CN107245492B - 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 - Google Patents

家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107245492B
CN107245492B CN201710301862.1A CN201710301862A CN107245492B CN 107245492 B CN107245492 B CN 107245492B CN 201710301862 A CN201710301862 A CN 201710301862A CN 107245492 B CN107245492 B CN 107245492B
Authority
CN
China
Prior art keywords
nosema bombycis
ile
leu
asn
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710301862.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107245492A (zh
Inventor
刘吉平
李峙贤
孙勋勋
杨宏宇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Agricultural University
Original Assignee
South China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Agricultural University filed Critical South China Agricultural University
Priority to CN201710301862.1A priority Critical patent/CN107245492B/zh
Publication of CN107245492A publication Critical patent/CN107245492A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107245492B publication Critical patent/CN107245492B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用。本发明首先克隆获得了一种家蚕微孢子虫DNA2基因，其全长序列如SEQ ID NO.1所示，ORF框序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。并以此为基础提供了一组特异性检测家蚕微孢子虫的特异性检测引物组，对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，在家蚕微孢子虫的特异性检测方面具有很好的应用前景。而且，家蚕微孢子虫DNA2基因作为一个新发现的蛋白基因，具有潜在的功能应用，本发明DNA2基因的发现对于治疗和检测的理论验证和生产实践均有一定的意义。

Description

家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种来源于家蚕微孢子虫的解旋酶和核酸酶DNA2基因(DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease DNA2-like)及其应用。
背景技术
家蚕微孢子虫病是病原家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，N.b)经食下传染或胚卵(胎)传染，使家蚕感染发病的一种毁灭性疫病。家蚕微孢子虫是一类细胞内专性寄生的真核生物，之前一直属于原虫，近些年被划分到真菌类。因其具有垂直传播的特点使成为了家蚕病原微生物中最受人关注的一种，也因此成为家蚕病原微生物中唯一需要检疫的疫病。从19世纪发现到现在，家蚕微孢子虫病对各国的养蚕业造成巨大的损失。除此之外，其他不同的微孢子虫也可侵害其他昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。
最初人们对家蚕微粒子病的检测主要根据显微镜下组织研磨液中的微孢子虫的形态和大小进行，但是显微镜镜检的缺点是对操作人员的技术及经验要求较高，很难区分不同种属的微孢子虫及其类似物。
随着PCR技术的普及，人们开始使用PCR方法来检测家蚕微孢子虫并且达到了较高的灵敏度。现有技术中常用的靶基因SSUrRNA，研究发现，基于16SrDNA保守区段设计的引物检测蚕卵微孢子虫，经常会有非目的条带出现，推测蚕卵抽提物中可能存在某种抑制物质干扰了对病原基因DNA的PCR有效扩增。发明人团队也先后发现了多种适用于家蚕微粒子病PCR检测的靶基因，具有较好的检测效果，各有优势和缺陷。
发明内容
本发明的目的是提供一种家蚕微孢子虫DNA2基因。
本发明另一目的是提供该基因在检测家蚕微孢子虫方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先获得了一个家蚕微孢子虫DNA2基因，其全长序列如SEQ ID NO.1所示。其ORF框序列如SEQ ID NO.2所示。
所述家蚕微孢子虫DNA2基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
同时，本发明设计了用于检测的DNA2基因的引物，并对一些其他桑园昆虫进行了了DNA2基因的特异性检测，结果显示，检测引物F/R对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，因此，如下所述应用均应在本发明的保护范围之内。
家蚕微孢子虫DNA2基因在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用。
家蚕微孢子虫DNA2基因在制备家蚕微孢子虫特异性检测试剂方面的应用。
一种特异性检测家蚕微孢子虫的检测引物F/R，上下游引物序列分别如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示。
一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，包括如下步骤：以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以权利要求6所述的检测引物F/R进行实时荧光定量PCR检测；当扩增结果显示为一条特异性388bp的条带时，则待测样品中含有或感染了家蚕微孢子虫。
其中，所述实时荧光定量PCR检测的PCR体系(20μL)为：SYBR Green Mix 10μL，Forwrd primer(10pmol/μL)0.5μL，Reverse primer(10pmol/μL)0.5μL，cDNA 2μL，ddH2O 7μL。
所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40个循环；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。
另外，所述方法在家蚕微孢子虫特异性检测方面的应用，也在本发明的保护范围之内。
不同的微孢子虫也可侵害其他昆虫如蜜蜂、蝗虫，水产如鱼，哺乳动物如兔、狗，甚至也可以感染到人类，造成人角膜炎、脑炎、肠炎等疾病。蚕桑生产环境较为复杂，混杂有其他种类的微孢子虫。本发明DNA2基因的发现对于治疗和检测的理论验证和生产实践均有一定的意义。
本发明具有以下有益效果：
本发明克隆获得了一种家蚕微孢子虫DNA2基因，并以此为基础提供了一组特异性检测家蚕微孢子虫的特异性检测引物组，对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和灵敏性，在家蚕微孢子虫的特异性检测方面具有很好的应用前景。
而且，家蚕微孢子虫DNA2基因作为一个新发现的蛋白基因，具有潜在的功能应用，为家蚕微孢子虫的相关研究提供了一个新的素材和基础。
附图说明
图1为家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白氨基酸系统发育树(N-J)。注：Bootstrap＝1000,图中有下划线的是本研究测定的家蚕微孢子虫DNA2蛋白氨基酸序列。
图2为家蚕微孢子虫DNA2蛋白与其他物种DNA2蛋白多重比对；1.家蚕微孢子虫DNA2蛋白，2.蜜蜂微孢子虫BRL01蛋白，3.蜜蜂微孢子虫DNA解旋酶蛋白，4.兔脑炎原虫DNA复制解旋酶蛋白，5.兔脑炎原虫DNA解旋酶蛋白，6.兔脑炎原虫EcunIII-L蛋白，7.肠脑炎微孢子虫DNA解旋酶，8.线虫DNA复制解旋酶蛋白。
图3为家蚕微孢子虫DNA2基因的PCR引物设计简图。
图4中A、B、C分别为引物1F/R、2F/R、3F/R对几种不同的微孢子虫特异性PCR扩增的结果；注：M:DL2000Marker；泳道：1.斜纹夜蛾微孢子虫；2.桑螟微孢子虫；3.玉米螟微孢子虫；4.柞蚕微孢子虫；5.浙江小孢子；6.家蚕微孢子虫；7.正常家蚕中肠(阴性对照)；8.灭菌水。
图5为检测引物F/R对几种不同的微孢子虫特异性PCR扩增的结果；注：M:DL2000Marker；泳道：1.斜纹夜蛾微孢子虫；2.桑螟微孢子虫；3.玉米螟微孢子虫；4.柞蚕微孢子虫；5.浙江小孢子；6.家蚕微孢子虫；7.正常家蚕中肠(阴性对照)；8.灭菌水。
图6为检测引物F/R对家蚕微孢子虫的检测灵敏性；注：M:DL2000Marker；泳道：1.10-1ng/ul DNA；2.10-2ng/ul DNA；3.10-3ng/ul DNA；4.10-4ng/ul DNA；4.10-4ng/ul DNA；5.10-5ng/ul DNA；6.无菌水。
图7为感病家蚕中肠中N.b DNA2基因的表达水平。
图8为感病家蚕蚕卵中N.b DNA2基因的表达水平。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1 DNA2基因克隆
1、引物设计
同源性分析预测：通过与其他种微孢子虫基因组基因进行同源性分析等手段，设计了家蚕微孢子虫DNA2基因序列编码区的扩增引物ORF-F/ORF-R：
引物ORF-F(SEQ ID NO.4所示)：
5'ATTATCATATGAACAACAATAAGTC 3'；
引物ORF-R(SEQ ID NO.5所示)：
5'ATATGAAGCTTCATAAAATCTCTAAT 3'。
2、PCR扩增和克隆
利用家蚕微孢子虫基因组DNA为模板，以引物ORF-F/ORF-R进行PCR扩增目的基因，将克隆的片段连接到PET28A载体上，然后送去公司(上海生工)进行测序，对测序结果进行验证分析后，获得家蚕微孢子虫DNA2基因全长序列如SEQ ID NO.1所示，编码区序列如SEQID NO.2所示。
另外研究得出，家蚕微孢子虫DNA2基因所编码蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。
3、序列同源性分析
通过在微孢子虫数据库进行同源性比对，BLAST分析表明家蚕微孢子虫DNA2基因与库中蛋白的同源性不高(如图1和2所示)，而其对于微孢子虫又极为重要，因此该基因是一种新发现的蛋白基因，家蚕微孢子虫DNA2基因是家蚕微孢子虫的解旋酶和核酸酶基因，在DNA的复制、修复、重组、转录等多个生理过程中具有不可替代的作用。
实施例2利用DNA2基因检测微孢子虫
1、设计了如表1所示的检测引物组(如图3所示)：
表1家蚕微孢子虫(广东株)转录组的DNA2基因验证及检测的PCR引物
2、检测特异性
以几种不同的微孢子虫DNA模板，利用上述引物进行PCR检测，结果显示，表1中的引物组均对家蚕微孢子虫具有检测特异性。如图4和图5所示。
3、检测灵敏性
灵敏性检测结果显示，检测引物F/R的灵敏度最好(如图6所示)，家蚕微孢子虫DNA2基因作为检测桑园环境中家蚕微孢子虫特异性引物，能检测到浓度为10-4ng/ul的DNA。
而且，检测引物F/R的扩增片段较短，更利于检测。
因此，检测引物F/R对家蚕微孢子虫具有很好的特异性和检测灵敏性，在家蚕微孢子虫的检测方面具有很好的应用前景。
实施例3 DNA2基因表达水平
1、检测感染家蚕微孢子虫的家蚕中肠和蚕卵中N.b DNA2基因的表达水平，结果分别如图7和图8所示。
图7：感病家蚕中肠中N.b DNA2基因在各时间段的相对表达量如下：
6h：1.55；12h：16.67；24h：118.96；48h：194.99:；72h：17.17；96h：5.49；120h：25.89；144h：4.33；168h：2.14；192h：1.32；216h：1.20；240h：1.03；对照组表达量：1。
图8：感病家蚕蚕卵中N.b DNA2基因在各时间段的相对表达量如下：
1h：1.06；12h：7.48；24h：55.83；48：13.66；72h：5.91；96h：3.39；120h：2.01；144h：1.52；168h：1.30；192h：1.23；对照组表达量：1。
结果显示，家蚕微孢子虫感染家蚕以后，可在早期就及时的从中肠何蚕卵中检测到家蚕微孢子虫，结合实时荧光定量PCR检测，可在
综上研究及结果，本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测家蚕微孢子虫的方法，具体如下：
以待测样品的总DNA、中肠DNA、或蚕卵DNA为模板，以检测引物F/R(序列如SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.7所示)进行实时荧光定量PCR检测；当扩增结果显示为一条特异性388bp的条带时，则待测样品中含有或感染了家蚕微孢子虫。
其中，所述实时荧光定量PCR检测的PCR体系(20μL)为：SYBR Green Mix 10μL，Forwrd primer(10pmol/μL)0.5μL，Reverse primer(10pmol/μL)0.5μL，cDNA 2μL，ddH2O 7μL。
所述实时荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃2min；95℃10s，55.5℃30s，72℃30s，40个循环；95℃1min，55.5℃30s，95℃30s，60℃15s。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南农业大学
<120> 家蚕微孢子虫DNA2基因及其应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 5582
<212> DNA
<213> 家蚕微孢子虫DNA2基因全长
<400> 1
ctagagtaga aattcgaaat ttgaaaattt tgttgattta aattttaatc cctaagaatg 60
aacaacaata agtcgcctca ttctttcaat tcgctaagaa aaagtcctat acgaaagaaa 120
atgaaagtcg tgtatgaatc aaatatttcg ttctgggaca atgtaaaaga tacaaattgt 180
gaagaggacg cacactcaga aagtgacttt actgaactgt catttacatc gttcgaaatt 240
gaacaatcaa aaaaatcttt aaaaaacatc acttctgtca aatttattat tagagaaata 300
gaaagagaag aagattgtgt tcgtttaatc agtaatgatg ttgtgtgtac agtttatgga 360
gaatggagtg agttagatta tgagatagac acaaaaataa ccgtaactcc ttgtatttgt 420
tgtacaaatg aactggaaag agatttcata gattcaaaga tacacattaa agttgatgat 480
aacactaatt atctatttat tgaagacgat cttatgacta taactaattt atgttcctct 540
attcggtgtt acaataagcc aatggttaat agtaaagtag cagatataaa ctttgaattt 600
agagacaagt gtttggttaa tggaattata ttacacgatg ttatggaaga agtgctgata 660
aacaaaaatt acactcttgc gtttattaat gaagcagtaa gaaaagcaac agaaaacaat 720
gcactaaata tatacgcgtg taatacaacg gaaagaagtg ttaagaagga tatttttgcc 780
agcctaacca atataagtcg ttttaaaaga cataatcttg ttttcgaaca gtctgaaaag 840
cgaattgttt ctttgatttc taatttgaaa ggaaatatcg atgttgttgg agaaaatatt 900
gttttagaaa ttaagagtgg taaaactatg gatgtttctc ataaggcgca agtcatgatg 960
tacaatttgc ttatgaaaga aagatttctt aaggattttg attgttattt gtattacatt 1020
gcaaatgata atcttgttaa aatagacgtt aagcactcag aggttaaaag tctatttata 1080
cggcgaaata aattaacttt gaagaacgat attgaaattt gcaactgtca agcctttgaa 1140
ccttgccaaa ttataaacaa aattttgagt ctgccaaatg accacttttt aaaacaaact 1200
tgggacgcta ttgaaaagga agaaaattat agactaaagg aaacatggaa caatgttact 1260
tttaaaaaac agaatgacac aaatgttatt tttaaatttg attttgagcc ttcaattatt 1320
gatgatattt acattaatat ttacaaccaa gatttaataa aattgtgtaa aggtatcata 1380
acatcctttg aaaataatat tatgatggtt tctcttagtg aaagaatcaa tttagaaaat 1440
aattctcttt attttatatc ttttggctgt aatgatttat tttttaagta tttaagatac 1500
tcactaatta acattgcttt ctttcgttat gtcgataaca gtaatggcca cggttttaaa 1560
ttgccaggtg aggaatttca attaggaaac gaaagtgaca ttgaagattc tgatagttcc 1620
gcagaatctt tagattgtga tagtttagaa tctaatgaaa aatctaataa tgagatcaca 1680
aatcaattgg acgatgtttt tatgaaaacc attgatacga cccccataaa aaacaataat 1740
ataactttaa tcaggaatgt ttcaagtagt ttagatttga atactgctct tttaaaaaac 1800
tcaaattcta gtttagattc ttcttttcaa tattttacac caccaacacc accaaaagtg 1860
acttacaaat atcaaattcc tgaaatttac aaagagcaat tttttaattt gaacgaagag 1920
caaaaaaact cgttgttttt atcacttaat tgtgaaaatt acaaaataat tcatggcatg 1980
cctggcactg gtaaaagcac aatcatcgtt cttttgatta agatattaat ttctcttaat 2040
tttaaagttt tacttgtttg ttacaccaat ttagccatta caaatattct tgataaatta 2100
aaaacggtca gatattacag agcaagaaaa gaaaaaatag attttaaatc atcagaggaa 2160
gtcaaaaaat attatgccaa tatcgattta gtggctagta catgtttcgg attttcagat 2220
acaattttta ttgatagaaa atttgatttt tgtattatcg acgaaggttc acaacaacat 2280
cttcttttaa ctttaattcc tgtgtcatta agcaatagat ttgtggtttt tggcgatcat 2340
ctacaactta agcctcttgt caaatcgtgt aaatttttat caacgagttt gttcgaatac 2400
cttttagatg aagatcattc tgaattacac acacaatata gaatgggaaa aaatattatg 2460
aggttatcta atgaattatt ttatgaaaac aaacttattg cagcaaatga tttcaaagat 2520
aaggttgtat ttattgattc tacagatata aattattctg agttcattag caatgtcaag 2580
aattcaacaa ttctctgtta ttttaattct caggttaaac ttacaaaact gcatacaaag 2640
tgccaagttg agactatcga cagatttcaa ggtagtgaag atgaaaatgt gattattgta 2700
tttgatccag tcagttcgtg tgaggttatg gagagtcatg aaagacttaa tgttgcgtta 2760
acaagagctc gaaagagttt gactttagtt ggagataaag aaaaaatgat ggaaattggt 2820
attttaagga gattattaga gattttatga aaaagaaatt tgttcggttt aattaaaagt 2880
taatatgttc ttttaaatga aagttaatat gttttggtta aatttaacat taaaatcctt 2940
tttattatca ttttttaatt ggttaagtga aaaccaatca aaatttgact aatttaaatt 3000
atcaactcta caaaacacat ggctgcatct gagaacaaca gtaacaaatc cgaaaatggt 3060
aaagatgaga ataatagaga agagaaaaaa gatgaaaaca gcagagaaaa gaaggaagat 3120
gaaaacaaaa tagaatttcg taatgacaaa aaatttccag aagaaatcaa agaagagatt 3180
agaaaggcct tacttcctga attagataag ccttctccaa cgacaatcag taaaaatttg 3240
tctaaaatgc ttaataaaaa ttttggtgct ggttggaatg tcgtggcagg aggtcattat 3300
tcgggaagtt tcacgtatat cgatgggatg tacacggaga ttaaggcgaa agatttagtt 3360
atttcaattt ttaaaattta cataccacaa aaataaacga attattttta aaaaaaggca 3420
gtttaaataa tgttaaagtt tacttaacta actttgaact ttgaagtagt cacaaattaa 3480
gatttatgtc cactgttgtc cctttgttat caacattaag cgtcataacc agttgctttg 3540
taaacatttt ttagtcaaaa cttttattac ttaattcgct taatttcatt gttgtagtta 3600
gtaatagaaa aaatcttatt aggaggatac tcacctgtaa ctgtccttgt tccatctgcg 3660
tgtatattct caaaatattg atcatcttca gtcaaaatat tcaaagccac atcttttata 3720
cagttaattt caacaccact agtctcaaaa atagccacat tacatccatt cacacccact 3780
ggacatgtaa caacttcaac tggatctccg tacaagtctt ttatctcctt ttttatttgt 3840
ttttccggat tttttatcgt aattctcata tccacacgac aagaatggca agacatttca 3900
taattgcact tatagacgtc tttttcagat ttatgacttt cattggttaa gattacaatt 3960
ttatcgtgtt tcacattgca acaagtgcaa gtgacctccg ctgggaatgt aagttctgca 4020
ttcatacctt gtatgttgct aaaatcgcct gttatgttta aggaatactt gatcatttag 4080
ggctcaagaa atttgtaaac aaaataataa aaagaaataa aggaggcatt agtgtagaag 4140
taatgtaaac agttttcttg tagatagatt aaaaatctta ataagcttct ttaaaaaaaa 4200
tatccgtgta acccccttac caaaatatgc tccttaaaga aatcaaacca attcacttcg 4260
gattttacaa aaagaaagcg ccaaaaaccg atttaatcgt ggaattatat tcaaaagacg 4320
aattaatttg tgacgtaaac gttttgaaaa cgatctcgaa atattccaag gagattatcg 4380
tgtcaagaaa gtgtagagat ttcgtcatag tttacaatga aaaaacttta ataaaattca 4440
aaccatcaaa acgcacgtgt tacgacatta agaaaattta caaaaagttt gttaattgtc 4500
aatatttgga ttatttaatt ataaacgtag aaggtttatt ttatagtatg agcagattaa 4560
accaatggaa ttactctgta aatttatatt tgtctcttga aaataattat aaagattatt 4620
ctgtagaaga agtgtttgat gaaccaagtc ggttattatg tgatgtttat tatgttaaaa 4680
atgacgaaat taaagacgac aagattaaag atggtgaggt taaggatgaa aatgttgata 4740
aaggagagaa tgaggttaag gaatccacaa ttttatctaa aatagacaca tcttctcaaa 4800
ttaataaacc aattaatact cgttcaaatg ctaacacttt ctcgaatttc acaattgtcg 4860
aaaccgatta cgtcactttg tttgatttaa aagatttaga taattttaat attaatccaa 4920
aaccaacttt aaatgagcca gtcgtgatag acgtaacaaa tgagccagcc aagcaggaaa 4980
acagcccaag ggtcataaaa ttttatgagg gaaaaagaag ttttatggac aaattcgtag 5040
atttatttat taaaaaaaat atctcaacca aaaaacatac gataaaatac gggaaaagga 5100
aaggaaataa aatttactgc cacactaaac caatagaatc actcgaattt agtgattcaa 5160
aaacagtaac ttttttaatt aatcttatat ctaaattaag aaatggtcca gttgatttta 5220
ttgaaataga ttgtggtgcc ttgatttggt tggtacgaaa caacaaaggt cttttcttat 5280
tttcaaattt cgaagttgag gagaaagttt caaattttgt caaagatttt cacaatgttt 5340
tccaaaaaat aaaagagaat tgagtgaaag agtatattca ggatatggaa aatatggaat 5400
atataagata gaaaaataag ctttcttttt atctttataa ttacttactg tcataataca 5460
cttttcacct cactttttaa cacacttctc ttttattttt tggaaaacat tgtgaaaatc 5520
tttgacaaaa tttgaaactt tctcctcaac ttcgaaattt gaaaataaga aaagaccttg 5580
gt 5582
<210> 2
<211> 2793
<212> DNA
<213> 家蚕微孢子虫DNA2基因ORF框序列
<400> 2
atgaacaaca ataagtcgcc tcattctttc aattcgctaa gaaaaagtcc tatacgaaag 60
aaaatgaaag tcgtgtatga atcaaatatt tcgttctggg acaatgtaaa agatacaaat 120
tgtgaagagg acgcacactc agaaagtgac tttactgaac tgtcatttac atcgttcgaa 180
attgaacaat caaaaaaatc tttaaaaaac atcacttctg tcaaatttat tattagagaa 240
atagaaagag aagaagattg tgttcgttta atcagtaatg atgttgtgtg tacagtttat 300
ggagaatgga gtgagttaga ttatgagata gacacaaaaa taaccgtaac tccttgtatt 360
tgttgtacaa atgaactgga aagagatttc atagattcaa agatacacat taaagttgat 420
gataacacta attatctatt tattgaagac gatcttatga ctataactaa tttatgttcc 480
tctattcggt gttacaataa gccaatggtt aatagtaaag tagcagatat aaactttgaa 540
tttagagaca agtgtttggt taatggaatt atattacacg atgttatgga agaagtgctg 600
ataaacaaaa attacactct tgcgtttatt aatgaagcag taagaaaagc aacagaaaac 660
aatgcactaa atatatacgc gtgtaataca acggaaagaa gtgttaagaa ggatattttt 720
gccagcctaa ccaatataag tcgttttaaa agacataatc ttgttttcga acagtctgaa 780
aagcgaattg tttctttgat ttctaatttg aaaggaaata tcgatgttgt tggagaaaat 840
attgttttag aaattaagag tggtaaaact atggatgttt ctcataaggc gcaagtcatg 900
atgtacaatt tgcttatgaa agaaagattt cttaaggatt ttgattgtta tttgtattac 960
attgcaaatg ataatcttgt taaaatagac gttaagcact cagaggttaa aagtctattt 1020
atacggcgaa ataaattaac tttgaagaac gatattgaaa tttgcaactg tcaagccttt 1080
gaaccttgcc aaattataaa caaaattttg agtctgccaa atgaccactt tttaaaacaa 1140
acttgggacg ctattgaaaa ggaagaaaat tatagactaa aggaaacatg gaacaatgtt 1200
acttttaaaa aacagaatga cacaaatgtt atttttaaat ttgattttga gccttcaatt 1260
attgatgata tttacattaa tatttacaac caagatttaa taaaattgtg taaaggtatc 1320
ataacatcct ttgaaaataa tattatgatg gtttctctta gtgaaagaat caatttagaa 1380
aataattctc tttattttat atcttttggc tgtaatgatt tattttttaa gtatttaaga 1440
tactcactaa ttaacattgc tttctttcgt tatgtcgata acagtaatgg ccacggtttt 1500
aaattgccag gtgaggaatt tcaattagga aacgaaagtg acattgaaga ttctgatagt 1560
tccgcagaat ctttagattg tgatagttta gaatctaatg aaaaatctaa taatgagatc 1620
acaaatcaat tggacgatgt ttttatgaaa accattgata cgacccccat aaaaaacaat 1680
aatataactt taatcaggaa tgtttcaagt agtttagatt tgaatactgc tcttttaaaa 1740
aactcaaatt ctagtttaga ttcttctttt caatatttta caccaccaac accaccaaaa 1800
gtgacttaca aatatcaaat tcctgaaatt tacaaagagc aattttttaa tttgaacgaa 1860
gagcaaaaaa actcgttgtt tttatcactt aattgtgaaa attacaaaat aattcatggc 1920
atgcctggca ctggtaaaag cacaatcatc gttcttttga ttaagatatt aatttctctt 1980
aattttaaag ttttacttgt ttgttacacc aatttagcca ttacaaatat tcttgataaa 2040
ttaaaaacgg tcagatatta cagagcaaga aaagaaaaaa tagattttaa atcatcagag 2100
gaagtcaaaa aatattatgc caatatcgat ttagtggcta gtacatgttt cggattttca 2160
gatacaattt ttattgatag aaaatttgat ttttgtatta tcgacgaagg ttcacaacaa 2220
catcttcttt taactttaat tcctgtgtca ttaagcaata gatttgtggt ttttggcgat 2280
catctacaac ttaagcctct tgtcaaatcg tgtaaatttt tatcaacgag tttgttcgaa 2340
taccttttag atgaagatca ttctgaatta cacacacaat atagaatggg aaaaaatatt 2400
atgaggttat ctaatgaatt attttatgaa aacaaactta ttgcagcaaa tgatttcaaa 2460
gataaggttg tatttattga ttctacagat ataaattatt ctgagttcat tagcaatgtc 2520
aagaattcaa caattctctg ttattttaat tctcaggtta aacttacaaa actgcataca 2580
aagtgccaag ttgagactat cgacagattt caaggtagtg aagatgaaaa tgtgattatt 2640
gtatttgatc cagtcagttc gtgtgaggtt atggagagtc atgaaagact taatgttgcg 2700
ttaacaagag ctcgaaagag tttgacttta gttggagata aagaaaaaat gatggaaatt 2760
ggtattttaa ggagattatt agagatttta tga 2793
<210> 3
<211> 930
<212> PRT
<213> 家蚕微孢子虫DNA2基因编码的蛋白序列
<400> 3
Met Asn Asn Asn Lys Ser Pro His Ser Phe Asn Ser Leu Arg Lys Ser
1 5 10 15
Pro Ile Arg Lys Lys Met Lys Val Val Tyr Glu Ser Asn Ile Ser Phe
20 25 30
Trp Asp Asn Val Lys Asp Thr Asn Cys Glu Glu Asp Ala His Ser Glu
35 40 45
Ser Asp Phe Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ser Phe Glu Ile Glu Gln Ser
50 55 60
Lys Lys Ser Leu Lys Asn Ile Thr Ser Val Lys Phe Ile Ile Arg Glu
65 70 75 80
Ile Glu Arg Glu Glu Asp Cys Val Arg Leu Ile Ser Asn Asp Val Val
85 90 95
Cys Thr Val Tyr Gly Glu Trp Ser Glu Leu Asp Tyr Glu Ile Asp Thr
100 105 110
Lys Ile Thr Val Thr Pro Cys Ile Cys Cys Thr Asn Glu Leu Glu Arg
115 120 125
Asp Phe Ile Asp Ser Lys Ile His Ile Lys Val Asp Asp Asn Thr Asn
130 135 140
Tyr Leu Phe Ile Glu Asp Asp Leu Met Thr Ile Thr Asn Leu Cys Ser
145 150 155 160
Ser Ile Arg Cys Tyr Asn Lys Pro Met Val Asn Ser Lys Val Ala Asp
165 170 175
Ile Asn Phe Glu Phe Arg Asp Lys Cys Leu Val Asn Gly Ile Ile Leu
180 185 190
His Asp Val Met Glu Glu Val Leu Ile Asn Lys Asn Tyr Thr Leu Ala
195 200 205
Phe Ile Asn Glu Ala Val Arg Lys Ala Thr Glu Asn Asn Ala Leu Asn
210 215 220
Ile Tyr Ala Cys Asn Thr Thr Glu Arg Ser Val Lys Lys Asp Ile Phe
225 230 235 240
Ala Ser Leu Thr Asn Ile Ser Arg Phe Lys Arg His Asn Leu Val Phe
245 250 255
Glu Gln Ser Glu Lys Arg Ile Val Ser Leu Ile Ser Asn Leu Lys Gly
260 265 270
Asn Ile Asp Val Val Gly Glu Asn Ile Val Leu Glu Ile Lys Ser Gly
275 280 285
Lys Thr Met Asp Val Ser His Lys Ala Gln Val Met Met Tyr Asn Leu
290 295 300
Leu Met Lys Glu Arg Phe Leu Lys Asp Phe Asp Cys Tyr Leu Tyr Tyr
305 310 315 320
Ile Ala Asn Asp Asn Leu Val Lys Ile Asp Val Lys His Ser Glu Val
325 330 335
Lys Ser Leu Phe Ile Arg Arg Asn Lys Leu Thr Leu Lys Asn Asp Ile
340 345 350
Glu Ile Cys Asn Cys Gln Ala Phe Glu Pro Cys Gln Ile Ile Asn Lys
355 360 365
Ile Leu Ser Leu Pro Asn Asp His Phe Leu Lys Gln Thr Trp Asp Ala
370 375 380
Ile Glu Lys Glu Glu Asn Tyr Arg Leu Lys Glu Thr Trp Asn Asn Val
385 390 395 400
Thr Phe Lys Lys Gln Asn Asp Thr Asn Val Ile Phe Lys Phe Asp Phe
405 410 415
Glu Pro Ser Ile Ile Asp Asp Ile Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Gln Asp
420 425 430
Leu Ile Lys Leu Cys Lys Gly Ile Ile Thr Ser Phe Glu Asn Asn Ile
435 440 445
Met Met Val Ser Leu Ser Glu Arg Ile Asn Leu Glu Asn Asn Ser Leu
450 455 460
Tyr Phe Ile Ser Phe Gly Cys Asn Asp Leu Phe Phe Lys Tyr Leu Arg
465 470 475 480
Tyr Ser Leu Ile Asn Ile Ala Phe Phe Arg Tyr Val Asp Asn Ser Asn
485 490 495
Gly His Gly Phe Lys Leu Pro Gly Glu Glu Phe Gln Leu Gly Asn Glu
500 505 510
Ser Asp Ile Glu Asp Ser Asp Ser Ser Ala Glu Ser Leu Asp Cys Asp
515 520 525
Ser Leu Glu Ser Asn Glu Lys Ser Asn Asn Glu Ile Thr Asn Gln Leu
530 535 540
Asp Asp Val Phe Met Lys Thr Ile Asp Thr Thr Pro Ile Lys Asn Asn
545 550 555 560
Asn Ile Thr Leu Ile Arg Asn Val Ser Ser Ser Leu Asp Leu Asn Thr
565 570 575
Ala Leu Leu Lys Asn Ser Asn Ser Ser Leu Asp Ser Ser Phe Gln Tyr
580 585 590
Phe Thr Pro Pro Thr Pro Pro Lys Val Thr Tyr Lys Tyr Gln Ile Pro
595 600 605
Glu Ile Tyr Lys Glu Gln Phe Phe Asn Leu Asn Glu Glu Gln Lys Asn
610 615 620
Ser Leu Phe Leu Ser Leu Asn Cys Glu Asn Tyr Lys Ile Ile His Gly
625 630 635 640
Met Pro Gly Thr Gly Lys Ser Thr Ile Ile Val Leu Leu Ile Lys Ile
645 650 655
Leu Ile Ser Leu Asn Phe Lys Val Leu Leu Val Cys Tyr Thr Asn Leu
660 665 670
Ala Ile Thr Asn Ile Leu Asp Lys Leu Lys Thr Val Arg Tyr Tyr Arg
675 680 685
Ala Arg Lys Glu Lys Ile Asp Phe Lys Ser Ser Glu Glu Val Lys Lys
690 695 700
Tyr Tyr Ala Asn Ile Asp Leu Val Ala Ser Thr Cys Phe Gly Phe Ser
705 710 715 720
Asp Thr Ile Phe Ile Asp Arg Lys Phe Asp Phe Cys Ile Ile Asp Glu
725 730 735
Gly Ser Gln Gln His Leu Leu Leu Thr Leu Ile Pro Val Ser Leu Ser
740 745 750
Asn Arg Phe Val Val Phe Gly Asp His Leu Gln Leu Lys Pro Leu Val
755 760 765
Lys Ser Cys Lys Phe Leu Ser Thr Ser Leu Phe Glu Tyr Leu Leu Asp
770 775 780
Glu Asp His Ser Glu Leu His Thr Gln Tyr Arg Met Gly Lys Asn Ile
785 790 795 800
Met Arg Leu Ser Asn Glu Leu Phe Tyr Glu Asn Lys Leu Ile Ala Ala
805 810 815
Asn Asp Phe Lys Asp Lys Val Val Phe Ile Asp Ser Thr Asp Ile Asn
820 825 830
Tyr Ser Glu Phe Ile Ser Asn Val Lys Asn Ser Thr Ile Leu Cys Tyr
835 840 845
Phe Asn Ser Gln Val Lys Leu Thr Lys Leu His Thr Lys Cys Gln Val
850 855 860
Glu Thr Ile Asp Arg Phe Gln Gly Ser Glu Asp Glu Asn Val Ile Ile
865 870 875 880
Val Phe Asp Pro Val Ser Ser Cys Glu Val Met Glu Ser His Glu Arg
885 890 895
Leu Asn Val Ala Leu Thr Arg Ala Arg Lys Ser Leu Thr Leu Val Gly
900 905 910
Asp Lys Glu Lys Met Met Glu Ile Gly Ile Leu Arg Arg Leu Leu Glu
915 920 925
Ile Leu
930
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物ORF-F
<400> 4
attatcatat gaacaacaat aagtc 25
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 引物ORF-R
<400> 5
atatgaagct tcataaaatc tctaat 26
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 检测引物F
<400> 6
gtgaagagga cgcacactca 20
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 检测引物R
<400> 7
accattggct tattgtaaca ccg 23

Claims (5)

1.家蚕微孢子虫DNA2基因，其特征在于，其全长序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的家蚕微孢子虫DNA2基因，其特征在于，其ORF序列如SEQ IDNO.2所示。
3.家蚕微孢子虫DNA2基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.家蚕微孢子虫DNA2基因在制备家蚕微孢子虫特异性检测试剂方面的应用，其特征在于，所述家蚕微孢子虫DNA2基因的全长序列如SEQ ID NO.1所示。
5.一种特异性检测家蚕微孢子虫的引物组，其特征在于，为检测引物F和检测引物R，检测引物F的序列如SEQ ID NO.6所示，检测引物R的序列如SEQ ID NO.7所示。
CN201710301862.1A 2017-05-02 2017-05-02 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用 Active CN107245492B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710301862.1A CN107245492B (zh) 2017-05-02 2017-05-02 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710301862.1A CN107245492B (zh) 2017-05-02 2017-05-02 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107245492A CN107245492A (zh) 2017-10-13
CN107245492B true CN107245492B (zh) 2019-10-22

Family

ID=60016549

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710301862.1A Active CN107245492B (zh) 2017-05-02 2017-05-02 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107245492B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3449961B2 (ja) * 2000-02-25 2003-09-22 独立行政法人農業生物資源研究所 マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法
CN102260737A (zh) * 2011-05-30 2011-11-30 华南农业大学 一组引物及其在家蚕微孢子虫的快速检测方面的应用
CN104017890A (zh) * 2014-06-20 2014-09-03 华南农业大学 Eb1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用
CN104017891A (zh) * 2014-06-20 2014-09-03 华南农业大学 septin1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3449961B2 (ja) * 2000-02-25 2003-09-22 独立行政法人農業生物資源研究所 マルチプライマーｐｃｒ法による病原生物検出法
CN102260737A (zh) * 2011-05-30 2011-11-30 华南农业大学 一组引物及其在家蚕微孢子虫的快速检测方面的应用
CN104017890A (zh) * 2014-06-20 2014-09-03 华南农业大学 Eb1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用
CN104017891A (zh) * 2014-06-20 2014-09-03 华南农业大学 septin1基因在检测家蚕微孢子虫中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Detection of Nosema bombycis by FTA Cards and Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP);Wei Yan等;《Current Microbiology》;20140604;第69卷(第4期);第532-540页，参见全文 *
基于EB1基因的环介导等温扩增(LAMP)法检测感染家蚕微粒子病的蚕卵;刘吉平等;《昆虫学报》;20150831;第58卷(第8期);第846-855页，参见全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107245492A (zh) 2017-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Li et al. The complete mitochondrial genomes of five important medicinal Ganoderma species: features, evolution, and phylogeny
Dutra et al. Application of representational difference analysis to identify sequence tags expressed by Metarhizium anisopliae during the infection process of the tick Boophilus microplus cuticle
CN104498599B (zh) 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
Liang et al. A proposed adhesin AoMad1 helps nematode-trapping fungus Arthrobotrys oligospora recognizing host signals for life-style switching
Liu et al. Genetic variability of mtDNA sequences in Chinese native chicken breeds
CN108707687A (zh) 一种可以区分谷瘟病菌与稻瘟病菌的pcr检测鉴定方法
CN105801706A (zh) 蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、自组装蛋白质纳米笼及其制备方法和应用
CN104928397B (zh) 豇豆疫霉菌pcr检测引物及其检测方法
CN1657627A (zh) 禾谷镰孢菌抗多菌灵检测基因及其检测方法
CN104805066B (zh) 一种葡萄球菌裂解酶及其应用
CN107245492B (zh) 家蚕微孢子虫dna2基因及其应用
CN108660144A (zh) 一种牛支原体多功能蛋白CDNPase
CN108690140B (zh) 一种杂合肽及其在抑菌中的应用
CN106866818A (zh) 免疫诊断急性肝胰腺坏死综合症的蛋白卵黄抗体及其制备工艺和应用
CN101532055A (zh) 辅助鉴定五指山小型猪近交系的方法及其专用试剂盒
CN104651375B (zh) 家蚕微孢子虫Met‑AP2基因及其应用
CN110699471A (zh) 一种快速检测支原体的引物对和试剂盒及其应用
CN104498509B (zh) Hmg1基因及其在家蚕微孢子虫分子检测中的应用
Xu et al. First report of leaf spot disease in Angelica dahurica caused by Phoma bellidis in China
CN108359673A (zh) 一种高效杀食用菌眼蕈蚊的Bt cry11基因、编码蛋白及其应用
CN102212611B (zh) 黑麦草腥黑粉菌检测标准分子及其构建方法
CN101285064A (zh) 一种新的信号芋螺m-超家族毒素序列、制备方法及其应用
ES2329960B1 (es) Metodo para la deteccion e identificacion de peronospora arborescens.
Lan et al. Among-Population Genetic Diversity of Rice Blast Fungus Based on Fingerprinting of Virulence-related genes
CN111886022B (zh) 葎草花粉重组疫苗及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant