CN112342207A

CN112342207A - 一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法

Info

Publication number: CN112342207A
Application number: CN202011367038.4A
Authority: CN
Inventors: 张光亚; 葛钟琪; 葛慧华
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2020-11-27
Filing date: 2020-11-27
Publication date: 2021-02-09
Anticipated expiration: 2040-11-27
Also published as: CN112342207B

Abstract

本发明公开了一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法，本发明将木聚糖酶与铁蛋白单亚基重组为融合蛋白，在特定pH和温度下使其成为易于沉淀的纳米级聚集体，从而使重组木聚糖酶能够进行自沉淀，通过低速离心进行快速的分离纯化，该纯化方式操作简单省时，处理量大，受设备限制小，制得的重组木聚糖酶存储方便，酶活稳定，酶学性质得以提高。

Description

一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法

技术领域

本发明属于木聚糖酶纯化技术领域，具体涉及一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法。

背景技术

木聚糖酶是一种微生物产生的酶，其作用是帮助分解植物细胞壁，利用这一特性使其广泛应用于食品加工、造纸，以及农业和保健品行业。而目前对于木聚糖酶的纯化分离而言，无论是实验室级别还是工业生产级别，要想获得纯度大于90％的目标酶，一般都要采用色谱的方法纯化。其过程烦碎，所用试剂较贵，导致制备成本大增。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法。

本发明的技术方案如下：

一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法，包括如下步骤：

(1)将依次相连的木聚糖酶的基因片段和铁蛋白的基因片段插入pET-22b(+)质粒载体中，构建形成pET-Xyl-Ferritin，其中，木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.01所示，铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示；

(2)将步骤(1)所得的pET-Xyl-Ferritin转入大肠杆菌中，制成工程菌；

(3)将步骤(2)所得的工程菌在LB培养基中活化后，于TB培养基中扩大培养，再加入IPTG诱导表达，获得培养液；

(4)将步骤(3)所得的培养液经离心后，获得第一沉淀，再加入PBS重悬洗涤，获得菌体；

(5)将步骤(4)所得的菌体进行超声破碎；

(6)将步骤(5)所得的物料于pH＝7-8且10-30℃的条件下静置10-30min；

(7)将步骤(6)所得的物料于500-2800g离心5-15min，获得第二沉淀，即成。

在本发明的一个优选实施方案中，所述木聚糖酶的基因片段的序列如SEQ IDNO.03所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述铁蛋白的基因片段的序列如SEQ ID NO.04所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述木聚糖酶的基因片段的序列如SEQ IDNO.03所示，所述铁蛋白的基因片段的序列如SEQ ID NO.04所示。

进一步优选的，所述大肠杆菌为E.coil BL21(DE3)。

进一步优选的，所述步骤(2)的活化为培养至OD600＝0.6-1.0。

进一步优选的，所述步骤(2)的扩大培养的温度为37℃，200rpm摇床培养3-4h，接种量为1∶100。

进一步优选的，所述超声破碎的条件为：超声2s，停2s，如此循环80次。

进一步优选的，所述步骤(6)为：将步骤(5)所得的物料于pH＝7.5且35℃的条件下静置20min。

进一步优选的，所述步骤(7)为：将步骤(6)所得的物料于2000g离心5min，获得第二沉淀，即成。

本发明的有益效果是：本发明将木聚糖酶与铁蛋白单亚基重组为融合蛋白，在特定pH和温度下使其成为易于沉淀的纳米级聚集体，从而使重组木聚糖酶能够进行自沉淀，通过低速离心进行快速的分离纯化，该纯化方式操作简单省时，处理量大，受设备限制小，制得的重组木聚糖酶存储方便，酶活稳定，酶学性质得以提高。

附图说明

图1为本发明实施例1中的pET-Xyl-Ferritin图谱。

图2为本发明实施例1中的电泳图，其中，M泳道：marker；1泳道：实施例1步骤(5)所得的物料；2泳道：本实施例1制得的重组木聚糖酶。

图3为本发明实施例1制得的重组木聚糖酶的光学显微镜照片。

图4为本发明实施例1制得的重组木聚糖酶的透射电子显微镜照片。

图5为本发明实施例1制得的重组木聚糖酶在放置35℃静置5h后，离心所得上清的透射电子显微镜照片。

图6为本发明实施例1制得的重组木聚糖酶在室温放置30天后的酶活力变化图。

图7为本发明实施例1制得的重组木聚糖酶在室温放置30天后的比活力变化图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)将依次相连的木聚糖酶的基因片段和铁蛋白的基因片段插入pET-22b(+)质粒载体中，构建形成如图1所示的pET-Xyl-Ferritin，其中，木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.01所示，铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.02所示，具体如下：

木聚糖酶的氨基酸序列(SEQ ID NO.01)：

木聚糖酶的基因片段的核苷酸序列(SEQ ID NO.03)：

铁蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.02)：

其对应的核苷酸序列(SEQ ID NO.04)：

(2)将步骤(1)所得的pET-Xyl-Ferritin转入大肠杆菌E.coil BL21(DE3)中，制成工程菌；

(3)将步骤(2)所得的工程菌的甘油菌按1∶100的体积比接入到含氨苄青霉素(Amp)(100mg/L)的LB液体中培养12h至OD600值为0.6，然后按1∶100的接种量接种于TB培养基中，置于37℃摇床，以200r/min的速度培养3-4h，再加入IPTG(终浓度为1mM)诱导培养7h，获得培养液；

(4)将步骤(3)所得的培养液经4000rpm离心20min后，获得第一沉淀，再按照培养液与PBS的体积比为20∶1加入PBS重悬洗涤3次，获得菌体；

(5)将步骤(4)所得的菌体进行超声破碎，超声破碎的条件为：超声2s，停2s，如此循环80次，所得物料如图2的泳道1所示；

(6)将步骤(5)所得的物料于pH＝7.5且35℃的条件下静置20min；

(7)将步骤(6)所得的物料于2000g离心5min，获得如图2至图5所示第二沉淀，即为重组木聚糖酶，其回收率为75.01±0.34％。

如图3所示，本实施例制得的重组木聚糖酶在光学显微镜下呈现球形形态结构；如图4所示，该重组木聚糖酶在透射电子显微镜下呈现球形形态结构；如图6所示，将本实施例步骤(6)制得的重组木聚糖酶放置在35℃下静置5h，离心后上清在透射电子显微镜下呈现中空近似球形结构

将本实施例制得的重组木聚糖酶均匀分装在多个试管中，放置35℃水浴锅中静置，分别在距离起始时间8h、20h、32h、56h、92h、140h的时间点低速离心后，取沉淀和上清分别测定酶活力，如图7所示，其中上清酶活力随时间显著提高。

将本实施例制得的重组木聚糖酶均匀分装，放置35℃水浴锅中静置，分别在距离起始时间8h、20h、32h、56h、92h、140h的时间点低速离心后，分别取沉淀和上清测定酶活力及蛋白浓度，计算其比活力，结果如图7所示，同样测定游离木聚糖酶酶活力及其蛋白浓度计算其比活力为144.89U/mg。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110> 华侨大学

<120> 一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 186

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Ser Thr Asp Tyr Trp Gln Asn Trp Thr Asp Gly Gly Gly Thr

1 5 10 15

Val Asn Ala Val Asn Gly Ser Gly Gly Asn Tyr Ser Val Asn Trp Ser

20 25 30

Asn Thr Gly Asn Phe Val Val Gly Lys Gly Trp Thr Lys Gly Ser Pro

35 40 45

Ser Arg Thr Ile Asn Tyr Asn Ala Gly Val Trp Ala Pro Asn Gly Asn

50 55 60

Gly Tyr Leu Ala Leu Tyr Gly Trp Thr Arg Ser Pro Leu Ile Glu Tyr

65 70 75 80

Tyr Val Val Asp Ser Trp Gly Thr Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys

85 90 95

Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Thr Thr Lys

100 105 110

Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Gln His Ser Thr Phe Thr Gln

115 120 125

Tyr Trp Ser Val Arg Arg Ser Lys Arg Pro Thr Gly Asn Asn Ala Lys

130 135 140

Ile Thr Phe Ser Asn His Val Lys Ala Trp Lys Ser His Gly Met Asn

145 150 155 160

Leu Gly Ser Ile Trp Ser Tyr Gln Val Leu Ala Thr Glu Gly Tyr Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Ser Ser Asn Val Thr Val Trp

180 185

<210> 2

<211> 182

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Thr Thr Ala Ser Thr Ser Gln Val Arg Gln Asn Tyr His Gln Asp Ser

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ile Asn Arg Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr

20 25 30

Val Tyr Leu Ser Met Ser Tyr Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala Leu

35 40 45

Lys Asn Phe Ala Lys Tyr Phe Leu His Gln Ser His Glu Glu Arg Glu

50 55 60

His Ala Glu Lys Leu Met Lys Leu Gln Asn Gln Arg Gly Gly Arg Ile

65 70 75 80

Phe Leu Gln Asp Ile Gln Lys Pro Asp Cys Asp Asp Trp Glu Ser Gly

85 90 95

Leu Asn Ala Met Glu Cys Ala Leu His Leu Glu Lys Asn Val Asn Gln

100 105 110

Ser Leu Leu Glu Leu His Lys Leu Ala Thr Asp Lys Asn Asp Pro His

115 120 125

Leu Cys Asp Phe Ile Glu Thr His Tyr Leu Asn Glu Gln Val Lys Ala

130 135 140

Ile Lys Glu Leu Gly Asp His Val Thr Asn Leu Arg Lys Met Gly Ala

145 150 155 160

Pro Glu Ser Gly Leu Ala Glu Tyr Leu Phe Asp Lys His Thr Leu Gly

165 170 175

Asp Ser Asp Asn Glu Ser

180

<210> 3

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccagca ccgactactg gcagaactgg accgacggcg gcggcaccgt gaacgccgtg 60

aacggcagcg gcggcaacta cagcgtgaac tggagcaaca ccggcaactt cgtggtgggc 120

aagggctgga ccaagggcag ccccagcaga accatcaact acaacgccgg cgtgtgggcc 180

cccaacggca acggctacct ggccctgtac ggctggacca gaagccccct gatcgagtac 240

tacgtggtgg acagctgggg cacctacaga cccaccggca cctacaaggg caccgtgtac 300

agcgacggcg gcacctacga catctacacc accaagagat acaacgcccc cagcatcgag 360

ggccagcaca gcaccttcac ccagtactgg agcgtgagaa gaagcaagag acccaccggc 420

aacaacgcca agatcacctt cagcaaccac gtgaaggcct ggaagagcca cggcatgaac 480

ctgggcagca tctggagcta ccaggtgctg gccaccgagg gctaccagag cagcggcagc 540

agcaacgtga ccgtgtgg 558

<210> 4

<211> 546

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accaccgcga gcaccagtca agttcgccag aactaccatc aagatagcga ggccgccatc 60

aaccgccaga tcaatctgga gctgtacgcc agctacgtgt acctcagcat gagctactac 120

ttcgaccgtg atgacgttgc gctgaagaac ttcgccaagt actttctcca ccagagccat 180

gaggaacgcg aacacgccga gaagctgatg aaactgcaga accagcgtgg cggccgtatc 240

tttctgcaag atatccagaa accggactgt gatgactggg aaagcggtct gaatgcgatg 300

gagtgcgcgc tgcacctcga aaaaaacgtg aaccagagtc tgctggagct gcacaaactg 360

gcgaccgaca aaaacgatcc gcatctgtgc gacttcatcg aaacccacta tctgaacgag 420

caagttaaag ccatcaagga gctgggcgat catgttacca atctgcgcaa aatgggcgcg 480

ccagaaagtg gtctggcgga atatctgttc gataagcaca cgctgggtga cagcgacaat 540

gagagc 546

Claims

1.一种低速离心纯化重组木聚糖酶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(5)将步骤(4)所得的菌体进行超声破碎；

(6)将步骤(5)所得的物料于pH＝7-8且10-35℃的条件下静置10-30min；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述木聚糖酶的基因片段的序列如SEQ IDNO.03所示。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述铁蛋白的基因片段的序列如SEQ IDNO.04所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述木聚糖酶的基因片段的序列如SEQ IDNO.03所示，所述铁蛋白的基因片段的序列如SEQ ID NO.04所示。

5.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为E.coilBL21(DE3)。

6.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的活化为培养至OD600＝0.6-1.0。

7.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)的扩大培养的温度为37℃，200rpm摇床培养3-4h，接种量为1∶100。

8.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述超声破碎的条件为：超声2s，停2s，如此循环80次。

9.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(6)为：将步骤(5)所得的物料于pH＝7.5且35℃的条件下静置20min。

10.如权利要求1至4中任一权利要求所述的方法，其特征在于：所述步骤(7)为：将步骤(6)所得的物料于2000g离心5min，获得第二沉淀，即成。