CN114277177A - 快速检测家蚕微孢子虫的探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

快速检测家蚕微孢子虫的探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测家蚕微孢子虫的探针，能够通过RAA技术来快速检测家蚕微孢子虫；还公开了快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，检测快速，灵敏度高；还公开了快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，减少了试剂混合加样步骤，操作方便，节省时间。

Description

快速检测家蚕微孢子虫的探针、试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种快速检测家蚕微孢子虫的探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
家蚕微孢子虫，隶属于真菌界，是一类细胞内专性寄生的真核生物，依据其可在家蚕中寄生，遂将其命名为"家蚕微孢子虫"。当母蛾感染微孢子虫后可经胚种垂直传播给子代，当前成品卵检疫的通用做法是通过对母蛾镜检微孢子虫来判定蚕种合格与否，但由于我国母蛾检疫判定标准是基于家蚕微粒子病30％的平均胚传率来设定的，成品卵实际带毒情况还有待进一步研究。而蚕期中，家蚕微粒子病要在感染的中后期才能直观辨别，不利于该病的及时防控。因此，一种可以快速直接检测微孢子虫技术在成品卵检疫、蚕期疾病早期诊断与防控中有现实需求。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种快速检测家蚕微孢子虫的探针，探针的核苷酸序列为： TGAATTGTATTTTCCAGTAGAGAAA/i6FAMdT/[THF]AA/iBHQ1dT/AAAATGTAAAT；
本发明的另外一个目的是提供一种快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，检测快速，灵敏度高；
本发明还有一个目的是提供一种所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法减少了试剂混合加样步骤，操作方便，节省时间。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种快速检测家蚕微孢子虫的探针，探针的的核苷酸序列为： TGAATTGTATTTTCCAGTAGAGAAA/i6FAMdT/[THF]AA/iBHQ1dT/AAAATGTAAAT。
快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，包括：上游引物、下游引物、探针。
优选的是，所述快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，所述上游引物的核苷酸序列为：AGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGAAT；所述下游引物的核苷酸序列为：AACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTTGT。
优选的是，所述上游引物、所述下游引物和所述探针为混合均匀的冻干粉。
快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
S1、将待测物研磨粉碎或匀浆破碎，加入裂解液静置裂解后，取上清液，得待测液；
S2、取三份试剂盒，将每份试剂盒中的所有试剂混合均匀，得三份预混物；
S3、向每份预混物中加入buffer A，待混合均匀后，其中一份中加入待测液，得检测组，另外两份分别加入与所述待测液相同量的阳性DNA对照模板和阴性对照模板，分别得阳性对照组和阴性对照组；
S4、向所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中均加入buffer B，震荡混匀后，离心，将所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中的溶液离心至试管底部，分别得到待检测的检测组、待检测的阳性对照组和待检测的阴性对照组；
S5、将所述待检测的检测组、所述待检测的阳性对照组和所述待检测的阴性对照组均放入带有荧光检测功能的仪器中，设定程序39.2℃，检测15-20min。
优选的是，步骤S3中所述buffer A为20％PEG，步骤S4中所述buffer B为醋酸镁。
优选的是，所述阴性对照模板为20％PEG。
优选的是，所述阳性DNA对照模板为插入EB1基因片段的重组质粒。
优选的是，所述阳性DNA对照模板的模板为30000拷贝/μL。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明基于RAA技术，提供了快速检测家蚕微孢子虫的探针，能够通过RAA技术来快速检测家蚕微孢子虫。
第二、本发明提供了快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，检测快速，灵敏度高。
第三、本发明提供了快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，减少了试剂混合加样步骤，操作方便，节省时间。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明的其中一种技术方案所述R8分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对的检测曲线图；
图2为本发明的其中一种技术方案所述R9分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对的检测曲线图；
图3为本发明的其中一种技术方案所述R10分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对的检测曲线图；
图4为本发明的其中一种技术方案所述R11分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对的检测曲线图；
图5为本发明的其中一种技术方案所述R12分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对的检测曲线图；
图6为本发明的其中一种技术案所述R8与F6进行组合配对的检测曲线图；
图7为本发明的其中一种技术案所述R11与F6进行组合配对的检测曲线图；
图8为本发明的其中一种技术案所述R8与F12进行组合配对的检测曲线图；
图9为本发明的其中一种技术案所述R11与F11进行组合配对的检测曲线图；
图10为本发明的其中一种技术案所述R9与F8进行组合配对的检测曲线图；
图11为本发明的其中一种技术案所述R11与F12进行组合配对的检测曲线图；
图12为本发明的其中一种技术案所述R10与F11进行组合配对的检测曲线图；
图13为本发明的其中一种技术案所述R12与F12进行组合配对的检测曲线图；
图14为本发明的其中一种技术案所述家蚕母蛾检测图。
其中，图14中，图A：含微孢子虫和无微孢子虫的母蛾研磨液；图B：稀释10倍后，加入裂解液裂解5-10min；图C：按试剂盒说明依次加入试剂及模板DNA；图D：反应体系混匀；图E：检测样本加入到RAA荧光检测仪；图F：输出检测结果(T1：阳性对照, 曲线颜色橙色；T2：阴性对照，曲线颜色红色；T3-5，无微孢子虫母蛾研磨液样本，曲线颜色分别是黄绿色、深蓝色、青色；T6-8，含微孢子虫的母蛾研磨液样本，曲线颜色分别是紫色、黄色、浅蓝色)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
<实施例>
1、探针和引物的合成
由于探针序列长度需要介于40-50bp之间，同时淬灭基团和荧光基团分别连接在一对胸腺嘧啶核苷酸上，这对寡聚T中间被1-5个碱基隔开，杂合1-5个碱基中有一个碱基被四氢呋喃取代，根据GenBank公布的EB1-Probe基因全长762bp中进行设计，探针起始于216-256bp共计41bp，淬灭基团和荧光基团分别连在241与245位置，第242位胸腺嘧啶被四氢呋喃取代，形成所需检测探针(EB1-Probe)，EB1-Probe的核苷酸序列为：TGAATTGTATTTTCCAGTAGAGAAA/i6FAMdT/[THF]AA/iBHQ1dT/AAAATGTAAAT，以此为基点设计出30对引物进一步筛选匹配度，设计出的引物如表1所示。
表1引物的核苷酸序列
引物 核苷酸序列
NbEB1-F6 CAAGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGAA
NbEB1-F8 AGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGAA
NbEB1-F9 CAAGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGA
NbEB1-F10 CAAGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTG
NbEB1-F11 AAGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGA
NbEB1-F12 AGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGAAT
NbEB1-R8 AACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTTGT
NbEB1-R9 CTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTTGT
NbEB1-R10 AACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTT
NbEB1-R11 ACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTTG
NbEB1-R12 CAACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTT
2、引物的筛选
2.1筛选引物用试剂盒具体包括：RAA冻干粉具体包括25μL重组聚合酶、10μL待测上游引物F、10μL待测下游引物R、0.6μL探针、20.4μL纯化水。
2.2将抽提得到的DNA为试验的阳性标准品，对阳性标准品分别使用上述反应体系反应测试，反应程序39.2℃1min，39.2℃30s每检测循环，共计检测40个循环。
2.3对表1中的引物进行组合配对，其中R8分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对，R9分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对，R10分别与F6、F8、 F9、F10、F11、F12进行组合配对，R11分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对，R12分别与F6、F8、F9、F10、F11、F12进行组合配对；将组合配对的引物通过2.1 的试剂盒进行检测，检测包括以下具体步骤：
S1、当待测物为家蚕母娥组织研磨液时，向其中加入2倍体积的裂解液混匀，裂解5-10min后，再次震荡混匀，然后稍作静置取其上清液，得待测液；如果待测物为蚕卵，则先震荡破碎，然后加入10倍体积的裂解液混匀，裂解5-10min后，再次震荡混匀，静置30s后，取上清液，得待测液；
S2、对于每一份引物组合取三份试剂盒，将每份试剂盒中的所有试剂混合均匀，得三份预混物；
S3、向每份预混物中加入42.5μL buffer A即42.5μL 20％PEG，待混合均匀后，其中一份中加入5μL样本DNA模板液，得检测组，另外两份分别加入与所述待测液相同量的阳性30000拷贝/μL插入EB1基因片段的重组质粒和20％PEG，分别得阳性对照组和阴性对照组；
S4、向所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中均加入2.5μL buffer B，震荡混匀后，离心，将所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中的溶液离心至试管底部，分别得到待检测的检测组、待检测的阳性对照组和待检测的阴性对照组；
S5、将所述待检测的检测组、所述待检测的阳性对照组和所述待检测的阴性对照组均放入带有荧光检测功能的仪器中，设定程序39.2℃，检测15-20min；
其中，当阳性对照组检测出峰时间≤15min(Ct值大于等于30)为有效结果；阴性对照组无扩增曲线；检测样本有典型的扩增曲线，出峰时间≤18min(Ct值小于等于36)为阳性，出峰时间大于18min为阴性。
通过上述具体检测步骤，对2.2引物的组合配对进行检测，检测结果如图1-5所示，选择其中出峰时间早且峰值较高的引物组，分别为R8+F6、R8+F12、R9+F8、R10+F11、 R11+F6、R11+F11、R11+F12、R12+F12这8组，将此8组进行进一步的分析。
2.4将样品DAN溶液进行10倍稀释作为实验的阳性标准品，对上述8组引物再次进行S1-S5步骤的检测，得到的结果如图6-13所示，当降低模板浓度的情况下，引物R8+F12 组合具有更好的反应敏感性及稳定性，与探针协同效果最优，所以选取F12、R8分别为上下游引物。即当以RAA反应体系检测基Nb.EB1基因时，探针序列为NbEB1-Probe：TGAATTGTATTTTCCAGTAGAGAAA/i6FAMdT/[THF]AA/iBHQ1dT/AAAATGTAAAT，正向引物为NO.1Nb.EB1 F：AGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGAAT，反向引物为NO.2 Nb.EB1 R：AACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTTGT的组合，他们的反应灵敏度和稳定最优，其扩增产物为96bp。
3、家蚕母蛾研磨液稀释10倍检测实例
选取添食显微镜镜检下有微孢子虫和无微孢子虫的母蛾研磨液进行对比测试，各测试 3样本(图14A)，先吸取10μL磨蛾液并稀释10倍，然后加入2倍体积的裂解液裂解5-10min (图14B)，再按照试剂盒使用说明依次在预混冻干粉离心管中加入42.5μL BufferA、5μL 模板溶液(阳性对照、阴性对照、家蚕组织研磨裂解液)、2.5μL Buffer B，然后迅速震荡混合并瞬时离心(见图14C、D)，图14E为制备好的样本上机检测，图14F结果显示稀释10倍后的显微镜母蛾研磨液全部为阳性反应，所有无毒母蛾研磨液显示为阴性，说明该反应体系稳定、准确。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (9)

1.快速检测家蚕微孢子虫的探针，其特征在于，探针的的核苷酸序列为：TGAATTGTATTTTCCAGTAGAGAAA/i6FAMdT/[THF]AA/iBHQ1dT/AAAATGTAAAT。
2.快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于，包括：上游引物、下游引物、探针。
3.如权利要求2所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列为：AGCCTTTTTAATTGCAAATAAAATTGAAT；所述下游引物的核苷酸序列为：AACTTTTGAGCTACTTCTAAATTATCTTGT。
4.如权利要求2所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒，其特征在于，所述上游引物、所述下游引物和所述探针为混合均匀的冻干粉。
5.如权利要求2-4任一项所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将待测物研磨粉碎或匀浆破碎，加入裂解液静置裂解后，取上清液，得待测液；
S2、取三份试剂盒，将每份试剂盒中的所有试剂混合均匀，得三份预混物；
S3、向每份预混物中加入buffer A，待混合均匀后，其中一份中加入待测液，得检测组，另外两份分别加入与所述待测液相同量的阳性DNA对照模板和阴性对照模板，分别得阳性对照组和阴性对照组；
S4、向所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中均加入buffer B，震荡混匀后，离心，将所述检测组、所述阳性对照组和所述阴性对照组中的溶液离心至试管底部，分别得到待检测的检测组、待检测的阳性对照组和待检测的阴性对照组；
S5、将所述待检测的检测组、所述待检测的阳性对照组和所述待检测的阴性对照组均放入带有荧光检测功能的仪器中，设定程序39.2℃，检测15-20min。
6.如权利要求5所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤S3中所述buffer A为20％PEG，步骤S4中所述buffer B为醋酸镁。
7.如权利要求5所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述阴性对照模板为20％PEG。
8.如权利要求5所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述阳性DNA对照模板为插入EB1基因片段的重组质粒。
9.如权利要求8所述的快速检测家蚕微孢子虫的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述阳性DNA对照模板的模板为30000拷贝/μL。
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