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Fachgebiet
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein diagnostisches Kombinationsverfahren
zum Identifizieren von Individuen, bei denen das Risiko von irreversiblen
neurologischen Schäden,
einschließlich
Demenz, besteht.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
basiert auf der Kombination zweier Tests, die an einer Blut- oder Serumprobe
durchgeführt
werden, insbesondere um Patienten zu identifizieren, die dazu neigen,
einen B12-Mangel zu entwickeln und bei denen somit das Risiko besteht,
Beschwerden zu entwickeln, die sich aus einem derartigen Mangel
ergeben, wie etwa irreversible neurologische Schäden, einschließlich Demenz
und perniziöser
Anämie.
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Hintergrund
der Erfindung
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Eine
Reihe von verschiedenen Magenkrankheiten oder -beschwerden, wie
etwa chronisch-atrophische
Gastritis, perniziöse
Anämie,
Magengeschwür,
Magenpolyposis und das Ménétrier-Syndrom (Riesenfaltengastritis),
gehen Magenkrebs voran. Deutlich erkennbare Veränderungen der Schleimhaut sind
Dysplasie und Adenom. Es ist bewiesen worden, dass bei fast allen
Krankheiten das Risiko über
chronisch-atrophische Gastritis vermittelt wird.
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Chronische
Gastritis bedeutet einen längeren
entzündlichen
Zustand der Magenschleimhaut. Die Krankheit kann grob in die oberflächliche
und die atrophische Form unterteilt werden. Bei der oberflächlichen
Gastritis ist die Infiltration von Entzündungszellen unterhalb des
Oberflächenepithels
konzentriert. Im Falle, dass die Entzündung fortschreitet und zwischen
die spezifischen sekretorischen Magendrüsen diffundiert, wird sie als
chronisch-atrophische Gastritis bezeichnet. In einem derartigen
Fall werden die normalen Drüsenstrukturen
der Magenschleimhaut zumindest teilweise durch metaplastische Veränderungen
ersetzt.
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Das
relative Risiko für
Magenkrebs bei Patienten, die an atrophischer Gastritis im Corpusbereich des
Magens leiden, gegenüber
Personen, die eine gesunde Schleimhaut aufweisen, ist, wie aus den
finnischen Krebsstatistiken berechnet, auf etwa das 4- bis 5-fache
veranschlagt worden. Außerdem
besteht ein Risiko, infolge eines Intrinsic-Faktor-Mangels und einer
Vitamin-B12-Resorptionsstörung an
perniziöser
Anämie
zu erkranken. Bei schwerer Atrophie des Antrumbereichs ist das Risiko
sogar 18-fach. Falls atrophische Veränderungen sowohl im Antrum-
als auch im Corpusbereich auftreten (Pangastritis), kann das Risiko
sogar auf das 90-fache ansteigen.
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Die
Veröffentlichung
WO 96/15456 offenbart ein Screeningverfahren für das Risiko für Magenkrebs,
nach welchem Atrophie in der Schleimhaut von entweder dem Corpus-
oder dem Antrumbereich, oder von beiden, durch das Bestimmen des
Pepsinogen-I (PGI)- und Gastrin-17 (G-17)-Analytspiegels in einer
Serumprobe und das Vergleichen der so bestimmten Spiegel mit einem
verfahrensspezifischen Cut-Off-Wert für den jeweiligen Analyt bestimmt
wird. Die bestimmten Spiegel werden vorzugsweise auch mit einem
verfahrensspezifischen Referenzwert für den jeweiligen Analyt verglichen.
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Die
Veröffentlichung
B. Regland, Aging Clin. Exp. Res. Bd. 4, Nr. 1, 1992, S. 35–41, betrifft
eine Studie, die bei Patienten mit Demenzstörungen eine Beziehung zwischen
der Serumkonzentration von PGI und Gastrin einerseits und Vitamin
B12 andererseits beurteilt.
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Ein
Serum-PGI-Wert unterhalb des spezifischen Cut-Off-Wertes für PGI deutet
auf atrophische Gastritis im Corpusbereich des Magens hin. Falls
die Serum-G-17-Konzentration unterhalb ihres Cut-Off-Wertes liegt,
befindet sich die Atrophie im Antrumbereich des Magens. Bei Pangastritis
liegt das Serum-PGI unterhalb des Cut-Off-Wertes und der Serum-G-17-Wert
liegt an der unteren Grenze seines Referenzwertes.
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Die
Versorgung mit ausreichend Vitamin B12 ist für den Folatmetabolismus und
die normale Blutbildung notwendig, sowie für die Funktion der Nervenzellen.
Vitamin B12 bildet einen Komplex mit einem Protein, dem Intrinsic-Faktor,
der von der Schleimhaut des Corpusbereichs des Magens produziert
wird, wobei der Komplex im unteren Teil des Ileums resorbiert wird.
Das ist die bevorzugte Resorptionsform von Vitamin B12.
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Ein
Mangel an Intrinsic-Faktor, als Folge von atrophischer Gastritis
oder Magenkrebs, insbesondere im Corpusbereich des Magens, wird
letztlich zu einem Mangel an Vitamin B12 im Körper führen. Ein längerer Mangel kann zu der Entwicklung
von perniziöser
Anämie
führen
und sogar früher,
innerhalb eines Jahres, zu irreversiblem neurologischem Schaden
und Demenz. Ein Vitamin B12-Mangel ist somit ein bedeutender Risikofaktor,
der bei der Entwicklung von neurologischen Störungen, wie etwa Demenz, insbesondere
bei der älteren
Bevölkerung,
zu berücksichtigen
ist. Es ist geschätzt
worden, dass hunderttausende Personen an einem heimlichen Defizit an
Vitamin B12 leiden. In diesen Fällen
wäre die
Behandlung mit Vitamin B12-Injektionen
einfach und wirksam, falls das Defizit bekannt wäre. Es wäre insbesondere wertvoll, imstande
zu sein, diejenigen Individuen zu identifizieren, welche noch keinen
Vitamin B12-Mangel
entwickelt haben, die aber ein beträchtliches Risiko aufweisen,
diesen in der Zukunft zu entwickeln, sofern nicht Maßnahmen
getroffen werden, die Entwicklung eines derartigen Mangels zu verhindern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Kombinieren eines
Tests für
das Bestimmen, in einer Serumprobe, eines Markers für atrophische Gastritis
mit einem Test auf Vitamin B12 gerichtet, um bei der Diagnose von
irreversiblem, neurologischem Schaden bei einem Individuum, oder
bei der Bestimmung des Risikos dafür, mitzuhelfen.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist ein Verfahren zum Identifizieren eines Individuums, bei dem
das Risiko von irreversiblem neurologischem Schaden und perniziöser Anämie besteht,
wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
- – quantitatives
Bestimmen der Pepsinogen-I (PGI)-Analytkonzentration in einer Serumprobe des
Individuums,
- – Auswählen eines
verfahrensspezifischen Cut-Off-Wertes für den Analyt,
- – Vergleichen
der so bestimmten Analytkonzentration mit dem verfahrensspezifischen Cut-Off-Wert
für den
Analyt und
- – Bestimmen
der Konzentration eines Analyts, ausgewählt aus Vitamin B12, Methylmalonat
und Homocystein, in einer Serumprobe des Individuums, und Vergleichen
dieser Konzentration mit einem verfahrensspezifischen Referenzwert
für den so
bestimmten Analyt, wobei ein Serum-PGI-Konzentrationswert unterhalb
seines spezifischen Cut-Off-Werts in Kombination mit einem normalen Vitamin
B12-, Methylmalonat- oder Homocystein-Konzentrationswert einen Hinweis
auf ein derartiges Risiko darstellt.
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Die
Bestimmung der Serum-PGI- und Vitamin-B12-Konzentrationen, oder
von Methylmalonat oder Homocystein, die mit der B12-Konzentration korrelieren,
kann in beliebiger Reihenfolge stattfinden, um gleichzeitig Kenntnis
von sowohl Serum-PGI- als auch Vitamin-B12-Spiegeln zu erhalten, zwecks
Mithilfe bei der Diagnose oder der Beurteilung des Risikos für neurologischen
Schaden bei dem Individuum. Jedoch wird gemäß einer Ausführungsform
der Erfindung die Serum-PGI-Konzentration bestimmt und mit ihrem
verfahrensspezifischen Cut-Off-Wert verglichen und für die weitere
Diagnose wird ein Individuum ausgewählt, das einen Serum-PGI-Konzentrationswert
unterhalb seines verfahrensspezifischen Cut-Off-Wertes aufweist.
In dieser Ausführungsform
wird nur bei den Individuen, die niedrige Serum-PGI-Werte zeigen,
die auf Corpus-Atrophie hinweisen, das Vitamin B12 überprüft.
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Somit
zielt, gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform,
die vorliegende Erfindung insbesondere auf die Überprüfung solcher Individuen ab,
welche noch keinen Vitamin B12-Mangel zeigen, das heißt, welche
im Wesentlichen normale Vitamin B12-Spiegel zeigen, welche aber
infolge diagnostizierter Atrophie im Corpusbereich des Magens dazu
neigen, im Laufe der Zeit einen derartigen Mangel zu entwickeln.
Eine derartige Identifizierung macht es möglich, bereits in einem frühen Stadium
vorbeugende Maßnahmen
zu ergreifen, um der Entwicklung der mit Vitamin B12-Mangel verbundenen
Beschwerden, insbesondere irreversibler neurologischer Schaden, der
sich früher
entwickelt als Anämie,
entgegenzuwirken.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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1. Bestimmung von Pepsinogen-I
(PGI)
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Das
Verfahren zur Bestimmung von PGI in einer Serumprobe kann durchgeführt werden,
wie es in der Veröffentlichung
WO 96/15456 beschrieben wird, wobei die Veröffentlichung hier zur Bezugnahme
eingeschlossen ist.
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Das
Verfahren schließt
vorzugsweise die Schritte der Verwendung von poly- oder monoklonalen
Antikörpern
gegen Pepsinogen-I in einem immunologischen Verfahren zur Bestimmung
von Pepsinogen-I ein. Geeigneterweise wird die Reaktion auf einem
geeigneten Träger,
wie etwa einem Plastik-, Glas- oder Celluloseträger, beispielsweise auf einer Mikroplatte,
durchgeführt.
Die immunologischen Verfahren können
auf bekannte Weise durchgeführt
werden, z.B. unter Verwendung von Extinktions-, Lumineszenz- oder
Fluoresenzverfahren zur Messung der Pepsinogen-I-Konzentration in
der Probe.
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Der
verfahrensspezifische Cut-Off-Wert, in diesem Fall für Serum-PGI,
wird je nach der für
den für
die Bestimmung der Analytkonzentration verwendeten Test gewählten Spezifität und Sensitivität ausgewählt und
ist als solcher dem Fachmann gut bekannt, siehe z.B. William J Marshall,
Clinical Chemistry, Dritte Auflage, 1995, Mosby, insbesondere Seite
7.
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Falls
die Serum-Pepsinogen-I-Konzentration unterhalb des Cut-Off-Wertes
liegt, welcher je nach der für
das betreffende Verfahren vereinbarten Spezifität und Sensitivität 20–30 μg/l beträgt, was
annähernd
450–690
pmol/l entspricht, liegt Atrophie im Corpusbereich des Magens vor.
Der normale oder Referenzwert für
PGI liegt im Bereich von 25–120 μg/l.
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2. Bestimmung von Vitamin
B12
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Die
Vitamin B12 (Cobalamin)-Konzentration in einer Serumprobe kann gemäß eines
der per se für diesen
Zweck bekannten Verfahren bestimmt werden. Derartige bekannte Verfahren
schließen
einen mikrobiologischen Test auf Serum-B12 ein, der einen Organismus,
wie etwa Euglena gracilis oder Lactobacillus leichmannii, einsetzt,
welcher Cobalamin für das
Wachstum benötigt.
Auch Radioisotop-Verdünnungstests
für Vitamin
B12 sind genutzt worden und derartige Testverfahren sind in der
Literatur gut dokumentiert, z.B. Lau et al., "Measurement of serum B12 levels using
Radioisotope Dilution and Coated Charcoal", Blood, 26 (1965), 202. Radioisotop-Verdünnungsverfahren
sind schneller und ergeben Ergebnisse, vergleichbar mit z.B. dem
Euglena-Test, vorausgesetzt, das Bindungsprotein ist spezifisch
für biologisch
aktives Cobalamin. Ein standardisiertes reines oder gereinigtes
Intrinsic-Faktor-Präparat
ist als das Bindungsprotein am besten zufriedenstellend, da es spezifisch
echtes Cobalamin anstatt Cobalamin-Analoga bindet.
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Der
Radioisotop-Verdünnungstest
auf Vitamin B12 schließt
im Allgemeinen den Schritt des Freisetzens von endogenem B12 von
seinem natürlichen Bindungsprotein,
z.B durch Kochen bei einem ausgewählten pH-Wert, und danach des
Zugebens einer abgemessenen Menge des Radioisotops 57Co-B12 und
einer begrenzten Menge an Bindungsprotein ein. Das gesamte Bindungsprotein
wird von irgendeiner Form des B12 gebunden, da die zugegebene Menge an
Radioisotop-B12 ausreicht, um die kleine Menge an Protein zu binden.
Da sowohl das natürliche
als auch das radioaktive B12 um die Bindung mit dem Bindungsprotein
konkurrieren, deutet der Grad, zu dem die radioaktive Zählung des
Protein-gebundenen B12 gehemmt wurde, auf die Menge an B12 in der
Probe hin. Dieses Verfahren ist von Lau, vorstehend, durch Abtrennen
des ungebundenen B12 von Protein-gebundenem B12 mit Protein-beschichteter Kohle
und Zählen
der Radioaktivität
der überstehenden
Flüssigkeit,
die das Gemisch aus gebundenem radioaktivem B12 und gebundenem nicht-radioaktivem
B12 enthält,
modifiziert worden. Die Serum-B12-Konzentration wird dann aus der Zählung berechnet,
oft durch Vergleich mit einer Standardkurve. Radiotest-Sets zur
Durchführung
des Verfahrens sind im Handel erhältlich.
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Es
sind auch andere Verfahren zum Testen von B12-Spiegeln in einer
Serumprobe verfügbar.
Da ein Cobalamin-Coenzym für
die Isomerisierung von Methylmalonat zu Succinat essentiell ist,
wird bei Vitamin B12-Mangel die Ausscheidung erhöhter Mengen an Methylmalonat
festgestellt. Dies liefert einen empfindlichen Test auf Vitamin
B12-Mangel. Außerdem
sind Plasmaspiegel von Homocystein ebenso erhöht. Das US-Patent 4,940,658
beschreibt ein Verfahren zum Nachweis erhöhter Homocysteinspiegel durch
das Vereinen einer Probe mit einer bekannten Menge an markiertem
Homocystein und das Bestimmen des Verhältnisses von markiertem zu
unmarkiertem Homocystein, z.B. durch massenspektrographische Verfahren,
und danach Berechnen der Menge an unmarkiertem Homocystein in der
Probe.
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Vitamin
B12-Mangel ist auch bestimmt worden unter Verwendung von z.B. Chemiluminiszenz-Rezeptortests (Wentworth,
S. et al., Clin. Chem., Bd. 40, 537–540), Radioimmuntests (Endres, D.B.,
et. al., Clin. Chem., Bd. 24, 460–465) sowie nicht-isotoper
Bindungstests, CEDIA, Immuntests mit geklonten Donorenzymen (van
der Weide; J. et al., Clin. Chem., Bd. 38, 766–768).
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Jedes
der bekannten Verfahren und Kits, die für das Bestimmen der Konzentration
von B12 oder von Methylmalonat oder Homocystein verfügbar sind,
wovon eine erhöhte
Konzentration als Hinweis auf einen B12-Mangel in der Probe verstanden
werden kann, kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Erfindung erwägt
auch die Möglichkeit,
sowohl die B12-Konzentration als auch die des Analyten, die mit
der B12-Konzentration korreliert, zu bestimmen.
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Gemäß der Erfindung
wird die gemessene Vitamin B12-Konzentration mit einem ausgewählten verfahrensspezifischen
Referenzwert oder -bereich für
B12 verglichen. Ein derartiger Referenzwert variiert zwischen 200–900 ng/l,
entsprechend annähernd 170
bis 700 pmol/l. Was Homocystein betrifft, ist ein Referenzwert von
weniger als 15–16 μmol/l, und
was Methylmalonat betrifft, ist ein Referenzwert von weniger als
0,4 μmol/l
empfohlen worden.