of Biotechnology 11(31) / registro #: 2411
Neuhaus, G., et al. (1987). "Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived Embryoids." Theoretical and Applied Genetics 75(1): 30-36 / registro #: 2123
Obert, B., et al. (2008). "Genetic transformation of barley microspores using anther bombardment." Biotechnology Letters 30(5): 945-949 / registro #: 2068
Olvera, H. F., et al. (2008). "Floral and Inflorescence Morfology and Ontogeny in Beta vulgaris, with Special Emphasis on the Ovary Position." Annals of Botany 102(4): 643-651 / registro #: 2372
Rajasekaran, K. (2013). Biolistic Transformation of Cotton Zygotic Embryo Meristem. T Transgenic Cotton. 958: 47-57 / registro #: 2403
Ramakrishna, S., et al. (2014). "Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA." Genome Research 24(6): 1020-1027 / registro #: 2287
Ritchie, G. L., et al. (2007). "Cotton growth and development." from http://cotton.tamu.edu/mwginteARNl/de5fs23hu73ds/progress?id=-gCnQaUKI-guBsRa08L1m_QGIEFw5-bHQ3iPfT8R-CI, / registro #: 2410 Rod-in, W., et al. (2014). "The floral-dip method for rice (Oryza sativa) transformation." Journal of Agricultural Technology 10(2): 467-474 / registro #: 2414
Sautter, C., et al. (1995). Ballistic microtargeting of visible marker genes to the shoot meristem of wheat. Gene Transfer to Plants, Springer: 152-156 / registro #: 2339
Sautter, C., et al. (1995). "Shoot apical as a target for gene transfer by microballistics." Euphytica 85(1-3): 45-51 / registro #: 2373
Shi, H., et al. (1996). "Exine-detached pollen of Nicotiana tabacum as an electroporation target for gene transfer." Acta Botánica Sínica 38(8): 626-630 / registro #: 2417
Shim, Y.-S., et al. (2012). "dsDNA and protein co-delivery in triticale microspores." in vitro Cellular & Developmental Biology - Plant: 1-10 / registro #: 1253
Shou, H., et al. (2002). "Irreproducibility of the soybean pollen-tube pathway transformation procedure." Plant Molecular Biology Reporter 20(4): 325-334 / registro #: 2399
Sivakumar, S., et al. (2014). "Optimization of factors influencing microinjection method for Agrobacterium - Mediated transformation of Embryonic Shoot Apical meristem in Cotton (Gossypium hirsutum L. cv.SVPR-2)." International Journal of Current Biotechnology / registro #: 2420
Touraev, A., et al. (1997). "Plant male germ line transformation." The Plant Journal 12(4): 949-956 / registro #: 2380 Twell, D., et al. (1989). "Transient expression of chimeric genes delivered into pollen by microprojectile bombardment." Plant Physiology 91(4): 1270-1274 / registro #: 2316
Vain, P., et al. (1993). "Osmotic treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize." Plant Cell Reports 12(2): 84-88 / registro #: 20
Wang, J., et al. (2000). "Transgenic maize plants obtained by pollen-mediated transformation." Acta Botanica Sinica 43(3): 275-279 / registro #: 2418
Wiebold, W. J. (2012). "Arrested Development in the Soybean Field." from http://iμm.missouri.edu/IPCM/2012/10/Arrested-Development-in-the-Soybean-Field/ / registro #: 2400
Zapata, C., et al. (1999). "Transformation of a Texas cotton cultivar by using Agrobacterium and the shoot apex." Theoretical and Applied Genetics 98(2): 252-256 / registro #: 2407
Zhang, C.-L., et al. (2008). "Efficient somatic Embryogenesis in sugar beet (Beta vulgaris L.) breeding lines." Plant Cell, Tissue and Organ Culture 93(2): 209-221 / registro #: 1461
Zuris, J. A., et al. (2015). "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nat Biotech 33(1): 73-80 / registro #: 2303

Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para la producción de una planta de maíz, que comprende los siguientes pasos:
(i) preparación de una estructura vegetal objetivo,
que comprende por lo menos una célula meristemática,
en donde la estructura vegetal objetivo es un embrión de maíz maduro e inmaduro y la por lo menos una célula meristemática comprende por lo menos una región objetivo de ácido nucleico;
(ii) preparación de por lo menos un ARNg o preparación de uno o varios híbrido(s) recombinante(s), en donde el o los híbrido(s) recombinante(s) comprende(n)
(a) por lo menos un ARNg o una secuencia que codifica para un ARNg, y
(b) opcionalmente por lo menos una secuencia reguladora y/o una secuencia de localización y
(c) opcionalmente por lo menos un patrón de reparación de ADN, y preparación de por lo menos una nucleasa CRISPR, preferiblemente una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, o un fragmento catalíticamente activo de ella y/o un dominio efector o preparación de uno o varios híbrido(s) recombinante(s),
en donde el o los híbrido(s) recombinante(s) comprende(n)
(A) por lo menos una nucleasa CRISPR, o un fragmento catalíticamente activo de ella o una secuencia que codifica para una nucleasa CRISPR o la secuencia que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella y/o por lo menos un dominio efector o una secuencia que codifica para un dominio efector, y
(B) opcionalmente por lo menos una secuencia reguladora y/o una secuencia de localización,
en donde el ARNg está en capacidad, tanto de hibridar a una sección de la región objetivo de ácido nucleico como también con la nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella y/o interactuar con el dominio efector; en donde, cuando el ARNg o la secuencia que codifica para ARNg y la nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella o la nucleasa CRISPR o la secuencia que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella y/o el dominio efector o la secuencia que codifica para un dominio efector, son preparados mediante uno o varios híbrido(s) recombinante(s), el ARNg o la secuencia que codifica para ARNg y la nucleasa CRISPR o el fragmento catalíticamente activo de ella o la nucleasa CRISPR o la secuencia que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella y/o el dominio efector o la secuencia que codifica para un dominio efector, están localizados sobre o en el mismo, o sobre o en diferentes híbridos recombinantes;
(iii) introducción del ARNg, de la nucleasa CRISPR o del fragmento catalíticamente activo de ella y/o del dominio efector o del o de los híbrido(s) recombinante(s) en la por lo menos una célula meristemática de la estructura vegetal objetivo;
(iv) cultivo de la estructura vegetal objetivo bajo condiciones, que permiten la activación del ARNg introducido, de la nucleasa CRISPR o del fragmento catalíticamente activo de ella y/o del dominio efector o del o de los híbrido(s) recombinante(s) introducido(s) y mediante ello permiten un cambio selectivo de la región objetivo de ácido nucleico en la por lo menos una célula meristemática de la estructura vegetal objetivo, para obtener una estructura vegetal objetivo, que comprende por lo menos una célula meristemática, que comprende el cambio selectivo de la región objetivo de ácido nucleico;
(v) obtención de una planta de maíz a partir de la por lo menos una célula meristemática cambiada de modo selectivo, en donde la planta de maíz es obtenida directamente mediante división celular y diferenciación, sin llegar como paso intermedio a un cultivo celular en forma de producción y regeneración de Kallus, a partir del cambio selectivo de por lo menos una célula meristemática,
en donde la planta de maíz obtenida comprende el cambio selectivo de la región objetivo de ácido nucleico y en donde en la planta de maíz del paso (v) el o los híbrido(s) recombinante(s), que comprende(n)
(a) por lo menos un ARNg o una secuencia que codifica para un ARNg, o
(b) por lo menos una nucleasa CRISPR, preferiblemente una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, o un fragmento catalíticamente activo de ella o una secuencia que codifica para una nucleasa CRISPR o la secuencia que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella y/o por lo menos un dominio efector o una secuencia que codifica para un dominio efector, están integrados de modo no cromosómico o extracromosómico.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde en el paso (ii) el ARNg o la secuencia que codifica para ARNg y/o la nucleasa CRISPR, preferiblemente una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, o el fragmento catalíticamente activo de ella o la nucleasa CRISPR o la secuencia que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella y/o el dominio efector o una secuencia que codifica para un dominio efector, son ajustados al uso en una célula vegetal.
3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 o 2, en donde entre los pasos (ii) y (iii) ocurre la preparación de por lo menos un vector para la inserción del o de los híbrido(s) recombinante(s).
4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde entre los pasos (ii) y (iii) ocurre la preparación de por lo menos otro híbrido recombinante, que comprende una sección de ácido nucleico recombinante para la reparación selectiva dirigida a la homología, de la región objetivo de ácido nucleico en la estructura vegetal objetivo o la inserción en la región objetivo de ácido nucleico en la estructura vegetal objetivo y opcionalmente por lo menos otro vector para la inserción del por lo menos otro híbrido recombinante.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el por lo menos un vector es elegido de entre el grupo consistente en un virus, elegido de entre el grupo consistente en SEQ ID NOs:12-15 y 25­ 38, así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias, o un agente que es adecuado para la transfección de una secuencia de péptido o polipéptido o de secuencias de ácidos nucleicos, o de una combinación de ellos.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el ARNg es introducido directamente como ácido nucleico natural o sintético y/o la nucleasa CRISPR, preferiblemente una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, o el fragmento catalíticamente activo de ella, son introducidos directamente como polipéptido y/o el dominio efector es introducido directamente como ácido nucleico o polipéptido, en la estructura vegetal objetivo.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el ARNg o la secuencia que codifica para ARNg o la nucleasa CRISPR, preferiblemente una nucleasa Cas o una nucleasa Cpf1, o el fragmento catalíticamente activo de ella o la secuencia que codifica la nucleasa CRISPR o la secuencia que codifica el fragmento catalíticamente activo de ella o el dominio efector o la secuencia que codifica el dominio efector, comprenden adicionalmente una secuencia de localización elegida de entre una secuencia de localización de núcleo, una secuencia de localización de plástido, preferiblemente una secuencia de localización de mitocondrias y una secuencia de localización de cloroplastos.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde adicionalmente se introduce un inhibidor del mecanismo de reparación endógeno de unión terminal no homóloga (NHEJ) en la estructura vegetal objetivo.
9. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el híbrido recombinante es elegido de entre SEQ ID NOs: 23 y 24, así como secuencias con por lo menos 66 %, 67 %, 68 %, 69 %, 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %,90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de homología de secuencia respecto a estas secuencias.
ES16724394T 2015-05-19 2016-05-19 Procedimiento e híbridos para la edición selectiva de ácido nucleico en plantas Active ES2953919T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102015006335.9A DE102015006335A1 (de) 2015-05-19 2015-05-19 Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
DE102015014252.6A DE102015014252A1 (de) 2015-11-05 2015-11-05 Verfahren und Konstrukte zur gezielten Nukleinsäure Editierung in Pflanzen
PCT/EP2016/061237 WO2016184955A2 (de) 2015-05-19 2016-05-19 Verfahren und konstrukte zur gezielten nukleinsäure editierung in pflanzen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2953919T3 true ES2953919T3 (es) 2023-11-17

Family

ID=55274948

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16724394T Active ES2953919T3 (es) 2015-05-19 2016-05-19 Procedimiento e híbridos para la edición selectiva de ácido nucleico en plantas

Country Status (10)

Country Link
US (3) US20180142248A1 (es)
EP (3) EP3095870A1 (es)
CN (2) CN107849582A (es)
AU (1) AU2016265197A1 (es)
BR (2) BR112017024754A2 (es)
CA (2) CA2989368A1 (es)
DK (1) DK3298148T5 (es)
EA (1) EA201792542A1 (es)
ES (1) ES2953919T3 (es)
WO (2) WO2016184955A2 (es)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2734621B1 (en) 2011-07-22 2019-09-04 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
IL310721A (en) 2015-10-23 2024-04-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
US11499158B2 (en) * 2016-05-13 2022-11-15 Kaneka Corporation Method for modifying plant
EP3456825A4 (en) * 2016-05-13 2020-03-18 Kaneka Corporation METHOD FOR PLANT GENE EDITING
JP6967217B2 (ja) 2016-05-13 2021-11-17 株式会社カネカ 形質転換植物の作製方法
CA3032699A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
US11168319B1 (en) 2017-02-28 2021-11-09 Inari Agriculture Technology, Inc. Plant cell culture
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11897920B2 (en) 2017-08-04 2024-02-13 Peking University Tale RVD specifically recognizing DNA base modified by methylation and application thereof
WO2019028686A1 (zh) 2017-08-08 2019-02-14 北京大学 基因敲除方法
AU2018320864B2 (en) 2017-08-22 2024-02-22 Napigen, Inc. Organelle genome modification using polynucleotide guided endonuclease
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
AU2018352592A1 (en) 2017-10-16 2020-06-04 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
CN108004266B (zh) * 2017-12-11 2021-05-04 西北大学 一种蓝猪耳遗传转化方法
US11634722B2 (en) 2018-01-22 2023-04-25 Inari Agriculture Technology, Inc. Plant gene editing systems, methods, and compositions
EP3546582A1 (en) * 2018-03-26 2019-10-02 KWS SAAT SE & Co. KGaA Promoter activating elements
CN110343724B (zh) * 2018-04-02 2021-10-12 北京大学 用于筛选和鉴定功能性lncRNA的方法
JP6614622B2 (ja) * 2018-04-17 2019-12-04 国立大学法人名古屋大学 植物ゲノム編集方法
US20210054390A1 (en) * 2018-05-24 2021-02-25 Monsanto Technology Llc Genome editing in plants
CA3099645A1 (en) * 2018-06-01 2019-12-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Crispr/cas system for editing brassica genome
CN108998469A (zh) * 2018-08-02 2018-12-14 天津大学 一种快速的水稻成熟胚原位转基因方法
CN108950047B (zh) * 2018-08-08 2020-11-13 华南农业大学 一种CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法
CN110468147B (zh) * 2018-10-24 2021-02-09 中国农业大学 一种基于大麦条纹花叶病毒的基因编辑载体系统
CN109456990B (zh) * 2018-10-24 2022-01-07 湖南杂交水稻研究中心 一种利用基因组编辑技术提高叶绿体遗传转化效率的方法
BR112021008427A8 (pt) * 2018-11-01 2023-05-09 Kws Saat Se & Co Kgaa Mutagênese direcionada usando editores de bases
CN113544277A (zh) * 2019-02-25 2021-10-22 先正达农作物保护股份公司 用于驱动t1事件多样性的组合物和方法
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
JP7334898B2 (ja) * 2019-04-12 2023-08-29 国立大学法人東海国立大学機構 花粉への物質導入方法
EP3757219A1 (en) * 2019-06-28 2020-12-30 KWS SAAT SE & Co. KGaA Enhanced plant regeneration and transformation by using grf1 booster gene
EP3999103A4 (en) 2019-07-19 2023-11-22 Inari Agriculture Technology, Inc. GENOMIC EDITING FOR ENHANCED HOMOLOGY-DIRECTED REPAIR
CA3153420A1 (en) * 2019-09-06 2021-03-11 James Berman Genetic modification of plants
CN112779266A (zh) * 2019-11-06 2021-05-11 青岛清原化合物有限公司 在生物体内创制新基因的方法及应用
CN115605082A (zh) * 2019-11-26 2023-01-13 先正达农作物保护股份公司（Ch） 转化方法
WO2021137299A1 (ja) * 2020-01-03 2021-07-08 株式会社カネカ 植物の改変方法
CN115768898A (zh) * 2020-02-28 2023-03-07 科沃施种子欧洲股份两合公司 用于顽拗型植物的快速基因组修饰的方法
EP4110929A1 (en) * 2020-02-28 2023-01-04 KWS SAAT SE & Co. KGaA Immature inflorescence meristem editing
CN111454984A (zh) * 2020-03-04 2020-07-28 深圳大学 一种植物基因转化方法及其应用
CA3177481A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David R. Liu Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
US10894812B1 (en) 2020-09-30 2021-01-19 Alpine Roads, Inc. Recombinant milk proteins
CA3191387A1 (en) 2020-09-30 2022-04-07 Nobell Foods, Inc. Recombinant milk proteins and food compositions comprising the same
US10947552B1 (en) 2020-09-30 2021-03-16 Alpine Roads, Inc. Recombinant fusion proteins for producing milk proteins in plants
JP7345760B2 (ja) * 2020-10-07 2023-09-19 国立大学法人東海国立大学機構 花粉への物質導入方法
WO2022226107A1 (en) * 2021-04-20 2022-10-27 Texas Tech University System Tissue-culture independent gene editing of cells by a long-distance rna transport system
CN113234720B (zh) * 2021-04-22 2023-08-18 河南城建学院 小麦长链非编码RNAlncR156及其在调控小麦响应干旱胁迫中的应用
CN113693086A (zh) * 2021-09-08 2021-11-26 山西省农业科学院园艺研究所 一种鸢尾植株专用抗旱剂
CN114375716A (zh) * 2022-01-19 2022-04-22 青海省农林科学院 一种青稞条纹病菌液体侵染鉴定方法
WO2023147222A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Living Carbon PBC Compositions and methods for enhancing biomass productivity in plants
WO2023172875A1 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Inedita Bio, Inc. Methods and compositions for intron mediated- expression of regulatory elements for trait development
WO2024030442A1 (en) * 2022-08-01 2024-02-08 Purdue Research Foundation Efficient genotype-independent in planta transformation of cereals
WO2024054536A2 (en) * 2022-09-08 2024-03-14 Paul Westmeyer Nanoscopic projectiles
CN116584376A (zh) * 2023-06-28 2023-08-15 湖北省农业科学院经济作物研究所 一种桑树快速杂交育种方法

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1288073C (en) * 1985-03-07 1991-08-27 Paul G. Ahlquist Rna transformation vector
CA2169094A1 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Reinhard Topfer Medium chain-specific thioesterases
US5736369A (en) * 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US6051409A (en) 1995-09-25 2000-04-18 Novartis Finance Corporation Method for achieving integration of exogenous DNA delivered by non-biological means to plant cells
US6583335B1 (en) 1997-04-18 2003-06-24 Texas Tech University Direct transformation of higher plants through pollen tube pathway
AU757672B2 (en) 1997-11-18 2003-02-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. A method for directional stable transformation of eukaryotic cells
BR0010169A (pt) 1999-04-29 2002-02-05 Syngenta Ltd Polinucleotìdeo isolado, vetor, material de planta, plantas completas férteis, morfologicamente normais, plantas de milho, trigo e arroz, métodos para controlar seletivamente ervas daninhas no campo, para produzir plantas que são substancialmente tolerantes ou substancialmente resistentes a glifosato, para selecionar material biológico e para regenerar uma planta transformada fértil para conter dna estranho, e, uso do polinucleotìdeo
US6846970B1 (en) 1999-07-19 2005-01-25 Plant Bioscience Limited Transformation method and transgenic plants produced thereby
US6603061B1 (en) 1999-07-29 2003-08-05 Monsanto Company Agrobacterium-mediated plant transformation method
AU8786201A (en) 2000-09-29 2002-04-08 Syngenta Ltd Herbicide resistant plants
US20030135891A1 (en) 2001-12-04 2003-07-17 The Texas A&M University System Method of transforming intact plants
MXPA05000758A (es) 2002-07-18 2005-04-28 Monsanto Technology Llc Metodos para utilizar polinucleotidos artificiales y composiciones de los mismos para reducir el silenciamiento de los transgenes.
CN1175724C (zh) * 2002-11-28 2004-11-17 上海交通大学 超声波辅助大豆原位丛生芽转化的方法
US20050039228A1 (en) * 2003-06-19 2005-02-17 The Samuel Roberts Noble Foundation Methods and compositions for analysis of plant gene function
CN1286978C (zh) * 2004-11-08 2006-11-29 安徽农业大学 简便高效的农杆菌介导玉米转基因方法
CN100451122C (zh) * 2006-03-07 2009-01-14 中国农业科学院油料作物研究所 油菜转基因的方法
US8399218B2 (en) 2007-09-27 2013-03-19 Dow Agrosciences, Llc Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
JP2011120478A (ja) 2008-03-31 2011-06-23 Japan Tobacco Inc アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
AU2010327998B2 (en) 2009-12-10 2015-11-12 Iowa State University Research Foundation, Inc. TAL effector-mediated DNA modification
CA2787494C (en) 2010-01-22 2019-09-17 Dow Agrosciences Llc Targeted genomic alteration
BR112013024337A2 (pt) 2011-03-23 2017-09-26 Du Pont locus de traço transgênico complexo em uma planta, planta ou semente, método para produzir em uma planta um locus de traço transgênico complexo e construto de expressão
US20130145488A1 (en) 2011-12-06 2013-06-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. Mesoporous silica nanoparticles suitable for co-delivery
WO2013096567A2 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Duke University The hsf-like transcription factor, tbf1, is a major molecular switch for growth-to-defense transition in plants
CN102533851A (zh) * 2012-01-31 2012-07-04 安徽农业大学 一种高通量农杆菌介导的玉米基因原位转化方法
CN102558309B (zh) 2012-02-10 2014-09-17 浙江大学 一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
NZ701060A (en) 2012-05-02 2016-10-28 Sangamo Biosciences Inc Targeted modification of malate dehydrogenase
RU2650819C2 (ru) 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов
DE202013012242U1 (de) 2012-05-25 2016-02-02 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
CN105188767A (zh) 2012-07-25 2015-12-23 布罗德研究所有限公司 可诱导的dna结合蛋白和基因组干扰工具及其应用
UA119135C2 (uk) 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини
US20140096284A1 (en) 2012-10-01 2014-04-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Method for the delivery of molecules lyophilized onto microparticles to plant tissues
DE202013012597U1 (de) 2012-10-23 2017-11-21 Toolgen, Inc. Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
CN103898099B (zh) 2012-12-25 2017-08-25 袁晶 一种实现基因组定点修饰的蛋白表达载体的方法
EP2938184B1 (en) 2012-12-27 2018-10-31 Keygene N.V. Method for removing genetic linkage in a plant
EP2958996B1 (en) * 2013-02-25 2019-10-16 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
MX2015011985A (es) * 2013-03-15 2016-04-07 Univ Minnesota Ingenieria genomica de plantas utilizando sistemas crispr/cas.
WO2014161821A1 (en) 2013-04-02 2014-10-09 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in eukaryotes
US20150067922A1 (en) 2013-05-30 2015-03-05 The Penn State Research Foundation Gene targeting and genetic modification of plants via rna-guided genome editing
JP2016521561A (ja) 2013-06-14 2016-07-25 セレクティス 植物における非トランスジェニックのゲノム編集のための方法
CN103343120B (zh) 2013-07-04 2015-03-04 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种小麦基因组定点改造方法
CN103382468B (zh) 2013-07-04 2015-04-29 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种水稻基因组定点改造方法
WO2015007194A1 (zh) 2013-07-16 2015-01-22 中国科学院上海生命科学研究院 植物基因组定点修饰方法
CN103555711A (zh) 2013-07-22 2014-02-05 安徽省农业科学院水稻研究所 一种主要农作物非转基因的基因组定向分子改良方法和应用
EP3611268A1 (en) 2013-08-22 2020-02-19 E. I. du Pont de Nemours and Company Plant genome modification using guide rna/cas endonuclease systems and methods of use
US10077449B2 (en) 2013-11-04 2018-09-18 Dow Agrosciences Llc Universal donor system for gene targeting
US10787684B2 (en) 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
CN103667338B (zh) 2013-11-28 2016-01-27 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种玉米基因组定点改造方法
CN103952405B (zh) 2014-05-13 2016-02-10 扬州大学 一种山羊mstn基因定点修饰系统及其应用
CN104212778A (zh) 2014-06-26 2014-12-17 绍兴市人民医院 基于TALEN和pMD18载体的定点突变系统及应用
CN106922154B (zh) 2014-08-06 2022-01-07 基因工具股份有限公司 使用空肠弯曲杆菌crispr/cas系统衍生的rna引导的工程化核酸酶的基因编辑
CN104293827A (zh) * 2014-09-24 2015-01-21 华南农业大学 一种定点突变RNase ZS1获得温敏不育系的方法
WO2016084084A1 (en) 2014-11-27 2016-06-02 Danziger Innovations Ltd. Nucleic acid constructs for genome editing
DE102015004187A1 (de) 2015-04-02 2016-10-06 Kws Saat Se Männlich sterile Pflanze der Gattung Triticum
CN105087641A (zh) * 2015-07-31 2015-11-25 贵州省园艺研究所 一种新的农杆菌介导的大白菜原位转基因方法
CN106811479B (zh) 2015-11-30 2019-10-25 中国农业科学院作物科学研究所 利用CRISPR/Cas9系统定点修饰ALS基因获得抗除草剂水稻的系统及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016184955A3 (de) 2017-04-06
CN107849581A (zh) 2018-03-27
DK3298148T3 (da) 2023-09-11
BR112017024754A2 (pt) 2018-07-31
EP3095870A1 (en) 2016-11-23
EA201792542A1 (ru) 2018-08-31
WO2016184955A2 (de) 2016-11-24
CA2989368A1 (en) 2016-11-24
WO2016184989A1 (en) 2016-11-24
CN107849582A (zh) 2018-03-27
EP3298147A1 (en) 2018-03-28
CA2986184A1 (en) 2016-11-24
US11492630B2 (en) 2022-11-08
EP3298148A2 (de) 2018-03-28
DK3298148T5 (da) 2023-09-18
EP3298148B1 (de) 2023-07-26
AU2016265197A1 (en) 2017-12-14
US20180142248A1 (en) 2018-05-24
BR112017024649A2 (pt) 2018-07-24
US20230242926A1 (en) 2023-08-03
US20180223295A1 (en) 2018-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2953919T3 (es) Procedimiento e híbridos para la edición selectiva de ácido nucleico en plantas
JP7321477B2 (ja) 植物のゲノム編集方法
US11624071B2 (en) Method of creating a plurality of targeted insertions in a plant cell
JP6967217B2 (ja) 形質転換植物の作製方法
ES2946040T3 (es) Regeneración de plantas modificadas genéticamente
US20230250441A1 (en) Inht26 transgenic soybean
CA3123016A1 (en) Simultaneous gene editing and haploid induction
US20220154194A1 (en) Inht31 transgenic soybean
US20220030822A1 (en) Inht26 transgenic soybean
CA3188279A1 (en) Inht26 transgenic soybean
WO2019234129A1 (en) Haploid induction with modified dna-repair
Conner et al. Transformation and regeneration of Petunia
US20230030612A1 (en) Solanaceous plant and solanaceous plant cell having resistance to tomato spotted wilt virus, and method for producing solanaceous plant
US11499158B2 (en) Method for modifying plant
WO2022154115A1 (ja) 形質転換またはゲノム編集された次世代植物体の製造方法
KR101437613B1 (ko) 벼 유래 프로모터 및 이의 이용
CN115151637A (zh) 基因组内同源重组
EP2423316B1 (en) Method for determining meiotic recombination frequencies in plants