CN116584376A - 一种桑树快速杂交育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种桑树快速杂交育种方法，包括如下步骤：S1，雄花枝的收集及处理：雄花开放时，剪取开花的雄花小枝放入硫酸纸袋，于4℃密封保存；S2，雌花枝的处理：在雌花开放前用硫酸纸袋套袋；S3，授粉：当雌花柱头伸展并变为白色时，将雌花套袋解开取下，直接将装有雄花枝条的硫酸纸袋套在雌花枝上，摇动套袋的枝条，使花粉散落，待全部柱头枯萎之后去除杂交袋；S4，杂交种子的采收：桑椹变色成熟时，摘下桑椹洗出种子，去除杂质留下种子。本发明对收集时间限制较小，只要雄花枝条有少量花即可收集，成功解决了优良亲本花期不遇的问题，同时节省了套袋、花粉收集和毛笔蘸花粉轻扫雌花柱头授粉工作，省时省力且杂交效率高。
Description
技术领域
本发明属于杂交育种技术领域，特别涉及一种桑树快速杂交育种方法。
背景技术
桑树是一种重要的经济树种，我国作为蚕桑业的发祥地，蕴含的桑树种质资源异常丰富，收集保存的桑树种质资源多达3000余份，蚕桑产业的发展为中华民族经济发展和丝绸文化的传播做出了巨大贡献。桑喜光热，具有较强的土壤、环境适应性，故在我国南方和北方等地都有栽培。随着研究的深入，桑枝、桑葚、桑叶等的应用也越来越广泛，给社会带来了较高的经济效益，同时也给蚕桑产业带来了极大的资源和充足的原料。桑枝是中国传统中药材，也是国家卫生部规定的可用于保健的食品，富含桑枝多糖、黄酮类、生物碱等多种药理活性物。桑葚在1993年被国家卫生部列入“既是食品也是药品”的名录内。桑叶中含有丰富的蛋白质、矿物质、脂肪酸、微量元素和多种生物活性物等，它可以散风清热、清肺润燥和清肝明目等作用，而且在《本草纲目》中也有记载，可以治疗劳热咳喘，明目，长发等作用。桑还可用于饲用、茶用、治理用、观赏用、材用、肥用、菌用等。
桑炭疽病是一种常见且广泛传播的真菌寄生所引起的叶部病害，可以侵染桑叶和实生幼苗，主要危害枝条基部成熟叶，使桑叶发生枯斑或全叶枯黄，且对于桑苗的危害尤为严重。田间叶片表现为褐色坏死，呈圆形至不规则斑点或条纹，病斑中心叶背面常可见橙色分生孢子团。症状最初表现为小的淡褐色或红褐色斑点，后来变成深褐色，形状不规则或圆形，表现为不同程度的凹陷或棕褐色病变。渐渐地，坏死病斑扩大、合并，覆盖了大部分叶面积，最终叶片变黄枯萎直至死亡。桑炭疽病在我国广东、广西、四川、山东等省区均有发生，在许多桑园中，该病危害较重，有些品种的叶片病死率达100％以上，造成严重损失。桑炭疽菌的防治刻不容缓，其中最经济有效的措施就是选育和栽植抗性品种。因此，如何快速有效的获取杂交品种并进行抗病性评价显得尤为重要。
杂交育种、优良单株选育、辐射诱变、多倍体育种和芽变选育等是桑树品种选育的主要方式。大多数桑树属雌雄异株，此桑树多采用杂交育种的方式对品种进行改良，目前也已培育出诸多优良品种，如育2号、强桑1号、桂优系列等桑树品种。然而，现有桑树的田间杂交育种仍然存在如下缺点：
(1)桑树种间与种内的花期差异较大，杂交育种在操作过程中经常遇到优良亲本花期不遇的难题，从而降低杂交组合的亲本选择性；
(2)桑树属于异花授粉，风媒传粉，在杂交育种过程中操作不当易受外源花粉污染，影响收获种子的纯度；
(3)雄花花序的各个小花发育程度不一致，套袋收集花粉，工作量大且易受天气影响，碰上雨季花粉活性低，花粉量少，很难满足杂交育种工作对大量花粉的需求。
(4)授粉时，一般用毛笔蘸上花粉，均匀的蘸在雌花柱头上，用过的毛笔要用70％-75％的乙醇洗涤，杀死花粉后才能再用。
目前国内外尚未见到有关桑树种质对炭疽病抗性鉴定的报道，更无一种比较成熟的鉴定方法。因此，建立一种快速的抗病评价方法，可为桑树抗炭疽病育种提供有力支撑。
发明内容
为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种桑树快速杂交育种方法。本发明对收集时间限制较小，只要雄花枝条有少量花即可收集，成功解决了优良亲本花期不遇的问题；同时节省了套袋、花粉收集和毛笔蘸花粉轻扫雌花柱头授粉工作，省时省力且杂交效率高。本发明可直接通过对杂交种催芽，室内点播后，4-5叶期可采样炭疽分生孢子悬浮液喷雾法进行接种，在苗期对品种抗性进行评价，可以在较短的时间里对大批植株进行比较、筛选，再通过田间试验对筛选的植株进行抗病性评价，节省大量时间和土地成本，为桑树抗病育种提供借鉴。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种桑树快速杂交育种方法，包括如下步骤：
S1，雄花枝的收集及处理：雄花开放时，剪取开花的雄花小枝放入硫酸纸袋，于4℃密封保存；
S2，雌花枝的处理：在雌花开放前用硫酸纸袋套袋；
S3，授粉：当雌花柱头伸展并变为白色时，将雌花套袋解开取下，直接将装有雄花枝条的硫酸纸袋套在雌花枝上，摇动套袋的枝条，使花粉散落，待全部柱头枯萎之后去除杂交袋；
S4，杂交种子的采收：桑椹变色成熟时，摘下桑椹洗出种子，去除杂质留下种子。
在以上技术方案中，在S1中，剪取开花的雄花小枝放入硫酸纸袋后，用硫酸纸袋包裹好，放入装有硅胶的自封袋中密封，于4℃保存。
在以上技术方案中，在S2中，遇雨期时在硫酸纸袋外再套一层塑料袋并扎紧袋口。
在以上技术方案中，在S3中，若硫酸纸袋套袋过程中有破损，直接再套一层硫酸纸袋，遇雨期时在硫酸纸袋外再套一层塑料袋并扎紧袋口。
在以上技术方案中，还包括S5，杂交苗的培育及炭疽病抗性评价，具体步骤为：将S4中收集的杂交种子催芽处理，然后点播种植，待杂交苗长到4-5叶期进行炭疽病抗性评价。
在以上技术方案中，炭疽病抗性评价的具体步骤为：将获得的单孢分离炭疽菌菌株转至PDA平板上于恒温培养箱中培育，待其产孢后接入到YPSS培养基恒温培养摇床，暗培养产孢后配制成分生孢子悬浮液，针刺后喷雾接种于4-5叶期桑树幼苗全株，接种后将桑苗保存在装有无菌水的容器中光暗循环培养，一段时间后统计发病率和病情指数，进行炭疽病抗性分级。
在以上技术方案中，发病率和病情指数的计算方法为：
发病率＝病叶数/调查总叶片数×100％；
病情指数＝[∑(各级病叶数×发病级别)/调查总叶片数×最高级值]×100。
在以上技术方案中，发病级别的确定标准如下：
| 发病级别 | 分级标准 |
| 0级 | 全株叶片无病斑； |
| 1级 | 叶片病斑斑点数小于5个，且病斑面积占叶片总面积5％以下； |
| 2级 | 叶片病斑斑点数6-10个，且病斑面积占叶片总面积5％-10％； |
| 3级 | 叶片病斑斑点数11-20个，且病斑面积占叶片总面积10.1％-20％； |
| 4级 | 叶片病斑斑点数21-30个，且病斑面积占叶片总面积20.1％-35％； |
| 5级 | 叶片呈枯黄状态，且病斑面积占叶片总面积35％以上。 |
在以上技术方案中，炭疽病抗性分级的标准为：病情指数在15之内为高抗，15～25之间为中抗，25～35为中感，高于35为高感。
本发明的有益效果在于：
1、现有田间杂交育种中，雄桑收集花粉时间为无风的早晨六点至九点之间，时间要求高。桑树杂交需要大量套袋收集花粉，本发明只需剪去少量开花雄枝即可满足杂交授粉的要求，节省了大量套袋和花粉收集工作。
2、桑树雄花花序的各个小花发育程度不一致，一般在1/3雄花开了就套袋，收集花粉需要等几天才能满足杂交对花粉的需求，套袋过程中若遇阴雨天气则硫酸纸袋易被雨水淋破，无法完成花粉收集工作，且阴雨天气花粉活力低，就算收集到花粉进行杂交也容易使种子不育，导致当年杂交育种工作失败。本发明在晴天收集的雄枝条，花粉活力强，成功授粉机率高，避免了连续阴雨天气对杂交工作的影响。同时本发明对收集时间限制较小，只要雄花枝条有少量花即可收集。
3、由于桑树雄花开花时间一般早于雌花开花时间，且桑树种间与种内的花期差异较大(例如白桑Morus alba在湖北花期大部分是3月中旬左右，而长穗桑Morus wittiorum在湖北花期为4-5月)，杂交育种在操作过程中经常遇到优良亲本花期不遇的难题，从而降低杂交组合的亲本选择性。本发明将剪取的雄花小枝放入硫酸纸袋，并用硫酸纸袋包裹好后，放入装有硅胶的自封袋中密封，可以在4℃放置20～30天，成功解决了优良亲本花期不遇的问题。
4、传统杂交授粉需用毛笔蘸花粉轻扫雌花柱头，工作量大且繁琐，完成一个枝条的授粉需要花费大量时间，且容易受外源花粉的污染。本发明只需将装有雄花小枝的硫酸纸袋直接套在雌花枝条上，抖动或通过风力摇晃使雄株枝条的花粉在密闭空间中与雌花接触，成功授粉几率高，避免了外源花粉污染，且节省了大量时间。
5、雌花枝条套袋和杂交授粉过程中套袋如遇阴雨天气，本发明在硫酸纸袋外再套一层塑料袋，塑料袋最长可套7天，完全可避免套袋过程中遇雨季需更换硫酸纸袋，且避免了硫酸纸袋更换不及时，导致花粉污染的问题。
6、获得桑树杂交种后一般直接在田间播种，等长成大树后再对其进行评价，需要大量土地和时间，同时还需要发病地块才来进行抗病性评价。本发明获得桑树杂交种后，直接催芽，然后点播，较直接撒播成苗最少快1个月。在桑树4-5叶期采样分生孢子悬浮液喷雾法进行接种，在苗期对品种抗性进行评价，鉴定法省工省时，可以在很少的时间里对大批植株进行比较、筛选，再对筛选的植株进行抗病性评价，可节省大量时间和土地成本。
附图说明
图1为剪取雄花小枝放入硫酸纸袋，用硫酸纸袋包裹后，放入装有硅胶的自封袋中密封；
图2为杂交种子催芽；
图3为不同杂交桑苗催芽后点播20d状态；
图4为杂交桑苗催芽后撒播20d状态；
图5为接种试验7d后桑树苗状态图。
具体实施方式
为了更好地说明本发明的目的、技术发明和优点，下面将结合具体实施例对本发明做进一步描述。本发明可以以许多不同的形式实施，而不应该被理解为限于在此阐述的实施例。相反，提供这些实施例，使得本公开将是彻底和完整的，并且将把本发明的构思充分传达给本领域技术人员，本发明将仅由权利要求来限定。
如图1-5所示，作为其中一种实施例，本发明提供了一种桑树快速杂交育种方法，具体包括如下步骤：
亲本：本实施例具体以抗青10号与珍珠白♀，新疆2-4资源与卢旺达资源♀，红雄资源/>与云果1号♀作为快速杂交育种的实验品种。
雄花枝：当雄花开放时可随时收集，剪取开花的雄花小枝放入硫酸纸袋中，并用硫酸纸袋(90cm长×30cm宽)包裹好后，放入装有硅胶的自封袋中密封，标明资源名和采集时间，于4℃保存，可放置20～30天(图1)。
雌花枝：为防止外源花粉污染，在雌花开放前用硫酸纸袋进行套袋，遇雨期，为防止雨水将硫酸纸袋淋破，在硫酸纸袋外再套一层塑料袋，袋口用绳子扎紧，以防止其他花粉侵入。
授粉：当雌花柱头伸展并变为白色柱头时，先将雌花套袋解开取下，直接将装有雄花枝条的硫酸纸袋套在雌花枝上，如硫酸纸袋套袋过程中有破损，可直接再套一层硫酸纸袋或塑料袋(雨季)，然后摇动套袋的枝条，尽量使花粉散落。待全部柱头枯萎之后即可去除杂交袋。
杂交种子的采收：待桑椹变色成熟时，摘下桑椹并用100目筛子于水中洗出种子，将筛网洗出的种子，倒入塑料量杯，去除种皮等杂质，只留种子。
杂交种子催芽：将所得杂交种子放置在铺有5层卫生纸的培养皿中，放置在25℃温室催芽5～7d(图2)，将催芽后的种子点播至装有基质的种植盆中。点播可比直接撒播出苗快20～30d(图3、图4)。
炭疽病抗性评价：用桑炭疽菌接种4～5叶期杂交苗，将获得的单孢分离隐秘炭疽菌C.aenigma菌株转至PDA平板上，于25℃恒温培养箱中培育5d。后，接入到YPSS培养基(每升含有4g酵母粉、15g蔗糖、1g KH2PO4、0.5g MgSO4)，于25℃恒温培养摇床(Ruihua HZ300L，China)，暗培养7d产孢后，配制成1×105个/mL分生孢子悬浮液，针刺后喷雾接种于4～5叶期桑树幼苗全株，以滴水为度，接种后将桑苗保存在装有无菌水的塑料盒中，并在28℃下以12小时光暗循环培养。每个品种20株，试验重复3次，以接种等量无菌水处理为对照(图5)。待供试桑树品种接种7d后，统计发病率和病情指数。
发病率＝病叶数/调查总叶片数×100％；
病情指数＝[∑(各级病叶数×发病级别)/调查总叶片数×最高级值]×100。
其中，桑炭疽病严重度分级如表1所示。表1中的病级即为叶片发病级别。例如1株桑苗，总叶片数10个，0级病叶数2个，1级病叶数2个，2级病叶数3个，3级病叶数3个，4、5级病叶数均为0个，那么它的发病率就是(2+2+3+3)/10×100％＝80％；病情指数就是[(1×2+2×3+3×3)/10×5]×100＝34。
表1桑炭疽病严重度分级
桑树品种炭疽病抗性分级标准如下：桑树抗性级别的划分根据辛宝宝(辛宝宝等2017)等人对紫花苜蓿的炭疽病抗性等级标准，并对其进行了修正。病情指数在15之内为高抗，15～25之间为中抗，25～35为中感，高于35为高感。
通过SPSS 20.0统计分析软件，对不同品种的桑树发病率和病情指数展开单因素方差分析。
需要说明的是，对于本次实验选择接种桑炭疽菌的病原菌类型，发明人进行了相关研究。Hara(1925)首次报道了由Colletotrichummorifolium Hara和C.morina Hara引起的桑叶炭疽病。Yoshida等(1995)从日本各地的病桑叶中分离出炭疽病真菌，并根据VonArx(1957)提出的分类法确定其种类，通过致病性测试，明确了桑炭疽病最具侵染性的病原菌是C.dematium，其次是C.gloeosporioides和C.acutatum。在中国，桑炭疽病主要是由C.morifolium和C.morium引起的(Tai 1979)。Xue等(2019)等报道了基于形态特征和组合序列ITS、GAPDH、ACT、CHS-1、TUB2和GS的DNA分析，引起四川省都江堰地区桑炭疽病最主要的病原菌为C.fioriniae，其引起了典型的褐色坏死斑点或条纹，其次是C.brevisporum、C.karstii和C.kahawae subsp.Ciggaro，未引起桑树发病的炭疽菌为C.fructicola和C.cliviae。我们通过分离鉴定和致病性测定发现引起湖北省桑炭疽的主要病原菌为隐秘炭疽菌C.aenigma，相关研究发表在Plant Disease杂志。因此本发明实施例选用隐秘炭疽菌C.aenigma对杂交苗进行接种。当然，本发明炭疽病抗病性评价方法适用于上述提到的所有病原菌类型。
发明人在室内评价了11份桑树品种对炭疽病的抗性，获得了1份高抗材料浙杂1号。6份中抗材料，包括69×851、丰驰桑、桑特优2号、山东2020、塘10、粤桑51号。3份中感材料，包括桂桑5号、桂桑6号、桂桑优12。1份高感材料，桂桑优62(表2)。该评价方法也可直接用于杂交苗炭疽病抗性评价。
表2桑树品种对炭疽菌抗性的苗期鉴定结果
注：不同材料间差异显著使用同列不同小写字母呈现(P<0.05)；HR：高抗；HS：高感；R：中抗；S：中感。
本发明建立的桑树苗期抗病性评价方法，可为桑树抗病育种提供借鉴。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种桑树快速杂交育种方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，雄花枝的收集及处理：雄花开放时，剪取开花的雄花小枝放入硫酸纸袋中，于4℃密封保存；
S2，雌花枝的处理：在雌花开放前用硫酸纸袋套袋；
S3，授粉：当雌花柱头伸展并变为白色时，将雌花套袋解开取下，直接将装有雄花枝条的硫酸纸袋套在雌花枝上，摇动套袋的枝条，使花粉散落，待全部柱头枯萎之后去除杂交袋；
S4，杂交种子的采收：桑椹变色成熟时，摘下桑椹洗出种子，去除杂质留下种子。
2.根据权利要求1所述杂交育种方法，其特征在于，在S1中，剪取开花的雄花小枝放入硫酸纸袋后，用硫酸纸袋包裹好，放入装有硅胶的自封袋中密封，于4℃保存。
3.根据权利要求1所述杂交育种方法，其特征在于，在S2中，遇雨期时在硫酸纸袋外再套一层塑料袋并扎紧袋口。
4.根据权利要求1所述杂交育种方法，其特征在于，在S3中，若硫酸纸袋套袋过程中有破损，直接再套一层硫酸纸袋，遇雨期时在硫酸纸袋外再套一层塑料袋并扎紧袋口。
5.根据权利要求1所述杂交育种方法，其特征在于，还包括S5，杂交苗的培育及炭疽病抗性评价，具体步骤为：将S4中收集的杂交种子催芽处理，然后点播种植，待杂交苗长到4-5叶期进行炭疽病抗性评价。
6.根据权利要求5所述杂交育种方法，其特征在于，炭疽病抗性评价的具体步骤为：将获得的单孢分离炭疽菌菌株转至PDA平板上于恒温培养箱中培育，待其产孢后接入到YPSS培养基恒温培养摇床，暗培养产孢后配制成分生孢子悬浮液，针刺后喷雾接种于4-5叶期桑树幼苗全株，接种后将桑苗保存在装有无菌水的容器中光暗循环培养，一段时间后统计发病率和病情指数，进行炭疽病抗性分级。
7.根据权利要求6所述杂交育种方法，其特征在于，发病率和病情指数的计算方法为：
发病率＝病叶数/调查总叶片数×100％；
病情指数＝[∑(各级病叶数×发病级别)/调查总叶片数×最高级值]×100。
8.根据权利要求7所述杂交育种方法，其特征在于，发病级别的确定标准如下：
9.根据权利要求6所述杂交育种方法，其特征在于，炭疽病抗性分级的标准为：病情指数在15之内为高抗，15～25之间为中抗，25～35为中感，高于35为高感。
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