CN104651375B

CN104651375B - 家蚕微孢子虫Met‑AP2基因及其应用

Info

Publication number: CN104651375B
Application number: CN201510029801.5A
Authority: CN
Inventors: 刘吉平; 杨思佳
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2015-01-21
Filing date: 2015-01-21
Publication date: 2017-12-26
Anticipated expiration: 2035-01-21
Also published as: WO2016115903A1; CN104651375A

Abstract

本发明公开了家蚕微孢子虫Met‑AP2基因及其在微孢子虫检测方面的应用，以及一组微孢子虫通用检测引物及试剂盒。所述通用检测引物包括上游引物MC‑F和下游引物MC‑R，上游引物MC‑F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC‑R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。该检测引物以基因Met‑AP2为靶基因，能够同时应用于多种微孢子虫的检测，检测结果可靠、易于操作、灵敏度高，尤其是对于实际检验检疫工作中，对于样品中各种微孢子虫的早期检测，具有重要的实际应用意义。

Description

家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其应用。

背景技术

家蚕微孢子虫病的病原家蚕微孢子虫是一类细胞内专性寄生的真核生物，之前一直属于原虫，近些年被划分到真菌类。因其具有垂直传播的特点使之成为了家蚕病原微生物中最受人关注的一种，也是家蚕病原微生物中唯一法定检疫的疫病。从19世纪发现到现在，家蚕微孢子虫病对各国的养蚕业造成了巨大的损失。除此之外，其他不同的微孢子虫也可侵害其它昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。不论是在哪种微孢子虫病的治疗上都未取得很好的结果，而准确检测指示微孢子虫是治疗的前提。

最初人们判别微孢子虫主要根据微粒子病的发病特点进行肉眼观察。显微镜发明以后，人们根据微孢子虫的形态和大小进行显微镜镜检，一定程度上提高了检测的灵敏度和效率，并因此遏制了法国等欧洲蚕桑生产国流行的家蚕微粒子病。但是显微镜镜检有明显的缺点，如对操作人员的技术及经验要求较高，而且微孢子虫个体及其微小，常用的显微镜镜检检测方法特异性和灵敏度较低，难以区分微孢子虫类似物。

随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。“分子钟”是分子水平分析生物系统进化中的有效手段，SSU rRNA（16S rDNA）是微生物进化研究中常用的“分子钟”（Pei A Y, et al., 2010）。家蚕微粒子病PCR检测技术研究中所设计的引物针对的靶基因多数也是SSU rRNA，针对其他微孢子虫基因设计的引物较少或灵敏度较差，因而很少被报道。Baker et al（1995）和Terry et al（1999）根据相近种属微孢子虫SSU rRNA高度保守区设计的PCR引物V1f/530r，可鉴别多种种属的微孢子虫的DNA模板扩增约450bp的特异目的条带，但是经常出现假阳性等问题。

微孢子虫寄主域广泛，不仅可侵害各种昆虫，也可侵染水产生物、陆生的哺乳动物。微孢子虫感染人后，造成人角膜炎、脑炎、肠炎以及腹泻等疾病。而同一种物种也可能会被不同种属微孢子虫同时感染。因此，在实际工作中，尤其是检验检疫工作，对于样品中存在多种微孢子虫病原的同时检测是很重要的，且不能出现漏检的情况，因此寻求一种既能够通用的检测多种微孢子虫，又具有很好的检测灵敏性的引物组，在微孢子虫及微孢子虫病的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有昆虫微孢子虫通用检测技术的缺陷和不足，提供一种家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其在微孢子虫检测方面的应用。

本发明另一目的是提供一组微孢子虫通用检测引物及其应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明获得了家蚕微孢子虫Met-AP2基因，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述家蚕微孢子虫Met-AP2基因编码的具有生物活性的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了所述家蚕微孢子虫Met-AP2基因在微孢子虫检测方面的应用。在获得家蚕微孢子虫Met-AP2基因的基础上，以Met-AP2基因为靶基因设计引物进行PCR扩增，根据扩增DNA片段的结果判定样品中是否含有微孢子虫。

另外，本发明还提供了一组微孢子虫通用检测引物，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

上述引物是以Met-AP2基因为靶基因设计，经过大量的实验和研究获得的，该引物既能够通用的检测多种微孢子虫，又具有很好的检测灵敏性，在微孢子虫的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。所述引物尤其适用于同时检测多种桑园及野外常见的昆虫微孢子虫，如家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫或柞蚕微孢子虫等。

本发明还提供了一种微孢子虫通用检测试剂盒，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQID NO.5所示。

所述试剂盒的使用方法如下：

以样品DNA或cDNA为模板，利用引物MC-R和MC-F进行PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物判定结果，当琼脂糖凝胶上出现特异性地1077bp的DNA片段产物，即该样品感染了微孢子虫。

所述PCR反应体系（总体积20 μL）：

2×Taq Master Mix（反应缓冲液） 10 μL

10 μM上游引物 0.5 μL

10 μM下游引物 0.5 μL

模板 DNA 1 μL；

ddH₂O 补至20 μL。

其中， 2×Taq Master Mix（反应缓冲液）的组分为Taq DNA聚合酶，160 mM Tris-HCl，40 mM(NH₄)₂SO₄，3.0 mM MgCl₂，400 μM dNTP。

PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 45 s，72℃ 90 s，32个循环；72℃10 min。

本发明具有以下有益效果：

本发明公开了家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其在微孢子虫检测方面的应用，大量实验结果显示，根据该基因设计合适的引物，既能够通用的检测多种微孢子虫，又具有很好的检测灵敏性，是一个微孢子虫通用检测的良好靶点，对于其他昆虫来源的微粒子病病原检测有现实意义。

本发明还提供了一组微孢子虫通用检测引物，是根据家蚕微孢子虫Met-AP2基因序列设计的引物，该引物用于多种微孢子虫病的PCR检测，具有很好的通用性和灵敏性，能够通用的检测多种微孢子虫，尤其是对多种桑园主要微孢子虫，如家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫或柞蚕微孢子虫等，在微孢子虫的实际检测应用中具有广泛的应用价值和意义。

另外，本发明引物及相关试剂可组装成试剂盒，使用方便，节省时间，当样品被家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫或柞蚕微孢子虫等中的一种或几种感染时，都能够检测出阳性结果，对样品的筛选更加准确，不会出现漏检。

附图说明

图1为2047-F/2047-R、MC-F/MC-R、M6-F/M6-R、M7-F/M7-R四对引物的设计简图。

图2为Met-AP2基因编码蛋白的同源性比对结果。

图3为引物MC-F/MC-R的特异性检测结果，1.浙江小孢子微孢子虫、2.玉米螟微孢子虫、3.桑螟微孢子虫、4.菜粉蝶微孢子虫、5.小菜蛾微孢子虫、6.斜纹夜蛾微孢子虫、7.桑尺蠖微孢子虫、8.柞蚕微孢子虫、9.家蚕微孢子虫、10.家蚕中肠、11.ddH₂O、M.DL2000Maker。

图4为引物2047-F/2047-R的特异性检测结果，1.桑螟微孢子虫、2.玉米螟微孢子虫、3.桑尺蠖微孢子虫、4.斜纹夜蛾微孢子虫、5.小菜蛾微孢子虫、6.菜粉蝶微孢子虫、7.浙江小孢子微孢子虫、8.山东大孢子微孢子虫、9.柞蚕微孢子虫、10.家蚕微孢子虫、11.家蚕中肠、12.ddH₂O、M.DL1000 Maker。

图5为引物M5-F/M5-R和M6-F/M6-R的特异性检测结果，1～12为引物M5-F/M5-R的特异性检测结果，13～24为引物M6-F/M6-R的特异性检测结果；1/13.桑螟微孢子虫、2/14.玉米螟微孢子虫、3/15.桑尺蠖微孢子虫、4/16.斜纹夜蛾微孢子虫、5/17.小菜蛾微孢子虫、6/18.菜粉蝶微孢子虫、7/19.浙江小孢子微孢子虫、8/20.山东大孢子微孢子虫、9/21.柞蚕微孢子虫、10/22.家蚕微孢子虫、11/23.家蚕中肠、12/24.ddH₂O、M.DL1000 Maker。

图6为引物M7-F/M7-R的特异性检测结果，1.桑螟微孢子虫、2.玉米螟微孢子虫、3.桑尺蠖微孢子虫、4.斜纹夜蛾微孢子虫、5.小菜蛾微孢子虫、6.菜粉蝶微孢子虫、7.浙江小孢子微孢子虫、8.山东大孢子微孢子虫、9.柞蚕微孢子虫、10.家蚕微孢子虫、11.家蚕中肠、12.ddH₂O、M.DL1000 Maker。

图7为引物MC-F/MC-R对家蚕微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.85×10¹、1.85×10⁰、1.85×10^-1、1.85×10^-2、1.85×10^-3、1.85×10^-4、1.85×10^-5、1.85×10^-6μg/mL的家蚕微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图8为引物MC-F/MC-R对斜纹夜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.21×10¹、1.21×10⁰、1.21×10^-1、1.21×10^-2、1.21×10^-3、1.21×10^-4、1.21×10^-5、1.21×10^-6μg/mL的斜纹夜蛾微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图9为引物MC-F/MC-R对桑尺蠖微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.64×10¹、1.64×10⁰、1.64×10^-1、1.64×10^-2、1.64×10^-3、1.64×10^-4、1.64×10^-5、1.64×10^-6μg/mL的桑尺蠖微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图10为引物MC-F/MC-R对柞蚕微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为2.87×10¹、2.87×10⁰、2.87×10^-1、2.87×10^-2、2.87×10^-3、2.87×10^-4、2.87×10^-5、2.87×10^-6μg/mL的柞蚕微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图11为引物MC-F/MC-R对菜粉蝶微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.21×10¹、1.21×10⁰、1.21×10^-1、1.21×10^-2、1.21×10^-3、1.21×10^-4、1.21×10^-5、1.21×10^-6μg/mL的菜粉蝶微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图12为引物MC-F/MC-R对小菜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.21×10¹、1.21×10⁰、1.21×10^-1、1.21×10^-2、1.21×10^-3、1.21×10^-4、1.21×10^-5、1.21×10^-6μg/mL的小菜蛾微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图13为引物MC-F/MC-R对桑螟微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.8×10¹、1.8×10⁰、1.8×10^-1、1.8×10^-2、1.8×10^-3、1.8×10^-4、1.8×10^-5、1.8×10^-6μg/mL的桑螟微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图14为引物2047-F/2047-R对家蚕微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.85×10¹、1.85×10⁰、1.85×10^-1、1.85×10^-2、1.85×10^-3、1.85×10^-4、1.85×10^-5、1.85×10^-6μg/mL的家蚕微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图15为引物2047-F/2047-R对菜粉蝶微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.8×10¹、1.8×10⁰、1.8×10^-1、1.8×10^-2、1.8×10^-3、1.8×10^-4、1.8×10^-5、1.8×10^-6μg/mL的菜粉蝶微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图16为引物2047-F/2047-R对小菜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.21×10¹、1.21×10⁰、1.21×10^-2、1.21×10^-3、1.21×10^-4、1.21×10^-5、1.21×10^-6、1.21×10^-1μg/mL的小菜蛾微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图17为引物2047-F/2047-R对桑尺蠖微孢子虫和斜纹夜蛾微孢子虫的灵敏性检测结果；1～8分别为1.64×10¹、1.64×10⁰、1.64×10^-1、1.64×10^-2、1.64×10^-3、1.64×10^-4、1.64×10^-5、1.64×10^-6μg/mL的桑尺蠖微孢子虫DNA，9～16分别为1.21×10¹、1.21×10⁰、1.21×10^-1、1.21×10^-2、1.21×10^-3、1.21×10^-4、1.21×10^-5、1.21×10^-6μg/mL的斜纹夜蛾微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

图18为引物2047-F/2047-R对桑螟微孢子虫的灵敏性检测结果，1～8分别为1.8×10¹、1.8×10⁰、1.8×10^-1、1.8×10^-2、1.8×10^-3、1.8×10^-4、1.8×10^-5、1.8×10^-6μg/mL的桑螟微孢子虫DNA，M为DL1000 Maker。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1 家蚕微孢子虫Met-AP2基因的克隆

1、引物设计

基于基因组分析数据，对其他物种的Met-AP2基因进行分析，并结合各类微孢子虫基因组进行同源性分析，通过引物设计软件Primer5.0设计了一对引物MC-F/MC-R，引物序列如下所示：

上游引物MC-F（SEQ ID NO.4）：ATGAGGCCTATTGTTTTATCAGAAG；

下游引物MC-R（SEQ ID NO.5）：TTAAAAATCATCTCCTTTTGTAAGA。

2、PCR扩增

分别以家蚕微孢子虫的DNA和cDNA为模板，以引物MC-F/MC-R进行PCR扩增，反应体系和反应程序如下：

所述PCR反应体系（总体积20 μL）：

2×Taq Master Mix（反应缓冲液） 10μL

10μM上游引物 0.5 μL

10μM下游引物 0.5 μL

模板 DNA 1 μL；

ddH₂O 补至20 μL。

3、基因克隆

将PCR克隆的片段连接到PMD18-T载体上，然后送去公司（上海生工）进行测序，获得家蚕微孢子虫Met-AP2基因的DNA和cDNA全长序列。Met-AP2基因DNA序列如SEQ ID NO.1所示，Met-AP2基因cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。

另外，应用MEGA5软件通过与其他种微孢子虫基因组基因进行同源性分析，得到了家蚕微孢子虫Met-AP2基因序列编码区，与SEQ ID NO.2所示序列一致。

4、蛋白分析

Met-AP2基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。将其在微孢子虫数据库进行同源性比对，比对结果如图2所示。 BLAST分析结果表明，家蚕微孢子虫Met-AP2基因与库中蛋白的同源性并不高，而其对于微孢子虫又极为重要，因此该蛋白是一个新发现的基因蛋白。

实施例2 检测引物设计及PCR扩增方法的建立

1、引物设计

（1）在获得家蚕微孢子虫Met-AP2基因的基础上，应用Primer premier 5.0软件设计，设计了14对引物，各组引物序列如下：

上游引物MC-F（SEQ ID NO.4）：ATGAGGCCTATTGTTTTATCAGAAG；

下游引物MC-R（SEQ ID NO.5）：TTAAAAATCATCTCCTTTTGTAAGA。

上游引物2047-F（SEQ ID NO.6）：GGAGAAGGGTGATGGAATAG；

下游引物2047-R（SEQ ID NO.7）：CGACGGTAGATAACCACATA。

上游引物M6-F（SEQ ID NO.8）：CCCCTAAATGAGGCC；

下游引物M6-R（SEQ ID NO.9）：CCTATTCCATCACCCT。

上游引物M7-F（SEQ ID NO.10）：CCCCTAAATGAGGCC；

下游引物M7-R（SEQ ID NO.11）：TGGAAGCACGGTAAA。

上游引物M8-F（SEQ ID NO.12）：TTTCTGCTCCCCTAAA；

下游引物M8-R（SEQ ID NO.13）：TTCCATCACCCTTCTC。

上游引物M9-F（SEQ ID NO.14）：TTTCTGCTCCCCTAAA；

下游引物M9-R（SEQ ID NO.15）：CCTATTCCATCACCCT。

上游引物M10-F（SEQ ID NO.16）：TTTCTGCTCCCCTAAA；

下游引物M10-R（SEQ ID NO.17）：TCCATGATTCTCCCAT。

上游引物M11-F（SEQ ID NO.18）：AAACTTCCCTCTTACAC；

下游引物M11-R（SEQ ID NO.19）：TCGACGGTAGATAACC。

上游引物M12-F（SEQ ID NO.20）：GCTTACTATGATGGGTCT；

下游引物M12-R（SEQ ID NO.21）：TGAACACGGATACTTTA。

上游引物M13-F（SEQ ID NO.22）：ATCGCCTTGTACTCAT；

下游引物M13-R（SEQ ID NO.23）：TCGACGGTAGATAACC。

上游引物M14-F（SEQ ID NO.24）：AAATCGCCTTGTACTCA；

下游引物M14-R（SEQ ID NO.25）：CGACGGTAGATAACCACAT。

上游引物M15-F（SEQ ID NO.26）：AGGAACTCTACCCTTTA；

下游引物M15-R（SEQ ID NO.27）：TGAACACGGATACTTTA。

上游引物M16-F（SEQ ID NO.28）：AAATCGCCTTGTACTCA；

下游引物M16-R（SEQ ID NO.29）：TCGACGGTAGATAACC。

上游引物M17-F（SEQ ID NO.30）：TCTGATAAATCGCCTTGT；

下游引物M17-R（SEQ ID NO.31）：CGACGGTAGATAACCACAT。

（2）通过大量的特异性和灵敏性检测，最终选取了相对较好的7对引物，即MC-F和MC-R、2047-F和2047-R、M6-F和M6-R、M7-F和M7-R、M13-F和M13-R、M16-F和M16-R、M17-F和M17-R。

2、PCR扩增方法的建立

（1）样品总DNA的提取

采用QIAGEN 公司生产的植物DNA快捷迷你型抽提试剂盒（DNeasy Plant minikit试剂盒）抽提样品DNA，步骤如下（按照说明书进行）：

取20g样品放入研钵中，液氮充分研磨，将研磨后的粉末收集至1.5mL的离心管中。加入400 μL 裂解缓冲液AP1和4 μL Rnase A，涡旋混匀（400 μL裂解缓冲液AP1和4μLRnase A勿在使用前混合）；混匀后的溶液，65℃，孵育10 min（期间上下颠倒试管2~3次）；加130 μL 缓冲液AP2，混合后冰浴5 min；然后14,000 rpm，离心5 min；吸取上清于过滤柱（QIAshredder spin column）中的收集管，14,000rpm，离心2min；将离心管中上清液移至新管（勿搅动出现的残渣），加入1.5倍体积的AP3/E，移液器混合；将650 μL混合液移至吸附柱（DNeasy Mini spin column）中，4200 rpm，离心1 min；剩下的液体重复此步骤；将吸附柱放入新收集管中，加入500 μL缓冲液AW，4200 rpm，离心1 min；弃上清；再加入500 μL缓冲液AW，14000 rpm，离心2 min（保证收集管不接触到底部上清）；移收集管至1.5 mL或2 mL离心管中；加入40μL缓冲液AE洗脱，室温放置5 min；4200 rpm离心1 min；重复上一步（即加入40 μL缓冲液AE洗脱，室温放置5 min，4200 rpm离心1 min）；将提取好的总DNA置于-20℃冰箱保存备用。

（2）PCR扩增方法

以样品总DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增。

所述PCR反应体系（总体积20 μL）：

2×Taq Master Mix（反应缓冲液） 10 μL

10μM上游引物 0.5 μL

10μM下游引物 0.5 μL

模板 DNA 1 μL；

ddH₂O 补至20 μL。

（3）结果判断

将PCR反应结束后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据是否扩增到目的条带（DNA片段）判定样品是否感染了微孢子虫。当能特异性地扩增出目的条带，即可判断该样品感染了微孢子虫。

实施例3 引物特异性检测

1、分别以家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫、柞蚕微孢子虫、浙江小孢子微孢子虫、玉米螟微孢子虫或山东大孢子微孢子虫的DNA为模板，利用实施例2的PCR方法，对实施例2筛选的7对引物的检测特异性进行研究。

2、结果显示，只有MC-F和MC-R、2047-F和2047-R、M5-F和M5-R、M6-F和M6-R、M7-F和M7-R这五对引物能够检测到的微孢子虫种类较多，分别能检测到7种、6种、5种、5种、4种微孢子虫。具体如附图3～6所示。

其中，MC-F和MC-R所检测的微孢子虫种类最多，能同时检测到家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫和柞蚕微孢子虫7种常见的桑园主要微孢子虫，检测通用性最好，在实际样品的微孢子虫检测中有很好的应用前景。

实施例4 引物灵敏性检测

1、分别以家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫、柞蚕微孢子虫、浙江小孢子微孢子虫、玉米螟微孢子虫或山东大孢子微孢子虫的DNA为模板，利用实施例2的PCR方法，对实施例2筛选的7对引物的检测灵敏性进行研究。

2、检测结果

（1）引物MC-F/MC-R对7种桑园主要微孢子虫的检测灵敏度结果分别如附图7～13所示。其中，对桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫和柞蚕微孢子虫的检测灵敏度最高，分别可达到1.64×10^-4、1.21×10^-4、2.87×10^-4μg/mL，对家蚕微孢子虫的检测灵敏度亦可达到1.85×10^-2μg/mL。

（2）引物2047-F/2047-R对家蚕微孢子虫和菜粉蝶微孢子虫的检测灵敏度最好，分别达到1.85×10^-2、1.8×10^-1μg/mL，对斜纹夜蛾微孢子虫和小菜蛾微孢子虫的检测灵敏度均为1.21μg/mL，对桑螟微孢子虫和桑尺蠖微孢子虫的检测灵敏度分别为18、16.4μg/mL，具体分别如附图14～18所示。

（3）引物M5-F/M5-R对家蚕微孢子虫的检测灵敏度最好，为18.5μg/mL。

引物M6-F/M6-R对菜粉蝶微孢子虫、家蚕微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫和小菜蛾微孢子虫的检测灵敏度分别为1.21×10^-2、1.85×10^-1、1.21×10^-1、1.64×10^-1、12.1μg/mL。

引物M7-F/M7-R对柞蚕微孢子虫、家蚕微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫的检测灵敏度分别为2.87×10^-2、1.85、1.21、16.4μg/mL。

（4）另外，引物M13-F/M13-R、M16-F/M16-R、M17-F/M17-R等不仅检测通用性差，检测灵敏性也很差，能检测到的微孢子虫DNA的浓度基本都大于1.0×10^-1μg/mL。

综上所述，MC-F和MC-R所检测的微孢子虫种类最多，能同时检测到家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫和柞蚕微孢子虫7种常见的桑园主要微孢子虫，检测通用性最好，而且检测灵敏性也最好，在实际样品的微孢子虫检测中有很好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 家蚕微孢子虫Met-AP2基因及其应用

<130>

<160> 31

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1278

<212> DNA

<213> Met-AP2基因DNA序列

<400> 1

accacgtcat gttttttaat ctttttgtat tttttttctg ctcccctaaa tgaggcctat 60

tgttttatca gaagtcgaag aaaaaccaat agaattttta gaaaaagacg agaaatacat 120

aaaaaacgtc ttttatgaca aaaacaataa tgaaataccc aatgaacttg aaaatgacat 180

tcttttagaa gcgaggcgtg cagctgaagc gcatagaaga ataagatata aagtacaaaa 240

tttaattaaa cccgggatac ctataataga tatcgttaat tgtatagaaa attcaacaag 300

aactctttta aagggggaga agggtgatgg aatagggttc cctgccggga tgagtgctaa 360

tgattgtgct gctcatttta ccgtgcttcc agacgataac actacgactt tacaagaaaa 420

tgatgtatta aaaatagatt ttgggacaca tgttaatggg agaatcatgg actgtgcttt 480

tactgtggct tttaatcctc aatttgaaca actactttta gctagcaaag aagctactta 540

cgctggagtt aaagctttag gtgttgatgt aagattatgt gaaataggaa gagacattca 600

tgaagtgatg aagagctttg aagttcagat tgatggagtt acttacccta taaaacctat 660

ttatgattta catggtcata gcatttctca gtatacaata cacgccgggc agtctatacc 720

ttgttatgat aacggggata ctacaagaat taaggaaaat actttctatg ctgtagaaac 780

ttttgcttct acaggtaaag gtcgaatttc tgataaatcg ccttgtactc attacatttt 840

gaacaaaaac aaacagagaa aattatttga caaaaactgt attgctgtct ataattttat 900

aaaagataat ttaggaactc taccctttag tcctaaacat attgatcatt atggaattat 960

caaacttccc tcttacacat acattaagat gcttactatg atgggtctta ttacccctta 1020

tcctcccctt aatgatatta aaggatcgta tgttgcacaa tttgaacata caatttatgt 1080

tacagaaaac ggtaaagaaa ttcttacaaa aggagatgat ttttaataaa attttaacaa 1140

aagaggagtt tgttgtattt tttataattt aatgaaaagt ttatgtggtt atctaccgtc 1200

gaaatagatc gatttatttt ttaaatttaa agtatccgtg ttcaataata tgaaggtttt 1260

tttttttttt tttttttt 1278

<210> 2

<211> 1077

<212> DNA

<213> Met-AP2基因cDNA序列

<400> 2

atgaggccta ttgttttatc agaagtcgaa gaaaaaccaa tagaattttt agaaaaagac 60

gagaaataca taaaaaacgt cttttatgac aaaaacaata atgaaatacc caatgaactt 120

gaaaatgaca ttcttttaga agcgaggcgt gcagctgaag cgcatagaag aataagatat 180

aaagtacaaa atttaattaa acccgggata cctataatag atatcgttaa ttgtatagaa 240

aattcaacaa gaactctttt aaagggggag aagggtgatg gaatagggtt ccctgccggg 300

atgagtgcta atgattgtgc tgctcatttt accgtgcttc cagacgataa cactacgact 360

ttacaagaaa atgatgtatt aaaaatagat tttgggacac atgttaatgg gagaatcatg 420

gactgtgctt ttactgtggc ttttaatcct caatttgaac aactactttt agctagcaaa 480

gaagctactt acgctggagt taaagcttta ggtgttgatg taagattatg tgaaatagga 540

agagacattc atgaagtgat gaagagcttt gaagttcaga ttgatggagt tacttaccct 600

ataaaaccta tttatgattt acatggtcat agcatttctc agtatacaat acacgccggg 660

cagtctatac cttgttatga taacggggat actacaagaa ttaaggaaaa tactttctat 720

gctgtagaaa cttttgcttc tacaggtaaa ggtcgaattt ctgataaatc gccttgtact 780

cattacattt tgaacaaaaa caaacagaga aaattatttg acaaaaactg tattgctgtc 840

tataatttta taaaagataa tttaggaact ctacccttta gtcctaaaca tattgatcat 900

tatggaatta tcaaacttcc ctcttacaca tacattaaga tgcttactat gatgggtctt 960

attacccctt atcctcccct taatgatatt aaaggatcgt atgttgcaca atttgaacat 1020

acaatttatg ttacagaaaa cggtaaagaa attcttacaa aaggagatga tttttaa 1077

<210> 3

<211> 358

<212> PRT

<213> Met-AP2基因编码氨基酸序列

<400> 3

Met Arg Pro Ile Val Leu Ser Glu Val Glu Glu Lys Pro Ile Glu Phe

1 5 10 15

Leu Glu Lys Asp Glu Lys Tyr Ile Lys Asn Val Phe Tyr Asp Lys Asn

20 25 30

Asn Asn Glu Ile Pro Asn Glu Leu Glu Asn Asp Ile Leu Leu Glu Ala

35 40 45

Arg Arg Ala Ala Glu Ala His Arg Arg Ile Arg Tyr Lys Val Gln Asn

50 55 60

Leu Ile Lys Pro Gly Ile Pro Ile Ile Asp Ile Val Asn Cys Ile Glu

65 70 75 80

Asn Ser Thr Arg Thr Leu Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Gly Ile Gly

85 90 95

Phe Pro Ala Gly Met Ser Ala Asn Asp Cys Ala Ala His Phe Thr Val

100 105 110

Leu Pro Asp Asp Asn Thr Thr Thr Leu Gln Glu Asn Asp Val Leu Lys

115 120 125

Ile Asp Phe Gly Thr His Val Asn Gly Arg Ile Met Asp Cys Ala Phe

130 135 140

Thr Val Ala Phe Asn Pro Gln Phe Glu Gln Leu Leu Leu Ala Ser Lys

145 150 155 160

Glu Ala Thr Tyr Ala Gly Val Lys Ala Leu Gly Val Asp Val Arg Leu

165 170 175

Cys Glu Ile Gly Arg Asp Ile His Glu Val Met Lys Ser Phe Glu Val

180 185 190

Gln Ile Asp Gly Val Thr Tyr Pro Ile Lys Pro Ile Tyr Asp Leu His

195 200 205

Gly His Ser Ile Ser Gln Tyr Thr Ile His Ala Gly Gln Ser Ile Pro

210 215 220

Cys Tyr Asp Asn Gly Asp Thr Thr Arg Ile Lys Glu Asn Thr Phe Tyr

225 230 235 240

Ala Val Glu Thr Phe Ala Ser Thr Gly Lys Gly Arg Ile Ser Asp Lys

245 250 255

Ser Pro Cys Thr His Tyr Ile Leu Asn Lys Asn Lys Gln Arg Lys Leu

260 265 270

Phe Asp Lys Asn Cys Ile Ala Val Tyr Asn Phe Ile Lys Asp Asn Leu

275 280 285

Gly Thr Leu Pro Phe Ser Pro Lys His Ile Asp His Tyr Gly Ile Ile

290 295 300

Lys Leu Pro Ser Tyr Thr Tyr Ile Lys Met Leu Thr Met Met Gly Leu

305 310 315 320

Ile Thr Pro Tyr Pro Pro Leu Asn Asp Ile Lys Gly Ser Tyr Val Ala

325 330 335

Gln Phe Glu His Thr Ile Tyr Val Thr Glu Asn Gly Lys Glu Ile Leu

340 345 350

Thr Lys Gly Asp Asp Phe

355

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 上游引物MC-F

<400> 4

atgaggccta ttgttttatc agaag 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 下游引物MC-R

<400> 5

ttaaaaatca tctccttttg taaga 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 上游引物2047-F

<400> 6

ggagaagggt gatggaatag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 下游引物2047-R

<400> 7

cgacggtaga taaccacata 20

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 上游引物M6-F

<400> 8

cccctaaatg aggcc 15

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M6-R

<400> 9

cctattccat caccct 16

<210> 10

<211> 15

<212> DNA

<213> 上游引物M7-F

<400> 10

cccctaaatg aggcc 15

<210> 11

<211> 15

<212> DNA

<213> 下游引物M7-R

<400> 11

tggaagcacg gtaaa 15

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 上游引物M8-F

<400> 12

tttctgctcc cctaaa 16

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M8-R

<400> 13

ttccatcacc cttctc 16

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> 上游引物M9-F

<400> 14

tttctgctcc cctaaa 16

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M9-R

<400> 15

cctattccat caccct 16

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 上游引物M10-F

<400> 16

tttctgctcc cctaaa 16

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M10-R

<400> 17

tccatgattc tcccat 16

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物M11-F

<400> 18

aaacttccct cttacac 17

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M11-R

<400> 19

tcgacggtag ataacc 16

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物M12-F

<400> 20

gcttactatg atgggtct 18

<210> 21

<211> 17

<212> DNA

<213> 下游引物M12-R

<400> 21

tgaacacgga tacttta 17

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> 上游引物M13-F

<400> 22

atcgccttgt actcat 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M13-R

<400> 23

tcgacggtag ataacc 16

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物M14-F

<400> 24

aaatcgcctt gtactca 17

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 下游引物M14-R

<400> 25

cgacggtaga taaccacat 19

<210> 26

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物M15-F

<400> 26

aggaactcta cccttta 17

<210> 27

<211> 17

<212> DNA

<213> 下游引物M15-R

<400> 27

tgaacacgga tacttta 17

<210> 28

<211> 17

<212> DNA

<213> 上游引物M16-F

<400> 28

aaatcgcctt gtactca 17

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 下游引物M16-R

<400> 29

tcgacggtag ataacc 16

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 上游引物M17-F

<400> 30

tctgataaat cgccttgt 18

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 下游引物M17-R

<400> 31

cgacggtaga taaccacat 19

Claims

1.家蚕微孢子虫Met-AP2基因在微孢子虫检测方面的应用，其特征在于，所述微孢子虫检测是指不以疾病诊断为目的的微孢子虫检测；所述家蚕微孢子虫Met-AP2基因的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，以Met-AP2基因为靶基因设计引物进行PCR扩增，根据扩增DNA片段的结果判定样品中是否含有微孢子虫。

3.一种微孢子虫通用检测引物在微孢子虫检测方面的应用，其特征在于，所述微孢子虫检测是指不以疾病诊断为目的的微孢子虫检测，所述微孢子虫通用检测引物包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求1~3任一所述应用，其特征在于，所述微孢子虫为家蚕微孢子虫、桑螟微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、小菜蛾微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫或柞蚕微孢子虫中的一种或几种。

5.一种微孢子虫通用检测试剂盒，其特征在于，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

6.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法如下：

以样品DNA或cDNA为模板，利用引物MC-F和MC-R进行PCR反应，反应结束后凝胶电泳检测扩增产物，根据扩增产物判定结果，当琼脂糖凝胶上出现特异性1077bp的DNA片段产物，即该样品感染了微孢子虫。