WO1993010451A1 - Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitätskontrolle von immunoassays aller provenienzen und von rezeptorassays sowie vorrichtung zur durchführung des verfahrens - Google Patents

Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitätskontrolle von immunoassays aller provenienzen und von rezeptorassays sowie vorrichtung zur durchführung des verfahrens Download PDF

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WO1993010451A1
WO1993010451A1 PCT/DE1992/000704 DE9200704W WO9310451A1 WO 1993010451 A1 WO1993010451 A1 WO 1993010451A1 DE 9200704 W DE9200704 W DE 9200704W WO 9310451 A1 WO9310451 A1 WO 9310451A1
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nmol
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Pavel Strohner
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Pavel Strohner
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Definitions

  • the invention relates to the optimization and quality control of radioimmunoassays (RIA) and immunoradiometric assays (IRMA) both in the liquid and solid phase and of receptor assays. If the average, relative measurement error of the non-radioactive indicator (instead of the counting error) is included, it can be transferred to all non-radioactive competitive and non-competitive immunoassays, to binding studies with antibodies and to receptor assays.
  • RIA radioimmunoassays
  • IRMA immunoradiometric assays
  • Fields of application of the invention are medical and veterinary medical diagnostics, food and environmental analysis, immunological and pharmacological research.
  • the method generally used to optimize an immunoassay is based on Haies and Rändle (Haies C.N., Rändle P.J., Biochem. J., 88 (1963), 137).
  • the binding values of a tracer are then determined for a degressive, aliquot dilution series of an antiserum (or antibody) in the absence and presence of the antigen to be determined with the antiserum.
  • the tracer used is a labeled compound which is identical or related to the antigen (a conjugate of the antigen). In the case of an IRMA, the tracer is a labeled antibody.
  • the graphical representation of the binding values of the antigen-antibody complex as a function of the antiserum dilution (antibody concentration) at a fixed antigen concentration is called the titer curve. However, there is no unlabeled antigen in one titer curve.
  • the highest antigen concentration to be determined in a future standard curve of the RIA or IRMA is generally chosen as the fixed antigen concentration.
  • the standard curve is to be understood as the graphical representation of the binding values of the antigen-antibody complex as a function of known antigen concentrations at a fixed antibody concentration, with the aid of which unknown antigen concentrations are to be determined as precisely and reproducibly as possible in the future.
  • the optimal antiserum dilution or antibody concentration of a future standard curve is the one in which the difference in binding values is greatest in the absence in comparison to the presence of the unlabelled antigen.
  • the physicochemical parameters determined with their help could only be used to a very limited extent for the optimization of an immunoassay.
  • the aim of the invention is, on the one hand, to save time and to reduce the experimental effort in the optimization, adaptation and quality control of an immunoassay and of receptor assays, and on the other hand to increase the clarity and comparability of the immunoassay and receptor assay experiments.
  • the optimization, the adaptation of the standards and the targeted quality control and control of immuno and receptor assays in assay measuring devices should be able to be designed within the device .
  • the invention is based on the one hand on the discovery of a simplified, generally applicable and consistent basic physicochemical model of the antigen-antibody reaction and the receptor-ligand reaction and on the other hand on the selective design and evaluation of three-dimensional and multidimensional binding experiments. It is realized according to claims 1 and 6-8, the subclaims are preferred variants.
  • the mathematical evaluation is carried out with the help of PC computer programs that are based on. based on variants of the basic physicochemical model and an algorithm of nonlinear regression (J.G. Reich, Curve Fitting with the Personal Computer, New York, Mc Grawhill, 1991).
  • the basic model on which the calculations are based assumes that antibodies or receptors bind both to one another and to antigen or ligand.
  • Cross-reactive foreign substances and nonspecifically binding heteroprotein in the reaction medium act like an additional amount of antigen or ligand or like an additional amount of receptor or antibody, or lead to an apparente in accordance with their quantitative ratio to the antigen or ligand or to the receptor or antibody Affinity reduction of Antibody or the receptor.
  • the method is described below for immunoassays with three-dimensional experiments. It applies in the same way to receptor assays.
  • the ligand replaces the antigen and the receptor instead of the antibody.
  • the binding rates of the antigen-antibody complex are determined with simultaneous variation of both the antigen and the antibody concentration.
  • the data of the 2-3 titer or standard curves are either recorded with the program INPUT for each titer or standard curve or are in the field sequence: antibody or antigen concentration, B / T values as response, coefficient of variation (CV) of the replicates of the B / T values.
  • the ZUSAM program converts the two-dimensional (antigen or antibody concentration, B / T values) into a three-dimensional test (antigen concentration, antibody concentration, B / T values).
  • the IRMAOPT program evaluates, optimizes and describes a standardized precision profile of the optimized non-competitive immunoassay (sandwich method).
  • the RIAOPT program differentiates between the following cases of a competitive immunoassay:
  • Model Modified MWG, influenced by both an unknown, cross-reactive compound that affects affinity as well as antigen concentration.
  • Model Modified MWG, influenced by an unknown substance that cross-reacts with the antigen
  • 3rd Model Modified MWG, influenced by an unknown substance that cross-reacts with the antigen and the antibody Using nonlinear regression based on the
  • Binding factor n which expresses the binding relationship between antigen and antibody and results as a summary variable from the stoichiometric factor, the purity of the antigen or the specific antibody and from steric binding effects.
  • Binding factor n which expresses the binding relationship between antigen and antibody and results as a summary variable from the stoichiometric factor, the purity of the antigen or the specific antibody and from steric binding effects.
  • the program evaluates the three-dimensional immunoassay with the available models and selects the most suitable for the output protocol.
  • the output protocol contains the estimated physicochemical constants and shows the quality of the reproduction of the experimental values by the selected model. Furthermore, there is the optimal antibody concentration or dilution for a preselected antigen concentration and establishes a standardized precision profile for the optimal antibody concentration.
  • the binding rates of the antigen-antibody complex are determined from standard curves (at a fixed antibody concentration) by varying the dilution (e.g. serum dilution) or increasing (e.g. increasing the attached heteroprotein) of the reaction medium of the standard curves.
  • dilution e.g. serum dilution
  • increasing e.g. increasing the attached heteroprotein
  • the binding rates of the antigen-antibody complex are determined from standard curves (at a fixed antibody concentration) by varying the concentration of the putative, cross-reactive antigen contained in the standard curves.
  • the coefficient of variation (CV) of the replicas of the B / T values already exists.
  • the ZUSAM program converts the two-dimensional test (antigen concentration, B / T values) into a three-dimensional test (antigen concentration, concentration of the reactive antigen or dilution or replenishment factors of the reaction medium, B / T values) .
  • the field sequence of the experiment required for the evaluation 1. antigen concentration, 2. concentration of the cross-reactive antigen or dilution or replenishment factors of the reaction medium, 3. B / T values, 4. CV of the replicas of the B / T values.
  • the IRMKREUZ program evaluates and describes the effect of the cross-reactive substance on the standardized precision profile of a non-competitive immunoassay (sandwich method).
  • the RIAKREUZ program differentiates between the following cases of a competitive immunoassay:
  • physicochemical constants of the antigen-antibody binding assay (RIA, IRMA) are estimated based on the models.
  • the user is given suggestions for starting values for non-linear regression.
  • the user has the option of changing the start values or simply accepting the suggested start values.
  • the program evaluates the three-dimensional immunoassay with the available models and selects the most suitable for the output protocol.
  • the output protocol contains the estimated physicochemical constants and shows the quality of the reproduction of the experimental values by the selected model. Furthermore, it shows the systematic error caused by a user-specified concentration of the cross-reactive substance in the immunoassay.
  • a four-dimensional test procedure distinguishes between two variants for the quality control of immunoassays.
  • the ZUSAM3 program is used to convert a three-dimensional (antigen, antibody concentration, B / T values) into a four-dimensional test (antigen concentration, antibody concentration, foreign substance or time, B / T values).
  • the field sequence of the experiment required for the evaluation 1. Antigen concentration, 2. Antibody concentration, 3. Foreign substance or time, 4. B / T values, 5. CV of the replicas of the B / T values.
  • the RIA4D program is used to evaluate the competitive immunoassay and the IRM4D program is used to evaluate the non-competitive immunoassay (sandwich method).
  • the RIA4D program differentiates between the following cases of a competitive immunoassay:
  • Model 1 Modified MWG, taking into account the kinetics of the modified MWG
  • Model 2 Modified MWG, including one
  • the IRM4D program differentiates between the following cases of a non-competitive immunoassay:
  • Model 1 Modified MWG, taking into account the kinetics of the modified MWG
  • Model 2 Modified MWG, including one
  • Model 3 Modified MWG, including the capture antibody
  • Antibody, z capture antibody Using nonlinear regression, physicochemical constants of the antigen-antibody binding assay (RIA, IRMA) are estimated based on the models.
  • the user is given suggestions for starting values for nonlinear regression.
  • the user has the option of changing the start values or simply accepting the suggested start values.
  • the program evaluates the four-dimensional immunoassay with the existing models and select the most suitable for the output protocol.
  • the output protocol contains the estimated physicochemical constants and shows the quality of the reproduction of the experimental values by the selected model.
  • the invention also extends to devices which are used to carry out the method. Of particular importance are devices which have automatic pipetting and dilution devices and which independently program and evaluate on the basis of the RIAOPT, IRMAOPT, RIAKREUZ, IRMKREUZ, RIA4D and IRM4D programs.
  • the invention opens up completely new perspectives for the optimization, the adaptation of the standard and the targeted quality control and control of immuno and receptor assays. For the first time, an exact functional characterization of antibodies and antigens as well as of receptors and their ligands is made possible with minimal effort. The new process forms the basis for a new generation of measuring devices. The invention will be explained in more detail below by means of exemplary embodiments.
  • Example 4 bLH-RIA with unpurified antiserum, cold pre-incubation, B / F separation with double antibody technique
  • Example 5 TSH-IRMA with an I-125 monoclonal antibody, an unlabeled polyclonal antibody,
  • Example 8 Serum influence on the ß-HCG-RIA
  • Example 11 Assay for the determination of estradiol receptors in the cytosol of breast cancer tissue
  • Example 12 Assay for the Determination of Progesterone Receptors in the Cytosol of Breast Cancer Tissue
  • Example 14 Albumine influence on a three-dimensional T3 RIA
  • RIA optimization for example 1: T3-RIA with polyclonal, purified antibodies,
  • 0.1 ml of buffer, 0.1 ml of antibody and 0.1 ml are placed in cell T.
  • the test is carried out twice. The cells are closed and the 2 test apparatus are rotated overhead for 6 hours.
  • Cell P contains half of the free antigen (F).
  • Total value of the tracer (T) is reduced by the adsorption and the binding rate B / T per cell is calculated.
  • DIAINPUT special case of the INPUT program.
  • the ZUSAM program turns two-dimensional experiments
  • Evaluation result of the experiment b: s150389s
  • Binding constant K 4.30205 +/- 0.24247 binding factor pl / q: 0.43801 +/- 0.02190 unspecific binding nsb: 0.11952 +/- 0.00940 antigen equivalent of the foreign substance p2: 0.41496 + / • 0.05031 pmol / l
  • Binding factor 0.43 nmol T3 bind 1 nmol IgG, theoretically one would expect: 2 nmol T3 bind 1 nmol IgG,
  • the protein A-ger purified IgG contains IgG that does not bind T3.
  • a foreign substance is present in the reaction medium, which acts like a T3 concentration of 0.415 nmol / 1 (HSA!).
  • the standardized precision profile results as the scatter (1 ⁇ S range) of the antigen (antigens) to be determined with an average error of the experimental values of 2% and a pulse rate of the total value specified by the user.
  • polyclonal antibodies (IgG) of the following concentrations:
  • 0.1 ml ß-HCG standard, 0.1 ml I-125-ß-HCG as tracer and 0.1 ml or 0.2 ml (standard 0) buffer are added to the antibody-coated tubes.
  • Binding constant K 2.19837 +/- 0.10422 binding factor pl / q: 0. 00587 +/- 0.00055 non-specific binding nsb: 0.03774 +/- 0.00564 antigen equivalent (foreign substance)
  • p2 0.10021 +/- 0.01776 nmol / l
  • the protein A-purified antibody pool contains a very large fraction of non- ⁇ -HCG-binding IgGs
  • the standardized precision profile results from the scatter (1 ⁇ S range) of the antigen to be determined (antigens) with an average error of the experimental values of 2% and a pulse rate of the total value specified by the user.
  • estradiol RIA with monoclonal antibodies for example 3: estradiol RIA with monoclonal antibodies
  • the ZUSAM program turns two-dimensional experiments
  • Binding constant K 1.42253 +/- 0.05311
  • Binding factor p / q 1.00405 +/- 0.05742
  • Binding factor binding of E2 to monoclonal antibody in a ratio of 1: 1.
  • the standardized precision profile results as the scatter (1 ⁇ S range) of the antigen (antigens) to be determined with an average error of the experimental values of 2% and a pulse rate of the total value specified by the user.
  • Binding constant K1 2.32291 +/- 0.04526 binding factor p / q1: 38.29413 +/- 0.96095 unspecific binding nsb: 0.04345 +/- 0.00370 antigen equivalent (foreign substance)
  • p2 0.78202 +/- 0.02068 ⁇ g / l
  • the standardized precision profile results from the scatter (1 ⁇ S range) of the antigen (antigens) to be determined with an average error of the experimental values of 2% and a pulse rate of the total value specified by the user.
  • I-125 monoclonal antibody (I-125 MAK) a 40, 20 and 10
  • Precipitation mixture goat precipitation antibody against rabbit gamma globulin together with NKS and PEG (polyethylene glycol) 6000 dilution.
  • Binding constant Kl 1.44601 +/- 0.02135 binding factor p / q: 0.21994 +/- 0.00366 nonspecific binding nsb: 0.00340 +/- 0.00011 antigen equivalent (foreign protein) q2: 8.62739 +/- 0.50975
  • the standardized precision profile results from an average experimental error of 2% and from the counting error of the optimized concentration of the I-125-MAK.
  • Binding constant K1 1.88349 +/- 0.04877 Binding factor p / q: 0.99937 +/- 0.00494 unspecific binding nsb: 0.00002 +/- 0.00002 Antigen equivalent (foreign substance) p2: 0.02810 +/- 0.00266
  • 0.5 ml of buffer which contains all variants of the listed estradiol and estrone concentrations, together with 0.1 ml of tracer and 0.1 ml of antiserum are placed in a plastic tube and incubated overnight.
  • Entries and conversions to B / T and VK values for standard curves can be made with the INPUT program.
  • the ZUSAM program turns two-dimensional experiments (Standard curves) a three-dimensional experiment with the name sl61091t (experiment from 16.10.91). This experiment is evaluated with the RIAKREUZ program. The evaluation result can be found in the following output report.
  • Binding constant K1 0.81216 +/- 0.01441
  • Binding capacity q 0.16775 +/- 0.00781 nmol / l non-specific binding nsb: 0.03365 +/- 0.00415
  • the antiserum dilution used (1: 20,000) has one
  • estrone (p2) The cross-reactivity of estrone (p2) to estradiol (pl) is
  • Example 8 Serum influence on the ß-HCG-RIA
  • 0.1 ml ß-HCG, 0.1 ml antibody and 0.1 ml tracer are added to 0.3 ml buffer solution, 0.3 ml 1: 4 diluted serum and 0.3 ml full serum in a plastic tube. Overnight incubation. Addition of a precision solution consisting of 1:10 diluted 2nd antibody against rabbit gamma globulin, Normal rabbit serum 1: 100 and 4% PEG 6000.
  • Entries and conversions to B / T and VK values for standard curves can be made with the INPUT program.
  • ZUSAM program a three-dimensional experiment with the name s081289s (experiment from December 8th, 1989) is compiled from the two-dimensional experiments (standard curves). This experiment is evaluated with the RIAKREUZ program. The evaluation result can be found in the following output report.
  • Binding capacity q 0.05535 +/- 0.00494 non-specific binding nsb: 0.03339 +/- 0.00874
  • the antibody dilution used has a binding capacity for 0.055 nmol / l ß-HCG
  • the full serum has a cross-reactivity of 8.1% with ß-HCG. Since the total environment for 0.3 ml serum and 0.3 ml buffer is at most half a serum, disturbing, unknown cross-reactive substances of 0.162 nmol ß-HCG equivalent are to be expected in a full serum environment.
  • Standard 1 ß-HCG (p1)
  • Standard 2 Calculate serum dilution (p2).
  • T3 Triiodthyronine
  • Entries and conversions to B / T and VK values for standard curves can be made with the INPUT program.
  • ZUSAM program a three-dimensional experiment with the name sl70589s (experiment from 5/17/89) is compiled from the two-dimensional experiments (standard curves). This experiment is evaluated with the RIAKREUZ program. The evaluation result can be found in the following output report.
  • Binding constant K1 1.54015 +/- 0.05858
  • Binding capacity q 0.80873 +/- 0.06008 nmol / l non-specific binding nsb: 0.01135 +/- 0.00917
  • the 1,406 nmol / l anti-T3-IgG have a binding capacity for 0.809 nmol / l T3
  • Example 10 Influence of bovine gamma globulin on the
  • I-125 monoclonal antibody (I-125-MAK; ZIM, Micheel) a 20 KBq / ml as tracer
  • Binding constant K 1.02286 +/- 0.01064
  • Binding capacity q 19.67130 +/- 0.48317 mU / 1
  • Binding capacity increase factor 0.02999 +/- 0.01311
  • the two antibodies used (labeled and unlabeled antibodies) have a common binding capacity for 19.67 mU / 1 TSH
  • Bovine gamma globulin increases this binding capacity by 0.03 ⁇ gamma globulin concentration.
  • the 46.9 ⁇ mol / l gamma globulin acts like an additional binding capacity of 1,407 mU / l.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Schnelloptimierung und gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzen und von Rezeptorassays sowie eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes bzw. eines bestimmten Rezeptor-Ligand-Komplexes, gegebenenfalls unter Zufügung eines oder mehrerer weiterer Stoffe oder nach Verdünnung, nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit bzw. nach Einstellung des Gleichgewichtes, bestimmt werden, die Daten mathematisch erfaßt und in den mehrdimensionalen Versuch überführt werden und nachfolgend die mathematische Auswertung für die Anpassung und Optimierung des Assays erfolgt. Die Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische und veterinär-medizinische Diagnostik, die Nahrungs- und Umweltanalytik, die immunologische und pharmakologische Forschung.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Schnelloptimierung und gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzen und von Rezeptorassays sowie Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
Die Erfindung bezieht sich auf die Optimierung und die Qualitätskontrolle von Radioimmunoassays (RIA) und Immunoradiometrischen Assays (IRMA) sowohl in flüssiger als auch an fester Phase und von Rezeptorassays. Sie ist bei Einbeziehung des durchschnittlichen, relativen Meßfehlers des nichtradioaktiven Indikators (anstelle des Zählfehlers) auf alle nichtradioaktiven kompetitiven und nicht-kompetitiven Immunoassays, auf Bindungstudien mit Antikörpern und auf Rezeptorassays übertragbar.
Sie betrifft gleichermaßen Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische und veterinär-medizinische Diagnostik, die Nahrungs- und Umweltanalytik, die immunologische und pharmakologische Forschung.
Bisher bekannt ist folgender Stand der Technik:
a. Optimierung
Das bisher generell verwendete Verfahren zur Optimierung eines Immunoassays geht auf Haies und Rändle (Haies C.N., Rändle P.J., Biochem. J., 88 (1963), 137) zurück.
Danach werden für eine degressive, aliquote Verdünnungsreihe eines Antiserums (bzw. Antikörpers) die Bindungswerte eines Tracers in Abwesenheit und Anwesenheit des mit dem Antiserum zu bestimmenden Antigens ermittelt. Der dabei verwendete Tracer ist eine mit dem Antigen identische bzw. verwandte markierte Verbindung (ein Konjugat des Antigens) . Im Falle eines IRMA ist der Tracer ein markierter Antikörper. Die graphische Darstellung der Bindungswerte des Antigen- Antikörper-Komplexes in Abhängigkeit von der Antiserumverdünnung (Antikörperkonzentration) bei fixer Antigenkonzentration wird Titerkurve genannt. Wobei in der einen Titerkurve kein unmarkiertes Antigen enthalten ist. In einer zweiten Titerkurve wird als fixe Antigenkonzentration in der Regel die in einer künftigen Standardkurve des RIA oder IRMA zu bestimmende höchste Antigenkonzentration gewählt. Als Standardkurve ist dabei die graphische Darstellung der Bindungswerte des Antigen-Antikörper- Komplexes in Abhängigkeit von bekannten Antigenkonzentrationen bei fixer Antikörperkonzentration zu verstehen, mit deren Hilfe künftig unbekannte Antigenkonzentrationen möglichst präzise und reproduzierbar bestimmt werden sollen.
Als optimale Antiserumverdünnung bzw. Antikörperkonzentration einer künftigen Standardkurve gilt diejenige, bei der die Differenz der Bindungswerte bei Abwesenheit im Vergleich zur Anwesenheit des unmarkierten Antigens am größten ist.
b. Qualitätskontrolle
Die bisherigen aus der Literatur bekannten Verfahren beruhen auf rein statistischen Vergleichen (Wiederfindeexperimente und Kreuzreaktionsstudien) und sind nur sehr unvollkommen zur gezielten Qualitätskontrolle verwendbar (G.E.Abraham (Ed.): Handbook of Radioimmunoassay, New York, 1978,
R.P.Ekins: Basic Concepts in Quality Control in Radioimmunoassays and Related Procedures in Medicine, Vol.2, 6-20, IAEA, Wien 1978)
Sie sind in der Regel nicht geeignet, um gezielte Maßnahmen zur Beseitigung von Qualitätsmängeln, zur Neuanpassung eines Assays oder zur Kalibrierung eines Standards zu unternehmen.
Die bisher verwendeten physikochemischen Modelle (Scatchard-, Sips- bzw. Hill-Modell, H.A.Feldman: Analyt.Biochem. 48 (1972), 317) konnten meist nur als reine Eichfunktionen in der Qualitätskontrolle Verwendung finden.
Die mit ihrer Hilfe ermittelten physikochemischen Parameter, wie Gleichgewichtskonstanten und Bindungskapazitäten waren nur in einem sehr begrenzten Rahmen für die Optimierung eines Immunoassays verwendbar. Das Ziel der Erfindung besteht zum einen in der Zeitersparnis und in der Reduzierung des experimentellen Aufwandes bei der Optimierung, Anpassung und Qualitätskontrolle eines Immunoassays und von Rezeptorassays und zum anderen in einer Erhöhung der Übersichtlichkeit und Vergleichbarkeit der Immunoassay- und Rezeptorassay-Experimente. Weiterhin soll im Zusammenhang mit automatischen Pipettier- und Verdünnungsschritten die Optimierung, die Anpassung der Standards und die gezielte Qualitätskontrolle und -Steuerung von Immuno- und Rezeptorassays in Assay-Meßgeräten (Gamma-Counter, LSC, Spektralphotometer, Luminiszensmeßplätzen, Fluoreszensmeßgeräten u.a.m.) geräteintern gestaltungsfähig sein.
Die Erfindung fußt zum einem auf der Entdeckung eines vereinfachten, allgemein gültigen und konsistenten physikochemischen Grundmodells der Antigen-Antikörper-Reaktion und der Rezeptor-Ligand-Reaktion und zum anderen auf der selektiven Konzipierung und Auswertung drei- und mehrdimensionaler Bindungsexperimente. Sie wird gemäß den Ansprüchen 1 und 6-8 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. Die mathematische Auswertung erfolgt mit Hilfe von PC-Computerprogrammen, die auf. der Grundlage von Varianten des physikochemischen Grundmodells und eines Algorithmus der nichtlineare Regression (J.G.Reich, Curve Fitting with the Personal Computer, New York, Mc Grawhill, 1991) geschaffen wurden.
Zu den Modellvorstellungen
1. Das den Berechnungen zugrunde liegende Grundmodell geht davon aus, daß Antikörper bzw. Rezeptoren sich sowohl untereinander als auch an Antigen bzw. Ligand binden.
2. Kreuzreaktive Fremdsubstanzen und unspezifisch bindendes Heteroprotein im Reaktionsmilieu wirken sich wie eine zusätzliche Antigen- bzw. Ligandmenge oder wie eine zusätzliche Rezeptor- bzw. Antikörpermenge aus bzw. führen entsprechend ihrem Mengenverhältnis zum Antigen bzw. Ligand oder zum Rezeptor bzw. Antikörper zu einer apparenten Affinitätserniedrigung des Antikörpers bzw. des Rezeptors.
Beide Modellhypothesen haben in mathematischen Formulierungen
Eingang in die Programme RIAOPT und IRMAOPT gefunden.
Zum Verfahren der Schnelloptimierunςr eines Immunoassays
Das Verfahren wird nachfolgend für Immunoassays mit dreidimensionaler Versuchsführung beschrieben. Es gilt in gleicher Weise für Rezeptorassays. Anstelle des Antigen tritt in diesem Falle der Ligand und anstelle des Antikörpers der Rezeptor.
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörperkonzentration .
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn entweder 2-3 Titerkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antigenkonzentrationen oder wenn 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antikörperverdünnungen
(-konzentrationen) aufgestellt werden.
Als Trennmethode des antikörpergebundenen vom freien Antigen können alle effektiven Methoden, ob Doppelantikörpertechnik, einfache Antikörperpräzipitation, Dextrankohletrennung, Solid Phase Techniken (z.B. Coated Tube) oder auch trennungsfreie Bestimmungen des gebundenen Antigens verwendet werden.
Die Daten der 2-3 Titer- bzw. Standardkurven werden entweder mit dem Programm EINGABE je Titer- bzw. Standardkurve erfaßt oder liegen in der Feldfolge: Antikörper- bzw. Antigenkonzentration, B/T-Werte als Response, Variationskoeffizient (VK) der Replikate der B/T-Werte bereits vor.
Mit dem Programm ZUSAM erfolgt die Überführung des zweidimensionalen (Antigen- oder Antikörperkonzentration, B/T-Werte) in einen dreidimensionalen Versuch (Antigenkonzentration, Antikörperkonzentration, B/T-Werte).
Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs: 1. Antigenkonzentration, 2. Antikörperkonzentration,
3. B/T-Werte, 4. VK der Replikate der B/T-Werte.
Sollten Antikörperkonzentration und Antigenkonzentration in ihrer Feldfolge vertauscht sein, muß mit dem Programm VARIABLE ein Austausch der Feldfolge vorgenommen werden.
Mit dem Programm RIAOPT erfolgt die Auswertung, Optimierung sowie die Beschreibung eines standardisierten Präzisionsprofils (=Streuung der Antigenkonzentration in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration) des optimierten kompetitiven Immunoassays. Mit dem Programm IRMAOPT erfolgt die Auswertung, Optimierung sowie die Beschreibung eines standardisierten Präzisionsprofils des optimierten nichtkompetitiven Immunoassays (SandwichMethode).
Als standardisiert wird dasjenige Präzisionsprofil bezeichnet, das bei einem experimentellen Fehler (VK der Responsewerte) von 2 % entsteht.
Im Programm RIAOPT werden folgende Fälle eines kompetitiven Immunoassays unterschieden:
2. Modell : Modifiziertes MWG (Massenwirkungsgesetz) ,
unbeeinflußt
2. Modell : Modifiziertes MWG, beeinflußt sowohl durch eine unbekannte, kreuzreaktive Verbindung, die sich auf die Affinität als auch auf die Antigenkonzentration auswirkt .
3 . Modell : Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz
4. Modell : Modifiziertes MWG bei kalter Vorinkubation,
beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz
Im Programm IRMAOPT werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven Immunoassays verwendet:
2. Modell : Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz
2. Modell : Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antikörper kreuzreagierende Substanz
3 . Modell : Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen und dem Antikörper kreuzreagierende Substanz Mittels nichtlinearer Regression werden auf der Grundlage der
Modelle physikochemische Konstanten des Antigen-Antikörper- Bindungsassays (RIA, IRMA) geschätzt.
Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay
bei 1. Modell:
a) Bindungskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz zum e) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz,
ausgedrückt als Antigenkonzentration
zum Antikörper, ausgedrückt als Antigenbindungskapazität bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz,
ausgedrückt als Antigenkonzentration
bei 4. Modell:
a), b) und c) wie im 1.Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz,
ausgedrückt als Antigenkonzentration
Beim nichtkompetitiven Immunoassay
bei 1. Modell:
a) Bindungskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1.Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz,
ausgedrückt als zusätzliche Bindungskapazität für das
Antigen
bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1.Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz,
ausgedrückt als Antigenkonzentration
e) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz,
ausgedrückt als zusätzliche Bindungskapazität für das
Antigen
Bei Aufruf der Programme RIAOPT und IRMAOPT werden dem Nutzer Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit die Startwerte zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen Startwerte zu übernehmen.
Das Programm wertet den dreidimensionalen Immunoassay mit den vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für das Ausgabeprotokoll.
Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen Werte durch das gewählte Modell. Desweiteren gibt es die optimale Antikörperkonzentration bzw. -Verdünnung für eine vom Nutzer vorgewählten Antigenkonzentration an und stellt ein standardisiertes Präzisionsprofil für die optimale Antikörperkonzentration auf.
Zum Verfahren der Qualitätskontrolle eines Immunoassays
Das Verfahren wird nachfolgend für Immunoassays mit dreidimensionaler Versuchsführung beschrieben. Es gilt in gleicher Weise für Rezeptorassays. Anstelle des Antigen tritt in diesem Falle der Ligand und anstelle des Antikörpers der Rezeptor. a) Untersuchung der Einflüsse des Reaktionsmilieus Bereits bei den Auswertungen mit RIAOPT und IRMAOPT werden unbekannte kreuzreaktive Substanzen als Konzentrationsäquivalente zum Antigen ausgewiesen. Um genauere Hinweise zum kreuzreaktiven Verhalten der im Reaktionsmilieu des Assays vorhandenen Stoffe zu finden, ist folgende dreidimensionale Versuchsanordnung erforderlich:
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei einer Variation der Verdünnung (z.B. Serumverdünnung) oder Aufstockung (z.B. Aufstockung des beigefügten Heteroproteins) des Reaktionsmilieus der Standardkurven.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn Experimente für 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen Verdünnungs- bzw. Aufstockungsstufen des Reaktionsmilieus durchgeführt werden. b) Untersuchung der Einflüsse kreuzreaktiver Antigene
(Kreuzreaktionsstudien)
Um die Einwirkung möglicher kreuzreaktiver (chemisch verwandter Antigene) zu ermitteln, ist folgende dreidimensionale Versuchsanordnung erforderlich:
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei Variation der in den Standardkurven enthaltenen Konzentration des mutmaßlich, kreuzreaktiven Antigens.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn Experimente für 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen Konzentrationen des mutmaßlich kreuzreaktiven Antigens durchgeführt werden. c) Auswertung der Kreuzreaktionsexperimente
Die Daten der 2-3 Standardkurven werden entweder mit dem
Programm EINGABE als Standardkurve erfaßt oder liegen in der
Feldfolge: Antigenkonzentration, B/T-Werte als Response,
Variationsköffizient (VK) der Replikate der B/T-Werte bereits vor. Mit dem Programm ZUSAM erfolgt die Überführung des zweidimensionalen Versuches (Antigenkonzentration, B/T-Werte) in einen dreidimensionalen Versuch (Antigenkonzentration, Konzentration des kr euz r eakt i ves Antigen bzw. Verdünnungs- oder Aufstockungsfaktoren des Reaktionsmilieus, B/T-Werte).
Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs: 1. Antigenkonzentration, 2. Konzentration des kreuzreaktiven Antigen bzw. Verdünnungs- oder Aufstockungsfaktoren des Reaktionsmilieus, 3. B/T-Werte, 4. VK der Replikate der B/T- Werte.
Sollten Feld 1 und Feld 2 in ihrer Feldfolge vertauscht sein, muß mit dem Programm VARIABLE ein Austausch der Feldfolge vorgenommen werden.
Mit dem Programm RIAKREUZ erfolgt die Auswertung und Beschreibung der Auswirkung der kreuzreaktiven Substanz auf das standardisierte Präzisionsprofils (=Streuung der Antigenkonzentration in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration) eines kompetitiven Immunoassays.
Mit dem Programm IRMKREUZ erfolgt die Auswertung und Beschreibung der Auswirkung der kreuzreaktiven Substanz auf das standardisierte Präzisionsprofils eines nichtkompetitiven Immunoassays (Sandwich-Methode) .
Als standardisiert wird dasjenige Präzisionsprofil bezeichnet, das bei einem experimentellen Fehler (VK der Responsewerte) von 2 % entsteht.
Im Programm RIAKREUZ werden folgende Fälle eines kompetitiven Immunoassays unterschieden:
2. Modell : Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne
Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf
die Gesamtantigenkonzentration,
2. Modell : Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit
Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die
Gesamtantigenkonzentration, Im Programm IRMKREUZ werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven Immunoassays verwendet:
1. Modell: Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die
Gesamtantigenkonzentration
2. Modell: Modifiziertes MNG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die
Gesamtantigenkonzentration,
Mittels nichtlinearer Regression werden auf der Grundlage der Modelle physikochemische Konstanten des Antigen-AntikörperBindungsassays (RIA,IRMA) geschätzt.
Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay bei 1. Modell:
a) Bindungskonstante K
b) Bindungskapazität des Antikörpers für den 1. Antigenen c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2.
(kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder
Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2.
(kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder
Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
Beim nichtkompetitiven Immunoassay bei 1. Modell:
a) Bindungskonstante K
b) Bindungskapazität des markierten Antikörpers für den
1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder
Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1.Modell sowie
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2.
(kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder
Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
Bei Aufruf der Programme RIAKREUZ und IRMKREUZ werden dem Nutzer Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit die Startwerte zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen Startwerte zu übernehmen.
Das Programm wertet den dreidimensionalen Immunoassay mit den vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für das Ausgabeprotokoll.
Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen Werte durch das gewählte Modell. Desweiteren zeigt es den systematischen Fehler, den eine vom Nutzer vorgegebenen Konzentration der kreuzreaktiven Substanz im Immunoassay verursacht.
Zum Verfahren der Qualitätskontrolle eines Immunoassays bei vierdimensionaler Versuchs führung
Das Verfahren wird nachfolgend für Immunoassays beschrieben. Es gilt in gleicher Weise für Rezeptorassays. Anstelle des Antigen tritt in diesem Falle der Ligand und anstelle des Antikörpers der Rezeptor.
Bei einer vierdimensionalen Versuchsführung werden für die Qualitätskontrolle von Immunoassays zwei Varianten unterschieden.
1. Bestimmung der Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörperkonzentration als auch der Zeitdauer der Antigen-Antikörperreaktion.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn entweder 2-3 Titerkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antigenkonzentrationen oder wenn 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antikörperverdünnungen
(-konzentrationen) aufgestellt werden und die Bindungsraten zu unterschiedlichen Zeiten gemessen werden.
2. Bestimmung der Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörperkonzentration als auch der Konzentration einer kreuzreaktiven Substanz bzw. der Verdünnung bzw. Aufstockung des Reaktionsmilieus des Immunoassays.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn entweder 2-3 Titerkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antigenkonzentrationen oder wenn 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antikörperverdünnungen
(-konzentrationen) bei gleichzeitiger Variation der Konzentration einer kreuzreaktiven Substanz bzw. der Verdünnung bzw. Aufstockung des Reaktionsmilieus des Immunoassays
(2-3 Verdünnungs- bzw. Aufstockungsstufen) aufgestellt werden.
3. Bestimmung der Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes eines nichtkompetitiven Assays (Sandwichassay) bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörperkonzentration des markierten Antikörpers als auch der Konzentration des Fängerantikörpers.
Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn entweder 2-3 Titerkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antigenkonzentrationen oder wenn 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen AntikörperVerdünnungen (-konzentrationen) bei gleichzeitiger Variation der Konzentration des Fängerantikörpers (2-3 Konzentration) aufgestellt werden.
Mit dem Programm ZUSAM3 erfolgt die Überführung eines dreidimensionalen (Antigen-, Antikörperkonzentration, B/T-Werte) in einen vierdimensionalen Versuch (Antigenkonzentration, Antikörperkonzentration, Fremdsubstanz bzw. Zeit, B/T-Werte). Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs: 1. Antigenkonzentration, 2. Antikörperkonzentration, 3. Fremdsubstanz oder Zeit, 4. B/T-Werte, 5. VK der Replikate der B/T- Werte.
Mit dem Programm RIA4D erfolgt die Auswertung des kompetitiven Immunoassays und mit dem Programm IRM4D die Auswertung des nichtkompetitiven Immunoassays (Sandwich-Methode).
Im Programm RIA4D werden folgende Fälle eines kompetitiven Immunoassays unterschieden:
Modell 1 : Modifiziertes MWG, Unter Einbeziehung der Kinetik des modifizierten MWG
unabhängige Variable: x= Antigen, y= Antikörper, z= Zeit
Modell 2 : Modifiziertes MWG, Unter Einbeziehung einer
kreuzreagierenden Substanz
unabhängige Variable: x= Antigen, y= Antikörper, z= Fremdsubstanz
Im Programm IRM4D werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven Immunoassays unterschieden:
Modell 1 : Modifiziertes MWG, Unter Einbeziehung der Kinetik des modifizierten MWG
unabhängige Variable: x= Antigen, y= Antikörper, z= Zeit
Modell 2 : Modifiziertes MWG, Unter Einbeziehung einer
kreuzreagierenden Substanz
unabhängige Variable : x= Antigen, y- Antikörper, z= Fremdsubstanz
Modell 3 : Modifiziertes MWG, Unter Einbeziehung des Fängerantikörpers
unabhängige Variable : x= Antigen, y= markierter
Antikörper, z= Fängerantikörper Mittels nichtlinearer Regression werden auf der Grundlage der Modelle physikochemische Konstanten des Antigen-AntikörperBindungsassays (RIA, IRMA) geschätzt.
Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay
bei 1, Modell:
a) Bindungskonstante K
b) Bindungsfaktor n,
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Assoziations-Geschwindigkeitskonstante
bei 2. Modell:
a) , b) und c) wie im 1.Modell sowie
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2.
(kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder
Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
Es sind dies beim nichtkompetitiven Immunoassay
bei 1. Modell:
a) Bindungskonstante K
b) Bindungsfaktor n,
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Assoziations-Geschwindigkeitskonstante
bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2.
(kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder
Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus
bei 3.Modell:
a), b) und c) wie im 1.Modell sowie
d) Bindungsfaktor des Fängerantikörpers
Bei Aufruf der Programme RIA4D und IRM4D werden dem Nutzer Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit die Startwerte zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen Startwerte zu übernehmen.
Das Programm wertet den vierdimensionalen Immunoassay mit den vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für das Ausgabeprotokoll.
Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen Werte durch das gewählte Modell.
Die Erfindung erstreckt sich auch auf Vorrichtungen, die zur Durchführung des Verfahrens dienen. Von besonderer Bedeutung sind dabei Vorrichtungen, die automatische Pipettier- und Verdünnungseinrichtungen aufweisen und auf der Basis der erfindungsgemäßen Programme RIAOPT, IRMAOPT, RIAKREUZ, IRMKREUZ, RIA4D und IRM4D selbständig programmieren und auswerten.
Die Erfindung eröffnet ganz neue Perspektiven für die Optimierung, die Anpassung des Standards und die gezielte Qualitätskontrolle und -Steuerung von Immuno- und Rezeptorassays. Erstmalig wird auch eine exakte funktionelle Charakterisierung von Antikörpern und Antigenen sowie von Rezeptoren und deren Liganden bei minimalem Aufwand ermöglicht. Das neue Verfahren bildet die Basis für eine neue Generation von Meßgeräten. Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiele
1. RIA-Optimierung
Beispiel 1: T3-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern,
B/F-Trennung mit Gleichgewichtsdialyse
Beispiel 2: ß-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten
Antikörpern,
B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Beispiel 3: Estradiol-RIA mit monoklonalen Antikörpern,
B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 4: bLH-RIA mit ungereinigtem Antiserum, Kalte Vorinkubation, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
2. IRMA-Optimierung
Beispiel 5: TSH-IRMA mit einem I-125-monoklonalen Antikörper, einem unmarkierten polyklonalen Antikörper,
B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 6: TSH-IRMA mit zwei monoklonalen Antikörpern,
B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
3. Kreuzreaktionsstudien
Beispiel 7: Estron-Kreuzreaktivität im Estradiol-RIA
Estradiol-RIA mit ungereinigtem Antiserum,
B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 8: Serumeinfluß auf den ß-HCG-RIA
ß-HCG-RIA mit gereinigtem, polyklonalen
Antikörpern,
B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 9: Albumineinfluß auf den T3-RIA
T3-RIA mit gereingten, polyklonalen Antikörpern,
B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik Beispiel 10: Einfluß von Rindergammaglobulin auf die
Bindungskapazität im TSH-IRMA mit Doppelantikörpertechnik
4. Rezeptorassays
Beispiel 11: Assay für die Bestimmung von Estradiol-Rezeptoren im Zytosol von Mammakarzinomgewebe
Beispiel 12: Assay für die Bestimmung von Progesteron-Rezeptoren im Zytosol von Mammakarzinomgewebe
5. Vierdimensionale Immunoassays
Beispiel 13: Kinetik und Gleichgewicht des ß-hCG-RIA mit
polyklonalen, gereinigten Antikörpern,
B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Beispiel 14: Albumineinfluß auf einen dreidimensionalen T3-RIA
T3-RIA mit gereingten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
1. RIA-Optimierung zu Beispiel 1: T3-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern,
B/F-Trennung mit Gleichgewichtsdialyse
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.1 m Tris-Puffer bei pH 7.7 mit 0.05 % Humanserumalbumin von SERVA
- als Antigen Trijodthyronin (T3 von Henning, Berlin) in den Konzentrationen 0.157, 0.312, 0.625, 1.125, 2.501, 4.992 und 10 nmol/l - als Antikörper Protein-A-gereinigter polyklonaler anti-T3- Antikörper in den Konzentrationen 11.25, 2.813 und 0.704 nmol/l
- als Tracer I-125-T3 (0.215 nmol/l)
Es werden speziell gebaute Versuchsapparaturen benutzt. Sie enthalten 7 Kammern a 1 ml Volumen. Jede Kammer ist durch eine SERVAPOR Dialyse-Membranin zwei Zellen T und P a 0.5 ml geteilt.
Verfahrensschritte:
In die Zelle T werden 0.1 ml Puffer, 0.1 ml Antikörper, 0.1 ml
Standard und 0.1 ml Tracer, in die Zelle P werden 0.4 ml Puffer gegeben.
Es werden je Antikörperkonzentration Standardkurven a 7
Antigenkonzentrationen in einer Apparatur ausgeführt. Jeder
Versuch wird doppelt ausgeführt. Die Zellen werden verschlossen und es erfolgt eine Über-Kopf-Rotation der 2 Versuchsapparaturen über 6 Stunden.
Als Totalwert (T) werden 0.1 ml des Tracers im Gammacounter gemessen.
Aus Zelle T und Zelle P werden 0.2 ml entnommen und ebenfalls im
Gammacounter gemessen und auf 0.4 ml umgerechnet. Die Zelle T enthält sowohl das antikörpergebundene Antigen (B) als auch die
Hälfte des freien Antigens (F).
Die Zelle P enthält die Hälfte des freien Antigens (F). Die
Adsorption des Tracers (A) errechnet sich als A = T - B - F. Der
Totalwert des Tracers (T) wird um die Adsorption reduziert und die Bindungsrate B/T je Zelle berechnet.
Eingaben und Berechnungen für eine Standardkurve können für den speziellen Fall der Gleichgewichtsdialyse mit dem Program
DIAINPUT (Sonderfall des Programms EINGABE) vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen
(Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen sl50389s (Versuch vom 15.3.89) zusammengestellt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das
Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen. Auswerteergebnis des Versuchs: b: s150389s
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 3
Tracerkonzentration: 0.215 nmol/l
Bindungskonstante K : 4.30205 +/- 0.24247 Bindungsfaktor pl/q : 0.43801 +/- 0.02190 unspezifische Bindung nsb : 0.11952 +/- 0.00940 Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2 : 0.41496 +/• 0.05031 pmol/l
Summe der Abweichungsquadrate: 5.2788809877E-03
Modellfehler: 0.0317 Versuchsfehler: 0.0528
Erläuterungen:
- Bindungsf aktor: 0.43 nmol T3 binden 1 nmol IgG, theoretisch zu erwarten wäre: 2 nmol T3 binden l nmol IgG,
Ursache: Das Prote in- A-ger einigte IgG enthält IgG, das T3 nicht bindet .
- Antigenäquivalent der Fremdsubstanz: Im Reaktionsmilieu ist eine Fremdsubstanz vorhanden, die wie eine T3 -Konzentration von 0.415 nmol/1 wirkt (HSA ! ) .
STANDARD-TITER-KURVE berechn.
Standard IgG-Konz, B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l
0.157 11.250 0.9094 0.9008 0.0096 0.0027
0.312 11.250 0.9048 0.9041 0.0008 0.0028
0.625 11.250 0.8949 0.8934 0.0017 0.0012
1.250 11.250 0.8735 0.8771 0.0041 0.0036
2.501 11.250 0.8235 0.8525 0.0340 0.0007
4.992 11.250 0.7065 0.7502 0.0582 0.0025 Fortsetzung der Tabelle
STANDARD-TITER-KURVE berechn.
Standard IgG-Konz. B/T-Wert ; B/T-Wert ; Abweich. VK nmol/l nmol/l
9.999 11.250 0.5132 0.4874 0.0528 0.0888
0.157 2.813 0.8228 0.8086 0.0176 0.0310
0.312 2.813 0.7950 0.7771 0.0230 0.0387
0.625 2.813 0.7354 0.7229 0.0172 0.0400
1.250 2.813 0.6214 0.6025 0.0314 0.0490
2.501 2.813 0.4648 0.4617 0.0068 0.0197
4.992 2.813 0.3255 0.3197 0.0180 0.0051
9.999 2.813 0.2320 0.2247 0.0327 0.1087
0.157 0.704 0.4637 0.4783 0.0305 0.0295
0.312 0.704 0.4150 0.4290 0.0326 0.0110
0.625 0.704 0.3483 0.3443 0.0116 0.0015
1.250 0.704 0.2764 0.2892 0.0442 0.1225
2.501 0.704 0.2156 0.2143 0.0058 0.0338
4.992 0.704 0.1736 0.1806 0.0387 0.1116
9.999 0.704 0.1483 0.1451 0.0221 0.0478
Diskriminationsprofil für p = 2.000 pmol/l T3
IgG-Konz. Delta-B/T
nmol/l
9.132 0.0910
7.306 0.1221
4.676 0.2128
3.741 0.2674
2.992 0.3196
2.394 0.3623
1.532 0.3981
1.226 0.3866
0.784 0.3179 Fortsetzung der Tabelle
IgG-Konz. Delta-B/T
nmol/l
0.628 0.2736
0.502 0.2304
0.402 0.1910
0.321 0.1568
0.206 0.1037
0.165 0.0838
0.132 0.0676
0.105 0.0544
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination =
1.532 pmol/l
für Antigenkonzentration = 2.000 pmol/l T3
Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Antigenkonzι. B/T-Wert Antigenstreuung VK
nmol/l nmol/l
0.106 0.7169 0.044 0.4123
0.318 0.6452 0.044 0.1373
0.536 0.5807 0.047 0.0872
0.774 0.5226 0.052 0.0674
1.043 0.4703 0.060 0.0576
1.355 0.4233 0.071 0.0521
1.726 0.3810 0.085 0.0491
2.174 0.3429 0.104 0.0477
2.727 0.3086 0.130 0.0475
3.426 0.2777 0.166 0.0486
4.335 0.2500 0.220 0.0509
5.560 0.2250 0.305 0.0548
7.290 0.2025 0.445 0.0611
9.907 0.1822 0.709 0.0715
14.295 0.1640 1.289 0.0902
23.110 0.1476 3.021 0.1307 Das Standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich als Streuung (1 × S-Bereich) des zu bestimmenden Antigens (Antigenen) bei einem durchschnittlichen Fehler der experimentellen Werte von 2 % und einer vom Nutzer angegebenen Impulsrate des Totalwertes.
zu Beispiel 2; ß-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten
Antikörpern,
B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.01% Rinderserumalbumin (Merck)
- adsorptiv beschichtete NUNC-Röhrchen (NUNC, Dänemark), über Nacht beschichtet mit 0.3 ml Protein-A gereinigten
polyklonalen Antikörpern (IgG) folgender Konzentrationen:
106.3, 53.13, 26.56, 13.28, 6.64, 3.32 und 1.66 nmol/l, zweimal mit 0.1 m NaCl-Lösung und danach mit Humanserumalbumin(0.5%)- NaCl(0.1 m)-Lösung 6-8 h bei Raumtemperatur gewaschen.
- ß-HCG (Calbiochem) als Antigen in den Konzentrationen 0.033, 0.267 und 0.5 nmol/l
- I-125-ß-HCG als Tracer (0.067 nmol/l)
Verfahrensschritte:
In die antikörperbeschichteten Röhrchen werden 0.1 ml ß-HCG-Standard, 0.1 ml I-125-ß-HCG als Tracer und 0.1 ml bzw. 0.2 ml (Standard 0) Puffer gegeben.
Reaktion über Nacht. 0.5 ml H2O dazu. Röhrchen absaugen und im Gammacounter messen. 0.1 ml Tracer werden als Totalwert messen. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Titerkurven können mit dem Program EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Titerkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s251091t (Versuch vom 25.10.91) zusammengestellt. Mit dem Programm VARIABLE wird die Feldfolge
1. Antikörperkonzentration, 2. Antigenkonzentration in die für die Auswertung erforderliche Feldfolge 1. Antigenkonzentration,
2. Antikörperkonzentration getauscht.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s251091t
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 3
Bindungskonstante K : 2.19837 +/- 0.10422 Bindungsfaktor pl/q : 0. 00587 +/- 0.00055 unspezifische Bindung nsb : 0.03774 +/- 0.00564 Antigenäquivalent (Fremdsubstanz) p2 : 0.10021 +/- 0.01776 nmol/l
Summe der Abweichungsquadrate: 6.1058965933E-03
Modellfehler: 0.1499 Versuchsfehler: 0.0729
Auswertung zureichend
Erläuterungen:
- Bindungsf aktor: a) Die Beschichtungsausbeute für IgG beträgt im Vergleich zur Doppelantikörpertechnik ca . 10 - 16 %.
b) Im Protein-A-gereinigtem Antikörper-Pool ist eine sehr große Fraktion nicht ß-HCG- bindenden IgGs enthalten
- Antigenäquivalent (Fremdsubstanz: ) Es ist im Reaktionsmilieu eine Fremdsubstanz enthalten,
die wie 0.1 nmol/1 ß-HCG wirkt (HSA ) TITER-STANDARD-KURVE berechn.
Standard IgG-Konz. B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l
0.067 106.300 0.6829 0.6582 0.0376 0.0125
0.067 53.130 0.6365 0.6459 0.0145 0.0086
0.067 26.560 0.5407 0.5748 0.0594 0.0644
0.067 13.280 0.3889 0.4625 0.1590 0.0417
0.067 6.641 0.2433 0.2765 0.1199 0.0717
0.067 3.320 0.1477 0.1609 0.0821 0.0833
0.067 1.660 0.0944 0.1146 0.1763 0.0405
0.100 106.300 0.6740 0.6543 0.0301 0.0104
0.100 53.130 0.6175 0.6375 0.0314 0.0113
0.100 26.560 0.5052 0.5925 0.1473 0.0239
0.100 13.280 0.3475 0.4512 0.2299 0.0480
0.100 6.641 0.2135 0.2073 0.0297 0.0085
0.100 3.320 0.1305 0.0893 0.4618 0.1174
0.100 1.660 0.0853 0.0771 0.1060 0.0746
0.330 106.300 0.6089 0.5959 0.0219 0.0384
0.330 53.130 0.4901 0.5513 0.1111 0.0387
0.330 26.560 .0.3314 0.3855 0.1403 0.0390
0.330 13.280 0.2026 0.1983 0.0216 0.0807
0.330 6.641 0.1244 0.1052 0.1827 0.1210
0.330 3.320 0.0821 0.0662 0.2392 0.2107
0.330 1.660 0.0601 0.0596 0.0089 0.0667
0.567 106.300 0.5412 0.5325 0.0165 0.0087
0.567 53.130 0.3896 0.4054 0.0391 0.0308
0.567 26.560 0.2437 0.2894 0.1579 0.0694
0.567 13.280 0.1479 0.1462 0.0120 0.0780
0.567 6.641 0.0945 0.0950 0.0053 0.0554
0.567 3.320 0.0665 0.0712 0.0662 0.0335
0.567 1.660 0.0522 0.0520 0.0038 0.1256 Diskriminationsprofil für p = 0.500 nmol/l ß-HCG
IgG-Konz. Delta-B/T
nmol/l
170.458 0.0848
136.366 0.1080
109.093 0.1367
87.275 0.1710
69.820 0.2098
55.856 0.2505
44.685 0.2897
35.748 0.3233
28.598 0.3484
22.879 0.3625
18.303 0.3644
14.642 0.3539
11.714 0.3322
9.371 0.3018
7.497 0.2665
5.997 0.2299
4.798 0.1946
3.838 0.1624
3.071 0.1342
2.457 0.1100
1.965 0.0896
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination = 18.303 nmol/l für Antigenkonzentration = 0.500 nmol/l ß-HCG
Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
nmol/l nmol/l
0.002 0.5621 0.007 3.9937
0.037 0.5059 0.007 0.1957 Fortsetzung der Tabelle
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
nmol/l nmol/l
0.073 0.4553 0.008 0.1035
0.111 0.4098 0.008 0.0730
0.151 0.3688 0.009 0.0584
0.196 0.3319 0.010 0.0500
0.301 0.2689 0.012 0.0412
0.364 0.2420 0.014 0.0388
0.520 0.1960 0.019 0.0362
0.617 0.1764 0.022 0.0357
0.866 0.1429 0.031 0.0357
1.028 0.1286 0.037 0.0363
1.464 0.1042 0.057 0.0386
2.151 0.0844 0.093 0.0434
3.358 0.0683 0.177 0.0527
4.367 0.0615 0.266 0.0610
8.735 0.0498 0.864 0.0990
Das Standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich als Streuung (1 × S-Bereich) des zu bestimmenden Antigens (Antigenen) bei einem durchschnittlichen Fehler der experimentellen Werte von 2 % und einer vom Nutzer angegebenen Impulsrate des Totalwertes.
zu Beispiel 3: Estradiol-RIA mit monoklonalen Antikörpern,
B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05 % Humanserumalbumin (Serva)
- Monoklonaler Antikörper (IgG 2a) von Biogenesis in den
Konzentrationen 2.0, 0.25 und 0.031 nmol/l - Estradiol(E2) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.05,. 0.15, 0.5, 5, 10 und 15 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.2 nmol/l)
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500
Verfahrensschritte:
Gabe von 0.05 ml E2, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer in ein
Glasröhrchen.
Inkubation über eine Stunde. Zugabe von 1 ml
Dextrankohlesuspension. Zentrifugation der Proben. Dekantieren des Überstandes in Plaströhrchen. Messen des Überstands im
Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen
(Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s250491s (Versuch vom 25.04.91) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s250491s = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.20 nmol/l
Bindungskonstante K : 1.42253 +/- 0.05311
Bindungsfaktor p/q : 1.00405 +/- 0.05742
unspezifische Bindung nsb : 0.01964 +/- 0.00603
Summe der Abweichungsquadrate: 5.4239827750E-03
Modellfehler: 0.1040 Versuchsfehler: 0.0622
Auswertung geeignet Erläuterungen:
- Bindungsf aktor: Bindung von E2 zu monoklonalem Antikörper im Verhältnis 1:1.
- Im Reaktionsmilieu ist keine nennenswerte kreuzreaktive
Substanz enthalten .
TITER-STÄNDÄRD-KURVE berechn.
Standard IgG-Konz. B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l
0.000 2.000 0.5925 0.6073 0.0243 0.0167
0.050 2.000 0.5889 0.5757 0.0230 0.0267
0.150 2.000 0.5817 0.5668 0.0262 0.0317
0.500 2.000 0.5559 0.5793 0.0404 0.0359
5.000 2.000 0.3000 0.3356 0.1059 0.0137
10.000 2.000 0.1884 0.2164 0.1291 0.0213
15.000 2.000 0.1391 0.1539 0.0959 0.0267
0.000 0.250 0.4903 0.4758 0.0305 0.0314
0.050 0.250 0.4625 0.4597 0.0062 0.0272
0.150 0.250 0.4117 0.4112 0.0012 0.0198
0.500 0.250 0.2865 0.2652 0.0804 0.0138
1.500 0.250 0.1515 0.1369 0.1072 0.0132
5.000 0.250 0.0663 0.0622 0.0651 0.0626
10.000 0.250 0.0438 0.0436 0.0049 0.0273
15.000 0.250 0.0360 0.0363 0.0093 0.1905
0.000 0.031 0.1589 0.1300 0.2224 0.0552
0.050 0.031 0.1339 0.1212 0.1047 0.0629
0.150 0.031 0.1036 0.1014 0.0226 0.0367
0.500 0.031 0.0631 0.0611 0.0326 0.0558
1.500 0.031 0.0379 0.0399 0.0505 0.0414
5.000 0.031 0.0257 0.0334 0.2319 0.0509
10.000 0.031 0.0227 0.0278 0.1832 0.1378
15.000 0.031 0.0217 0.0222 0.0225 0.0787 Diskriminationsprofil für p = 5.000 nmol/l E2
IgG-Konz. Delta-B/T
nmol/l
9.960 0.0734
6.374 0.1143
4.079 0.1730
3.264 0.2085
2.089 0.2851
1.671 0.3222
1.069 0.3847
0.856 0.4080
0.684 0.4253
0.438 0.4411
0.350 0.4394
0.224 0.4158
0.179 0.3938
0.115 0.3324
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination = 0.438 nmol/l für Antigenkonzentration = 5.000 nmol/l E2
Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
nmol/l nmol/l
0.161 0.4869 0.032 0.2009
0.319 0.4382 0.032 0.1011
0.479 0.3944 0.033 0.0696
0.825 0.3195 0.038 0.0462
1.020 0.2875 0.042 0.0409
1.469 0.2329 0.051 0.0350
1.734 0.2096 0.058 0.0332
2.366 0.1698 0.074 0.0311 Fortsetzung der Tabelle
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
nmol/l nmol/l
3.181 0.1375 0.096 0.0301
4.253 0.1114 0.128 0.0300
5.698 0.0902 0.174 0.0306
7.703 0.0731 0.246 0.0320
9.009 0.0658 0.298 0.0331
12.556 0.0533 0.455 0.0362
18.188 0.0432 0.758 0.0417
28.206 0.0350 1.462 0.0518
50.204 0.0283 3.774 0.0752
74.792 0.0255 7.681 0.1027
Das Standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich als Streuung (1 × S-Bereich) des zu bestimmenden Antigens (Antigenen) bei einem durchschnittlichen Fehler der experimentellen Werte von 2 % und einer vom Nutzer angegebenen Impulsrate des Totalwertes .
zu Beispiel 4: bLH-RIA mit ungereinigtem Antiserum, Kalte
Vorinkubation, B/P-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 0.1 % HSA
- Antiserum gegen bovines luteinisierendes Hormon (bLH) vom Kaninchen in den Verdünnungen 1:500, 1:1000, 1:2000, 1:4000, 1:8000, 1:16000, 1:32000, 1:64000, 1:128000, 1:256000 (Für die Auswertung: 1:1000 = 1)
- bLH (Präparation 2026, IWF) als Antigen in der Konzentration 64 μg/l
- I-125-bLH als Tracer (2 μg/l)
- optimierte Doppelantikörpertechnik mit 1:20 verdünntem 2. Antikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin, 1:300 verdünntem Normalkaninchenserum (NKS) sowie einem Präzipitationshilfsmittel (Latex in Aqua dest.) für die Ausfällung des anti-körpergebundenen bLH.
Verfahrensschritte:
0.1 ml Antiserum, 0.1 ml bLH und 0.1 ml bzw. 0.2 ml (Standard 0) Puffer in Plaströhrchen zusammengeben. Über Nacht inkubieren lassen. Dazu 0.1 ml Tracer geben und nach 3 h Zugabe von 0.1 ml NKS und 0.1 ml 2. Antikörper. Reaktion über Nacht. Stoppen mit 1 ml Latex-Lösung. Zentrifugieren, Überstand absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen t250184t (Versuch vom 25.01.84) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: t250184t
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 4
Tracerkonzentration: 2.000 μg/l
Bindungskonstante K1 : 2.32291 +/- 0.04526 Bindungsfaktor p/q1 : 38.29413 +/- 0.96095 unspezifische Bindung nsb : 0.04345 +/- 0.00370 Antigenäquivalent (Fremdsubstanz) p2 : 0.78202 +/- 0.02068 μg/l
Summe der Abweichungsquadrate: 7.7951355217E-04
Modellfehler: 0.0403 Versuchsfehler: 0.0216 Erläuterungen: Eine Antiserumverdünnung von 1:1000 hat eine
Bindungskapazität für 38.3 μg bLH.
Im Reaktionsmedium befindet sich eine
Fremdsubstanz, die wie 0.78 μg/l bLH wirkt.
STÄNDARD-TITER-KDRVE
AS-Verd. berechn.
Standard IgG-Konz. B/T-Wert B/T-wert Abweich. VK μg/l (1=1:1000)
0.000 0.004 0.1157 0.1055 0.0966 0.0152
0.000 0.008 0.1826 0.1842 0.0084 0.0072
0.000 0.016 0.2985 0.3099 0.0367 0.0184
0.000 0.031 0.4588 0.4584 0.0008 0.0173
0.000 0.063 0.5982 0.5879 0.0176 0.0121
0.Q00 0.125 0.6745 0.6742 0.0005 0.0110
0.000 0.250 0.7100 0.7122 0.0031 0.0041
0.000 0.500 0.7267 0.7235 0.0045 0.0177
0.000 1.000 0.7347 0.7411 0.0086 0.0101
0.000 2.000 0.7386 0.7509 0.0163 0.0030
64.000 0.016 0.0458 0.0422 0.0842 0.0559
64.000 0.031 0.0528 0.0530 0.0024 0.0136
64.000 0.063 0.0806 0.0858 0.0603 0.0448
64.000 0.125 0.1843 0.1819 0.0133 0.0290
64.000 0.250 0.4612 0.4647 0.0076 0.0177
64.000 0.500 0.6729 0.6625 0.0157 0.0005
64.000 1.000 0.7241 0.7176 0.0091 0.0038
64.000 2.000 0.7364 0.7412 0.0064 0.0164
Diskriminationsprofil für p = 16.000 μg/l
IgG-Konz. Delta-B
0.836 0.0846
0.535 0.1375
0.342 0.2151 Fortsetzung der Tabelle
IgG-Konz. Delta-B/T
0.219 0.3063
0.175 0.3487
0.112 0.4114
0.072 0.4329
0.057 0.4259
0.037 0.3775
0.024 0.2983
0.015 0.2159
0.012 0.1797
Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination = 0.072 (= Antiserumverdünnung von 1 :13890)
für Antigenkonzentration = 16.000 μg/l
Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
μg/l μg/l
1.040 0.5345 0.200 0.1921
1.939 0.4810 0.170 0.0875
3.514 0.3896 0.161 0.0459
5.149 0.3156 0.182 0.0353
7.079 0.2556 0.224 0.0317
9.529 0.2071 0.293 0.0308
12.806 0.1677 0.403 0.0314
17.419 0.1359 0.584 0.0335
24.317 0.1100 0.907 0.0373
35.554 0.0891 1.564 0.0440
56.570 0.0722 3.233 0.0572
108.221 0.0585 9.879 0.0913
177.108 0.0526 24.886 0.1405 Das Standardisierte Prazisionsprofil ergibt sich als Streuung (1 × S-Bereich) des zu bestimmenden Antigens (Antigenen) bei einem durchschnittlichen Fehler der experimentellen Werte von 2 % und einer vom Nutzer angegebenen Impulsrate des Totalwertes.
2. IRMA-Optimierung zu Beispiel 5: TSH-IRMA mit einem I-125-monoklonalen Antikörper, einem unmarkierten polyklonalen Antikörperpool, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- TSH (eigener SekundärStandard in Serumverdünnung) in den
Konzentrationen: 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und mU/1
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK) a 40, 20 und 10
KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1:400 Verdünnung und 1 %
Tween 80 als Reaktiorismilieu
- gereinigte polyklonale Anti-TSH-Antikörper (1:2000) vom
Kaninchen
- Normalkaninchenserum (NKS; 1:100-Verdünnung)
- Fällungsgemisch: Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin zusammen mit NKS und PEG (Polyethylenglykol) 6000-Verdünnung.
Verfahrensschritte:
0.2 ml TSH und 0.1 ml Tracer in ein Plastrohrchen geben. Über Nacht inkubieren lassen. 0.1 ml polyklonaler Antikörper und NKS dazu. Nach einer Stunde Fällungsgemisch dazu und inkubieren lassen. Nach einer weiteren Stunde waschen, zentrifugieren, absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK- Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s270788t (Versuch vom 27.07.88) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s270788t
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 2
Bindungskonstante Kl : 1.44601 +/- 0.02135 Bindungsfaktor p/q : 0.21994 +/- 0.00366 unspezifische Bindung nsb : 0.00340 +/- 0.00011 Antigenäquivalent (Fremdprotein) q2 : 8.62739 +/- 0.50975
Summe der Abweichungsquadrate: 3.2043247356E-06
Modellfehler: 0.0599 Versuchsfehler: 0.0559
Erläuterungen : Angaben für den I-125-MAK in 1000 cpm (counts per minute) .
- Bindungsf aktor: 1000 cpm des I-125-MAK haben eine TSHBindungskapazität von 0.22 mU TSH .
- unspezifische Bindung: in Abwesenheit von TSH beträgt die Bindungsrate 0.34 %.
- Neben der gemeinsamen Sandwich-Bindung des I-125-MAK und des polyklonalen Antikörpers existiert eine zusätzliche, nicht mit dem I-125-MAK gemeinsam reagierende IgG- oder allgemeiner Proteinbindungkapazität für TSH. STANDÄRD-TITER-KURVE
Konz. des berechn.
Standard I-125-MAK B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK mU/l 1000 cpm
0.000 59.496 0.0034 0.0036 0.0664 0.0775
0.160 59.496 0.0107 0.0110 0.0210 0.0872
0.310 59.496 0.0175 0.0187 0.0630 0.0211
1.250 59.496 0.0586 0.0603 0.0278 0.0341
5.000 59.496 0.1958 0.1941 0.0083 0.0082
20.000 59.496 0.4370 0.4036 0.0828 0.0304
80.000 59.496 0.5549 0.5495 0.0098 0.0080
0.000 114.759 0.0034 0.0036 0.0667 0.1202
0.160 114.759 0.0081 0.0085 0.0423 0.0449
0.310 114.759 0.0125 0.0134 0.0638 0.0762
1.250 114.759 0.0394 0.0438 0.1019 0.0773
5.000 114.759 0.1355 0.1380 0.0178 0.0123
20.000 114.759 0.3638 0.3551 0.0247 0.0097
80.000 114.759 0.5322 0.5345 0.0043 0.0039
0.000 222.833 0.0034 0.0035 0.0400 0.0559
0.160 222.833 0.0062 0.0061 0.0173 0.0106
0.310 222.833 0.0088 0.0101 0.1357 0.1310
1.250 222.833 0.0248 0.0249 0.0060 0.0064
5.000 222.833 0.0848 0.0847 0.0015 0.0051
20.000 222.833 0.2653 0.2598 0.0209 0.0137
80.000 222.833 0.4882 0.5107 0.0440 0.0129
Diskriminationsprofil für p = 10.000
IgG-Konz. Delta-B/T
1000 cpm
227.337 0.1329
181.870 0.1551
145.496 0.1786
116.397 0.2027
93.117 0.2265 Fortsetzung der Tabelle
IgG-Konz. Delta-B/T
iooo cpm
74.494 0.2491
59.595 0.2697
47.676 0.2879
38.141 0.3032
30.513 0.3158
24.410 0.3258
19.528 0.3337
15.622 0.3397
12.498 0.3442
9.998 0.3476
7.999 0.3502
6.399 0.3521
5.119 0.3535
optimale Antikörperkonzentration = 12498 cpm
für Antigenkonzentration = 10.000 mU/l TSH
Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
mU/l mU/l
100.000 0.5781 30.959 0.3096
28.642 0.4914 1.432 0.0500
20.965 0.3550 0.331 0.0158
18.022 0.2565 0.166 0.0092
15.430 0.1853 0.106 0.0068
12.963 0.1339 0.076 0.0059
10.681 0.0967 0.060 0.0056
8.640 0.0699 0.050 0.0058
6.866 0.0505 0.043 0.0063
5.356 0.0365 0.038 0.0070
4.091 0.0264 0.033 0.0081 Fortsetzung der Tabelle
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
mU/l mU/l
3.046 0.0190 0.029 0.0095
2.189 0.0138 0.026 0.0117
1.492 0.0099 0.022 0.0151
0.926 0.0072 0.020 0.0213
0.468 0.0052 0.017 0.0370
0.273 0.0044 0.016 0.0595
0.097 0.0037 0.015 0.1568
Das standardisierte Präzizionsprofil ergibt sich aus einem durchschnittlichen experimentellen Fehler von 2 % und aus dem Zählfehler der optimierten Konzentration des I-125-MAK.
Beispiel 6: TSH-IRMA mit zwei monoklonalen Antikörpern,
B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- Mit MAK beschichtete Röhrchen (IRE, Belgien)
- TSH-Standards von IRE a 0, 0.15, 0.5, 1.5, 5, 15, 50 und 150 mU/1
- TSH-Standards von Henning,Berlin (Dyno-Test) a 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und 80 mU/l
- I-125-MAK a 126807 cpm (Dyno) und 32122 cpm (IRE) als Tracer
Verfahrensschritte:
0.2 ml Standard und 0.1 ml Tracer in die beschichteten Röhrchen geben. Über Nacht inkubieren lassen. Absaugen, waschen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s290688t (Versuch vom 29.06.88) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s290688t
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 3
Bindungskonstante K1 : 1.88349 +/- 0.04877 Bindungsfaktor p/q : 0.99937 +/- 0.00494 unspezifische Bindung nsb : 0.00002 +/- 0.00002 Antigenäquivalent (Fremdsubstanz) p2 : 0.02810 +/- 0.00266
Summe der Abweichungsquadrate: 9.2666388420E-09
Modellfehler: 0.0797 Versuchsfehler: 0.2167
Erläuterung: Im Reaktionsmedium oder an der Wandung befindet sich eine kreuzreaktive Substanz, die wie 0.028 mU/l TSH wirkt .
STANDARD-TITER-KURVE
Konz . des berechn.
Standard I-125-MAK B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK
mU/l 1000 cpm
0.000 32.122 0.0009 0.0009 0.0262 0.0812
0.150 32.122 0.0055 0.0056 0.0100 0.0868
0.500 32.122 0.0163 0.0163 0.0012 0.0034
1.500 32.122 0.0464 0.0460 0.0086 0.0102
5.000 32.122 0.1428 0.1417 0.0075 0.0178
15.000 32.122 0.3401 0.3430 0.0086 0.0116
50.000 32.122 0.5495 0.5586 0.0163 0.0131
150.000 32.122 0.6203 0.5937 0.0448 0.0285 Fozrtsetzung der Xabelle
Konz. des berechn.
Standard 1-125-MAK B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK mU/l 1000 cpm
0.000 126.807 0.0002 0.0003 0.2392 0.8041
0.160 126.807 0.0015 0.0015 0.0000 0.0053
0.310 126.807 0.0027 0.0026 0.0178 0.1087
1.250 126.807 0.0100 0.0098 0.0291 0.0905
5.000 126.807 0.0388 0.0421 0.0773 0.1396
20.000 126.807 0.1440 0.1425 0.0101 0.0447
80.000 126.807 0.4041 0.3858 0.0474 0.0242
Diskriminatiisnsprofil für p = 10.000 m U/l
IgG-Konz. Delta-B/T
1000 cpm
50.032 0.1572
40.025 0.1890
32.020. 0.2245
25.616 0.2625
20.493 0.3010
16.394 0.3370
13.115 0.3675
10.492 0.3899
8.394 0.4026
6.715 0.4048
5.372 0.3968
4.298 0.3790
3.438 0.3524
2.751 0.3185
2.200 0.2797
1.760 0.2385
1.408 0.1983
1.127 0.1614
0.901 0.1295 Fortsetzung der Tabelle
IgG-Konz. Delta-B/T
1000 cpm
0.721 0.1030
0.577 0.0815
0.461 0.0644
0.369 0.0509 optimale Antikörperkonzentration = 6715 cpm
für Antigenkonzentration = 10.000 mU/l
Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Antigenkonz. B/T-Wert Antigenstreuung VK
mU/l mU/l
100.000 0.6432 55.371 0.5537
10.169 0.5467 0.907 0.0892
5.756 0.4647 0.291 0.0505
3.051 0.3357 0.104 0.0341
1.933 0.2426 0.062 0.0323
1.297 0.1753 0.045 0.0344
0.892 0.1266 0.035 0.0387
0.518 0.0778 0.025 0.0484
0.361 0.0562 0.021 0.0573
0.208 0.0345 0.016 0.0760
0.141 0.0249 0.013 0.0939
0.094 0.0180 0.011 0.1194
0.060 0.0130 0.009 0.1585
0.046 0.0111 0.009 0.1875
0.026 0.0080 0.007 0.2878
0.011 0.0058 0.006 0.5878
0.005 0.0049 0.006 1.2005 Das standardisierte Präzizionsprofil ergibt sich aus einem durchschnittlichen experimentellen Fehler von 2 % und aus dem Zählfehler der optimierten Konzentration des I-125-MAK.
3. Kreuzreaktionsstudien zu Beispiel 7: Estron-Kreuzreaktivität im Estradiol-RIA
Estradiol-RIA mit ungereinigtem Antiserum, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05 % Humanserumalbumin (Serva)
- Anti-E2-Antiserum (3-E2-(3)D),1:20 000
- Estradiol(E2) in den Konzentrationen 0, 0.043, 0.143, 0.429, 1.429, 2.857 und 5.714 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.014 nmol/l)
- Estron in den Konzentrationen 0, 0.429 und 5.71 nmol/l
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500
Verfahrensschritte:
Es werden 0.5 ml Puffer, der alle Varianten der aufgeführten Estradiol- und Estronkonzentrationen enthält, zusammen mit 0.1 ml Tracer und 0.1 ml Antiserum in ein Plastrohrchen gegeben und über Nacht inkubiert. Zugabe von 1 ml Dextrankohlesuspension. Zentrifugation der Proben. Dekantieren des ÜberStands in Plastrohrchen. Messen des Überstands und von 0.1 ml Tracer als Totalwert im Gammacounter.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen sl61091t (Versuch vom 16.10.91) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s161091t
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.01400 nmol/l
Bindungskonstante K1 : 0.81216 +/- 0.01441
Bindungskapazität q : 0.16775 +/- 0.00781 nmol/l unspezifische Bindung nsb : 0.03365 +/- 0.00415
Kreuzreaktivität p1/p2 : 0.06076 +/- 0.00284
Summe der Abweichungsquadrate: 5.8483566241E-04
Modellfehler: 0.0249 Versuchsfehler: 0.0355
Erläuterungen:
- Die verwendete Antiserumverdünnung (1 :20 000) hat eine
Bindungskapazität für 0.168 nmol E2
- Die Kreuzreaktivität Estron (p2) zu Estradiol (pl) beträgt
KREUZREAKTIONSSTUDIE
Standard 1: Estradiol (p1) Standard 2: Estron (p2) berechn.
Standard1 Standard2 B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l
0.000 0.000 0.4726 0.4832 0.0219 0.0109
0.043 0.000 0.4449 0.4467 0.0038 0.0108
0.143 0.000 0.3861 0.3972 0.0278 0.0171
0.429 0.000 0.2689 0.2709 0.0073 0.0349
1.429 0.000 0.1339 0.1353 0.0099 0.0135
2.857 0.000 0.0879 0.0833 0.0553 0.0051
0.000 0.429 0.4557 0.4414 0.0324 0.0122
0.043 0.429 0.4288 0.4250 0.0090 0.0154
0.143 0.429 0.3723 0.3675 0.0129 0.0194
0.429 0.429 0.2614 0.2551 0.0249 0.0167
1.429 0.429 0.1324 0.1319 0.0039 0.0236
2.857 0.429 0.0875 0.0870 0.0061 0.0435
0.000 5.710 0.2954 0.2957 0.0010 0.0327
0.043 5.710 0.2809 0.2847 0.0133 0.0288
0.143 5.710 0.2520 0.2504 0.0063 0.0288
0.429 5.710 0.1955 0.1970 0.0078 0.0390
1.429 5.710 0.1169 0.1163 0.0050 0.0431
2.857 5.710 0.0825 0.0868 0.0497 0.0631
5.714 5.710 0.0603 0.0608 0.0072 0.0917
Effekt der Kreuzreaktion für eine vorgegebene Konzentration = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =
Systematische Abweichungen durch p2 = 0.500 nmol/l Estron unbeinflußt beeinflußt Systematische
Antigenkonz. B/T B/T Abweichung
nmol/l
0.014 0.4635 0.4441 0.0419
0.028 0.4545 0.4353 0.0421 Fortsetzung der Tabelle unbeinflußt beeinflußt System
Antigenkonz. B/T B/T Abweic
nmol/l
0.056 0.4368 0.4183 0.0423
0.112 0.4034 0.3864 0.0420
0.224 0.3454 0.3318 0.0394
0.448 0.2634 0.2551 0.0317
0.896 0.1793 0.1757 0.0202
1.792 0.1162 0.1150 0.0104
3.584 0.0776 0.0773 0.0045
7.168 0.0563 0.0562 0.0016 zu Beispiel 8: Serumeinfluß auf den ß-HCG-RIA
ß-HCG-RIA mit gereinigtem, polyklonalen
Antikörpern,
B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05 % Humanserumalbumin (Serva)
- ß-HCG (Calbiochem) in den Konzentrationen 0, 0.021, 0.042, 0.083, 0.167, 0.333, 0.667 und 1.333 nmol/l
- Protein-A gereinigter polyklonaler Anti-ß-HCG Antikörper
(4 nmol/l)
- Poolserum in den Verdünnungen 1 (unverdünnt) und 1:4
- I-125-ß-HCG (0.067 nmol/l) als Tracer
Verfahrenssehritte:
0.1 ml ß-HCG, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.3 ml Pufferlösung, zu 0.3 ml 1:4 verdünnten Serum und zu 0.3 ml Vollserum in ein Plastrohrchen gegeben. Inkubation über Nacht. Zugabe von einer Präzititationslösung, bestehend aus 1:10 verdünnten 2. Antikörper gegen Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1:100 und 4 % PEG 6000.
Nach 15 Minuten unter Zusatz von 1 ml Latex-Wasser zentrifugieren und Überstand absaugen. Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s081289s (Versuch vom 8.12.89) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: sθ81289s
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.06700
Bindungskonstante K1 : 1.76139 +/- 0.20004
Bindungskapazität q : 0.05535 +/- 0.00494 unspezifische Bindung nsb : 0.03339 +/- 0.00874
Kreuzreaktivität pl/p2 : 0.08098 +/- 0.00915
Summe der Abweichungsquadrate: 4.2555375171E-03
Modellfehler: 0.0817 Versuchsfehler: 0.0189
Auswertung geeignet
Erläuterungen:
- Die verwendete Antikörperverdünnung hat eine Bindungskapazität für 0.055 nmol/l ß-HCG
- Das Vollserum hat zum ß-HCG eine Kreuzreaktivität von 8.1 %. Da das Gesamtmilieu bei 0.3 ml Serum zu 0.3 ml Puffer maximal ein Halbserum ist, ist in einem Vollserummilieu mit störenden, unbekannten kreuzreaktiven Substanzen von 0.162 nmol ß-HCG- Aquivalent zu rechnen. KREUZREAKTIONSSTUDIE
Standard 1: ß-HCG (p1) Standard 2: Serumverdünnung (p2) berechn.
Standard1 Standard2 B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l
0.000 0.000 0.4804 0.4931 0.0258 0.0252
0.021 0.000 0.4293 0.4400 0.0243 0.0174
0.042 0.000 0.3855 0.3949 0.0239 0.0157
0.083 0.000 0.3187 0.3305 0.0357 0.0101
0.167 0.000 0.2358 0.2542 0.0723 0.0076
0.333 0.000 0.1603 0.1765 0.0918 0.0231
0.667 0.000 0.1055 0.1224 0.1386 0.0072
1.333 0.000 0.0720 0.0834 0.1370 0.0119
0.000 0.250 0.4305 0.4124 0.0438 0.0033
0.021 0.250 0.3867 0.3655 0.0580 0.0086
0.042 0.250 0.3498 0.3248 0.0769 0.0169
0.083 0.250 0.2936 0.2765 0.0617 0.0265
0.167 0.250 0.2223 0.2099 0.0592 0.0023
0.333 0.250 0.1548 0.1509 0.0253 0.0156
0.667 0.250 0.1036 0.0982 0.0553 0.0368
1.333 0.250 0.0715 0.0660 0.0829 0.0222
0.000 1.000 0.3215 0.3391 0.0520 0.0086
0.021 1.000 0.2953 0.3069 0.0380 0.0240
0.042 1.000 0.2730 0.2783 0.0193 0.0115
0.083 1.000 0.2380 0.2402 0.0093 0.0082
0.167 1.000 0.1905 0.1813 0.0510 0.0287
0.333 1.000 0.1406 0.1316 0.0687 0.0217
0.667 1.000 0.0986 0.0914 0.0791 0.0061
1.333 1.000 0.0700 0.0594 0.1777 0.0340 Effekt der Kreuzreaktion
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =
Systematische Abweichungen durch p2 = 0.500
(Serumverdünnung 1:4) unbeinflußt beeinflußt Systema
igenkonz. B/T B/T Abweich
nmol/l
0.067 0.3418 0.2888 0.1551
0.134 0.2623 0.2306 0.1209
0.268 0.1822 0.1678 0.0791
0.536 0.1202 0.1151 0.0429
1.072 0.0806 0.0790 0.0195
zu Beispiel 9: Albumineinfluß auf den T3-RIA
T3-RIA mit gereingten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.02 m Tris-Puffer mit pH 8.7 und 0.5 % Humanserumalbumin (HSA; Serva)
- Protein-A gereinigtes anti-T3-IgG (1.406 nmol/l) als
Antikörper.
- Triiodthyronin (T3; Henning, erlin) als Antigen in den
Konzentrationen
0, 0.157, 0.312, 0.624, 1.249, 2.498, 4.992 und 10 nmol/l
- HSA in den Konzentrationen 8.33, 30.0 und 103.3 μmol/l
- I-125-T3 (0.215 nmol/l) als Tracer
Verfahrensschritte:
0.1 ml T3, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.2 ml
Puffer unterschiedlicher HSA-Konzentration in ein Plastrohrchen gegeben. Nach 2 h Inkubation Zugabe von einer Präzititationslösung, bestehend aus 1:20 verdünnten 2. Antikörper gegen Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1:100 und 4 % PEG 6000.
Nach 15 Minuten mit 1 ml Latex-Lösung zentrifugieren und Überstand absaugen. Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen sl70589s (Versuch vom 17.5.89) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: b: sl70589s
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 1
Tracerkonzentration: 0.21500 nmol/l
Bindungskonstante K1 : 1.54015 +/- 0.05858
Bindungskapazität q : 0.80873 +/- 0.06008 nmol/l unspezifische Bindung nsb : 0.01135 +/- 0.00917
Kreuzreaktivität p1/p2 : 0.02209 +/- 0.00138
Stamme der Abweichungsquadrate: 3.0584606053E-03
Modellfehler: 0.0825 Versuchsfehler: 0.0513
Erläuterungen:
- Die 1.406 nmol/l anti-T3-IgG haben eine Bindungskapazität für 0.809 nmol/l T3
- HSA in μmol-Mengen ist 2.2 % kreuzreaktiv zu T3 in nmol- Mengen . Die Kreuzreaktivität des HSA zu T3 ist somit 0.0022 % KREUZREAKTIONSSTUDIE
Standard 1: T3 (p1) Standard 2: HSA (p2)
berechn.
Standard1 Standard2 B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l μmol/l
0.000 8.333 0.5432 0.5372 0.0110 0.0165
0.157 8.333 0.5135 0.5023 0.0223 0.0096
0.312 8.333 0.4848 0.4861 0.0028 0.0149
0.624 8.333 0.4309 0.4371 0.0141 0.0603
1.249 8.333 0.3436 0.3471 0.0101 0.0339
2.498 8.333 0.2375 0.2188 0.0857 0.0105
4.992 8.333 0.1462 0.1666 0.1227 0.1533
9.999 8.333 0.0851 0.1028 0.1722 0.1242
0.000 30.000 0.4552 0.4620 0.0146 0.0834
0.157 30.000 0.4290 0.4404 0.0258 0.0030
0.312 30.000 0.4048 0.4043 0.0014 0.0166
0.624 30.000 0.3615 0.3611 0.0011 0.0078
1.249 30.000 0.2942 0.2931 0.0040 0.0162
2.498 30.000 0.2119 0.2150 0.0143 0.0430
4.992 30.000 0.1363 0.1488 0.0836 0.0228
9.999 30.000 0.0820 0.0890 0.0784 0.0054
0.000 103.300 0.2641 0.2801 0.0572 0.0086
0.157 103.300 0.2530 0.2597 0.0256 0.0280
0.312 103.300 0.2429 0.2358 0.0304 0.0133
0.624 103.300 0.2248 0.2128 0.0564 0.0058
1.249 103.300 0.1956 0.1822 0.0732 0.0348
2.498 103.300 0.1555 0.1340 0.1606 0.0154
4.992 103.300 0.1115 0.0975 0.1438 0.0280
9.999 103.300 0.0733 0.0669 0.0949 0.0750 Effekt der Kreuzreaktion
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =
Systematische Abweichungen durch p2 15.000 μmol/l HSA unbeinflußt beeinflußt Systematische
Antigenkonz. B/T B/T Abweic
nmol/l
0.215 0.5373 0.4757 0.1147
0.430 0.4969 0.4385 0.1174
0.860 0.4225 0.3740 0.1150
1.720 0.3124 0.2821 0.0969
3.440 0.1993 0.1863 0.0655
6.880 0.1166 0.1123 0.0370
13.760 0.0670 0.0658 0.0185
zu Beispiel 10: Einfluß von Rindergammaglobulin auf die
Bindungskapazität im TSH-IRMA mit Doppelantikörpertechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- TSH (eigener SekundärStandard in Serumverdünnung) in den Konzentrationen:
0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und mU/l
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK; ZIM, Micheel) a 20 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1:400 Verdünnung und 1 % Tween 80 mit und ohne 46.9 μmol/1 Rindergammaglobulin als Reaktionsmi1ieu
- gereinigte polyklonale anti-TSH-Antikörper (1:2000) vom
Kaninchen
- Normalkaninchenserum (NKS; 1:100-Verdünnung)
- Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen KaninchenGammaglobulin in einem Fällungsgemisch zusammen mit NKS und PEG 6000-Verdünnung. Verfahrensschritte:
0.2 ml TSH und 0.1 ml Tracer in ein Plastrohrchen geben. Über Nacht inkubieren lassen. 0.1 ml polyklonaler Antikörper mit NKS dazu. Nach einer Stunde Fällungsgemisch dazu und nach einer weiteren Stunde waschen, zentrifigieren, absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s270788t (Versuch vom 27.07.88) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s270989t
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 3
Bindungskonstante K : 1.02286 +/- 0.01064 Bindungskapazität q : 19.67130 +/- 0.48317 mU/1
unspezifische Bindung nsb : 0.00337 +/- 0.00017
Erhöhungsfaktor der Bindungskapazität: 0.02999 +/- 0.01311
Summe der Abweichungsquadrate: 3.2190517302E-06
Modellfehler: 0.0538 Versuchsfehler: 0.0486
Erläuterungen:
- Die beiden verwendeten Antikörper (markierter und unmarkierter Antikörper) haben eine gemeinsame Bindungskapazität für 19.67 mU/1 TSH
- Durch das Rindergammaglobulin wird diese Bindungskapazität noch um 0.03 × Gammaglobulinkonzentration erhöht.
Die 46.9 μmol/l Gammaglobulin wirken wie eine zusätzliche Bindungskapazität von 1.407 mU/l . KREUZREAKTIONSSTUDIE
Standard 1 (p1) : TSH Standard 2 (p2 ) : Rinder-Gamma-Globulin berechn.
Standard1 Standard2 B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK
mU/l μmol/l
0.020 46.900 0.0043 0.0043 0.0093 0.0768
0.100 46.900 0.0081 0.0073 0.1129 0.0789
0.330 46.900 0.0188 0.0187 0.0046 0.0492
1.270 46.900 0.0601 0.0606 0.0092 0.0398
5.000 46.900 0.1881 0.1914 0.0177 0.0246
20.000 46.900 0.3835 0.3792 0.0111 0.0221
80.000 46.900 0.4758 0.4745 0.0028 0.0059
0.020 0.000 0.0044 0.0049 0.1065 0.0711
0.100 0.000 0.0084 0.0084 0.0081 0.0335
0.330 0.000 0.0199 0.0189 0.0536 0.0796
1.270 0.000 0.0639 0.0620 0.0293 0.0412
5.000 0.000 0.1976 0.1976 0.0003 0.0334
20.000 0.000 0.3910 0.3991 0.0203 0.0157
80.000 0.000 0.4780 0.4802 0.0046 0.0155
Effekt der Kreuzreaktion
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = =
Systematische Abweichungen durch p2 100 . 000 μmo l Rindergammaglobulin unbeinflußt beeinflußt Systematische
Antigenkonz . B/T B/T Abweichung
mU/l
0.800 0.0424 0.0374 0.1174
1.600 0.0783 0.0691 0.1172
3.200 0.1407 0.1254 0.1092
6.400 0.2336 0.2126 0.0897
12.800 0.3364 0.3164 0.0594
25.600 0.4149 0.4017 0.0319
51.200 0.4608 0.4536 0.0156
102.400 0.4848 0.4811 0.0076 4. Rezeptorassays zu Beispiel 11: Assay für die Bestimmung von Estradiolrezeptoren im Zytosol von Mammakarzinomgewebe
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- H3-markiertes Estradiol in den Konzentrationen:
21.232, 44.208, 62.593,90.945, 228.422 und 449.254 nmol/l
- Zytosol von Mammakarzinomgewebe mit E2-Rezeptoren mit den Proteingehalten:
3.5, 1.45 und 1.1 g/l (Proteinbestimmung nach Lowry)
- Puffer (0.01 m TRIS, 0.0015 m EDTA, 0.01 m Natriummolybdat, 0.001 m DTT und 10 % Glycerin)
- Dextrankohlesuspension (0.05 % Dextran T 70, 0.5 % Norit A, 0.1 % Gelatine in o.g. Puffer gelöst)
Verfahrensschritte:
Zytosolprobe: 5 μl H3-Estradiol unterschiedlicher Konzentration werden zu 5 μl Äthanol und 100 μl Zytosol einer Proteinkonzentration gegeben.
Mischen mit Schüttler. 18 h Reaktionszeit. Danach Zugabe von 100 μl Kohlesuspension, 15 min. einwirken lassen und anschließend zentrifigieren. Überstand sofort dekantieren und ein Aliquot des Überstands im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer messen. Totalwerte: 5 μl H3-Estradiol unterschiedlicher Konzentration werden zu 5 μl Äthanol und 100 μl Puffer gegeben. Ein Aliquot des Totalwertes im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer messen.
Umrechnen der Radioaktivität der Aliquote auf die eingesetzte Menge.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den 3 zweidimensionalen Versuchen (Tracerkurven) bei konstanter Proteinkonzentration des Zytosols ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s060390t (Versuch vom 06.06.90) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des dreidimensionalen Versuchs: a: s060390t = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 2
Bindungskonstante K : 0.77220 +/- 0.27041 Bindungsfaktor p/q : 10.23231 +/- 1.28212 unspezifische Bindung u : 0.05261 +/- 0.00465 Ligandäquivalent (Fremdsubstanz) p2 : 39.07329 +/- 13.30006 nmol/l
Antikörperäquivalent(Fremdsubstanz)q2 : -5.99250 +/- 1.48413 nmol/l
Summe der Abweichungsquadrate: 6.7677849414E-04
Modellfehler: 0.0661 Versuchsfehler: 0.0200
Erläuterungen:
- Im Zytosol befinden sich unbekannte, zum Estradiol kreuzreaktive Stoffe, die sich wie 39 nmol/l H3-Estradiol
auswirken .
- Der im Zytosol vorhandene Rezeptor wird durch unbekannte
Stoffe in seiner E2 -Bindungskapazität für ca . 6 nmol/l E2 von vornherein reduziert . Bei Umrechnung der E2 -Bindungskapazität auf die Proteinkonzentration mittels Bindungsf aktor = 10.23 zeigt sich, daß ca . 0.6 g/l der Rezeptorzytosolmenge von vornherein von der E2 -Bindung ausgeschlossen sind. Bei
Zytosolen mit einer Proteinkonzentration von 0.6 g/l und weniger erhält man keine Rezeptor-Bindungskurve mehr. TRACER-REZEPTOR-KURVE
H3- Rezept- berechn.
Estradiol Zytosol B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l g/i
21.232 3.500 0.3359 0.3420 0.0179 0.0200
44.208 3.500 0.2901 0.2880 0.0072 0.0200
62.563 3.500 0.2620 0.2672 0.0194 0.0200
90.945 3.500 0.2289 0.2244 0.0201 0.0200
228.422 3.500 0.1509 0.1441 0.0478 0.0200
449.254 3.500 0.1097 0.1118 0.0189 0.0200
21.232 1.450 0.1822 0.1726 0.0559 0.0200
44.208 1.450 0.1499 0.1505 0.0041 0.0200
62.563 1.450 0.1336 0.1411 0.0528 0.0200
90.945 1.450 0.1170 0.1166 0.0030 0.0200
228.422 1.450 0.0848 0.0898 0.0554 0.0200
449.254 1.450 0.0705 0.0788 0.1057 0.0200
21.232 1.100 0.1350 0.1496 0.0976 0.0200
44.208 1.100 0.1133 0.1030 0.0996 0.0200
62.563 1.100 0.1027 0.1071 0.0410 0.0200
90.945 1.100 0.0921 0.0885 0.0402 0.0200
228.422 1.100 0.0720 0.0733 0.0177 0.0200
449.254 1.100 0.0633 0.0576 0.0988 0.0200 Modellprüfung
Gewichtete lineare Regression zum Vergleich der experimentellen Response mit der berechneten Response
Ergebnis:
Relative Übereinstimmung (b +/- db) : 0.981 +/- 0.067
Mittlere Abweichung (a +/- da) : 0.002 +/- 0.007
Korrelationskoeffizient : 0.9812
Die Auswertung ist o.k., wenn b +/- db um 1 und a +/- da um 0 schwanken, da und db sind der Vertrauensbereich von a und b zu Beispiel 12: Assay für die Bestimmung von Progesteronrezeptoren im Zytosol von Mammakarzinomgewebe
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- H3-markiertes Progesteron in den Konzentrationen:
8.784, 40.994, 81.252, 219.252, 388.577, 589.491 und 1041.003 nmol/l
- Zytosol von Mammakarzinomgewebe mit Progesteron-Rezeptoren mit den Proteingehalten: 6.2, 5.2 und 3.25 g/l (Proteinbestimmung nach Lowry)
- Puffer (0.01 m TRIS, 0.0015 m EDTA, 0.01 m Natriummolybdat, 0.001 m DTT und 10 % Glycerin)
- Dextrankohlesuspension (0.05 % Dextran T 70, 0.5 % Norit A, 0.1 % Gelatine in o.g. Puffer gelöst)
Verfahrensschritte:
Zytosolprobe: 5 μl H3-Progesteron unterschiedlicher
Konzentration werden zu 5 μl Äthanol und 100 μl Zytosol einer
Proteinkonzentration gegeben.
Mischen mit Schüttler. 18 h Reaktionszeit. Danach Zugabe von 100 μl Kohlesuspension, 15 min. einwirken lassen und anschließend zentrifigieren. Überstand sofort dekantieren und ein Aliqot des
Überstands im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer messen.
Totalwerte: 5 μl H3-Progesteron unterschiedlicher Konzentration werden zu 5 μl Äthanol und 100 μl Puffer gegeben. Ein Aliquot des Totalwertes im Flüssigkeitsszintillationsspektrometer messen.
Umrechnen der Radioaktivität der Aliquote auf die eingesetzte
Menge.
Eingaben und Umrechnungen auf B / T und VK-Werte für
Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM wird aus den 3 zweidimensionalen
Versuchen (Tracerkurven) bei konstanter Proteinkonzentration des
Zytosols ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s260390t (Versuch vom 26.03.90) zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des dreidimensionalen Versuchs: a: 8260390t = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 3
Bindungskonstante K : 1.00976 +/- 0.26698 Bindungsfaktor p/q : 10.72764 +/- 1.21997 unspezifische Bindung u : 0.04809 +/- 0.00599 Ligandäquivalent (Fremdsubstanz) p2 : 99.99663 +/- 21.54948 nmol/l
Summe der Abweichungsquadrate: 1.4467397930E-03
Modellfehler: 0.0624 Versuchsfehler: 0.0300
Erläuterungen:
- Im Zytosol befinden sich unbekannte, zum Progesteron
kreuzreaktive Stoffe, die sich wie 100 nmol/1 H3 -Progesteron auswirken.
TRACER-REZEPTOR-KURVE
H3- Rezept- berechn.
Progesteron Zytosol B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l g/l
8.784 6.200 0.3708 0.3825 0.0306 0.0300
40.994 6.200 0.3333 0.3434 0.0296 0.0300
81.931 6.200 0.2949 0.3292 0.1042 0.0300
219.252 6.200 0.2150 0.2193 0.0196 0.0300
388.577 6.200 0.1662 0.1702 0.0239 0.0300
589.491 6.200 0.1354 0.1277 0.0599 0.0300
1041.003 6.200 0.1030 0.0994 0.0362 0.0300
8.784 5.200 0.3456 0.3226 0.0710 0.0300 Portsetzung der Tabelle
H3- Rezeptberechn.
Progesteron Zytosol B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK
nmol/l g/l
40.994 5.200 0.3068 0.3114 0.0146 0.0300
81.931 5.200 0.2687 0.2646 0.0153 0.0300
219.252 5.200 0.1934 0.1813 0.0664 0.0300
388.577 5.200 0.1495 0.1558 0.0404 0.0300
589.491 5.200 0.1225 0.1393 0.1203 0.0300
1041.003 5.200 0.0946 0.1012 0.0650 0.0300
8.784 3.250 0.2751 0.2799 0.0170 0.0300
40.994 3.250 0.2379 0.2445 0.0271 0.0300
81.931 3.250 0.2045 0.1874 0.0911 0.0300
219.252 3.250 0.1456 0.1379 0.0556 0.0300
388.577 3.250 0.1144 0.1089 0.0509 0.0300
589.491 3.250 0.0961 0.1008 0.0468 0.0300
1041.003 3.250 0.0777 0.0764 0.0173 0.0300
Modellprüfung
Gewichtete lineare Regression zum Vergleich der experimentellen
Response mit der berechneten Response
Ergebnis:
Relative Übereinstimmung (b +/- db) : 0.984 +/- 0.061
Mittlere Abweichung (a +/- da) : 0.002 +/- 0.009
Korrelationskoeffizient: 0.9828
Die Auswertung ist o.k. , wenn b +/- db um 1 und a +/- da um 0 schwanken, da und db sind der Vertrauensbereich von a und b 5. Vierdimensionale Immunoassays zu Beispiel 13: Kinetik und Gleichgewicht des ß-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern,
B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.01 m Posphatpuffer mit pH 7.4 und 0.01% Rinderserumalbumin (Merck)
- adsorptiv beschichtete NUNC-Röhrchen (NUNC, Dänemark) , über Nacht beschichtet mit 0.3 ml Protein-A gereinigten
polyklonalen Antikörpern (IgG) folgender Konzentrationen: 53.13, 26.56, 13.28, 6.64 und 3.32 nmol/l,
zweimal mit 0.1 m NaCl-Lösung und danach mit Humanserumalbumin (0.5%)- NaCl(0.1 m)-Lösung 6-8 h bei Raumtemperatur gewaschen.
- ß-HCG (Calbiochem) als Antigen in den Konzentrationen 0.017, 0.033, 0.267 und 0.534 nmol/l
- I-125-ß-HCG als Tracer (0.067 nmol/l)
Verfahrensschritte:
In die antikörperbeschichteten Röhrchen werden 0.1 ml ß-HCG- Standard, 0.1 ml I-125-ß-HCG als Tracer und 0.1 ml bzw. 0.2 ml (Standard 0) Puffer gegeben.
Reaktion über 1, 3, 6 und 24 Stunden. 0.5 ml H20 dazu. Röhrchen absaugen und im Gammacounter messen. 0.1 ml Tracer werden als Totalwert messen.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Titerkurven können mit dem Program EINGABE vorgenommen werden.
Mit dem Programm ZUSAM werden aus den zweidimensionalen Versuchen (Titerkurven) dreidimensionale Versuche mit den Namen S25111 bis S251124 (Versuche vom 25.11.91) als Titer-StandardKurven bei gleicher Inkubationszeit zusammengestellt. Mit dem Programm VARIABLE wird die Feldfolge
1. Antikörperkonzentration, 2. Antigenkonzentration in die für die Auswertung erforderliche Feldfolge 1. Antigenkonzentration, 2. Antikörperkonzentration getauscht. Mit dem Programm ZUSAM3 werden die dreidimensionalen RIA-Versuche zu einem vierdimensionalen Versuch unter Einbeziehung der Inkubationszeiten unter den Namen s2511k zusammengefaßt.
Dieser Versuch wird mit dem Programm RIA4D ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: s2511k
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 1
Bindungskonstante K : 1.02961 +/- 0.08052 Bindungsfaktor p/q : 0.00847 +/- 0.00088 unspezifische Bindung u : 0.01434 +/- 0.01302 Geschwindigkeitskonstante k : 1.06788 +/- 0.13293
(nmol/l)2/h
Ligandäquivalent (Fremdsubstanz) p2 : -0.01364 +/- 0.00427 nmol/l
Summe der Abweichungsquadrate: 2.7061065346E-03
Modellfehler: 0.2714 Versuchsfehler: 0.1450
Bemerkungen:
- Der Bindungsf aktor bezieht sich auf die IgG-Konzentration der Beschichtungslösung für die Antikörperbeschichtung der
Röhrchen
- Die Geschwindigkeitskonstante bezieht sich auf die
Assoziationsgeschwindigkeit .
- Der Einfluß einer unbekannten kreuzreaktiven Fremdsubstanz ist nicht signifikant . STÄNDARD-TITER-KINETIK-KURVE
berechn.
ß-hCG IgG-Konz. Zeit B/T-Wert B/T-Wert Abweich VK nmol/l nmol/l* h
0.067 53.130 1.000 0.3139 0.2546 0.2328 0.0465
0.067 26.560 1.000 0.1924 0.1869 0.0296 0.3110
0.067 13.260 1.000 0.1070 0.1961 0.4543 0.0664
0.067 6.641 1.000 0.0566 0.1076 0.4736 0.4959
0.067 3.320 1.000 0.0291 0.0485 0.4001 0.1305
0.084 53.130 1.000 0.3122 0.2324 0.3433 0.0562
0.084 26.560 1.000 0.1912 0.2293 0.1662 0.0352
0.084 13.260 1.000 0.1063 0.2019 0.4734 0.0232
0.084 6.641 1.000 0.0563 0.1163 0.5159 0.1672
0.084 3.320 1.000 0.0290 0.0624 0.5354 0.0977
0.100 53.130 1.000 0.3105 0.2609 0.1903 0.0108
0.100 26.560 1.000 0.1899 0.2239 0.1518 0.0563
0.100 13.260 1.000 0.1056 0.2045 0.4837 0.0815
0.100 6.641 1.000 0.0559 0.1152 0.5145 0.0548
0.100 3.320 1.000 0.0289 0.0585 0.5068 0.0945
0.334 53.130 1.000 0.2874 0.2231 0.2882 0.0227
0.334 26.560 1.000 0.1734 0.1968 0.1189 0.0051
0.334 13.260 1.0.00 0.0961 0.1504 0.3608 0.1897
0.334 6.641 1.000 0.0514 0.0838 0.3870 0.1199
0.334 3.320 1.000 0.0272 0.0429 0.3647 0.3990
0.601 26.560 1.000 0.1568 0.1514 0.0359 0.0028
0.601 13.260 1.000 0.0868 0.1334 0.3492 0.0255
0.601 6.641 1.000 0.0470 0.0854 0.4500 0.0455
0.601 3.320 1.000 0.0257 0.0348 0.2617 0.2354
0.067 13.260 3.000 0.2353 0.2933 0.1978 0.0200
0.067 6.641 3.000 0.1250 0.1908 0.3445 0.0480
0.067 3.320 3.000 0.0548 0.0670 0.1813 0.1256
0.084 26.560 3.000 0.3669 0.3201 0.1462 0.0577
0.084 13.260 3.000 0.2310 0.2963 0.2203 0.0216
0.084 6.641 3.000 0.1226 0.1517 0.1919 0.0295
0.084 3.320 3.000 0.0539 0.0721 0.2527 0.1305
0.100 26.560 3.000 0.3618 0.2894 0.2501 0.1533
0.100 13.260 3.000 0.2268 0.2584 0.1222 0.0230 Fortsetzung der Tabelle
berechn.
ß-hCG IgG-Konz. Zeit B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l* h
0.100 6.641 3.000 0.1202 0.1378 0.1281 0.2982
0.100 3.320 3.000 0.0529 0.0777 0.3192 0.0887
0.334 26.560 3.000 0.2967 0.2652 0.1189 0.1109
0.334 13.260 3.000 0.1772 0.2069 0.1435 0.1894
0.334 6.641 3.000 0.0925 0.1142 0.1894 0.2262
0.334 3.320 3.000 0.0423 0.0557 0.2404 0.0538
0.601 26.560 3.000 0.2395 0.2330 0.0281 0.0111
0.601 13.260 3.000 0.1379 0.1702 0.1901 0.1152
0.601 6.641 3.000 0.0720 0.1185 0.3922 0.0734
0.601 3.320 3.000 0.0347 0.0453 0.2350 0.0770
0.067 53.130 6.000 0.5075 0.4170 0.2170 0.0545
0.067 26.560 6.000 0.4627 0.4183 0.1062 0.0231
0.067 13.260 6.000 0.3435 0.3617 0.0503 0.0281
0.067 6.641 6.000 0.1987 0.2447 0.1877 0.0622
0.067 3.320 6.000 0.0858 0.1005 0.1463 0.0295
0.084 53.130 6.000 0.5026 0.4241 0.1852 0.0202
0.084 26.560 6.000 0.4542 0.4015 0.1313 0.0168
0.084 13.260 6.000 0.3336 0.3409 0.0215 0.0632
0.084 6.641 6.000 0.1916 0.1974 0.0294 0.3573
0.084 3.320 6.000 0.0826 0.0937 0.1185 0.5071
0.100 53.130 6.000 0.4978 0.4217 0.1807 0.0084
0.100 26.560 6.000 0.4459 0.3805 0.1718 0.1168
0.100 13.260 6.000 0.3240 0.3288 0.0144 0.1326
0.100 6.641 6.000 0.1847 0.2154 0.1422 0.0534
0.100 3.320 6.000 0.0796 0.0769 0.0360 0.0659
0.334 26.560 6.000 0.3419 0.3333 0.0257 0.0336
0.334 13.260 6.000 0.2195 0.2747 0.2008 0.0173
0.334 6.641 6.000 0.1171 0.1091 0.0736 0.2781
0.334 3.320 6.000 0.0517 0.0516 0.0018 0.0012
0.601 53.130 6.000 0.3669 0.3135 0.1703 0.0045
0.601 26.560 6.000 0.2588 0.2803 0.0767 0.0166
0.601 13.260 6.000 0.1531 0.2300 0.3344 0.0717
0.601 6.641 6.000 0.0801 0.1098 0.2709 0.1611 Fortsetzung der Tabelle berechn.
ß-hCG IgG-Konz. Zeit B/T-Wert B/T-Wert Abweich, VK nmol/l nmol/l* h
0.601 3.320 6.000 0.0376 0.0667 0.4359 0.1656
0.067 53.130 24.000 0.5095 0.5324 0.0429 0.0048
0.067 26.560 24.000 0.4958 0.5113 0.0302 0.0144
0.067 13.260 24.000 0.4602 0.5130 0.1029 0.0161
0.067 6.641 24.000 0.3522 0.3310 0.0638 0.2825
0.067 3.320 24.000 0.1724 0.1747 0.0130 0.1317
0.084 53.130 24.000 0.5047 0.5139 0.0179 0.0049
0.084 26.560 24.000 0.4857 0.5210 0.0677 0.0100
0.084 13.260 24.000 0.4396 0.5036 0.1271 0.0376
0.084 6.641 24.000 0.3228 0.3989 0.1907 0.0099
0.084 3.320 24.000 0.1533 0.2162 0.2909 0.0923
0.100 53.130 24.000 0.4998 0.5363 0.0680 0.0352
0.100 26.560 24.000 0.4757 0.5101 0.0675 0.0040
0.100 13.260 24.000 0.4198 0.4742 0.1147 0.0401
0.100 6.641 24.000 0.2967 0.3342 0.1123 0.0613
0.100 3.320 24.000 0.1375 0.1633 0.1577 0.1571
0.334 26.560 24.000 0.3523 0.4522 0.2209 0.0055
0.334 13.260 24.000 0.2374 0.3758 0.3684 0.0924
0.334 6.641 24.000 0.1296 0.2266 0.4278 0.0246
0.334 3.320 24.000 0.0567 0.1035 0.4522 0.0983
0.601 53.130 24.000 0.3673 0.3493 0.0516 0.0119
0.601 26.560 24.000 0.2609 0.3443 0.2421 0.0193
0.601 13.260 24.000 0.1555 0.2724 0.4291 0.0642
0.601 6.641 24.000 0.0815 0.1905 0.5722 0.4333
0.601 3.320 24.000 0.0381 0.0453 0.1583 0.0398
IgG-Konzentration in der Beschichtungslösung Modellprüfung
Gewichtete lineare Regression zum Vergleich der experimentellen
Response mit der berechneten Response
Ergebnis :
Relative Übereinstimmung (b +/- db) : 0.975 +/- -0.187
Mittlere Abweichung (a +/- da) : 0.001 +/- -0.012
Korrelationskoeffizient : 0.9754
Die Auswertung ist o.k. , wenn b +/- db um 1 und a +/- da um 0 schwanken, da und db sind der Vertrauensbereich von a und b zu Beispiel 14: Albumineinfluß auf den dreidimensionalen T3-RIA
T3-RIA mit gereingten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Kurze Verfahrensbeschreibung
Verwendete Substanzen:
- 0.02 m Tris-Puffer mit pH 8.7 und 0.5 % Humanserumalbumin (HSA; Serva)
- Protein-A gereinigtes anti-T3-IgG als Antikörper in den
Konzentrationen:
12.5, 6.25, 3.125, 1.563, 0.781 und 0.391 nmol/l
- Triiodthyronin (T3; Henning,Berlin) als Antigen in den
Konzentrationen
0, 0.664 und 4.977 nmol/l
- HSA in den Konzentrationen 0.5, 2 und 8 g/l
- I-125-T3 (0.18 nmol/l) als Tracer
Verfahrensschritte:
0.1 ml T3, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.2 ml Puffer unterschiedlicher HSA-Konzentrationen in ein Plastrohrchen gegeben. Nach 2 h Inkubation Zugabe von einer Präzititationslösung, bestehend aus 1:20 verdünntem 2. Antikörper gegen Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1:100 und 4 % PEG 6000. Nach 15 Minuten mit 1 ml Latex-Lösung zentrifugieren und Überstand absaugen. Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert.
Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standard- kurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM werden aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) dreidimensionale Versuche (Standard-TiterKurven) bei gleicher HSA-Konzentration zusammengestellt. Mit dem Programm ZUSAM3 wird aus den dreidimensionalen Immunoassays bei unterschiedlicher HSA-Konzentration ein gemeinsamer vierdimensionaler Versuch mit dem Namen ST3HSA gebildet. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIA4D ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.
Auswerteergebnis des Versuchs: a: st3hsa
= = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = = ausgewertet wurde mit Modell 2
Tracerkonzentration: 0.180 nmol/l
Bindungskonstante K : 4.50477 +/- 0.29377 Bindungsfaktor p/q : 0.71350 +/- 0.03536 unspezifische Bindung u : 0.03822 +/- 0.00607 Kreuzreaktion (Fremdsubstanz) pl/p2 : 0.17661 +/- 0.01364 Antikörperäquivalent(Fremdsubstanz) q2 : -0.05374 +/- 0.02630 nmol/l
Summe der Abweichungsquadrate: 2.7920572487E-02
Modellfehler: 0.1161 Versuchsfehler: 0.0175
Erläuterungen:
- Der Kreuzreaktionfaktor von 0.176 bezieht HSA in g/l auf T3 in nmol/1. 1 g/l HSA hat die gleiche Wirkung auf die Erniedrigung der Bindungswerte wie 0.18 nmol/1 T3 .
- Im Reaktionsmilieu ist eine unbekannte, die Bindungskapazität des Antikörpers um 0.054 nmol/1 reduziernde Substanz
enthalten.
STANDARD-TITER-HSA-KURVE berechn.
T3-Konz. IgG-Konz. HSA-Konz. B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l g/l
0.000 0.391 0.500 0.6453 0.4869 0.3254 0.0134
0.000 0.781 0.500 0.7878 0.6384 0.2341 0.0206
0.000 1.563 0.500 0.8293 0.7525 0.1020 0.0073
0.000 3.125 0.500 0.8443 0.8087 0.0440 0.0103
0.000 6.250 0.500 0.8507 0.8510 0.0003 0.0138
0.000 12.500 0.500 0.8537 0.8627 0.0104 0.0150
0.664 12.500 0.500 0.8440 0.8578 0.0161 0.0071
0.664 6.250 0.500 0.8297 0.8164 0.0163 0.0065
0.664 3.125 0.500 0.7954 0.7311 0.0880 0.0312
0.664 1.563 0.500 0.7019 0.6022 0.1656 0.0128
0.664 0.781 0.500 0.4893 0.4176 0.1717 0.0155
0.664 0.391 0.500 0.2670 0.2593 0.0297 0.0228
4.977 12.500 0.500 0.7601 0.8523 0.1081 0.0074
4.977 6.250 0.500 0.6209 0.6902 0.1003 0.0075
4.977 3.125 0.500 0.4017 0.4553 0.1177 0.0211
4.977 1.563 0.500 0.2304 0.2641 0.1276 0.0231
4.977 0.781 0.500 0.1322 0.1571 0.1584 0.0374
4.977 0.391 0.500 0.0808 0.1019 0.2068 0.0345
0.000 12.500 2.000 0.8499 0.8486 0.0015 0.0190
0.000 6.250 2.000 0.8427 0.8025 0.0502 0.0286
0.000 3.125 2.000 0.8265 0.7664 0.0784 0.0104
0.000 1.563 2.000 0.7855 0.7116 0.1037 0.0098
0.000 0.781 2.000 0.6648 0.6026 0.1032 0.0121
0.000 0.391 2.000 0.4149 0.4399 0.0568 0.0119
0.664 12.500 2.000 0.8399 0.8813 0.0470 0.0142
0.664 6.250 2.000 0.8204 0.8296 0.0111 0.0016 Fortsetzung der Tabelle berechn.
T3-Konz. IgG-Konz. HSA-Konz. B/T-Wert B/T-Wert Abweich. VK nmol/l nmol/l g/l
0.664 3.125 2.000 0.7718 0.7324 0.0537 0.0107
0.664 1.563 2.000 0.6408 0.5892 0.0876 0.0150
0.664 0.781 2.000 0.4091 0.4016 0.0185 0.0084
0.664 0.391 2.000 0.2189 0.2478 0.1166 0.0158
4.977 12.500 2.000 0.7538 0.8089 0.0681 0.0064
4.977 6.250 2.000 0.6067 0.6410 0.0534 0.0071
4.977 3.125 2.000 0.3872 0.4236 0.0857 0.0221
4.977 1.563 2.000 0.2217 0.2522 0.1210 0.0108
4.977 0.781 2.000 0.1278 0.1489 0.1416 0.0292
4.977 0.391 2.000 0.0788 0.0943 0.1649 0.0229
0.000 12.500 8.000 0.8335 0.8625 0.0337 0.0147
0.000 6.250 8.000 0.8054 0.8062 0.0009 0.0058
0.000 3.125 8.000 0.7324 0.7050 0.0389 0.0187
0.000 1.563 8.000 0.5544 0.5597 0.0094 0.0036
0.000 0.781 8.000 0.3284 0.3975 0.1738 0.0200
0.000 0.391 8.000 0.1756 0.2497 0.2967 0.0342
0.664 12.500 8.000 0.8221 0.8558 0.0393 0.0076
0.664 6.250 8.000 0.7773 0.7811 0.0048 0.0064
0.664 3.125 8.000 0.6596 0.6209 0.0623 0.0202
0.664 1.563 8.000 0.4414 0.4408 0.0013 0.0136
0.664 0.781 8.000 0.2493 0.2705 0.0782 0.0167
0.664 0.391 8.000 0.1361 0.1594 0.1465 0.0232
4.977 12.500 8.000 0.7274 0.7605 0.0435 0.0116
4.977 6.250 8.000 0.5529 0.5395 0.0248 0.0035
4.977 3.125 8.000 0.3386 0.3325 0.0184 0.0106
4.977 1.563 8.000 0.1935 0.1944 0.0047 0.0313
4.977 0.781 8.000 0.1136 0.1080 0.0519 0.0087
4.977 0.391 8.000 0.0723 0.0674 0.0727 0.0107 Modellprüfung
Gewichtete lineare Regression zum Vergleich der experimentellen
Response mit der berechneten Response
Ergebnis:
Relative Übereinstimmung (b +/- db) : 0.992 +/- 0.016
Mittlere Abweichung (a +/- da) : 0.002 +/- 0.006
Korrelationskoeffizient: 0.9937
Die Auswertung ist o.k . ,k wenn b +/- db um 1 und a +/- da um 0 schwanken, da und db sind der Vertrauensbereich von a und b .
Verwendete Abkürzungen:
Abweich.: (B/Tbeobachtet-B/Tberechnet) /B/Tbeobachtet absolut, ohne Vorzeichen B/F-Trennung: Trennung des gebundenen Antigen (B = bound) vom freien Antigen (F = free)
B/T: Bevorzugte Angabe der Response als antikörpergebundenes
Antigen (B) geteilt durch das Gesamtantigen (T = total) Delta-B/T: Differenz der B/T-Werte zwischen niedriger und hoher
Antigenkonzentration in Titerkurven
bLH: bovines luteinisierendes Hormon
cpm: counts per minute (Zählrate bei der Aktivitätsmessung) K : Bindungskonstante
MAK: Monoklonaler Antikörper
MWG: Massenwirkungsgesetz
NKS: Mormales Kaninchenserum
p : Antigenkonzentration bzw. Antikörperbindungskapazität des
Antigen
PEG 6000: Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen
Molekulargewicht von 6000
q : Antikörperkonzentration bzw. Antigenbindungskapazität des
Antikörper
VK : Variationskoeffizient der Response oder der
Antigenkonzentration
ß-HCG: Beta-Kette des humanen Chorion Gonadotropins
T3: Trijodthyronin

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Schnelloptimierung und gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzen und von Rezeptorassays,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes bzw. eines bestimmten RezeptorLigand-Komplexes, gegebenenfalls unter Zuführung eines oder mehrerer weiterer Stoffe oder nach Verdünnung, nach Ablauf einer vorbestimmten Reaktionszeit bzw. nach Einstellung des Gleichgewichts, bestimmt werden, die Daten mathematisch erfaßt und in den mehrdimensionalen Versuch überführt werden und nachfolgend die mathematische Auswertung für die Anpassung und Optimierung des Assays erfolgt.
2. Verfahren zur Schnelloptimierung und gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzien nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes, gegebenenfalls unter Zufügung eines oder mehrerer weiterer Stoffe oder nach Verdünnung, bestimmt werden, die Daten mathematisch erfaßt und in den dreidimensionalen Versuch überführt werden und nachfolgend die mathematische Auswertung für die Anpassung und Optimierung des Assays erfolgt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2 ,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten an 2-3 Standardkurven bzw. 2-3 Titerkurven mit 2-3 deutlich verschiedenen Konzentrationen des jeweils anderen Reaktionspartners bestimmt werden.
4. Verfahren zur Schnelloptimierung von Immunoassays aller Provenienzen nach Anspruch 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörper-Konzentration bestimmt werden, die Daten erfaßt und mit dem Programm ZUSAM in den dreidimensionalen Versuch überführt werden, wobei erforderlichenfalls eine Vertauschung der Feldfolge mit dem Programm RIAOPT bzw. IRMAOPT die Auswertung und Optimierung des Assays für eine vorgewählte Antigenkonzentration erfolgt.
5. Verfahren zur gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzen nach Anspruch 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes bei fixer Antikörper-Konzentration durch gleichzeitige Variation der Antigen-Konzentration und eines zugefügten Fremdantigens und/oder der Variation des Reaktionsgemisches durch seine Verdünnung oder Aufstockung bestimmt werden, die Daten erfaßt und mit dem Programm ZUSAM in den dreidimensionalen Versuch überführt werden, wobei erforderlichenfalls eine Vertauschung der Feldfolge mit dem Programm RIAKREUZ bzw. IRMKREUZ eine Auswertung und die Beschreibung der Auswirkung einer vorgegebenen Konzentration von Fremdantigenen und einer Mediumkonzentration auf die Richtigkeit des Assays erfolgt.
6. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1-5,
dadurch gekennzeichnet, daß sie automatische Pipettier- und Verdünnungseinrichtungen enthält, welche Verdünnungs- und Aufstockungsschritte des Reaktionsmediums vornehmen und dadurch den zweidimensionalen Immunoassayversuch programmtechnisch in einen dreidimensionalen Versuch überführen und nachfolgend mit den mathematischen Programmen verbinden.
7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß sie automatische Pipettier- und Verdünnungseinrichtungen enthält, die sowohl das Antigen wie auch den Antikörper dosieren und das Milieu verdünnen und dadurch den dreidimensionalen Versuch programmtechnisch in einen vier-dimensionalen Versuch überführen und nachfolgend mit mathematischen Programmen verbinden.
8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1-5,
dadurch gekennzeichnet, daß sie automatische Pipettier- und Verdünnungseinrichtungen enhält, die sowohl das Antigen wie auch den Antikörper in definierter zeitlicher Abfolge dosieren und dadurch den dreidimensionalen Versuch programmtechnisch in einen vierdimensionalen Versuch überführen und nachfolgend mit mathematischen Programmen verbinden.
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