DE4138712A1

DE4138712A1 - Verfahren zur schnelloptimierung und gezielten qualitaetskontrolle von immunoassays aller provenienzen sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens

Info

Publication number: DE4138712A1
Application number: DE19914138712
Authority: DE
Inventors: Pavel Dr Strohner
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1991-11-20
Filing date: 1991-11-20
Publication date: 1993-05-27
Also published as: WO1993010451A1; AU2461992A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf die Optimierung und die Qualitätskontrolle von Radioimmunoassays (RIA) und Immunoradiometrischen Assays (IRMA) sowohl in flüssiger als auch an fester Phase. Sie ist bei Einbeziehung des durchschnittlichen, relativen Meßfehlers des nichtradioaktiven Indikators (anstelle des Zählfehlers) auf alle nichtradioaktiven kompetitiven und nichtkompetitiven Immunoassays und auf Bindungsstudien mit Antikörpern übertragbar. Sie betrifft gleichermaßen Vorrichtungen zur Durchführung des Verfahrens.

Anwendungsgebiete der Erfindung sind die medizinische und veterinärmedizinische Diagnostik, die Nahrungs- und Umweltanalytik, die immunologische und pharmakologische Forschung.

Bisher bekannt ist folgender Stand der Technik:

a. Optimierung

Das bisher generell verwendete Verfahren zur Optimierung eines Immunoassays geht auf Hales und Randle (Hales C. N., Randle P. J., Biochem. J., 88 (1963), 137) zurück.

Danach werden für eine degressive, aliquote Verdünnungsreihe eines Antiserums (bzw. Antikörpers) die Bindungswerte eines Tracers in Abwesenheit und Anwesenheit des mit dem Antiserum zu bestimmenden Antigens ermittelt. Der dabei verwendete Tracer ist eine mit dem Antigen identische bzw. verwandte markierte Verbindung (ein Konjugat des Antigens). Im Falle eines IRMA ist der Tracer ein markierter Antikörper.

Die graphische Darstellung der Bindungswerte des Antigen-Antikörper-Komplexes in Abhängigkeit von der Antiserumverdünnung (Antikörperkonzentration) bei fixer Antigenkonzentration wird Titerkurve genannt, wobei in der einen Titerkurve kein unmarkiertes Antigen enthalten ist. In einer zweiten Titerkurve wird als fixe Antigenkonzentration in der Regel die in einer künftigen Standardkurve des RIA oder IRMA zu bestimmende höchste Antigenkonzentration gewählt. Als Standardkurve ist dabei die graphische Darstellung der Bindungswerte des Antigen-Antikörper-Komplexes in Abhängigkeit von bekannten Antigenkonzentrationen bei fixer Antikörperkonzentration zu verstehen, mit deren Hilfe künftig unbekannte Antigenkonzentrationen möglichst präzise und reproduzierbar bestimmt werden sollen.

Als optimale Antiserumverdünnung bzw. Antikörperkonzentration einer künftigen Standardkurve gilt diejenige, bei der die Differenz der Bindungswerte bei Abwesenheit im Vergleich zur Anwesenheit des unmarkierten Antigens am größten ist.

b. Qualitätskontrolle

Die bisherigen aus der Literatur bekannten Verfahren beruhen auf rein statistischen Vergleichen (Wiederfindeexperimente und Kreuzreaktionsstudien) und sind nur sehr unvollkommen zur gezielten Qualitätskontrolle verwendbar (G. E. Abraham (Ed.): Handbook of Radioimmunoassay, New York, 1978, R. P. Ekins: Basic Concepts in Quality Control in Radioimmunoassays and Related Produres in Medicine, Vol. 2, 6-20, IAEA, Wien 1978).

Sie sind in der Regel nicht geeignet, um gezielte Maßnahmen zur Beseitigung von Qualitätsmängeln, zur Neuanpassung eines Assays oder zur Kalibrierung eines Standards zu unternehmen.

Die bisher verwendeten physikochemischen Modelle (Scatchard-, Sips- bzw. Hill-Modell, H. A. Feldman: Analyt. Biochem. 48 (1972), 317) konnten meist nur als reine Eichfunktion in der Qualitätskontrolle Verwendung finden. Die mit ihrer Hilfe ermittelten physikochemischen Parameter, wie Gleichgewichtskonstanten und Bindekapazitäten waren nur in einem sehr begrenzten Rahmen für die Optimierung eines Immunoassays verwendbar.

Das Ziel der Erfindung besteht zum einen in der Zeitersparnis und in der Reduzierung des experimentellen Aufwandes bei der Optimierung, Anpassung und Qualitätskontrolle eines Immunoassays und zum anderen in einer Erhöhung der Übersichtlichkeit und Vergleichbarkeit der Immunoassay-Experimente.

Weiterhin soll im Zusammenhang mit automatischen Pipettier- und Verdünnungsschritten eine bequem zu handhabende und damit nutzerfreundliche Optimierung, Anpassung der Standards und gezielte Qualitätskontrolle und -steuerung von Immunoassays in Immunoassay-Meßgeräte (Gamma-Counter, LSC, Spektralphotometer, Luminiszensmeßplätzen, Fluoreszensmeßgeräten u. a. m.) erreicht werden.

Die Erfindung fußt zum einen auf der Entdeckung eines vereinfachten, allgemein gültigen und konsistenten physikochemischen Grundmodells der Antigen-Antikörper-Reaktion und zum anderen auf der selektiven Konzipierung und Auswertung dreidimensionaler Bindungsexperimente.

Sie ist dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes, gegebenenfalls unter Zufügung eines oder mehrerer weiterer Stoffe oder nach Verdünnung, bestimmt werden, die Daten mathematisch erfaßt und in den dreidimensionalen Versuch überführt werden und nachfolgend eine mathematische Auswertung für die Anpassung und Optimierung des Assays erfolgt.

Die Auswertung erfolgt mit Hilfe von PC-Computerprogrammen, die auf der Grundlage von Varianten des physikochemischen Grundmodells und eines Algorithmus der nichtlineare Regression (J. G. Reich, Curve Fitting with the Personal Computer, New York, Mc Grawhill, 1991) geschaffen wurden.

Zu den Modellvorstellungen:

1. Das den Berechnungen zugrunde liegende Grundmodell geht davon aus, daß Antikörper sich sowohl untereinander als auch an Antigen binden.
2. Kreuzreaktive Fremdsubstanzen und unspezifisch bindendes Heteroprotein im Reaktionsmilieu wirken sich wie eine zusätzliche Antigen- bzw. Antikörpermenge aus bzw. führen entsprechend ihrem Mengenverhältnis zum Antigen bzw. Antikörper zu einer apparenten Affinitätserniedrigung des Antikörpers.
Beide Modellhypothesen haben in mathematischen Formulierungen Eingang in die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Programme RIAOPT und IRMAOPT gefunden.

Zum Verfahren der Schnelloptimierung eines Immunoassays Voraussetzung für die Optimierung ist eine dreidimensionale Versuchsführung. Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörperkonzentration.

Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn entweder 2-3 Titerkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antigenkonzentrationen oder wenn 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen, fixen Antikörperverdünnungen (-konzentrationen) aufgestellt werden.

Als Trennmethode des antikörpergebundenen vom freien Antigen können alle effektiven Methoden, ob Doppelantikörpertechnik, einfache Antikörperpräzipitation, Dextrankohletrennung, Solid Phase Techniken (z. B. Coated Tube) oder auch trennungsfreie Bestimmungen des gebundenen Antigens verwendet werden.

Die Daten der 2-3 Titer- bzw. Standardkurven werden entweder mit dem Programm EINGABE je Titer- bzw. Standardkurve erfaßt oder liegen in der Feldfolge: Antikörper- bzw. Antigenkonzentration, B/T-Werte als Response, Variationskoeffizient (VK) der Replikate der B/T-Werte bereits vor.

Mit dem Programm ZUSAM erfolgt die Überführung des zweidimensionalen (Antigen- oder Antikörperkonzentration, B/T-Werte) in einen dreidimensionalen Versuch (Antigenkonzentration, Antikörperkonzentration, B/T-Werte).

Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs: 1. Antigenkonzentration, 2. Antikörperkonzentration, 3. B/T-Werte, 4. VK der Replikate der B/T-Werte.

Sollten Antikörperkonzentration und Antigenkonzentration in ihrer Feldfolge vertauscht sein, muß mit dem Programm VARIABLE ein Austausch der Feldfolge vorgenommen werden.

Mit dem Programm RIAOPT erfolgt die Auswertung, Optimierung sowie die Beschreibung eines standardisierten Präzisionsprofils (=Steuerung der Antigenkonzentration in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration) des optimierten kompetitiven Immunoassays. Mit dem Programm IRMAOPT erfolgt die Auswertung, Optimierung sowie die Beschreibung eines standardisierten Präzisionsprofils des optimierten nichtkompetitiven Immunoassays (Sandwichmethode).

Als standardisiert wird dasjenige Präzisionsprofil bezeichnet, das bei einem experimentellen Fehler (VK der Responsewerte) von 2% entsteht.

Im Programm RIAOPT werden folgende Fälle eines kompetitiven Immunoassays unterschieden:

1. Modell:
Modifiziertes MWG (Massenwirkungsgesetz), unbeeinflußt
2. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt sowohl durch eine unbekannte, kreuzreaktive Verbindung, die sich auf die Affinität als auch auf die Antigenkonzentration auswirkt
3. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz
4. Modell:
Modifiziertes MWG bei kalter Vorinkubation, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz.

Im Programm IRMAOPT werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven Immunoassays unterschieden:

1. Modell:
Modifiziertes MWG, unbeeinflußt
2. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antikörper kreuzreagierende Substanz
3. Modell:
Modifiziertes MWG, beeinflußt durch eine unbekannte, mit dem Antigen kreuzreagierende Substanz.

Mittels nichtlinearer Regression werden auf der Grundlage der Modelle physikochemische Konstanten des Antigen-Antikörper-Bindungsassays (RIA, IRMA) geschätzt.

Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb

bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der unbekannten, kreuzreaktiven Substanz
e) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration

bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration

bei 4. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als Antigenkonzentration

Beim nichtkompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungsfaktor n, der die Bindungsrelation zwischen Antigen und Antikörper zum Ausdruck bringt und sich als summarische Größe aus Stöchiometriefaktor, der Reinheit des Antigens bzw. des spezifischen Antikörpers und aus sterischen Bindungseffekten ergibt.
c) Unspezifische Bindung nsb

bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) kreuzreaktives Äquivalent der unbekannten Substanz, ausgedrückt als zusätzliche Bindungskapazität für das Antigen

Bei Aufruf der Programme RIAOPT und IRMAOPT werden dem Nutzer Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit, die Startwerte zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen Startwerte zu übernehmen.

Das Programm wertet den 3-dimensionalen Immunoassay mit den vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für das Ausgabeprotokoll.

Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen Werte durch das gewählte Modell. Des weiteren gibt es die optimale Antikörperkonzentration bzw. -verdünnung für ein vom Nutzer vorgewählten Antigenkonzentration an und stellt ein standardisiertes Präszionsprofil für die optimale Antikörperkonzentration auf.

Zum Verfahren der Qualitätskontrolle eines Immunoassays:

a) Untersuchung der Einflüsse des Reaktionsmilieus

Bereits bei den Auswertungen mit RIAOPT und IRMAOPT werden unbekannte kreuzreaktive Substanzen als Konzentrationsäquivalente zum Antigen ausgewiesen. Um genauere Hinweise zum kreuzreaktiven Verhalten der im Reaktionsmilieu des Assays vorhandenen Stoffe zu finden, ist gemäß der Erfindung folgende dreidimensionale Versuchsanordnung erforderlich:
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei einer Variation der Verdünnung (z. B. Serumverdünnung) oder Aufstockung (z. B. Aufstockung des beigefügten Heteroproteins) des Reaktionsmilieus der Standardkurven.

Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn Experimente für 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen Verdünnungs- bzw. Aufstockungsstufen des Reaktionsmilieus durchgeführt werden.

b) Untersuchung der Einflüsse kreuzreaktiver Antigene (Kreuzreaktionsstudien)

Um die Einwirkung möglicher kreuzreaktiver (chemisch verwandter Antigene) zu ermitteln, ist gemäß der Erfindung folgende dreidimensionale Versuchsanordnung erforderlich:
Man bestimmt die Bindungsraten des Antigen-Antikörper-Komplexes von Standardkurven (bei einer fixen Antikörperkonzentration) bei Variation der in den Standardkurven enthaltenen Konzentration des mutmaßlich, kreuzreaktiven Antigens.

Zur Einsparung von experimenteller Arbeit ist es ausreichend, wenn Experimente für 2-3 Standardkurven bei 2-3 deutlich verschiedenen Konzentrationen des mutmaßlich kreuzreaktiven Antigens durchgeführt werden.

c) Auswertung der Kreuzreaktionsexperimente

Die Daten der 2-3 Standardkurven werden entweder mit dem Programm EINGABE als Standardkurven erfaßt oder liegen in der Feldfolge: Antigenkonzentration, B/T-Werte als Response, Variationskoeffizient (VK) der Replikate der B/T-Werte bereits vor.

Mit dem Programm ZUSAM erfolgt die Überführung des zweidimensionalen Versuches (Antigenkonzentration, B/T-Werte) in einen dreidimensionalen Versuch (Antigenkonzentration, Konzentration des kreuzreaktiven Antigen bzw. Verdünnungs- oder Aufstockungsfaktoren des Reaktionsmilieus, B/T-Werte).

Die für die Auswertung erforderliche Feldfolge des Versuchs: 1. Antigenkonzentration, 2. Konzentration des kreuzreaktiven Antigens bzw. Verdünnungs- oder Aufstockungsfaktoren des Reaktionsmilieus, 3. B/T-Werte, 4. VK der Replikate der B/T-Werte. Sollten Feld 1 und und Feld 2 in ihrer Feldfolge vertauscht sein, muß mit dem Programm VARIABLE ein Austausch der Feldfolge vorgenommen werden. Mit dem Programm RIAKREUZ erfolgt die Auswertung und Beschreibung der Auswirkung der kreuzreaktiven Substanz auf das standardisierte Präzisionsprofil (= Streuung der Antigenkonzentration in Abhängigkeit von der Antigenkonzentration) eines kompetitiven Immunoassays.

Mit dem Programm IRMKREUZ erfolgt die Auswertung und Beschreibung der Auswirkung der kreuzreaktiven Substanz auf das standardisierte Präzisionsprofils eines nichtkompetitiven Immunoassays (Sandwich-Methode).

Als standardisiert wird dasjenige Präzionsprofil bezeichnet, das bei einem experimentellen Fehler (VK der Responsewerte) von 2% entsteht.

Im Programm RIAKREUZ werden folgende Fälle eines kompetitiven Immunoassays unterschieden:
1. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
2. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration.

Im Programm IRMKREUZ werden folgende Fälle eines nichtkompetitiven Immunoassays unterschieden:
1. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
2. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antigene mit Affinitätsbeeinflussung und mit Auswirkungen auf die Gesamtantigenkonzentration
3. Modell:
Modifiziertes MWG für zwei Antikörper ohne Affinitätsbeeinflussung, aber mit Auswirkungen auf die Gesamtbindungskapazität des markierten Antikörpers.

Es sind dies beim kompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungskapazität des Antikörpers für den 1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus

bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus.

Beim nichtkompetitiven Immunoassay:
bei 1. Modell:
a) Affinitäts- bzw. Gleichgewichtskonstante K
b) Bindungskapazität des markierten Antikörpers für den 1. Antigenen
c) Unspezifische Bindung nsb
d) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus

bei 2. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie d) Affinitätskonstante der kreuzreaktiven Substanz
e) Der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. und dem 2. (kreuzreaktiven) Antigen bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus

bei 3. Modell:
a), b) und c) wie im 1. Modell sowie
d) der Faktor der Kreuzreaktivität zwischen dem 1. markierten und dem 2. unmarkierten Antikörper bzw. der Verdünnungs- oder Aufstockungsstufe des Reaktionsmilieus

Bei Aufruf der Programme RIAKREUZ und IRMKREUZ werden dem Nutzer Vorschläge für Startwerte für die nichtlineare Regression unterbreitet. Der Nutzer hat die Möglichkeit, die Startwerte zu verändern oder einfach die vorgeschlagenen Startwerte zu übernehmen.

Das Programm wertet den 3-dimensionalen Immunassay mit den vorhandenen Modellen aus und wählt das geeignetste für das Ausgabeprotokoll.

Das Ausgabeprotokoll enthält die geschätzten physikochemischen Konstanten und zeigt die Güte der Wiedergabe der experimentellen Werte durch das gewählte Modell. Des weiteren zeigt es den systematischen Fehler, den eine vom Nutzer vorgegebenen Konzentration der kreuzreaktiven Substanz im Immunoassay verursacht.

Die Erfindung erstreckt sich auch auf Vorrichtungen, die zur Durchführung des Verfahrens dienen. Von besonderer Bedeutung sind dabei Vorrichtungen, die automatisch Pipettier- und Verdünnungseinrichtungen aufweisen und auf der Basis der erfindungsgemäßen Programme RIAOPT, IRMAOPT, RIAKREUZ und IRMKREUZ selbständig programmieren und auswerten.

Die Erfindung eröffnet ganz neue Perspektiven für die Optimierung, die Anpassung der Standards und die gezielte Qualitätskontrolle und -steuerung von Immunoassays. Erstmalig wird auch eine exakte funktionelle Charakterisierung von Antikörpern bei minimalem Aufwand ermöglicht. Das neue Verfahren bildet die Basis für eine neue Generation von Meßgeräten.

Die Erfindung soll an folgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden:

Ausführungsbeispiele 1. RIA-Optimierung

Beispiel 1:
T3-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Gleichgewichtsdialyse
Beispiel 2:
β-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik
Beispiel 3:
Estradiol-RIA mit monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 4:
bLH-RIA mit ungereinigtem Antiserum, kalte Vorinkubation, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik

2. IRMA-Optimierung

Beispiel 5:
TSH-IRMA mit einem I-125-monoklonalen Antikörper, einem unmarkierten polyklonalen Antikörper, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 6:
TSH-IRMA mit zwei monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik

3. Kreuzreaktionsstudien

Beispiel 7:
Estron-Kreuzreaktivität im Estradiol-RIA Estradiol-RIA mit ungereinigtem Antiserum, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik
Beispiel 8:
Serumeinfluß auf den β-HCG-RIA
β-HCG-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 9:
Albumineinfluß auf den T3-RIA
T3-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik
Beispiel 10:
Einfluß von Rindergammaglobulin auf die Bindungskapazität im TSH-IRMA mit Doppelantikörpertechnik

Ausführungsbeispiele RIA-Optimierung Beispiel 1 T3-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Gleichgewichtsdialyse Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.1 m Tris-Puffer bei pH 7.7 mit 0.05% Humanserumalbumin von SERVA
- als Antigen Triiodthyronine (T3 von Henning, Berlin) in den Konzentrationen 0.157, 0.312, 0.625, 1.125, 2.501, 4.992 und 10 nmol/l
- als Antikörper Protein-A-gereinigter polyklonaler anti-T3-Antikörper in den Konzentrationen 11.25, 2.813 und 0.704 nmol/l
- als Tracer I-125-T3 (0.215 nmol/l)

Es werden speziell gebaute Versuchsapparaturen benutzt. Sie enthalten 7 Kammern a 1 ml Volumen. Jede Kammer ist durch eine SERVAPOR Dialyse-Membran in zwei Zellen T und P a 0.5 ml geteilt.

Verfahrensschritte

In die Zelle T werden 0.1 ml Puffer, 0.1 ml Antikörper, 0.1 ml Standard und 0.1 ml Tracer, in die Zelle P werden 0.4 ml Puffer gegeben.

Es werden je Antikörperkonzentration Standardkurven a 7 Antigenkonzentrationen in einer Apparatur ausgeführt. Jeder Versuch wird doppelt ausgeführt. Die Zellen werden verschlossen und es erfolgt eine Über-Kopf-Rotation der 2 Versuchsapparaturen über 6 Stunden.

Als Totalwert (T) werden 0.1 ml des Tracers im Gammacounter gemessen. Aus Zelle T und Zelle P werden 0.2 ml entnommen und ebenfalls im Gammacounter gemessen und auf 0.4 ml umgerechnet. Die Zelle T enthält sowohl das antikörpergebundene Antigen (B) als auch die Hälfte des freien Antigens (F). Die Zelle P enthält die Hälfte des freien Antigens (F). Die Adsorption des Tracers (A) errechnet sich als A=T-B-F. Der Totalwert des Tracers (T) wird um die Adsorption reduziert und die Bindungsrate B/T je Zelle berechnet. Eingaben und Berechnungen für eine Standardkurve können für den speziellen Fall der Gleichgewichtsdialyse mit dem Programm DIAINPUT (Sonderfall des Programms EINGABE) vorgenommen werden.

Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s150389s zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: b:s150389s

Ausgewertet wurde mit Modell 3

Tracerkonzentration: 0.215 nmol/l
Affinitätskonstante K	4.30205±0.24247
Bindungsfaktor p1/q	0.43801±0.02190
unspezifische Bindung nsb	0.11952±0.00940
Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2	0.41496±0.05031 pmol/l

Erläuterungen:
- Bindungsfaktor: 0.43 nmol T3 binden 1 nmol IgG, theoretisch zu erwarten wäre: 2 nmol T3 binden 1 nmol IgG, Ursache: Das Protein-A-gereinigte IgG enthält IgG, das T3 nicht bindet.
- Antigenäquivalent der Fremdsubstanz: Im Reaktionsmilieu ist eine Fremdsubstanz vorhanden, die wie eine T3-Konzentration von 0.415 nmol/l wirkt (HSA!).)
Summe der Abweichungsquadrate: 5.2788809877E-03
Modellfehler: 0.0317 Versuchsfehler: 0.0528

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.9977[±0.0137]*B/T_beobachtet+0.0013[±0.0085]
r²=0.0064
Erläuterungen zu der Modellprüfung:
Das Modell ist zutreffenden, wenn die lineare Regression von berechneten zu beobachteten B/T-Werten im Anstieg 1 und im absoluten Glied 0 ergibt. Wobei als statistisch zulässige Abweichung der 3*S-Bereich gilt. Die Angaben in den Klammern [ ] hinter Anstieg und absolutem Glied stellen den 1*S-Bereich dar.

STANDARD-TITER-KURVE

Diskriminationsprofil für p=2.000 pmol/l T3
IgG-Konz. nmol/l
Delta-B/T
9.132
0.0910
7.306	0.1221
5.845	0.1630
4.676	0.2128
3.741	0.2674
2.992	0.3196
2.394	0.3623
1.915	0.3896
1.532	0.3981
1.226	0.3866
0.981	0.3578
0.784	0.3179
0.628	0.2736
0.502	0.2304
0.402	0.1910
0.321	0.1568
0.257	0.1278
0.206	0.1037
0.165	0.0838
0.132	0.0676
0.105	0.0544

Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=1.532 pmol/l für Antigenkonzentration=2.000 pmol/l T3

Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination

Das standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich als Streuung (1×S-Bereich) des zu bestimmenden Antigens (Antigenen) bei einem durchschnittlichen Fehler der experimentellen Werte von 2% und einer vom Nutzer angegebenen Impulsrate des Totalwertes.

Beispiel 2 β-HCG-RIA mit polyklonalen, gereinigten Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.01% Rinderserumalbumin (Merck)
- adsorptiv beschichtete NUNC-Röhrchen (NUNC, Dänemark), über Nacht beschichtet mit 0.3 ml Protein-A gereinigten polyklonalen Antikörpern (IgG) folgender Konzentrationen:
106.3, 53.13, 26.56, 13.28, 6.64, 3.32 und 1.66 nmol/l, zweimal mit 0.1 m NaCl-Lösung und danach mit Humanserumalbumin(0.5%)-NaCl(0.1 m)-Lösung 6-8 h bei Raumtemperatur gewaschen.
- β-HCG (Calbiochem) als Antigen in den Konzentrationen 0.033, 0.267 und 0.5 nmol/l
- I-125-β-HCG als Tracer (0.067 nmol/l)

Verfahrensschritte

In die antikörperbeschichteten Röhrchen werden 0.1 ml β-HCG-Standard, 0.1 ml I-125-β-HCG als Tracer und 0.1 ml bzw. 0.2 ml (Standard 0) Puffer gegeben. Reaktion über Nacht. 0.5 ml H₂O dazu, Röhrchen absaugen und im Gammacounter messen. 0.1 ml Tracer werden als Totalwert messen.

Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Titerkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.

Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Titerkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s251091t zusammengestellt. Mit dem Programm VARIABLE wird die Feldfolge 1. Antikörperkonzentration, 2- Antigenkonzentration in die für die Auswertung erforderliche Feldfolge 1. Antigenkonzentration, 2. Antikörperkonzentration getauscht.

Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s251091t

ausgewertet wurde mit Modell 3

Affinitätskonstante K
2.19837±0.10422
Bindungsfaktor p1/g	0.00587±0.00055
unspezifische Bindung nsb	0.03774±0.00564
Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2	0.10021±0.01776 pmol/l

Erläuterungen:
- Bindungsfaktor:
a) Die Beschichtungsausbeute für IgG beträgt im Vergleich zur Doppelantikörpertechnik ca. 10-16%.
b) Im Protein-A-gereinigtem Antikörper-Pool ist eine sehr große Fraktion nicht β-HCG-bindenden IgGs enthalten
- Antigenäquivalent (Fremdsubstanz): Es ist im Reaktionsmilieu eine Fremdsubstanz enthalten, die wie 0.1 nmol/l β-HCG wirkt (HSA!).
Summe der Abweichungsquadrate: 6.1058965933E-03
Modellfehler: 0.1499 Versuchsfehler: 0.0729

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.948[±0.029]*B/T_beobachtet+0.0023[±0.011]
r²=0.9767

TITER-STANDARD-KURVE

Diskriminationsprofil für p=0.500 pmol/l β-HCG
IgG-Konz. nmol/l
Delta-B/T
170.458
0.0848
136.366	0.1080
109.093	0.1367
87.275	0.1710
69.820	0.2098
55.856	0.2505
44.685	0.2897
35.748	0.3233
28.598	0.3484
22.879	0.3625
18.303	0.3644
14.642	0.3539
11.714	0.3322
9.371	0.3018
7.497	0.2665
5.997	0.2299
4.798	0.1946
3.838	0.1624
3.071	0.1342
2.457	0.1100
1.965	0.0896

Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=18.303 nmol/l für Antigenkonzentration=0.500 nmol/l β-HCG

Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination

Beispiel 3 Estradiol-RIA mit monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05% Humanserumalbumin (Serva)
- Monoklonaler Antikörper (IgG 2a) von Biogenesis in den Konzentrationen 2.0, 0.25 und 0.031 nmol/l
- Estradiol (E2) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.05, 0.15, 0.5, 5, 10 und 15 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.2 nmol/l)
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500

Verfahrensschritte

Gabe von 0.05 ml E2, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer in ein Glasröhrchen. Inkubation über eine Stunde. Zugabe von 1 ml Dextrankohlesuspension. Zentrifugation der Proben. Dekantieren des Überstandes in Plaströhrchen.

Messen des Überstands im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.

Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen a250491s zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s250491s

ausgewertet wurde mit Modell 1

Tracerkonzentration: 0.20 nmol/l
Affinitätskonstante K	1.42253±0.05311
Bindungsfaktor p/q	1.00405±0.05742
unspezifische Bindung nsb	0.01964±0.00603

Erläuterungen:
- Bindungsfaktor: Bindung von E2 zu monoklonalem Antikörper im Verhältnis 1 : 1.
- Im Reaktionsmilieu ist keine nennenswerte kreuzreaktive Substanz enthalten.
Summe der Abweichungsquadrate: 5.4239827750E-03
Modellfehler: 0.1040 Versuchsfehler: 0.0622

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.995[±0.016]*B/T_beobachtet+0.0013[±0.0051]
r²=0.9946

TITER-STANDARD-KURVE

Diskriminationsprofil für p=5.000 pmol/l E2
IgG-Konz. nmol/l
Delta-B/T
9.960
0.0734
7.968	0.0918
6.374	0.1143
5.099	0.1414
4.079	0.1730
3.264	0.2085
2.611	0.2465
2.089	0.2851
1.671	0.3222
1.337	0.3558
1.069	0.3847
0.856	0.4080
0.684	0.4253
0.548	0.4364
0.438	0.4411
0.350	0.4394
0.280	0.4310
0.224	0.4158
0.179	0.3938
0.144	0.3657
0.115	0.3324

Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=0.438 nmol/l für Antigenkonzentration=5.000 nmol/l E2

Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination

Beispiel 4 bLH-RIA mit ungereinigtem Antiserum, kalte Vorinkubation, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 0.1% HSA
- Antiserum gegen bovines luteinisierendes Hormon (bLH) vom Kaninchen in den Verdünnungen 1 : 500, 1 : 1000, 1 : 2000, 1 : 4000, 1 : 8000, 1 : 16 000, 1 : 32 000, 1 : 64 000, 1 : 128 000, 1 : 256 000 (Für die Auswertung: 1 : 1000=1)
- bLH (Präparation 2026, IWF) als Antigen in der Konzentration 64 µg/l
- I-125-bLH als Tracer (2 µg/l)
- optimierte Doppelantikörpertechnik mit 1 : 20 verdünntem 2. Antikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin, 1 : 300 verdünntem Normalkaninchenserum (NKS) sowie einem Präzipitationshilfsmittel (Latex in Aqua dest.) für die Ausfällung des antikörpergebundenen bLH.

Verfahrensschritte

0.1 ml Antiserum, 0.1 ml bLH und 0.1 ml 0.2 ml (Standard 0) Puffer in Plaströhrchen zusammengeben. Über Nacht inkubieren lassen. Dazu 0.1 ml Tracer geben und nach 3 h Zugabe von 0.1 ml NKS und 0.1 ml 2. Antikörper. Reaktion über Nacht. Stoppen mit 1 ml Latex-Lösung. Zentrifugieren, Überstand absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.

Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen t250184t zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:t250184t

ausgewertet wurde mit Modell 4

Tracerkonzentration: 2.000 µg/l
Affinitätskonstante K1	2.32291±0.04526
Bindungsfaktor p/q1	38.29413±0.96095
unspezifische Bindung nsb	0.04345±0.00370
Antigenäquivalent der Fremdsubstanz p2	0.78202±0.02068 µg/l

Erläuterungen:
Eine Antiserumverdünnung von 1 : 1000 hat eine Bindungskapazität für 38.3 µg/l bLH.
Im Reaktionsmedium befindet sich eine Fremdsubstanz, die wie 0.78 µg/l bLH wirkt.
Summe der Abweichungsquadrate: 7.7951355217E-04
Modellfehler: 0.0403 Versuchsfehler: 0.0216

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.9978[±0.006]*B/T_beobachtet+0.001[±0.0032]
r²=0.9994

STANDARD-TITER-KURVE

Diskriminationsprofil für p=16.000 µg/l
IgG-Konz.
Delta-B/T
0.836
0.0846
0.669	0.1081
0.535	0.1375
0.428	0.1734
0.342	0.2151
0.274	0.2606
0.219	0.3063
0.175	0.3487
0.140	0.3845
0.112	0.4114
0.090	0.4279
0.072	0.4329
0.057	0.4259
0.046	0.4070
0.037	0.3775
0.029	0.3400
0.024	0.2983
0.019	0.2560
0.015	0.2159
0.012	0.1797

Antikörperkonzentration mit höchster Diskrimination=0.072 (=Antiserumverdünnung von 1 : 13 890) für Antigenkonzentration=16.000 µg/l

Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination

2. IRMA-Optimierung Beispiel 5 TSH-IRMA mit einem I-125-monoklonalen Antikörper, einem unmarkierten polyklonalen Antikörperpool, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- TSH (eigener Sekundärstandard in Serumverdünnung) in den Konzentrationen: 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und mU/l
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK) a 40, 20 und 10 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1 : 400 Verdünnung un 1% Tween 80 als Reaktionsmilieu
- gereinigtes polyklonale Anti-TSH-Antikörper (1 : 2000) vom Kaninchen
- Normalkaninichenserum (NKS; 1 : 100-Verdünnung)
- Fällungsgemisch: Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin zusammen mit NKS und PEG (Polyethylenglykol) 6000-Verdünnung.

Verfahrensschritte

0.2 ml TSH und 0.1 ml Tracer in ein Plaströhrchen geben. Über Nacht inkubieren lassen. 0.1 ml polyklonaler Antikörper und NKS dazu. Nach einer Stunde Fällungsgemisch dazu und inkubieren lassen. Nach einer weiteren Stunde waschen, zentrifugieren, absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.

Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s270788t zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s270788t

ausgewertet wurde mit Modell 2

Affinitätskonstante, k1
1.44601±0.02135
Bindungsfaktor, p/q	0.21994±0.00366
unspezifische Bindung nsb	0.00340±0.00011
Antigenäquivalent (Fremdprotein) q2	8.62739±0.50975 mU/l

Erläuterungen:
Angaben für den I-125-MAK in 1000 cpm (counts per minute).
- Bindungsfaktor: 1000 cpm des I-125-MAK haben eine TSH-Bindungskapazität von 0.22 mU TSH.
- unspezifische Bindung: in Abwesenheit von TSH beträgt die Bindungsrate 0.34%.
- Neben der gemeinsamen Sandwich-Bindung des I-125-MAK und des polyklonalen Antikörpers existiert eine zusätzliche, nicht mit dem I-125-MAK gemeinsam reagierende IgG- oder Proteinbindungskapazität für 8.63 mU/l TSH.
Summe der Abweichungsquadrate: 3.2043247356E-06
Modellfehler: 0.0599 Versuchsfehler: 0.0559

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=1.007[±0.011]*B/T_beobachtet-0.00026[±0.0027]
r²=0.9978

STANDARD-TITER-KURVE

Diskriminationsprofil für p=10.00 mU/l TSH
IgG-Konz. 1000 cpm
Delta-B/T
227.337
0.1329
181.870	0.1551
145.496	0.1786
116.397	0.2027
93.117	0.2265
74.494	0.2491
59.595	0.2697
47.676	0.2879
38.141	0.3032
30.513	0.3158
24.410	0.3258
19.528	0.3337
15.622	0.3397
12.498	0.3442
9.998	0.3476
7.999	0.3502
6.399	0.3521
5.119	0.3535

optimale Antikörperkonzentration=12 498 cpm für Antigenkonzentration=10.000 mU/l TSH

Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination

Das standardisierte Präzisionsprofil ergibt sich aus einem durchschnittlichen experimentellen Fehler von 2% und aus dem Zählfehler der optimierten Konzentration des I-125-MAK.

Beispiel 6 TSH-IRMA mit zwei monoklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Coated-Tube-Technik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- Mit MAK beschichtete Röhrchen (IRE, Belgien)
- THS-Standards von IRE a 0, 0.15, 0.5, 1.5, 5, 15, 50 und 150 mU/l
- THS-Standards von Henning, Berlin (Dyno-Test) a 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und 80 mU/l
- I-125-MAK a 126 807 cpm (Dyno) und 32 122 cpm (IRE) als Tracer

Verfahrensschritte

0.2 ml Standard und 0.1 ml Tracer in die beschichteten Röhrchen geben. Über Nacht inkubieren lassen. Absaugen, waschen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s290688t zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMAOPT ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s290688t

ausgewertet wurde mit Modell 3

Affinitätskonstante K1
1.88349±0.04877
Bindungsfaktor p/q	0.99937±0.00494
unspezifische Bindung nsb	0.00002±0.00002
Antigenäquivalent (Fremdsubstanz) p2	0.02810±0.00266 mU/l

Erläuterung:
Im Reaktionsmedium oder an der Wandung befindet sich eine kreuzreaktive Substanz, die wie 0.028 mU/l TSH wirkt.
Summe der Abweichungsquadrate: 9.2666388420E-09
Modellfehler: 0.0797 Versuchsfehler: 0.2167

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=1.019[±0.010]*B/T_beobachtet-0.00075[±0.0026]
r²=0.9987

STANDARD-TITER-KURVE

Diskriminationsprofil für p=10.000 mU/l
IgG-Konz. 1000 cpm
Delta-B/T
50.032
0.1572
40.025	0.1890
32.020	0.2245
25.616	0.2625
20.493	0.3010
16.394	0.3370
13.115	0.3675
10.492	0.3899
8.394	0.4026
6.715	0.4048
5.372	0.3968
4.298	0.3790
3.438	0.3524
2.751	0.3185
2.200	0.2797
1.760	0.2385
1.408	0.1983
1.127	0.1614
0.901	0.1295
0.721	0.1030
0.577	0.0815
0.461	0.0644

optimale Antikörperkonzentration=6715 cpm für Antigenkonzentration=10.000 mU/l

Standardisiertes Präzisionsprofil bei optimaler Diskrimination

3. Kreuzreaktionsstudien Beispiel 7 Estron-Kreuzreaktivität im Estradiol-RIA Estradiol-RIA mit ungereinigtem Antiserum, B/F-Trennung mit Dextrankohletechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05% Humanserumalbumin (Serva)
- Anti-E2-Antiserum (3-E2-(3)D), 1 : 20 000
- Estradiol (E2) in den Konzentrationen 0, 0.043, 0.143, 0.429, 1.429, 2.857 und 5.714 nmol/l
- I-125-6-Histamin-Estradiol als Tracer (0.014 nmol/l)
- Estron in den Konzentrationen 0, 0.429 und 5.71 nmol/l
- Dextrankohlesuspension mit 5 mg/ml Aktivkohle (Norit A) und mit 0.5 mg/ml Dextran T 500

Verfahrensschritte

Es werden 0.5 ml Puffer, der alle Varianten der aufgeführten Estradiol- und Estronkonzentrationen enthält, zusammen mit 0.1 ml Tracer und 0.1 ml Antiserum in ein Plaströhrchen gegeben und über Nacht inkubiert. Zugabe von 1 ml Dextrankohlesuspension. Zentrifugation der Proben. Dekantieren des Überstands in Plaströhrchen. Messen des Überstands und von 0.1 ml Tracer als Totalwert im Gammacounter.

Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s161091t zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s161091t

ausgewertet wurde mit Modell 1

Tracerkonzentration: 0.01400 nmol/l
Affinitätskonstante K1	0.81216±0.01441
Bindungskapazität q	0.16775±0.00781 nmol/l
unspezifische Bindung nsb	0.03365±0.00415
Kreuzreaktivität p1/p2	0.06076±0.00284

Erläuterungen:
- Die verwendete Antiserumverdünnung (1 : 20 000) hat eine Bindungskapazität für 0.168 nmol E2
- Die Kreuzreaktivität Estron(p2) zu Estradiol(p1) beträgt 6.08%.
Summe der Abweichungsquadrate: 5.8483566241E-04
Modellfehler: 0.0249 Versuchsfehler: 0.0355

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.998[±0.009]*B/T_beobachtet-0.00041[±0.0028]
r²=0.9987

KREUZREAKTIONSSTUFE

Standard 1: Estradiol (p1) Standard 2: Estron (p2)

Effekt der Kreuzreaktion für eine vorgegebene Konzentration

Systematische Abweichungen durch p2=0.500 nmol/l Estron

Beispiel 8 Serumeinfluß auf den β-HCG-RIA β-HCG-RIA mit gereinigtem, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trennung mit Doppelantikörpertechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.01 m Phosphatpuffer mit pH 7.4 und 0.05% Humanserumalbumin (Serva) - β-HCG (Calbiochem) in den Konzentrationen 0, 0.021, 0.042, 0.083, 0.167, 0.333, 0.667 und 1.333 nmol/l
- Protein-A gereinigter polyklonaler Anti-β-HCG Antikörper (4 nmol/l)
- Poolserum in den Verdünnungen 1 (unverdünnt) und 1 : 4
- I-125-β-HCG (0.067 nmol/l) als Tracer

Verfahrensschritte

0.1 ml β-HCG, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.3 ml Pufferlösung, zu 0.3 ml 1 : 4 verdünntem Serum und zu 0.3 ml Vollserum gegeben in ein Plaströhrchen gegeben. Inkubation über Nacht. Zugabe von einer Präzititationslösung, bestehend aus 1 : 10 verdünnten 2. Antikörper gegen Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1 : 100 und 4% PEG 6000.

Nach 15 Minuten unter Zusatz von 1 ml Latex-Wasser zentrifugieren und Überstand absaugen. Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert.

Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s081289s zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s081289s

ausgewertet wurde mit Modell 1

Tracerkonzentration: 0.06700 nmol/l
Affinitätskonstante K1	1.76139±0.20004
Bindungsfaktor q	0.05535±0.00494
unspezifische Bindung nsb	0.03339±0.00874
Kreuzreaktivität p1/p2	0.08098±0.00915

Erläuterungen:
- Die verwendete Antikörperverdünnung hat eine Bindungskapazität für 0.055 nmol/l β-HCG
- Das Vollserum hat zum β-HCG eine Kreuzreaktivität von 8.1%. Da das Gesamtmilieu bei 0.3 ml Serum zu 0.3 ml Puffer maximal ein Halbserum ist, ist in einem Vollserummilieu mit störenden, unbekannten kreuzreaktiven Substanzen von 0.162 nmol β-HCG-Äquivalent zu rechnen.
Summe der Abweichungsquadrate: 4.2555375171E-03
Modellfehler: 0.0817 Versuchsfehler: 0.0189

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.988[±0.022]*B/T_beobachtet-0.0029[±0.0061]
r²=0.9887

KREUZREAKTIONSSTUDIE

Standard 1: β-HCG (p1) Standard 2: Serumverdünnung (p2)

Effekt der Kreuzreaktion

Systematische Abweichungen durch p2=0.500 (Serumverdünnung 1 : 4)

Beispiel 9 Albumineinfluß auf den T3-RIA T3-RIA mit gereinigten, polyklonalen Antikörpern, B/F-Trenung mit Doppelantikörpertechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- 0.02 m Tris-Puffer mit pH 8.7 und 0.5% Humanserumalbumin (HSA; Serva)
- Protein-A gereinigtes anti-T3-IgG (1.406 nmol/l) als Antikörper.
- Triiodthyronin (T3; Henning, Berlin) als Antigen in den Konzentrationen 0, 0.157, 0.312, 0.624, 1.249, 2.498, 4.992 und 10 nmol/l
- HSA in den Konzentrationen 8.33, 30.0 und 103.3 µmol/l
- I-125-T3 (0.215 nmol/l) als Tracer

Verfahrensschritte

0.1 ml T3, 0.1 ml Antikörper und 0.1 ml Tracer werden zu 0.2 ml Puffer unterschiedlicher HSA-Konzentration in ein Plaströhrchen gegeben. Nach 2 h Inkubation Zugabe von einer Präzititationslösung, bestehend aus 1 : 20 verdünnten 2. Antikörper gegen Kaninchengammaglobulin, Normalkaninchenserum 1 : 100 und 4% PEG 6000.

Nach 15 Minuten mit 1 ml Latex-Lösung zentrifugieren und Überstand absaugen. Messen der Röhrchen im Gammacounter. Messen von 0.1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden. Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s170589s zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm RIAKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: b:s170589s

ausgewertet wurde mit Modell 1

Tracerkonzentration: 0.21500 nmol/l
Affinitätskonstante K1	1.54015±0.05858
Bindungskapazität q	0.80873±0.06008 nmol/l
unspezifische Bindung nsb	0.01135±0.00917
Kreuzreaktivität p1/p2	0.02209±0.00138

Erläuterungen:
- Die 1.406 nmol/l anti-T3-IgG haben eine Bindungsskapazität für 0.809 nmol/l T3
- HSA in µmol-Mengen ist 2.2% kreuzreaktiv zu T3 in nmol-Mengen. Die Kreuzreaktivität des HSA zu T3 ist somit 0.0022%
Summe der Abweichungsquadrate: 3.0584606053E-03
Modellfehler: 0.0825 Versuchsfehler: 0.0513

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.995[±0.017]*B/T_beobachtet-0.0013[±0.0053]
r²=0.9938

KREUZREAKTIONSSTUDIE

Standard 1: T3 (p1) Standard 2: HSA (p2)

Effekt der Kreuzreaktion

Systematische Abweichungen durch p2=15.000 µmol/l HSA

Beispiel 10 Einfluß von Rindergammaglobulin auf die Bindungskapazität im TSH-IRMA mit Doppelantikörpertechnik Kurze Verfahrensbeschreibung Verwendete Substanzen

- TSH (eigener Sekundärstandard in Serumverdünnung) in den Konzentrationen: 0, 0.16, 0.31, 1.25, 5, 20 und mU/l
- I-125-monoklonaler Antikörper (I-125-MAK; ZIM, Micheel) a 20 KBq/ml als Tracer
- Normales humanes Männerserum in 1 : 400 Verdünnung und 1% Tween 80 mit und ohne 46.9 µmol/l Rindergammaglobulin als Reaktionsmilieu
- gereinigte polyklonale anti-TSH-Antikörper (1 : 2000) vom Kaninchen
- Normalkaninchenserum (NKS; 1 : 100-Verdünnung)
- Präzipitationsantikörper von der Ziege gegen Kaninchen-Gammaglobulin in einem Fällungsgemisch zusammen mit NKS und PEG 6000-Verdünnung.

Verfahrensschritte

0.2 ml TSH und 0.1 ml Tracer in ein Plaströhrchen geben. Über Nacht inkubieren lassen. 0.1 ml polyklonaler Antikörper mit NKS dazu. Nach einer Stunde Fällungsgemisch dazu und nach einer weiteren Stunde waschen, zentrifigieren, absaugen und Röhrchen im Gammacounter messen. Messen von 0,1 ml Tracer als Totalwert. Eingaben und Umrechnungen auf B/T und VK-Werte für Standardkurven können mit dem Programm EINGABE vorgenommen werden.

Mit dem Programm ZUSAM wird aus den zweidimensionalen Versuchen (Standardkurven) ein dreidimensionaler Versuch mit dem Namen s270788t zusammengestellt. Dieser Versuch wird mit dem Programm IRMKREUZ ausgewertet. Das Auswerteergebnis ist dem nachfolgenden Ausgabeprotokoll zu entnehmen.

Auswerteergebnis des Versuchs: a:s270989t

ausgewertet wurde mit Modell 3

Affinitätskonstante K1
1.02286±0.01064
Bindungskapazität q	19.67130±0.48317 mU/l
unspezifische Bindung nsb	0.00337±0.00017
Erhöhungsfaktor der Bindungskapazität	0.02999±0.01311

Erläuterungen:
- Die beiden verwendeten Antikörper (markierter und unmarkierter Antikörper) haben eine gemeinsame Bindungskapazität für 19.67 mU/l TSH
- Durch das Rindergammaglobulin wird diese Bindungskapazität noch um 0.03× Gammaglobulinkonzentration erhöht. Die 46.9 µmol/l Gammaglobulin wirken wie eine zusätzliche Bindungskapazität von 1.407 mU/l.

Summe der Abweichungsquadrate: 3.2190517302E-06
Modellfehler: 0.0538 Versuchsfehler: 0.0486

Güte der Modellberechnungen:
B/T_berechnet=0.9963[±0.0042]*B/T_beobachtet-0.00023[±0.0010]
r²=0.9998

KREUZREAKTIONSSTUDIE

Standard 1: (p1): TSH Standard 2 (p2): Rinder-Gamma-Globulin

Effekt der Kreuzreaktion

Systematische Abweichungen durch p2=100.000 µmol Rindergammaglobulin

Verwendete Abkürzungen:
Abweich.: (B/T_beobachtet-B/T_berechnet)/B/T_beobachtet absolut, ohne Vorzeichen
B/F-Trennung: Trennung des gebundenen Antigen (B=bound) vom freien Antigen (F=free)
B/T: Bevorzugte Angabe der Response als antikörpergebundenes Antigen (B) geteilt durch das Gesamtantigen (T=total)
Delta-B/T: Differenz der B/T-Werte zwischen niedriger und hoher Antigenkonzentration in Titerkurven
bLH: bovines luteinisierendes Hormon
cpm: counts per minute (Zählrate bei der Aktivitätsmessung)
K: Affinitätskonstante
I-125: radioaktives Isotop des Iod mit der Massenzahl 125
MAK: Monoklonaler Antikörper
MWG: Massenwirkungsgesetz
NKS: Normales Kaninchenserum
p: Antigenkonzentration bzw. Antikörperbindungskapazität des Antigen
PEG 6000: Polyethylenglykol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 6000
q: Antikörperkonzentration bzw. Antigenbindungskapazität des Antikörper
VK: Variationskoeffizient der Reponse oder der Antigenkonzentration
β-HCG: Beta-Kette des humanen Chorion Gonadotropins
r²: Bestimmtheitsmaß, Quadrat des Korrelationskoeffizienten

Claims

1. Verfahren zur Schnelloptimierung und gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzen, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes, gegebenenfalls unter Zufügung eines oder mehrerer weiterer Stoffe oder nach Verdünnung, bestimmt werden, die Daten mathematisch erfaßt und in den dreidimensionalen Versuch überführt werden und nachfolgend die mathematische Auswertung für die Anpassung und Optimierung des Assays erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten an 2-3 Standardkurven bzw. 2-3 Titerkurven mit 2-3 deutlich verschiedenen Konzentrationen des jeweils anderen Reaktionspartners bestimmt werden.

3. Verfahren zur Schnelloptimierung von Immunoassays aller Provenienzen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes bei gleichzeitiger Variation sowohl der Antigen- als auch der Antikörper- Konzentration bestimmt werden, die Daten optional erfaßt und mit dem Programm ZUSAM in den dreidimensionalen Versuch überführt werden, wobei erforderlichenfalls, eine Vertauschung der Feldfolge mit dem Programm VARIABLE erfolgt, und nachfolgend mit den Programmen RIAOPT bzw. IRMAOPT die Auswertung und Optimierung des Assays für eine vorgewählte Antigenkonzentration erfolgt.

4. Verfahren zur gezielten Qualitätskontrolle von Immunoassays aller Provenienzen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindungsraten eines bestimmten Antigen-Antikörper-Komplexes bei fixer Antikörper- Konzentration durch gleichzeitige Variation der Antigen-Konzentration und eines zugefügten Fremdantigens und/oder der Variation des Reaktionsgemisches durch seine Verdünnung oder Aufstockung bestimmt werden, die Daten erfaßt und mit dem Programm ZUSAM in den dreidimensionalen Versuch überführt werden, wobei erforderlichenfalls eine Vertauschung der Feldfolge mit dem Programm VARIABLE erfolgt und nachfolgend mit den Programmen RIAKREUZ bzw. IRMKREUZ eine Auswertung und die Beschreibung der Auswirkung einer vorgegebenen Konzentration von Fremdantigenen und einer Mediumkonzentration auf die Richtigkeit des Assays erfolgt.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß sie automatische Pipettier- und Verdünnungseinrichtungen enthält, welche Verdünnungs- und Aufstockungsschritte des Reaktionsmediums vornehmen und dadurch den 2-dimensionalen Immunoassayversuch programmtechnisch in einen dreidimensionalen Versuch überführen und nachfolgend mit den mathematischen Programmen verbinden.