CN115843678A - 一种桑树切枝水培的杂交育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂交育种技术领域，公开了一种桑树切枝水培的杂交育种方法，包括S1、亲本花枝收集及处理，所述处理为将收集的花枝于阴凉干燥处放置2～6天后用塑料膜整体密封,标明资源名和采集时间后置于4℃保存备用；S2、花枝水培；S3、花粉收集；S4授粉；S5、采收杂交种子。本方案不仅能解决不同桑树品种田间杂交育种时的花期不遇问题；还通过在花枝低温保存前先在阴凉干燥处放置2～6天，有效降低保存花枝的含水量，从而延长花枝低温保存时间，使得全年任何时间均可开展杂交育种工作，从而进一步提高桑树杂交育种的时间灵活性。

Description

一种桑树切枝水培的杂交育种方法

技术领域

本发明涉杂交育种技术领域，具体涉及一种桑树切枝水培的杂交育种方法。

背景技术

桑树是桑科(Moraceae)桑属(Morus)的多年生经济林木，其中桑叶是家蚕的主要饲料，具有重要经济价值；且近年来，果桑、饲料桑、茶用桑和生态桑等也逐渐凸显出桑的多方面经济价值。因此，桑树优良品种的延续和开发就显得尤为重要。

为了解决上述问题，近年来常采用田间杂交育种、优良单株选育、辐射诱变、多倍体育种和芽变选育等方式进行育种。桑树是雌雄异株，田间杂交育种具有其天然优势，因此多采用田间杂交育种的方式对桑的品种进行改良，目前也已培育出诸多优良品种，如桂优系列桑树品种。然而，现有桑树的田间杂交育种仍然存在如下缺点：(1)桑树的杂交育种授粉时间集中在早春，其育种时间窗口短，使得桑的大田杂交育种工作每年只能开展一次，严重降低了桑树育种的时间灵活性；(2)桑树种间与种内的花期差异较大，大田杂交育种在操作过程中经常遇到优良亲本花期不遇的难题，致使杂交组合设计失败，从而降低杂交组合的亲本选择性；(3)桑树多为雌雄异株异花、风媒传粉，在杂交育种过程中操作不当易使得外源花粉污染严重，造成收获种子纯度较低；(4)雄花花序的各个小花发育程度不一致，使得桑树花粉收集易受天气影响，导致花粉收集效率低下，活性低，较难满足杂交育种工作对花粉的大量需求。

以上因素都一定程度上限制了桑树田间杂交育种工作的开展。因此，亟需开发一种简单易行且高效的温室内桑树杂交育种方法。

发明内容

本发明旨在提供一种桑树切枝水培的杂交育种方法，以解决现有田间杂交育种因育种时间窗口短而降低桑树育种时间灵活性的技术问题。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种桑树切枝水培的杂交育种方法，包括S1、亲本花枝收集与处理，所述处理为将收集的花枝于阴凉干燥处放置2～6天后用塑料膜整体密封,标明资源名和采集时间后置于4℃保存备用；S2、花枝水培；S3、花粉收集；S4授粉；S5、采收杂交种子。

本方案的原理及优点是：

1、相比于现有田间杂交育种因育种时间窗口短而降低桑树育种时间灵活性而言，本方案通过切枝收集并在4℃保存，使得杂交育种不仅能在桑树的自然花期进行，还能在非自然花期完成杂交育种，有效克服桑树杂交育种时间窗口短的问题，从而提高桑树杂交育种的时间灵活性。

2、本方案的花枝在低温保存前先在阴凉干燥处放置2～6天，能有效降低保存花枝的含水量，从而延长花枝低温保存时间，进一步提高桑树杂交育种的时间灵活性。申请人实验发现，若是将剪切花枝直接密封保存，枝条保存5～7天开始出现发霉腐烂；而当将剪切的花枝在阴凉干燥处放置2～6后再密封保存，花枝保存8个月后仍然具有较高活力；有效保证全年任何时间均可开展杂交育种工作，从而进一步提高桑树杂交育种的时间灵活性。

3、相比于现有田间杂交育种时不同品种花期不遇而降低杂交组合亲本选择性而言，本方案通过将不同花期的桑树切枝保存后水培育种的方式，使得在不同花期的亲本能够通过分时间取出进行室内水培养护的方式，调整雌雄桑的花期，从而克服桑树田间杂交育种中花期不遇的难题。

4、本方案的室内水培育种可通过将雌雄花枝单独水培养护的方式，不仅能有效避免天气不好影响花粉收集，还能有效避免不同品种花粉相互污染，从而解决外源花粉污染严重的问题。

优选的，一种桑树切枝水培的杂交育种方法，具体包括如下步骤：

S1、亲本花枝收集及处理：在花芽分化并形成休眠芽后，选择生长旺盛的健康父本树和母本树，剪取长50～120cm的母本及长30～100cm父本枝条；于阴凉干燥处放置2～6天后用塑料膜整体密封,标明资源名和采集时间，于4℃保存备用；

S2、花枝水培：取出S1中保存的雌雄花枝，基部剪斜口，雌花枝上部套杂交袋，将基部置于水中进行水培，每1-2天换水一次，所述水为室温放置24h的自来水；

S3、花粉收集：待花药开裂后，于无风环境中用手抖动花枝，将花粉自然散落在表面光滑的白纸上，收集至离心管中，于4℃保存；

S4、授粉：当雌花柱头伸展，变为白色成熟柱头时，用毛笔蘸取花粉，轻扫雌花柱头，完成授粉；重复3～5次授粉后对花枝的父本和母本来源、授粉时间做好标记；

S5、采收杂交种子：待桑椹变色成熟时，摘下桑椹并于水中洗出种子，晾干贮藏。

有益效果：

1、本方案通过使用室温放置24h的自来水对花枝进行水培养护，即可实现桑树的室内杂交育种，无需额外调配营养液或增设将营养液注入花枝的设备，有效降低杂交育种的成本。

2、现有田间杂交育种中，雄桑收集花粉时间为无风的早晨六点至九点之间，时间要求高，另外若遇阴雨天气则无法完成花粉收集工作，导致当年杂交育种工作失败。本方案通过室内水培雄桑枝条，并于无风环境中通过花粉自然散落或抖落收集花粉，不仅可以获得大量、高纯度和高活力的花粉，且对收集时间没有限制，显著降低杂交育种中花粉收集难度，从而提升杂交育种成功率。

3、本方案室内水培可有效避开户外天气因素影响和病虫害的侵害等，特别是桑椹菌核病，从而提高桑椹的座果率和结实率；同时，温室作为相对封闭的环境，亦可避免外源花粉污染的问题。

优选的，在S1中，花枝收集时间为休眠芽形成后～次年萌芽前。

有益效果：本方案通过在休眠芽形成后至次年萌芽前剪枝采样，有效获取满足育种条件的花枝，且通过在整个休眠芽期采样，即使不能长时间保存花枝育种活性，也能在休眠芽期多次进行育种工作，显著提高育种的时间灵活性。

优选的，在S2中，水培温度20～25℃，空气湿度为40％～60％，空气湿度通过每天3-5次喷水实现。

有益效果：本方案通过控制水培温度和湿度，有效模拟花枝在自然状态下的萌芽及育种条件。每天喷雾3-5次还能有效为花枝保湿，避免剪切花枝水培过程中出现花枝干枯；还能为花枝内部营养输送提供载体，促使育种工作正常进行。

优选的，在S3中，花粉保存为将离心管敞口置于含变色硅胶的密闭容器中，于4℃保存。

有益效果：本方案通过将装有花粉的离心管敞口置于干燥环境中，有效对新收集的花粉进行干燥和保存，从而保证花粉在杂交育种过程中持续保持较高的花粉活力，以适应不同品种雌花枝水培时的不同成熟时间。

优选的，在S2中，花枝水培前的处理方式为：雄花枝取出后，截短至10～15cm长，保存全部花芽；雌花枝较雄花枝晚取出3～5天，截成30～100cm的枝条，每个枝条保留中上部分3～5个花芽。

有益效果：桑树雄花枝水培获取花粉所需营养较少、时间短，本方案中10-15cm长的花枝即可为整根花枝上的花芽供给花粉分化所需营养；而雌花枝分化及养护至种子成熟的时间较长、营养需求高，因此去除多余的花芽能有效保证雌花枝对花芽分化及种子成熟供给营养。

优选的，在S4中，授粉后还包括：待全部柱头枯萎之后去除杂交袋，继续室内水培至桑椹成熟。

有益效果：本方案在柱头枯萎后即去除杂交袋，换句话说，即是在雌花枝完成传粉授精后、外界花粉飘散也无法对杂交育种父本花粉来源造成影响时去除杂交袋，不仅有效提升雌花枝的通风效果，避免长时间不通风滋生病菌，还能促进果实内碳水化合物向种子的转化，从而增加种子粒重并提升种子质量。

优选的，在S2中，水培过程中包括对腐烂花枝基部进行修剪，修剪时基部剪斜口。

有益效果：桑树花枝基部剪切后会分泌乳汁，乳汁具粘性，长时间不清理会引起基部腐烂，进而影响花枝吸收水分；本方案通过间歇对花枝基部进行修剪，可有效避免花枝基部乳汁腐烂后影响花枝水分吸收；斜切口的基部进一步提升水分吸收效率。

优选的，所述杂交袋为羊皮纸袋。

有益效果：本方案通过使用羊皮纸袋，有效避免花芽分化与发育期内外部环境包括飞虫、菌丝等对花芽分化和发育造成影响。

附图说明

图1为本发明实施例中云19雌花枝条套袋与水培养护示意图。

图2为本发明实施例中人工杂交授粉示意图。

图3为本发明实施例中成熟桑椹示意图。

图4是本发明实施例1所得杂交种子温室成苗后移栽大田的桑苗生长状态图。

图5为本发明实施例2中花粉在保存0天(a)和保存20天(b)的活性对照图(棕色和黑色都代表具有较强的活性)。

图6为本发明实施例5中所得杂交种子温室成苗的桑苗生长状态图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，下述实施例以及实验例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，且所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。

实施例1

一种桑树切枝水培的杂交育种方法，具体包括如下步骤：

S1、亲本花枝收集及处理：本方案具体以桑树资源云19(长穗桑，Moruswittiorum)与贵14(华桑，M.cathayana)作为切枝水培杂交育种的实验品种。

雌花枝：选择生长旺盛、处于丰果期的健康长穗桑雌桑株，在花芽完成分化并形成休眠芽后，剪取长50～120cm的健康粗壮枝条，于阴凉处放置2～6天后用塑料膜整体密封(本实施例具体为放置4天)，标明资源名和采集时间，于4℃保存，取材时间为休眠芽形成后～次年萌芽前(云19属晚花桑种，重庆地区的采条时间具体为7月～次年3月中旬，本实施例具体取样时间为8月中旬)。

雄花枝：选择生长旺盛、花粉量大、花粉活力高的健康华桑雄桑株，在花芽完成分化并形成休眠芽后，剪取的健康粗壮枝条，于阴凉处放置2～5天后用塑料膜整体密封，标明资源名和采集时间，于4℃保存，取材时间为休眠芽形成后～次年萌芽前(贵14属中晚花桑种，重庆地区的采条时间具体为8月～次年2月底，本实施例具体取样时间为8月中旬)。

S2、花枝水培：取出保存2个月的雄花枝，保留全部花芽，截短至10～15cm，基部剪斜口后置于温度为20～25℃、湿度为40％～60％的室内进行水培；

本方案通过将花枝枝条剪短并保留全部花芽，便于花枝为花芽分化发育提供充足的水分和营养；再者，雄花枝太长的话，收集花粉时花粉极容易散到桌面而降低花粉收集效率；而本方案中10～15cm雄花枝则更容易收集花粉。另外，桑雄花枝上花粉陆续成熟，本方案通过分批次收集花粉，并及时低温保存可有效保证花粉授粉时的活力，提升授粉效果。

取出保存2个月的雌花枝(雌花枝较雄花枝晚取出3～5天)，截短至30～100cm的枝条，基部剪斜口，每个枝条保留中上部分3～5个花芽，抹去其余花芽并套杂交袋(具体为羊皮纸袋，以订书针密封透气孔，规格为34*25cm)；将花枝置于温度为20～25℃、湿度为40％～60％的室内进行水培(如图1所示)。

本方案将雌花枝晚取出几天开始培育的方式，则可有效保证雌花枝成熟时有足够的花粉授粉，从而确保雌花枝的授粉率，提升种子得率；有效避免雌雄花枝同时培育时因花粉欠缺导致种子得率下降。

水培过程中，若桑枝基部分泌粘液并开始腐烂，则用枝剪以斜口剪去；每1～2天换一次水，每天喷雾3-5次；其中水培及喷雾所用的水均为室温放置24h的自来水。

S3、花粉收集：在雄花枝正下方放置表面干净、光滑的白纸，待贵14的雄花枝花药开裂后，于无风环境中用手抖动花枝，将花粉自然散落在白纸上，收集至离心管中，将离心管敞口置于含变色硅胶的密闭容器中，于4℃干燥保存。

S4、授粉：当雌花柱头伸展并变为白色柱头时，用干毛笔蘸取少量花粉，轻扫雌花柱头，完成授粉(如图2所示)，授粉过程重复3～5次并对花枝做标记(当实验过程中包含多种父本和母本来源时，需详细备注母本及父本来源和授粉时间)。待全部柱头枯萎之后即可去除杂交袋，保持花枝通风，继续室内水培至桑椹成熟。

S5、杂交种子的采收：待桑椹变色成熟时(如图3所示)，摘下桑椹并于水中洗出种子，晾干，计算种子千粒重为0.4810g，低温低湿保存。将所得杂交种子在25℃温室成苗，桑苗移栽大田2月后的生长状态图详见图4。

另，申请人实验发现，收集田间育种所得长穗桑云19的种子，通过计算，其种子千粒重为0.4843g；相比之下，本方案通过将成熟枝条取枝保存后育种，其所得种子千粒重与田间育种相差不大；然而本方案切枝保存的室内育种方式可有效克服田间育种时桑树杂交育种时间窗口短的问题，从而提高桑树杂交育种的时间灵活性。另，本方案通过切枝保存的方式能够使得在不同花期的亲本能够通过分时间取出进行室内水培养护的方式，调整雌雄桑的花期，从而克服桑树田间杂交育种中花期不遇的难题。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于，收集的花粉保存20天后再次用于授粉，其所得种子千粒重为0.4732g，表明本方案中雄花枝萌发所得花粉在4℃环境下密封保存20天后仍然具有较高活性。

另外，本方案使用显微镜对保存0天和保存20天后的花粉活性进行检测，具体方法为：将花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在25℃的恒温箱(或室温20℃条件下)中孵育，5～10min后在显微镜下观察花粉活性，结果如图4和图5所示，图中棕色和黑色都代表花粉具有较强的活性。

实验数据表明，对比保存0天的花粉，本方案中雄花枝萌发所得花粉在4℃环境下密封保存20天后仍然具有较高活性，充分说明本方案中通过切枝收集并在4℃保存的方式是可行的，其使得杂交育种不仅能在桑树的自然花期进行，还能在非自然花期完成杂交育种，有效克服桑树杂交育种时间窗口短的问题，从而提高桑树杂交育种的时间灵活性。

实施例3

本方案与实施例1的区别在于，于12月中旬截取雌花枝和雄花枝，晾干放置6天后用塑料膜整体密封，标明资源名和采集时间，于4℃保存；并于次年3月取出经水培萌发、授粉、养护获得种子，计算种子千粒重为0.4806g。另，申请人研究发现，冬季截取的花枝保存时间较长，在保存8个月后仍然能够萌发进行育种。说明本方案冬季截取的花枝在低温保存前先在阴凉干燥处放置2～6天，能有效降低保存花枝的含水量，从而延长花枝低温保存时间，进一步提高桑树杂交育种的时间灵活性。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例采用桑资源云7(长穗桑，M.wittiorum，晚花品种，花期3月下旬至四月初)做母本、桑资源伦教109(广东桑，M.atropurpurea,早花品种，花期2月份)做父本，获得杂交种子并计算千粒重为0.3866g；而采用桑资源云7做母本、伦教109做父本时的田间育种所得种子千粒重为0.3963g。本方案切枝水培的杂交育种方法不仅能有效提高桑树杂交育种的时间灵活性，克服桑树田间杂交育种中花期不遇的难题；还能通过在室内水培，调控杂交育种条件而获得品质更优的杂交种子。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于，本实施例采用桑资源鸡桑(鸡桑，M.caustralis，花期3月份)做母本、桑资源长穗桑4号(长穗桑，M.wittiorum，花期3月下旬至四月初)做父本，获得杂交种子并计算千粒重为0.7175g。将所得杂交种子在25℃温室成苗，成苗1月的桑苗生长状态图详见图6。

本方案以不同的桑资源进行切枝水培，均可实现桑资源的室内杂交育种，避免不同桑资源处于不同花期或不同地域而影响桑资源育种，从而有效提高桑树杂交育种的时间灵活性，克服桑树田间杂交育种中花期不遇的难题。

对比例1

本方案与实施例1的区别在于，于8月中旬截取雌花枝和雄花枝，晾干放置0天后用塑料膜整体密封，标明资源名和采集时间，于4℃保存；然而本对比例的花枝在保存5天后即会逐渐发霉腐烂，无法继续用于室内育种。其原因在于，截取的新鲜花枝含有较多水分，而在保存过程中并未置于完全无菌的环境，而花枝含水量较多时其较易出现发霉腐烂的现象；另申请人也在12月截取花枝在不晾干放置的情况下直接保存，其在保存7天后即会开始出现发霉腐烂的现象。

对比例2

本方案与实施例1的区别在于，于8月中旬截取雌花枝和雄花枝，晾干放置8天后用塑料膜整体密封，标明资源名和采集时间，于4℃保存；然而本对比例的花枝在10月(保存2个月)取出经水培时发现，无论雄花枝和雌花枝均无法萌发。其原因在于，8月截取的花枝在保存8天后出现脱水现象，导致其保存2月后无法萌发。

对比实施例1、3、对比例1～2中，8月截取的花枝经不同晾干放置天数后表现出的保存及萌发情况，表明截取的花枝需要在低温保存前晾干放置2～6天，降低花枝中含水量，有利于延长花枝保存时间。未晾干放置及晾干放置时间过长都会影响花枝育种萌发。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。

Claims (9)

1.一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：包括S1、亲本花枝收集及处理，所述处理为将收集的花枝于阴凉干燥处放置2～6天后用塑料膜整体密封,标明资源名和采集时间后置于4℃保存备用；S2、花枝水培；S3、花粉收集；S4授粉；S5、采收杂交种子。

2.根据权利要求1所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：具体包括如下步骤：

S1、亲本花枝收集及处理：在花芽分化并形成休眠芽后，选择生长旺盛的健康父本树和母本树，剪取长50～120cm的母本及长30～100cm父本枝条；于阴凉干燥处放置2～6天后用塑料膜整体密封,标明资源名和采集时间，于4℃保存备用；

S2、花枝水培：取出S1中保存的雌雄花枝，基部剪斜口，雌花枝上部套杂交袋，将基部置于水中进行水培，每1-2天换水一次，所述水为室温放置24h的自来水；

S3、花粉收集：待花药开裂后，于无风环境中用手抖动花枝，将花粉自然散落在表面光滑的白纸上，收集至离心管中，于4℃保存；

S4、授粉：当雌花柱头伸展，变为白色成熟柱头时，用毛笔蘸取花粉，轻扫雌花柱头，完成授粉；重复3～5次授粉后对花枝的父本及母本来源、授粉时间做好标记；

S5、采收杂交种子：待桑椹变色成熟时，摘下桑椹并于水中洗出种子，晾干贮藏。

3.根据权利要求2所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：在S1中，花枝收集时间为休眠芽形成后～次年萌芽前。

4.根据权利要求3所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：在S2中，水培温度20～25℃，空气湿度为40％～60％，空气湿度通过每天3-5次喷水实现。

5.根据权利要求4所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：在S3中，花粉保存为将离心管敞口置于含变色硅胶的密闭容器中，于4℃保存。

6.根据权利要求5所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：在S2中，花枝水培前的处理方式为：雄花枝取出后，截短至10～15cm长，保存全部花芽；雌花枝较雄花枝晚取出3～5天，截成30～100cm的枝条，每个枝条保留中上部分3～5个花芽。

7.根据权利要求6所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：在S4中，授粉后还包括：待全部柱头枯萎之后去除杂交袋，继续室内水培至桑椹成熟。

8.根据权利要求7所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：在S2中，水培过程中包括对腐烂花枝基部进行修剪，修剪时基部剪斜口。

9.根据权利要求8所述的一种桑树切枝水培的杂交育种方法，其特征在于：所述杂交袋为羊皮纸袋。

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