CN103131773A

CN103131773A - 一种家蚕病原微孢子虫lamp可视化快速检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN103131773A
Application number: CN2013100268701A
Authority: CN
Inventors: 刘吉平; 杨吉龙
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-01-24
Filing date: 2013-01-24
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2033-01-24
Also published as: CN103131773B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法。所述试剂盒包含四条LAMP引物、DNA裂解液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品和显色液，构成检测反应体系，在60~65℃的恒温条件下，快速扩增模板DNA，通过加入显色染料，在自然光下通过肉眼观察判读结果：反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕病原微孢子虫；反应产物变橙色，则不含有家蚕病原微孢子虫。该试剂盒可快速、灵敏地检测目前多种家蚕病原微孢子虫，其操作简单、成本低廉、不需要特殊复杂的仪器、反应结果易于判定，特异性强，能较好地满足疾病监测、现场应急以及生产样本检测的迫切需要，易于大范围推广应用。

Description

一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更为具体地，涉及一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

微孢子虫（Microsporidia）是一类专性细胞内寄生的单细胞真核生物。由家蚕病原微孢子虫寄生家蚕引起的家蚕微粒子病，是蚕桑生产上危害严重而又长期得不到根治的传染性疫病，并严重制约着蚕丝业的健康稳定的发展。19世纪中叶曾因该病的蔓延，给欧洲的蚕丝业带来了毁灭性的破坏；上个世纪初家蚕微粒子病也给中国、日本、印度等养蚕国带来了极大地危害。自Nageli首次发现家蚕微孢子虫以来，世界各地又陆续从家蚕体内分离出多种不同种属的微孢子虫（汪忠康. 家蚕异形微孢子虫与交叉传染. 江苏蚕业,2001,(2):19-21；Takeshi Kawarabata. Biology of microsporidians Infecting the Silkworm, Bombyx mori, in Japan. Journal of Insect Biotechnology and Sericology, 2003, 72: 1-32）。且研究发现，其它昆虫来源的微孢子虫如菜粉蝶微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫等也能感染家蚕（黄旭华,朱方容,刘吉平等. 广西菜粉蝶微孢子虫对家蚕的病原性研究. 广西农业科学,2009,40(4):415-419；廖模祥,刘吉平,郝娟等.2种野外昆虫来源微孢子虫的超微结构及生活史观察.中国蚕业,2011,(1):17-20），说明野外昆虫微粒子病的传染也是造成家蚕微粒子病的一个重要因素（吉英. 2010.补正检查出微孢子虫与原种跟踪调查探讨. 四川蚕业,38(2):58-60）。因此，开展对家蚕病原微孢子虫的快速诊断及对其进行种属特异性鉴别，将为系统预防和控制家蚕微粒子病提供重要依据。但由于家蚕病原微孢子虫来源的复杂性、存在种属基因多样性和生态多样性，使微孢子虫的检测和鉴别一直成为蚕业研究的重点和难点。近年来我国原种超毒淘汰的比例逐年增加的趋势相对明显。大体上，每生产1万张原种，因检测出家蚕微孢子虫而淘汰近1000张，而剩余的带毒合格的和无毒合格的基本各占50%，直接经济损失达上千万元，且这个比例还是发生在条件和技术相对较好的桑蚕原种场内（中国农业科学院蚕业研究所,全国桑蚕微粒子病发生情况调研资料汇编，2010）。因此开展对家蚕病原微孢子虫的快速诊断技术研究，为系统预防和控制家蚕微粒子病提供重要技术依据，提高蚕种检疫的质量，对家蚕微粒子病的防治具有重要的科学意义。

目前国内外蚕种生产环节的检测检疫工作主要是针对家蚕微粒子病病原微孢子虫的检验，世界各养蚕国家均将家蚕微粒子病列为检疫对象。目前实验室中已经建立的新检测方法有：显微镜镜检法（王玉强.柞蚕微孢子虫浸染甜菜夜蛾的生物学特性研究,华南农业大学硕士学位论文.2009；刘吉平,曾玲.Calcofluor White M2R 荧光染色法识别家蚕微孢子虫.昆虫学报,2007,50(11):1185-1186）、免疫学检测法（梅玲玲,金伟. SPA-协同凝集反应快速鉴别微孢子虫孢子的研究.蚕业科学,1988,2:110-111；刘吉平,卢铿明,徐兴耀等. 单抗免疫金银染色法诊断家蚕微孢子虫的研究. 广东蚕业,1995,29(3):30-35；李艳红,谢俪,潘国庆等, 家蚕微孢子虫抗体免疫荧光检测方法的建立及应用. 西南农业大学学报.2006,28(6):990-993）、PCR技术（刘吉平,曹阳,Smith J.E等. 模拟感染家蚕微粒子病的PCR分子诊断技术研究. 中国农业科学,2004,37(12): 1925-1931）、核酸分子杂交方法（蔡平钟,邱宝利,周鹏. PCR和核酸杂交检测家蚕微孢子虫的研究(摘报). 四川蚕业,2000,28(4):15）等。但是，上述检测方法均都存在耗时费力、特异性不强且不适于野外检测等缺点，不利于实际生产上广泛地推广和使用。

环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是日本学者Notomi等（2000）发明的一种新型体外等温扩增特异核酸判断的技术（Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al.. 2000. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Research, 28(12): e63）。随着LAMP技术的发展，LAMP技术在农林畜牧业上的应用取得不俗的成绩，已成功应用LAMP技术检测病毒、细菌以及寄生虫等病原的检测（杨丽，何晓青，韦玉梅等. 环介导等温扩增技术(LAMP)检测人星状病毒方法的建立及其在再生水检测中的应用.生态毒理学报,2011,6(6):600-606；Diaeldin A. Salih & Awadia M. Ali & Zhijie Liu et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification method for detection of Theileria lestoquardi. Parasitol Res.2012，（110）:533-538）。

LAMP法具有特异性强，快速、高效，敏感性高，操作简便，检测方法简单等优点，肉眼即可判断结果，从而简化了检测过程，检测时间也大大缩短。目前尚未见应用LAMP技术用于检测多种家蚕病原微孢子虫的相关技术报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术家蚕病原微孢子虫检测技术的不足，提供一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒。利用所述检测试剂盒，能快速、灵敏地检测出多种目前法定检验检疫所要求的家蚕病原微孢子虫。

本发明的里一个目的是提供一种如上所述家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒的检测方法。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒，包括一对内侧引物NFI1/ NBI1和一对外侧引物NF1/ NB1，引物序列如SEQ ID NO:1~4所示。

进一步地，试剂盒还包含基因组DNA裂解液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品和显色液；

所述LAMP反应液除含有如上所述引物还含有2×LAMP反应缓冲液、Bst DNA 聚合酶（8U/μL）、密封液和无菌水。

优选地，所述2×LAMP反应缓冲液含有20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 mM MgSO₄；20 mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8 mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂。

优选地，所述DNA裂解液含有10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS。

优选地，所述阳性对照品为家蚕微孢子虫基因组DNA或含有家蚕微孢子虫SSUrRNA基因的重组质粒，阴性对照品为正常家蚕组织DNA。

优选地，所述显色液为SYBR Green I、EvaGreen或钙黄绿素。

优选地，所述试剂盒的反应体系为：

Figure 2013100268701100002DEST_PATH_IMAGE001

反应体系中引物的浓度可以根据具体反应来确定，优选方案中引物NF1和NB1的浓度都为5pmol/μL；引物NFI1和NBI1的浓度都为40pmol/μL。

优选地，所述试剂盒的LAMP反应条件为60~65℃恒温反应30~90 min；然后 80~100℃，1~10 min灭活。

优选地，所述密封液为甘油。

一种用如上所述试剂盒检测家蚕病原微孢子虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.在反应管中配置反应体系；

S3.向反应体系中加入密封液，在反应管盖内侧加入显色液；

S4.反应：将反应管60~65℃恒温反应30~90 min；然后 80~100℃，1~10 min灭活。

S5.结果判读：将显色液与反应产物混合；观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕病原微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕病原微孢子虫。

本发明采用环介导核酸等温扩增技术，与现有检测技术相比，具有以下优点：

本发明设计的引物组是该技术的关键，通过基因数据库中检索获得已公布的多种家蚕病原微孢子虫的16SrDNA基因序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得家蚕病原微孢子虫16SrDNA的高度保守序列，作为靶基因设计四条LAMP引物；同时在只有四条特异性引物完全识别靶基因的6个区域的情况下，才能进行扩增，从而保证了其对家蚕病原微孢子虫16SrDNA基因扩增的特异性和检测的全面性。

本发明的可视化快速检测试剂盒，应用四条基于微孢子虫16SrDNA序列设计的LAMP引物，能够检测出多种目前法定检验检疫所要求的家蚕病原微孢子虫。如家蚕微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、桑尺蠖微孢子虫、蝗虫微孢子虫、玉米螟微孢子虫等。

本发明的可视化快速检测试剂盒，能够到检测浓度为10³个/mL的微孢子虫，对阳性标准品浓度仅需100个拷贝数即可检测到。

本发明整个反应可在30~90min内完成，检测时间短，快速有效。

本发明采用LAMP技术，恒温扩增，不需要特殊仪器或设备，只需要水浴锅等提供恒温的设备。

本发明的检测方法结果易于观察判定，在反应产物中加入显色液，通过直观的显色反应就可以肉眼鉴别检测。在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕病原微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕病原微孢子虫。

本发明所述的家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒，采用煮沸法快速抽提微孢子虫DNA，结合设计的特异性引物和优化后的反应体系，操作简单、成本低廉、反应结果易于判定，特异性强，为应用LAMP技术进行家蚕病原微孢子虫的早期检测和预知检查提供重要基础和技术储备，能较好地满足疾病监测、现场应急以及生产样本检测的迫切需要，易于大范围推广应用。

附图说明

图1.四条LAMP引物设计的靶基因序列和位置示意图。

图2.家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测家蚕病原微孢子虫DNA结果；1 .家蚕微孢子虫；2. 柞蚕孢子；3. 小菜蛾孢子；4. 浙江小孢子；5. 玉米螟孢子；6. 斜纹夜蛾孢子；7. 广西桑尺蠖孢子；8. 菜粉蝶孢子（华农农场）；9. 蝗虫孢子；10. 菜粉蝶孢子；11.阳性对照品；12. 正常家蚕基因组DNA；13. ddH₂O。

图3.家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同浓度阳性对照品（重组质粒16SrDNA-pUCm）结果；1~10号反应管分别为稀释10¹⁰-10¹后的重组质粒 16SrDNA+pUC；11.N.bombycis DNA；12.正常家蚕组织DNA；13.无菌水。

图4.家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测不同浓度家蚕微孢子虫灵敏性结果；1~9分别为：4.8×10⁰个孢子/mL；4.8×101个孢子/mL；4.8×10²个孢子/mL；4.8×10³个孢子/mL；4.8×10⁴个孢子/mL；4.8×10⁵个孢子/mL；4.8×10⁶个孢子/mL；4.8×10⁷个孢子/mL；4.8×10⁸个孢子/mL；10 .阳性对照品； 11.正常家蚕DNA ；12.无菌水。

图5.家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测流程。

图6.家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒应用于生产样品的检测结果；1~32号管分别为收集自广东省蚕业技术推广中心显微镜镜检疑似感染微孢子虫的蚕蛾研磨液；33.阳性对照品；34.正常家蚕DNA；35.无菌水。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒的制备方法，具体方法步骤如下：

S1.从基因数据库中检索获得家蚕病原微孢子虫：家蚕微孢子虫、菜粉蝶微孢子虫、斜纹夜蛾微孢子虫、桑尺蠖微孢子、蝗虫微孢子冲、玉米螟微孢子虫等的16SrDNA序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得家蚕病原微孢子虫16SrDNA的保守序列，作为靶基因；

S2.使用在线软件：Primer ExplorerV4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0 /index.html）设计并合成四条特异性LAMP检测用引物组；引物组包括一对内侧引物NFI1/ NBI1和一对外侧引物NF1/ NB1，四条LAMP引物序列为：NF1：5'-GGGGATAGTATGATCGCAAG-3'，引物序列如SEQ ID NO:1所示；NB1：5'-CCTCTCCTTCATATGTATCACTAC-3'，引物序列如SEQ ID NO:2所示；NFI1：5'- ACCCCGGGTTGAGTCAAATTAAAAAGTGACGGAAGAATACCAC -3'，引物序列如SEQ ID NO:3所示；NBI1：5'- GTGCATGGCCGTTTCCAATGAGGGTCTCACATCTTGTTG-3'，引物序列如SEQ ID NO:4所示。

引物的靶基因序列和位置信息如附图1所示。

S3.家蚕病原微孢子虫的模板DNA的制备方法：

取200 μL 孢子液于或蚕蛾研磨液无菌的1.5mL离心管中；12000 r/min，离心5min，弃上清；将DNA裂解液（10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8.0；0. 5% SDS）置于110 ℃电热鼓风干燥箱中孵育10~15 min；加100μL 裂解液于孢子沉淀中，混匀后，煮沸10~15 min；将混合液12000 r/min，离心10 min，取上清，即为DNA溶液，置-20℃冰箱保存备用。

S4.制备阳性对照品和阴性对照品：按常规方法提取家蚕微孢子虫的DNA作为阳性对照品，或者还可以利用上游引物NF1、下游引物NB1为反应引物，以按常规方法提取的家蚕微孢子虫DNA为模板进行PCR扩增，反应条件为：94℃，5min；94℃，30s；57.2℃，45s；72℃，45s；72℃10min，32个循环；

扩增产物克隆入pUCm-T载体获得16SrDNA-pUCm重组质粒作为检测阳性对照品。按常规方法提取正常家蚕组织DNA作为阴性对照品，本实施例所用正常家蚕组织为家蚕中肠组织，正常家蚕的其它组织也都可以满足使用。

S5.引物组NF₁/NB₁作为外部引物，NFI₁/NBI₁作为内部引物，LAMP反应液包括如下组分：2×LAMP反应缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 m M MgSO₄；20 mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂）；引物NFI₁/NBI₁（40 pmol/μL）和引物NF₁/NB₁(5pmol/μL)；阳性对照品；阴性对照品；BstDNA 聚合酶（8U/μL）；密封液；显色液（SYBR Green I）；无菌水。将上述试剂分管组装成盒即为家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒。试剂盒的检测用配制体系如下：

显色液也可以采用EvaGreen或钙黄绿素。

实施例2

应用参照实施例1制备得到的家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒进行检测，具体步骤如下：

S1.制备待测样品核酸：

将电热鼓风干燥箱调整温度至110℃，加热；取200 μL 孢子液于或蚕蛾研磨液无菌的1.5mL离心管中；12000 r/min，离心5min，弃上清；将DNA裂解液（10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS）放于110 ℃电热鼓风干燥箱中孵育10~15 min；加100μL 裂解液于孢子沉淀中，混匀后，煮沸10~15 min；将混合液12000 r/min，离心10 min，取上清，即为DNA溶液，置-20℃冰箱保存备用。

S2.配置反应体系：在200μL的反应管中配置，采用优化后的25μL反应体系，如下表所述：

Figure 2013100268701100002DEST_PATH_IMAGE003

建议：对于N个样品，应配制（N+4）倍体积的反应液（包括空白对照、阴性对照、阳性对照各一个，以免分装耗费误差），保证各反应管分装均匀。

S3.加样：分装后，分别依次向反应管加入2μL 的无菌水（空白对照）、阴性对照品家蚕正常组织DNA、阳性对照品16SrDNA-pUCm、各模板DNA；然后加入甘油20μL密封，在反应管管盖内侧加入1μL显色液，将管盖盖紧（小心注意避免显色液掉入反应液中）。

S4.反应：将反应管置于恒温水浴箱或其他恒温设备中，63℃恒温放置40~60 min；然后 95℃，放置2 min灭活。

S5.结果判读：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品含有家蚕病原微孢子虫；反应产物变为橙色，则不含有家蚕病原微孢子虫。

实施例3

应用参照实施例1制备得到的家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒检测多种家蚕病原微孢子虫。

S1.实验材料与方法

S11.实验生物材料

家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，实验室保存）；桑尺蠖微孢子虫（Microsporidium spp. 收集自自然寄主桑尺蠖 Phthonandria atrilineataButler）、小菜蛾微孢子虫（收集自自然寄主小菜蛾 Pluella xylostella）、菜粉蝶微孢子虫（收集自自然寄主菜粉蝶Pieristrapae linne）、斜纹夜蛾微孢子虫（收集自自然寄主斜纹夜蛾 Prodenia litura）、柞蚕微孢子虫（Nosema antheraeae，简称N.a，分离自柞蚕蛾）等均为华南农业大学亚热带蚕病防控岗位专家实验室收集保存株，；玉米螟微孢子虫（Nosema pyrausta，简称 N.p），广州市生物防治站赠送；蝗虫微孢子虫（Antonospora locustae，简称A.l）由美国Solter L. 博士赠送，华南农业大学亚热带蚕病防控岗位专家实验室分离纯化所得；浙江小孢子（Microsporidiansp.）由浙江大学鲁兴萌教授馈赠。本技术领域技术人员也可以采用其他方式获得的同种微孢子虫。

S12.主要试剂和仪器

DNA裂解液：取9mL 1MTris-HCl（pH 8.0）、1.8mL 0.5M EDTA、18mL 5M KCl和90mL 1% Triton X-100混匀后，用无菌水定容至900mL。

本发明的家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒。

数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）或恒温金属浴（VZC-612，杭州博日科技有限公司）

S13.多种家蚕病原微孢子虫的模板DNA的制备：

分别取200μL 家蚕微孢子虫、柞蚕孢子、小菜蛾孢子、浙江小孢子、玉米螟孢子、斜纹夜蛾孢子、广西桑尺蠖孢子、菜粉蝶孢子、蝗虫孢子、菜粉蝶孢子的孢子液于无菌的1.5mL离心管中；12000 r/min，离心5min，弃上清；将DNA裂解液（10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS）放于110℃电热鼓风干燥箱中孵育10~15 min；加100μL 裂解液于孢子沉淀中，混匀后，煮沸10~15 min；将混合液12000 r/min，离心10 min，取上清，即为DNA溶液，置-20℃冰箱保存备用。

S14.配制反应体系

在200μL的反应管中配置，采用优化后的25μL反应体系，如下表所述：

S15.加样：分装后，分别依次向反应管加入2μL 的ddH₂O（空白对照）、阴性对照品、阳性对照品、各模板DNA；然后加入甘油20μL密封，在反应管管盖内侧加入1μL显色液，将管盖盖紧（小心注意避免显色液掉入反应液中）。

S16.反应：将反应管置于恒温水浴箱或恒温金属浴中，63℃恒温放置40~60 min；然后 95℃，放置2 min灭活。

S2.实验结果

S21.结果判读：将反应管管盖内侧的显色液弹入反应管，与反应产物混合；在自然光下通过肉眼观察颜色变化，反应产物颜色变为绿色，说明待测样品中含有家蚕病原微孢子虫；反应产物变为橙色，则说明样品中不含家蚕病原微孢子虫。

S22.试剂盒检测多种家蚕病原微孢子虫结果

实验结果如附图2所示，对照结果正常，该反应体系没有被污染，结果可信。仅有4号样品浙江小孢子结果显示为橙色，为阴性。实验结果表明，本发明的用于检测家蚕病原微孢子虫的LAMP试剂盒能够检测出除浙江小孢子以外的其它9种昆虫孢子。

实施例4

家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒应用于生产样品的检测

S1.实验材料与方法

S11.供试生产材料：32份广东省蚕业技术推广中心提供的疑似感染微粒子的蚕蛾研磨液。

S12.主要仪器和试剂同实施例1

S13.样品DNA提取同实施例1

S14.配置反应体系、加样、反应条件和结果判读同实施例1

S2.实验结果

实验结果如附图6所示，对照结果正常，该反应体系没有被污染，结果可信。32份检测样品，26份样品颜色为绿色，为阳性，6份为橙色，阴性，检出率为81.25%。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒及其检测方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> NF1

<400> 1

ggggatagta tgatcgcaag 20

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> NB1

<400> 2

cctctccttc atatgtatca ctac 24

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> NFI1

<400> 3

accccgggtt gagtcaaatt aaaaagtgac ggaagaatac cac 43

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> NBI1

<400> 4

gtgcatggcc gtttccaatg agggtctcac atcttgttg 39

Claims

1.一种家蚕病原微孢子虫LAMP可视化快速检测试剂盒，其特征在于，包括一对内侧引物NFI1/ NBI1和一对外侧引物NF1/ NB1，引物序列如SEQ ID NO:1~4所示。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含基因组DNA裂解液、LAMP反应液、阳性对照品、阴性对照品和显色液；

所述LAMP反应液除含有权利要求1所述引物还含有2×LAMP反应缓冲液、Bst DNA 聚合酶、密封液和无菌水。

3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述2×LAMP反应缓冲液含有20 mM Tris-HCl，pH8.8；10 mM KCl；2 mM MgSO₄；20 mM（NH₄）₂SO₄；0.1% Triton X-100；2.8 mM dNTPs；1M甜菜碱；25mM MgCl₂。

4.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述DNA裂解液含有10 mM Tris-Cl，pH8. 0；0. 1 M EDTA，pH 8. 0；0. 5% SDS。

5.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为微孢子虫基因组DNA或含有微孢子虫SSUrRNA基因片段的重组质粒、阴性对照品为正常家蚕组织模板DNA。

6.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述显色液为SYBR Green I、EvaGreen或钙黄绿素。

7.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：

2×LAMP反应缓冲液 12.5μL；

引物NFI1/ NBI1和NF1/ NB1 1μL ；

Bst DNA 聚合酶（8U/μL） 1μL；

模板DNA 2μL；

无菌水 8.5μL；

引物NF1和NB1的浓度都为5pmol/μL；引物NFI1和NBI1的浓度都为40pmol/μL。

8.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的LAMP反应条件为60~65℃恒温反应30~90 min；然后 80~100℃，放置1~10 min灭活。

9.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述密封液为甘油。

10.一种用权利要求1至9任一项所述试剂盒检测家蚕病原微孢子虫的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.提取待测样品DNA；

S2.在反应管中配置反应体系；

S3.向反应体系中加入密封液，在反应管盖内侧加入显色液；

S4.反应：将反应管60~65℃恒温反应30~90 min；然后 80~100℃，灭活1~10min；