CN105801706A - 蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、自组装蛋白质纳米笼及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、自组装蛋白质纳米笼及其制备方法和应用。本发明提供的技术方案利用蝎氯毒素多肽和人重链铁蛋白的生物医学功能和自身结构特征，采用基因工程的办法将他们设计为一种融合蛋白，形成一个有生物活性的融合蛋白质纳米笼，以提高蝎氯毒素多肽的稳定性和生物利用度，增强靶向抗神经胶质瘤的功能。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、自组装蛋白质纳米笼及其制备方法和应用。
背景技术
神经胶质瘤(glioma)又简称胶质瘤，是一种起源于胶质细胞的颅内原发性肿瘤，恶性胶质瘤的致死率高，早期边界不明显，现有治疗方法难以进行有效的诊断和治疗。
研究发现，从以色列金蝎的毒液中提取的神经毒素多肽Chlorotoxin(CTX)，这种只有36氨基酸的小肽能够抑制神经胶质瘤特异性的氯离子通道，随后发现重组表达的CTX能够通过与肿瘤细胞表面的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)结合，特异性靶向神经胶质瘤，而且具有抑制MMP-2胶原蛋白水解酶的活性，同时能够抑制细胞上MMP-2的表达。
铁蛋白是一种常见的球状蛋白质，由24个蛋白亚基自组装形成八面体对称的球状纳米笼结构。它能在所有类型的细胞中表达，是原核生物与真核生物用于储存铁离子的主要蛋白质。人源铁蛋白主要是有两种不同的亚基组成，分为H链和L链，它们的分子量大小不同，分别是21KDa和19KDa。其中人源铁蛋白H链含有一个保守的亚铁氧化酶的活性位点，能够单独自组装形成24聚体球状纳米笼结构，并且因为铁蛋白受体的存在，对体内的生理屏障具有很好的穿透效果，所以人重链铁蛋白是一种优异的纳米生物医学载体平台。
现有技术有报道采用重组表达的蝎氯毒素多肽直接对神经胶质瘤进行治疗，或与其它无机纳米材料偶联对神经胶质瘤进行诊断与治疗。多肽本身稳定性不够，产率较低，直接用于治疗时药代动力学较差，而与无机纳米材料偶联，过程中又容易造成多肽的变性，减弱生物活性。
针对上述问题，有必要提供一种有效的治疗神经胶质瘤的药物。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、自组装蛋白质纳米笼及其制备方法和应用。本发明提供的技术方案利用蝎氯毒素多肽和人重链铁蛋白的生物医学功能和自身结构特征，采用基因工程的办法将他们设计为一种融合蛋白，形成一个有生物活性的融合蛋白质纳米笼，以期提高蝎氯毒素多肽的稳定性和生物利用度，增强靶向抗神经胶质瘤的功能。
第一方面，本发明提供了一种蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，含有蝎氯毒素多肽区和铁蛋白重链，其中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的至少1个蝎氯毒素多肽，所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连。
优选地，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的1～2个蝎氯毒素多肽。
如本发明所述的，“串联的蝎氯毒素多肽”是指蝎氯毒素多肽之间以N端-C端-N端-C端的方式相连。
如本发明所述的，“所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连”的方式中，具体的：
1)所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的C端；所述蝎氯毒素多肽的N端通过linker短肽和铁蛋白重链的C端相连；
2)所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端；所述蝎氯毒素多肽的C端通过linker短肽和铁蛋白重链的N端相连；
3)所述蝎氯毒素多肽区分别位于所述铁蛋白重链的N端和C；位于铁蛋白重链N端的蝎氯毒素多肽区，蝎氯毒素多肽的C端通过linker短肽和铁蛋白重链的N端相连；位于铁蛋白重链C端的蝎氯毒素多肽区，蝎氯毒素多肽的N端通过linker短肽和铁蛋白重链的C端相连。
优选地，所述蝎氯毒素多肽的氨基酸序列为：
(a)序列表SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
优选地，所述铁蛋白重链的氨基酸序列为：
(a)序列表SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
优选地，所述linker短肽如SEQIDNO.3～8所示氨基酸序列中的至少一种。
本发明采用的linker，能有效降低外加蝎氯毒素多肽后对铁蛋白重链亚基组装的负面影响，有助于形成稳定的蛋白笼结构。
优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。
进一步优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。
优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNO.11所示。
进一步优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNO.12所示。
第二方面，本发明提供了一种重组蛋白质纳米笼，包括24个单体蛋白质亚基，其中，所述单体蛋白质亚基为蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，含有蝎氯毒素多肽和铁蛋白重链，其中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的至少1个蝎氯毒素多肽，所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连。
优选地，所述的重组蛋白质纳米笼中，所述蝎氯毒素多肽位于所述重组蛋白质纳米笼的表面。
优选地，所述的重组蛋白质纳米笼的外径为18～35nm。
优选地，所述的重组蛋白质纳米笼的外径为13～30nm。
进一步优选地，所述的重组蛋白质纳米笼的平均外径约为21nm。
优选地，所述的重组蛋白质纳米笼由24个单体蛋白质亚基在细胞内表达，并自组装形成。
优选地，所述的重组蛋白质纳米笼由24个单体蛋白质亚基在细胞内表达，并自组装形成，然后经过柱亲和层析、超虑脱盐和色谱分离，为纯度不低于95％的蛋白质纳米笼。
本发明所述的体外自组装形成的重组蛋白质纳米笼稳定存在的pH值范围为6.0-10.0。
优选地，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的1～2个蝎氯毒素多肽。
优选地，所述蝎氯毒素多肽的氨基酸序列为：
(a)序列表SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
优选地，所述铁蛋白重链的氨基酸序列为：
(a)序列表SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
优选地，所述linker短肽如SEQIDNO.3～8所示氨基酸序列中的至少一种。
优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。
进一步优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。
优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNO.11所示。
进一步优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNO.12所示。
第三方面，本发明提供了一种重组蛋白质纳米笼的制备方法，包括如下步骤：
(1)基因工程菌株的构建：构建表达蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的基因工程菌株，其中，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白含有蝎氯毒素多肽区和铁蛋白重链，其中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的至少1个蝎氯毒素多肽，所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连；
(2)融合蛋白的表达和收获：将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，收集菌体，悬浮于缓冲液中，超声波破菌并离心，收获含有重组蛋白质纳米笼的上清；
(3)自组装蛋白质纳米笼的分离纯化：将步骤(2)收获的含重组蛋白质纳米笼的上清分别通过亲和柱层析、超虑脱盐和色谱分离，获得纯化后的重组蛋白质纳米笼。
优选地，所述步骤(1)中，所用的表达载体为pET，所用的宿主菌为大肠杆菌。
进一步优选地，所用的pET表达载体为pET-28。
优选地，所述步骤(1)中，所用PCR引物为SEQIDNO.13和SEQIDNO.14(扩增HFt基因)。
优选地，所述步骤(1)中，所用PCR引物为SEQIDNO.15和SEQIDNO.16(扩增CTX基因)。
优选地，所述步骤(3)中，所用的亲和柱层析为Ni+亲和柱层析。
优选地，所述步骤(3)中，所述纯化后的重组蛋白质纳米笼的纯度高于95％。
优选地，所述步骤(1)中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的1～2个蝎氯毒素多肽。
优选地，所述步骤(1)中，所述蝎氯毒素多肽的氨基酸序列为：
(a)序列表SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
优选地，所述步骤(1)中，所述铁蛋白重链的氨基酸序列为：
(a)序列表SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
优选地，所述步骤(1)中，所述linker短肽如SEQIDNO.3～8所示氨基酸序列中的至少一种。
优选地，所述步骤(1)中，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.9所示。
进一步优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。
优选地，所述步骤(1)中，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNO.11所示。
进一步优选地，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的核苷酸编码序列如SEQIDNO.12所示。
第四方面，本发明提供了一种载体，含有如第一方面所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的基因表达盒。
第五方面，本发明提供了一种宿主菌，含有如第四方面所述的载体。
第六方面，本发明提供了如第一方面所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、如第二方面所述的重组蛋白质纳米笼、或第三方面所述的重组蛋白质纳米笼的制备方法在制备诊断或治疗神经胶质瘤药物中的应用。
本发明提供了技术方案具有如下有益效果：
(1)基因工程生产CHF蛋白质纳米笼产量高。实验室小试生产98％纯度以上的CHF蛋白质纳米笼产量达到60mg/L培养物；(2)CHF稳定性高。CHF是一个由231氨基酸组成的26.6KDa大小的蛋白质，分离得到的由24个CHF蛋白质亚基自组装形成的纳米笼，具有很高的稳定性，不易变质；(3)易于生产。使用亲和层析、超虑脱盐和高效液相色谱3个纯化操作步骤，就可以得到95％以上色谱纯的CHF蛋白质纳米笼。
附图说明
图1PCR方法扩增H-Ferritin基因示意图；
M：DNAMarker；2、3：目的基因HFt的扩增带；1：阴性对照。
图2重叠PCR方法扩增CTX基因示意图；
M：DNAMarker；1、2：目的基因CTX的扩增带；3：阴性对照。
图3重组表达质粒pET28a-CHF的双酶切鉴定示意图；
M：DNAMarker；1、2：Nco1和BamH1双酶切后的条带；3、4：BamH1和Xho1双酶切后的条带。
图4重组表达质粒pET28a-CHF的PCR鉴定示意图；
M：DNAMarker；1：目的基因CTX的扩增带；2：目的基因HFt的扩增带；3：阴性对照。
图5工程菌BL21(pET-28a/CHF)的诱导表达示意图；
1：未经诱导转化pET-28a-CHF的全细胞蛋白质提取物；2：经IPTG诱导转化pET-28a-CHF的全细胞蛋白质提取物；3：Ni+亲和层析柱纯化的基因工程CHF蛋白质纳米笼；4：蛋白质Marker。
图6基因工程CHF蛋白质纳米笼的HPLC分析示意图；
图7基因工程CHF蛋白质纳米笼的电镜检测示意图。
图8基因工程CHF蛋白质纳米笼的粒度检测示意图。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中无特别说明外，所用试剂及耗材均为市售商品；
实施例1：分子设计CHF基因
A、设计引物：以人类基因组cDNA文库中人铁蛋白质纳米笼重链为模板，设计2条引物PCR扩增得到HFt基因，正向引物为引物HFP1：TTAGGATCCATGACCACCGCGAGCACCA(SEQUENCENO.13)，正向引物为引物HFP2：TTACTCGAGGCTTTCGTTATCGCTATCGCCC(SEQUENCENO.14)。另外设计2条PCR扩增引物进行PCR扩增获取CTX基因，正向引物为引物CP1：TTACCATGGGCATGTGTATGCCGTGCTTCACTACCGATCA(SEQUENCENO.15),反向引物为引物CP2：TTAGGATCCACGGCACAGACACTGCGGACCGT(SEQUENCENO.16)。
B、PCR扩增得到HFt基因：将5微升的10xTaq聚合酶缓冲液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物HFP1、1微升的引物HFP2、1微升的模板(克隆获得质粒模板，氨基酸序列为：
MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQRGGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVTNLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES，核苷酸序列为SEQIDNO.12中对应核苷酸序列)、0.25微升的TaqDNA聚合酶和36.75微升的无菌水混合。PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性45秒、55℃复性45秒、72℃延伸100秒、72℃最后延伸300秒，循环35次。反应共设2管，另设立无模板的阴性对照1管(以1μl灭菌水代替模板以补足总体积)。PCR产物经琼脂糖电泳检测后用胶回收试剂盒回收，回收产物用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，获得特异性的扩增带(图1)。
C、两轮PCR扩增CTX基因：PCR反应的试剂如下：将5微升的10xTaq聚合酶缓冲液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物CP1、1微升的引物CP2、1微升的模板(克隆制得质粒模板，氨基酸序列为：
MCMPCFTTDHQMARKCDDCCGGKGRGKCYGPQCLCR，核苷酸序列为SEQIDNO.12中对应核苷酸序列)、0.25微升的TaqDNA聚合酶和36.75微升的无菌水混合，PCR反应条件：94℃预变性300秒、94℃变性30秒、55℃复性30秒、72℃延伸30秒、72℃最后延伸200秒，循环30次。反应共设2管，另设立无模板的阴性对照1管(以1μl灭菌水代替模板以补足总体积)。PCR产物经琼脂糖电泳检测后用胶回收试剂盒回收，回收产物用1％浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，获得特异性的扩增带(图2)。
实施例2：CHF蛋白质纳米笼重组表达载体的构建
A：HFt、CTX基因和pET-28a载体的双酶切与连接
将实施例1中所得PCR产物经过酚:氯仿:异戊醇(25：24：1)抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用50μl灭菌水溶解沉淀。用限制性内切酶BamHI和HindIII(Takara公司产品)对回收的PCR产物和表达载体pET-28a质粒进行酶切。酶切反应：BamHI(14U/μl)和HindIII(20U/μl)各lμl，10倍缓冲液2.5μl,，PCR产物或pET-28a质粒50-100ng，加无菌水至总体积为25μl。37℃水浴5小时，酶切产物经酚:氯仿:异戊醇抽提，无水乙醇(2.5倍体积)沉淀后用T4DNA连接酶(Takara公司产品)将PCR产物与表达载体pET-28a连接。连接反应：T4DNA连接酶(1U/μl)lμl，PCR产物与表达载体pET-28a的摩尔比为3：1，并且DNA总量为0.1μg，5倍连接酶反应缓冲液4μl，加无菌水至总体积为20μl，16℃放置24小时。
B：大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)感受态细胞的制备
DH5α(购自中国典型培养物保藏中心)感受态细胞的制备：在划线平板上挑取DH5α单菌落，接种于5mlLB培养液，37℃，250rpm摇床中培养过夜；以1％量转接于5mlLB培养基中，生长至OD600到0.4～0.6，取菌液1ml于预冷的1.5mlEppendorf管中，冰浴5～10分钟，4℃12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，倒置1分钟，再冰浴10分钟；沉淀重悬于1ml预冷的0.1MCaCl2中，冰浴20～40分钟，4℃12,000rpm离心20～30秒，收集菌体，将菌体重悬于150μl预冷的CaCl2中，冰浴2～7小时，4℃冰箱保存，如放置在-70℃则可保存6个月。
BL21(DE3)感受态细胞的制备同于DH5α感受态细胞的制备。
C：连接产物的转化和阳性克隆的鉴定
将实施例2A步骤中的20μl连接反应液加到100μl的DH5α感受态细胞，混匀，冰浴30分钟，42℃水浴90秒(不能摇动)，再冰浴2分钟；加等体积2×LB培养液，37℃摇床(120rpm)温育1小时；摇匀菌液，取200μl涂布于LB/Kan+琼脂平板上，待菌液吸干后倒置于37℃培养12～16小时，观察结果。
加卡那霉素琼脂平板(LB/Kan+)上挑取单菌落10个，于500μl含卡那霉素的LB液体培养基中37℃振摇4小时，取2μl菌液作为模板，以实施例1中的两组正反向引物分别进行PCR。PCR筛选的阳性克隆子进一步使用限制性酶切反应鉴定，获得双酶切条带(图3)和特异性的扩增带(图4)。两者都为阳性结果的克隆子送上海三博公司进行测序分析。测序引物是针对pET-28a质粒的通用测序引物pET5’primer。
实施例3：重组CHF基因工程菌的制备
将实施例2C步骤中测序正确的阳性克隆子按照碱裂解法提取重组表达质粒pET-28a-CHF(方法见《分子克隆》第二版)。按照实施例2C步骤中的转化方法将提取的pET-28a-CHF质粒转入实施例2B步骤制备的大肠杆菌感受态BL21(DE3)细胞中。平板为LB/Kan+琼脂平板。挑取单克隆子获得基因工程菌BL21(DE3)(pET-28a-CHF)。
实施例4：重组CHF蛋白质纳米笼的表达和纯化
在含卡那霉素的LB液体培养基中以1:100的比例接种克隆子(重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-CHF)，37℃培养至OD600＝0.8时加入IPTG(终浓度为0.1mM)对培养物进行诱导，然后将培养物在28℃培养4小时以进行目的基因的表达。之后在8000rpm离心收集菌体，依照每1L培养基的菌体约加入25-30ml的含5mM咪唑的Tris-Cl缓冲溶液(20mMTris-HClpH7.9，0.5MNaCl)，充分悬浮混匀，超声波破细胞(200HZ,工作2秒/次，间歇5秒/次，设定次数要求达到培养物变不粘稠，半透明为止)，12000rpM转速离心15min，所得上清过滤膜，低速结合到Ni+亲和层析胶，通过柱使表达的蛋白与Ni+亲和层析胶充分结合；用含10mM咪唑的Tris-Cl缓冲溶液反复冲洗去除杂蛋白；最后加入用5-10倍柱体积的含100mM咪唑的洗脱液洗下融合蛋白。
洗脱的CHF蛋白质通过50ml的10KDa超虑管(Millipore,Centricon,USA)离心浓缩脱盐，离心速度为3500g/min，温度为4℃。
然后浓缩脱盐的CHF蛋白质纳米笼进行HPLC(美国安吉伦公司产品)纯化。HPLC的参数设置为：分离柱子C18(EliteHPLC,China,10×250mm,5μm)，流速5ml/min，液相为含有0.1％的三氟乙酸TFA的乙腈(CH3CN：10％to80％)洗脱液，紫外检测设置在280nm处。
手工收集CHF蛋白质峰，并且冷冻干燥(－40℃)。通过Tris-Tricine缓冲液的十二烷基磺酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)检测收集液中的重组CHF蛋白质纳米笼(图5)，并用BCA方法测定蛋白质含量。由色谱峰面积分析可知，高效液相色谱鉴定蛋白质纯度达到95％(图6)。
将10μl稀释的蛋白质(1mg/ml)滴在以滤纸为底的有一层碳膜的铜网上，置于常温下过夜阴干。再滴加10μl新鲜配制的4％磷钨酸于其上，5mins后用滤纸把多余的溶液吸干，静置干燥后，置于TecnaiG2F20场发射透射电子显微镜(美国FEI公司)下观察其纳米笼结构(图7),蛋白质纳米笼的直径范围为13-30nm(外径)。
将稀释的蛋白质(1mg/ml)溶液移入石英玻璃皿内，置于ZetasizerNanoZS90纳米粒度电位仪(英国Malvern公司)中，检测蛋白质纳米笼的粒度，得到蛋白质纳米笼的直径范围为13-30nm(外径)，本发明实施例制备的蛋白纳米笼粒径均一，大部分粒径约为21.77nm(图8)，与电镜观察结果一致。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，其特征在于，含有蝎氯毒素多肽区和铁蛋白重链，其中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的至少1个蝎氯毒素多肽，所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连。
2.如权利要求1所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，其特征在于，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的1～2个蝎氯毒素多肽。
3.权利要求1所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，其特征在于，所述蝎氯毒素多肽的氨基酸序列为：
(a)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，其特征在于，所述铁蛋白重链的氨基酸序列为：
(a)SEQIDNO.2所示的氨基酸序列；
(b)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；或
(c)相对于SEQIDNO.2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQIDNO.2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。
5.如利要求1所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，其特征在于，所述linker短肽的氨基酸序列为SEQIDNO.3～8所示氨基酸序列。
6.一种重组蛋白质纳米笼，其特征在于，包括24个单体蛋白质亚基，其中，所述单体蛋白质亚基为蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白，含有蝎氯毒素多肽和铁蛋白重链，其中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的至少1个蝎氯毒素多肽，所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连。
7.一种重组蛋白质纳米笼的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)基因工程菌株的构建：构建表达蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的基因工程菌株，其中，所述蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白含有蝎氯毒素多肽区和铁蛋白重链，其中，所述蝎氯毒素多肽区包括串联的至少1个蝎氯毒素多肽，所述蝎氯毒素多肽区位于所述铁蛋白重链的N端和/或C端，所述蝎氯毒素多肽通过linker短肽和铁蛋白重链相连；
(2)融合蛋白的表达和收获：将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，收集菌体，悬浮于缓冲液中，超声波破菌并离心，收获含有重组蛋白质纳米笼的上清；
(3)重组蛋白质纳米笼的分离纯化：将步骤(2)收获的含重组蛋白质纳米笼的上清分别通过亲和柱层析、超虑脱盐和色谱分离，获得纯化后的重组蛋白质纳米笼。
8.一种载体，其特征在于，含有如权利要求1所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白的基因表达盒。
9.一种宿主菌，其特征在于，含有如权利要求8所述的载体。
10.如权利要求1所述的蝎氯毒素多肽-铁蛋白重链融合蛋白、如权利要求6所述的重组蛋白质纳米笼、或如权利要求7所述的重组蛋白质纳米笼的制备方法在制备诊断或治疗神经胶质瘤药物中的应用。
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