CH659136A5

CH659136A5 - Immunoreaktives liposom.

Info

Publication number: CH659136A5
Application number: CH6401/81A
Authority: CH
Inventors: Francis X Cole
Original assignee: Collaborative Res Inc
Priority date: 1980-02-04
Filing date: 1981-01-13
Publication date: 1986-12-31
Also published as: AU6785981A; FR2485038B1; DE3103826C2; GB2069133B; US4342826A; CA1175740A; SE8105827L; FR2485038A1; AU551950B2; GB2069133A; DK436781A; DE3103826A1; WO1981002344A1

Description

Die vorliegende Erfindung befasst sich mit Tests auf eine Substanz in einer Probe durch Bestimmung der komplementvermittelten Behandlung der Partikel (der Liposomen selbst) und Messung des Ergebnisses der Reaktion zwischen einem Enzym und einem Substrat. Erfindungsgemäss ist das Enzym innerhalb des Liposoms enthalten.

Da beim Test gemäss der US-PS 4193 983 keine komplementvermittelte Spaltung eines Liposoms angewandt wird, ist dieser Test grundsätzlich von der vorliegenden Erfindung verschieden.

Man hat schon vorgeschlagen, für solche Trennverfahren Immunoassaymethoden anzuwenden, weil Immunoassays bekanntlich sehr speziell und hochempfindlich sind und leicht durchgeführt werden können. Radioimmunoassays finden z.B. bei der klinischen Diagnostik weite Anwendung. RIA-Verfahren sind jedoch häufig nicht mit Untersuchungsprogrammen im grossen Massstab verträglich. Radiotracer haben von Haus aus eine limitierte Stabilität und spezielle Entsorgungsverfahren und Personalauswahl sind erforderlich. Ausserdem benötigt man häufig hochkomplizierte Instrumente. Bei gewissen Anwendungen stellt RIA auch eine potentielle Gefahr dar, z.B. bei nahrungsmittelverarbeitenden Betrieben.

Andere Verfahren sind schon entwickelt worden, z.B. Fluoreszenz- oder enzymatische Immunoassayverfahren, die deshalb brauchbar sind, weil man potentiell gefährliche Rea-gentien vermeiden kann. Bei diesen Verfahren muss man jedoch Trenn verfahren in Filtrations- oder Zentrifugations-stufen anwenden. Solche Trennverfahren verlangsamen das Testverfahren und sind auch nur schwer zu automatisieren.

Gemäss einer jüngeren Entwicklung verwendet man enzymmarkierte Antigene, die keine Abtrennung in gebundene und freie Spezies benötigen und die man deshalb schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit durchführen kann. Ein solches System kann man automatisieren und für hochvolumige Untersuchungen anwenden, wie in dem EMIT-System von Rosenthal A.F., Vargas M.G., und Klass C.S. ( 1976) Clin. Chem. 22,1899. Bei diesem Verfahren wird ein Antigen an ein Enzym gekuppelt, wobei dieses Verfahren sehr kritisch ist und dazu führen kann, dass das System nicht ausreichend für verschiedene Analysenmethoden angepasst ist, sofern man nicht für jedes neue System sorgfältige Entwicklungen vornimmt.

Kürzlich wurde von Liposomen berichtet, die Enzyme oder Substrate tragen können und die mit Antigenen oder Antikörpern markiert sind. Liposome die mit Antigenen an ihrer äusseren Oberfläche markiert sind und die in ihrem inneren Volumen ein Enzym eingefangen enthalten, werden mit verwandten Antikörpern und Komplementen vermischt, um zu entscheiden, ob die Liposome die Freilassung des eingefangenen Enzyms ermöglichen oder nicht. Diese Entscheidung wird durch den Nachweis der Enzymaktivität getroffen, welche physikalisch aus den Liposomen nach der Abtrennung der Liposome aus dem umgebenden Medium freigegeben wird (siehe Uemura K. und Kinsky S.C., 1972, Bioche-mistry, 11,4085-4094 und Kataoka T., Williamson J. und Kinsky S., 1973, Biochemics et Biophysica Acta 298,

158-179). Es ist jedoch nicht erkannt worden, dass solche Liposome, wenn sie in geeigneter Weise mit einem geeigneten hohen Signal-zu-Geräusch-Verhältnis gebildet werden, für Immunoassayverfahren geeignet sind, bei denen man Abtrennstufen vermeidet und man den Test in Reaktionen in homogener Phase durchführen kann. Ausserdem wird über Schwierigkeiten bei der Herstellung von immunospezif i-schen Liposomen berichtet (siehe G.H. Strejan, P.M. Smith, C.W. Grant und D. Surlan, «Naturally Occurring Antibodies To Liposomes», The Journal oflmmunology, Bd. 123, Nr. 1, Juli 1979,370-378). Ausserdem ist seit langem bekannt, dass die Diffusion von Makromolekülen, wie Enzymen, durch Läsionen, die durch Komplement in zweischichtigen Membranen gebildet werden, sehr viel langsamer ist als von kleinen Molekülen (Green H., Barrow P. und Goldberg B„ 1959, J. Exp. Med., 110,699).

Aufgabe der Erfindung ist es, immunoreaktive Liposome, immunologische Verfahren und Immunoassay-Test-Sätze zur Verfügung zu stellen, die eine schnelle und einfache quantitative und/oder qualitative Bestimmung von Antigenen ermöglichen.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren in Übereinstimmung mit der vorhergehenden Aufgabe zur Verfügung zu stellen, das durch verhältnismässig untrainiertes Personal durchgeführt werden kann und bei dem man Ergebnisse in einer einzigen Stufe durch einfaches Ablesen erzielt, ohne dass irgendeine Trennstufe nach der Testreaktion erforderlich ist.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine Reaktion in homogener Phase zur Verfügung zu stellen, bei welcher mit einem Antigen oder Antikörper markierte Liposome, durch die ein Enzym maskiert ist, immunospezifisch veranlasst werden, Enzym in Gegenwart des Partners des Antigens bzw. Antikörpers und von aktivem Komplement freizulegen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Liposome, die mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert sind und durch die ein Enzym maskiert ist, mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5, vorzugsweise nicht weniger als 10, und die vorzugsweise eine Stabilität von wenigstens etwa 60 Tagen bei Aufbewahrung in einer Flüssigkeit aufweisen, zur Verfügung zu stellen.

Das immunoreaktive Liposom gemäss der Erfindung ist mit einem Antigen oder Antikörper markiert und maskiert ein Enzym, wobei es ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5, vorzugsweise nicht wengier als 10, hat. Das Enzym ist zweckmässig innerhalb des Liposoms eingekapselt. Vorzugsweise wird das Liposom in einem flüssigen Medium gehalten und ist während eines Zeitraumes von wenigstens 60 Tagen stabil. Vorzugsweise ist das Liposom-Signal-zu-Geräusch-Verhältnis hoch und liegt oberhalb 60, und die Stabilität beträgt in einer Inertgasatmosphäre bei 4°C mehr als 6 Monate.

Der erfindungsgemässe Immunoassay-Test-Satz zum Nachweisen von Antigenen oder Antikörpern in einer Probe enthält einen Behälter, enthaltend erfindungsgemässe Liposome, und vorzugsweise einen weiteren Behälter, enthaltend den Partner des Antikörpers oder des Antigens, sowie einen Behälter für ein Substrat für das Enzym und einen Behälter, enthaltend Komplement für den Antikörper oder das Antigen.

Das erfindungsgemässe immunologische Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Liposom, das mit einem Antigen oder Antikörper markiert ist und das ein Enzym mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 maskiert, mit einem Substrat für das Enzym und dem zu untersuchenden Material und mit einem Mittel, das eine Freilegung des Enzyms gegenüber dem Substrat unter den Testbedingungen ermöglicht, kombiniert, wobei das Liposom mit der zu bestimmenden Substanz oder mit dem Partner der zu bestimmenden Substanz markiert ist. Vorzugsweise stellt man eine Mischung her aus :

(a) einem Liposom, das mit der zu bestimmenden Substanz oder dem Partner der zu bestimmenden Substanz markiert ist und durch welches ein Enzym maskiert ist, mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5,

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(b) einem Substrat für das Enzym,

(c) einem auf die spezifische Aktivität des Antigens oder des Antikörpers zu prüfenden Testmaterial und

(d) einem Komplement,

und bestimmt die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Enzymaktivität in dem Gemisch unter solchen Bedingungen, bei denen eine Immunreaktion stattfindet und das Enzym gegenüber dem Substrat freigelegt wird.

Das Vorhandensein einer Enzymaktivität kann durch für das Auge sichtbare Veränderung der Farbe, spektroskopisch oder in ähnlicher Form nachgewiesen werden. Vorzugsweise gibt man zusätzlich den Partner des Antigens oder Antikörpers, mit dem das Liposom markiert ist, zu der Mischung, und die Untersuchung wird dann für die gleichen Antigene oder Antikörper durchgeführt, mit denen die Liposome markiert sind. Wenn die gesuchten immunospezifischen Antigene oder Antikörper in dem zu untersuchenden Material vorhanden sind, dann reagiert der Antikörper oder das Antigen in der Mischung mit dem Antigen bzw. Antikörper, das bzw. der intakt das Liposom verlässt, und verhindert dadurch einen Komplementangriff, während in dem Fall, dass die gesuchten Antikörper bzw. Antigene nicht in dem zu untersuchenden Material vorhanden sind, die Liposommar-kierung reagiert und die Enzymaktivität nachweisbar wird. Die Menge an dem gesuchten Antigen bzw. Antikörper in dem zu untersuchenden Material, sofern sie vorhanden ist, ermöglicht einen gewissen Komplementangriff, wenn sie nicht ausreicht, mit den gesamten freien Antikörpern oder Antigenen in der Mischung zu reagieren, und ein Teil der Enzymaktivität kann dann nachgewiesen werden.

In einigen Fällen kann das erfindungsgemässe Verfahren direkt angewendet werden, um alle Elemente aus der Gruppe Antigen, Antikörper und Komplement nachzuweisen. Bei dieser direkten Methode wird eine unvollständige Mischung, die alle bis auf ein Element aus der Gruppe Antigen, Antikörper oder Komplement enthält, hergestellt, und die Gegenwart des nicht vorhandenen Elementes in einer zu untersuchenden Probe wird dadurch nachgewiesen, in welchem Aus-mass man bei der Zugabe der Probe zu der unvollständigen Mischung eine Lysis des Liposoms durch immunspezifischen Angriff auf die Liposommembranen oder das Freilegen von eingekapseltem Enzym gegenüber der Flüssigkeit um das Liposom beschleunigt. Wenn das zu untersuchende Testmaterial auf Antikörper oder Antigene untersucht wird, die die Partner derjenigen sind, die als Markierung des Liposoms dienen, muss man kein Antigen oder keinen Antikörper zu dem Gemisch zugeben. In einem direkten Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern würde eine Mischung der folgenden Zusammensetzung verwendet:

(a) mit einem Antigen oder dessen Partner markierte Liposome, die ein Enzym maskieren und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 haben,

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) das auf das Antigen oder dessen Partner zu untersuchende Testmaterial und

(d) Komplement.

Wenn man eine direkte Immunoassay durchführt, um das aktive Komplement in der Probe festzustellen, so würde man für ein solches Verfahren eine Mischung benötigen aus :

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) ein auf Komplement zu untersuchendes Testmaterial, und

(d) freier Partner des Antikörpers oder Antigens.

Eine bevorzugte Immunoassaymethode würde vorzugsweise folgende Mischung umfassen:

(a) Liposome, die mit einem Antigen oder dessen Partner markiert sind und ein Enzym maskieren und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 haben,

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) das auf das Antigen oder dessen Partner zu untersuchende Testmaterial,

(d) Komplement und

(e) freier Partner des Antikörpes oder Antigens,

wobei man die Gegenwart oder Abwesenheit von Enzymaktivität in dem Gemisch nachweisen würde. Bei diesem Verfahren kann das nachzuweisende Antigen zum Markieren der verwendeten Liposome und der freien Partner verwendet werden. Alternativ kann der nachzuweisende Antikörper zum Markieren des verwendeten Liposoms und des freien Partner-Antikörpers verwendet werden.

Vorzugsweise wird das Verfahren als Einstufenverfahren durchgeführt, und alle Stoffe werden in ein einziges Fläschchen gegeben, in dem eine Inkubierung unter standardimmunologischen Bedingungen, z.B. bei 37°C oder in einem Bereich von 4 bis 45°C, in Zeiträumen zwischen etwa 1 Sekunde und 120 Minuten, durchgeführt wird. Alternativ kann man alle Stoffe bis auf das Enzymsubstrat abmischen und 5 bis etwa 120 Minuten oder länger inkubieren, und dieses Gemisch gibt man dann zu dem Enzymsubstrat und stellt das Ergebnis fest.

Ein Test-Satz zum Nachweis von entweder einem Antigen oder dessen Partner besteht vorzugsweise aus einem ersten Behälter, in dem sich das Liposom befindet, welches mit entweder dem Antigen oder dessen Partner markiert ist und das in einem geeigneten Puffer suspendiert ist. Ein zweiter Behälter enthält pulverisierte lyophilisierte oder gefrorene, konzentrierte Antikörper oder Antigene, die die Partner der Markierung des Liposoms sind. Ein drittes Fläschchen enthält pulverisiertes oder gefrorenes konzentriertes Komplement, das in Form von Meerschweinchenserum vorliegen kann, und ein vierter Behälter enthält ein Enzymsubstrat für das Enzym, das in flüssiger oder Pulverform vorliegen kann. In einem weiteren Behälter befindet sich Puffer.

Eine Einstufenmethode kann man anwenden, bei der alle Komponenten abgemischt und inkubiert werden. In einigen Fällen kann man das Verfahren jedoch in zwei oder mehr Stufen durchführen, wobei einige der Materialien zusammen inkubiert werden, bevor man das Mischen vervollständigt. In allen Fällen wird keine Trennung nach der Immunreaktion oder in Abwesenheit davon durchgeführt, und eine direkte Ablesung wird an den Reaktionsmaterialien durchgeführt, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen oder Antikörper in der Testprobe festzustellen, indem man die Enzymaktivität oder -reaktion mit dem Substrat nachweist.

Es ist ein Vorteil der Erfindung, dass die Untersuchung schnell durch untrainiertes Personal mit verhältnismässig niedrigen Kosten durchgeführt werden kann. Die Ablesung kann subjektiv erfolgen, beispielsweise visuell durch Farbänderung, wenn qualitative Ablesungen gewünscht werden. Halbquantitative Ablesungen kann man subjektiv erhalten, wenn Farbänderungen von stark nach schwach eintreten. Spektrofotometrische Methoden oder dergleichen kann man anwenden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Enzymaktivität in der Gegenwart von Substrat, durch welche die Freilegung von Liposom oder ein immunspezifischer Angriff auf die Liposommembrane und dadurch die Freilegung des Enzyms gegenüber dem Substrat erfolgt, nachzuweisen. Die Freilegung der Enzymaktivität findet statt, wenn eine

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Immunreaktion abläuft unter Bildung eines Immunkomplexes und die Doppelschicht oder die enzymumgebende Membran der Liposome beeinträchtigt. Wenn der Antikörper oder das Antigen, je nachdem was hier vorliegt, in dem System mit dem jeweiligen Partner, mit dem das Liposom markiert ist, in Gegenwart von aktivem Komplement reagiert, so wird Enzym freigegeben. Wenn jedoch die Testprobe das nachzuweisende Antigen oder den nachzuweisenden Antikörper enthält, wird die Reaktion des Partners in dem Medium mit der Partner-Markierung verhindert oder vermindert, und dadurch wird der Nachweis des aufzufindenden Enzyms in dem Substrat verhindert, was ein positives Anzeichen für das nachzuweisende Antigen oder den nachzuweisenden Antikörper darstellt.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposome werden manchmal als smektische Mesophase oder synthetische Bläschen bezeichnet. Sie sind tatsächlich trockene Lipidfilme, suspendiert in einem wässrigen Medium, entsprechend der Beschreibung von Uemura K. und Kinsky S.C. ( 1972) Biochemistry 11,4085-4094. Liposome bestehen wahrscheinlich aus Lipid-Zweischichten (lipid bilayers), die eine innere wässrige Kammer von einem äusseren wässrigen Medium abtrennen, und sind tatsächlich Prototypen biologischer Membranen. Die Liposome haben ähnliche Eigenschaften wie biologische Membranen. Bekanntlich kann man sie so herstellen, dass sie entweder Enzymsubstrate oder Enzyme enthalten. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung maskieren die Liposome Enzym und haben eine äussere Oberfläche, die im wesentlichen frei von Enzym ist, wobei diese äussere Oberfläche das Enzym einschliesst, so dass die katalytische Wirkung des Enzyms nicht nachweisbar wird, bis die die Membran einkapselnde äussere Oberfläche aufreisst und mit einem Antigen oder einem Partner-Antikörper, je nach der Art des durchzuführenden Tests, markiert ist. Wenn man den Antikörper sucht, dann wird das Liposom vorzugsweise mit dem Antikörper markiert, und wenn man das Antigen sucht, so wird das Liposom vorzugsweise mit dem Antigen markiert.

Liposome sind schon beschrieben worden. Jedoch ist bisher kein Schrifttum bekannt, nach dem man Liposome erhalten hat, die Enzyme maskieren und bei denen die Liposome ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 haben. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass man bisher nicht die Vorteile solcher Liposome für deren Verwendung in Immunoassayverfahren erkannt hat.

Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis soll zweckmässig 10 oder mehr und vorzugsweise wenigstens 60 betragen und kann auch 1000 oder mehr betragen, so dass die Liposome das Enzym aus dem Substrat enthalten und maskieren. In Abwesenheit des Antigen-Antikörper-Komplexes oder eines Immunkomplexes, der sich beim Aufreissen oder Poröswerden der Liposommembran bildet, findet keine nachweisbare Enzymaktivität statt. Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis beträgt 5 oder mehr bei den erfindungsgemässen Liposomen, solange keine nachweisbare Enzymaktivität in Abwesenheit eines gebildeten Antigen-Antikörper-Kom-plexes oder eines Immunkomplexes stattfindet. Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis ist als solches bekannt und kann erhalten werden, indem man ein erstes Fläschchen oder ein Geräuschfläschchen, das ein mit einem Antigen oder einem Partner-Antikörper markiertes Liposom, suspendiert in einem isotonischen Puffer, in Gegenwart eines Enzymsubstrates enthält, mit einem zweiten oder einem Signal-fläschchen vergleicht, das Enzymsubstrat, Liposom der vorerwähnten Art und ein bekanntes Freigabemittel, z.B. ein starkes Detergenz, enthält. Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis ist das Testergebnis der beobachteten Enzymreaktion. Vorzugsweise ist das Geräusch in dem Gefäss, in dem sich kein Freigabemittel befindet, so niedrig wie möglich,

wodurch wenig oder gar keine Enzymaktivität angezeigt wird.

Vorzugsweise wird das Geräusch niedrig oder nichtexistent während einer möglichst langen Zeit gehalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Geräuschniveau bei Null oder in der Nähe davon nach einer Lagerung von wenigstens 60 Tagen, oder das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis ist nicht kleiner als 10. Dies ergibt eine gute Lagerfähigkeit, die dann wünschenswert ist, wenn man Test-Sätze für die Anwendung der vorliegenden Erfindung verkauft.

Bei den erfindungsgemässen Immunoassaymethoden maskiert das Liposom das Enzym aus dem Substrat, und durch die Vermittlung eines immunospezifisch aktivierten Komplements wird eine ansonsten latente (verborgene) Enzymaktivität augenscheinlich. Das Liposom kapselt dabei das Enzym ein, d.h. dass das Enzym physikalisch eingefangen ist innerhalb eines Raumes, der durch eine zweischichtige Membran umgrenzt ist. Die physikalische Einkapselung dient auch dazu, die Enzymaktivität zu maskieren. p-Nitro-phenylphosphat (pNPP) ist ein Substrat für das Enzym Alkali-phosphatase (AP). Unter alkalischen Bedingungen (pH grösser als 7) wird durch AP die Phosphatgruppe von pNPP (das farblos ist) abgeschnitten, und es bildet sich p-Nitro-phenol, das unter alkalischen Bedingungen eine intensive Gelbfärbung aufweist. Wenn man daher eine wässrige Lösung von pNPP herstellt, so ist diese Lösung farblos. Gibt man AP zu dieser Lösung, so erhält man sehr schnell eine intensive Gelbfärbung. Die erfindungsgemäss verwendeten Liposome sind derart, dass sie AP einkapseln und dieses AP dadurch gegenüber dem pNPP in der umgebenden wässrigen Lösung maskieren. Auf diese Weise können die Liposome mit dem eingekapselten AP in pNPP-Lösungen dispergiert werden, wobei nur in geringem Masse eine Gelbfärbung erfolgt, wogegen in dem Fall, dass die gleiche Menge an AP, die eingekapselt wurde, direkt eingeführt würde, eine beachtliche Farbtönung sich sehr schnell entwickeln würde.

Aus obigem Grund werden für den Aufbau der Liposome Enzyme ausgewählt, deren Aktivität wirksam durch die intakte Lipid-Doppelschicht der Liposome maskiert wird und bei denen man ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 erhält. Vorzugsweise werden solche Enzyme nicht verwendet, die

(a) an der äusseren Oberfläche der Liposommembran absorbiert würden und auf diese Weise immer gegenüber dem Substrat in dem umgebenden Medium frei vorlägen,

(b) in die Doppelschicht selbst eingeschlossen sind und auf diese Weise sowohl das innere wie das äussere Medium überbrücken würden und daher in gleicher Weise gegenüber dem Substrat in dem umgebenden Medium frei vorlägen,

(c) mit dem Substrat, das leicht durch die intakte Lipid-Doppelschicht diffundieren kann, reagieren (diese Lipid-Doppelschicht ist typischerweise unpolar, lipidlöslich und hat eine kleine Molekülgrösse). In diesem Fall könnte,

obwohl das Enzym eingekapselt sein kann, dessen Aktivität nicht maskiert werden, weil das Substrat in dem umgebenden Medium durch die Diffusion durch die Lipid-Doppelschicht zu dem eingekapselten Enzym Zutritt erhielte.

Der Aufbau der Maskierung ist wichtig im Zusammenhang mit der erfindungsgemässen Immunoassaymethode. Weil diese Maskierung immunospezifisch aufgebrochen werden kann, kann man eine homogene Assay erhalten, d.h. dass es nicht erforderlich ist, eine physikalische Trennung der gebundenen von der freien Signal-Form durch Zentrifu-gieren, Chromatografieren, Filtrieren, Festphasenimmobilisierung und dergleichen vorzunehmen. Solche Trennungen sind zeitraubend, machen spezielle Instrumente oder Vor5

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richtungen erforderlich und lassen sich nur schwierig automatisieren.

Liposome werden aus amphiphilischen Lipiden hergestellt. Lipide kann man allgemein als Moleküle mit mittlerem Molekulargewicht ( 150 bis 3000), die hauptsächlich aus gesättigten oder ungesättigten und/oder aromatischen oder aliphatischen Kohlenwasserstoffresten bestehen, bezeichnen. Amphiphilische Lipide sind solche, die sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche Regionen aufweisen.

Small (J. Am. Oil Chem. Soc., 45,108-117,1968) hat eine Klassifizierung der Lipide aufgestellt, die auf deren Reaktion mit Wasser, und zwar sowohl in Substanz als auch an der Oberfläche, beruht. Für die vorliegende Erfindung geeignete Lipide werden nachfolgend angegeben:

Klasse I - unlösliche, nichtquellen.de amphiphilische Lipide: Di- und Triglyzeride, langkettige protonierte Fettsäuren, Ste-rolester, langkettige Alkohole, Phytole, Retinale, Vitamin A, Vitamin K, Vitamin E und viele Sterole, wie Cholesterin, Desmosterol, Vitamin D und eine Anzahl von Hormonen.

Klasse II - unlösliche, quellende amphiphilische Lipide: Lecithine, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin, Cerebroside, Phosphatidsäuren, Plasmalo-gene, Phosphatidylserin, Cardiolipine und gewisse Pf lanzen-sulfolipide.

Klasse III A - lösliche Amphiphile, Typ A : bilden flüssige kristalline Phasen bei der Zugabe von geringen Mengen Wasser (lyotropischer Mesomorphismus). Schliesst zahlreiche klassiche anionische, kationische und nichtionische Detergentien ein.

Klasse HIB - lösliche Amphphile, Typ B: bilden keine Flüssigkristalle, haben keine ausgesprochene Polarität - Gallensalze.

Klasse-II-Lipide sind besonders für die Bildung von Liposomen geeignet, und die letzteren kann man häufig aus solchen Lipiden allein herstellen. Recht grosse Bläschen erhält man aus Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylserin nach Papahadjopoulos, Annais N.Y. Acad. of Sei. 308, 1978. In einigen Fällen ist es jedoch nützlich, Lipide der Klasse I oder III in die Bläschendoppelschicht aus Strukturgründen zuzugeben, um weniger flüssige Doppelschichten zu bilden, z.B. durch Inkorporieren von Cholesterin oder um einen grösseren Abstand zwischen anliegenden Doppelschichten zu bewirken, z.B. durch elektrostatische Abstos-sung, die durch die Inkorporierung von anionischen (Dicetyl-phosphat-) oder kationischen (Stearylamin-) Lipiden in die Zwischenschicht erfolgt. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Bläschenstrukturen sind beschrieben worden (Szoka und Papahadjopoulos Proc. Nat. Acad. Sei. 75,4194-4198,1978). Viele dieser Strukturen mit entsprechenden Abänderungen können für die vorliegende Erfindung angewendet werden. Bei der Auswahl von geeigneten Herstellungsverfahren werden vorzugsweise Kriterien der folgenden Art angewendet:

(1) Durch die Art der Inkorporierung der Enzyme in die Liposome sollte keine Inaktivierung oder Denaturierung der Enzyme erfolgen. Deshalb muss eine längere Einwirkung von erhöhten Temperaturen oder denaturierenden organischen Lösungsmitteln vermieden werden.

(2) Die Liposome sollen ausreichend gross sein, um eine Enzymaktivität zu inkorporieren. Strukturen, die weniger als 50 bis 100ÂX10"10 m Durchmesser haben, können nur einige wenige Enzymmoleküle einkapseln und sind deshalb in den meisten Fällen nicht bevorzugt.

(3) Die liposomische Doppelschicht soll stabil und verhältnismässig undurchdringlich sein. Von KitigawaT. und

Inoue K., Nature 254,254-6 ( 1975), wurde gezeigt, dass durch die Inkorporierung von Lipiden der Klasse I, wie Sterolen, eine Kondensierung der Zwischenschicht erfolgt mit einer sich daraus ergebenden grösseren Härte und Stabilität, die einer durch Komplement hervorgerufenen Lysis zugänglicher sind.

Bei der Herstellung von Liposomen ist es erforderlich, dass Lipide, wie solche der Klasse II, die wasserunlöslich sind, in eine wässrige Umgebung eingeführt werden. Dies kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden.

Nach einem bekannten Verfahren werden Lipide physikalisch in einer wässrigen Lösung dispergiert. Ein trockener, dünner Lipidfilm wird auf die innere Oberfläche eines geeigneten Gefässes aufgebracht. Die wässrige Lösung, welche die in die Liposome einzuschliessenden Substanzen enthält, wird dann in das Gefäss eingebracht und kommt in Kontakt mit dem Lipidfilm. Der Lipidfilm wird dann durch kräftiges Rühren in dem Gefäss (Glasperlen von ungefähr 0,1 mm Durchmesser können zur Beschleunigung der Dispergierung zugegeben werden) in der wässrigen Lösung dispergiert. Die Dispergierung des Lipidfilms kann auch durch Beschallen durch Eintauchen eines Beschallers in das Gefäss oder durch Einführen einer Sonde eines Beschallers in die wässrige Lösung beschleunigt werden. Eine zu starke Beschallung kann das Enzym inaktivieren und kann sehr kleine Liposome bilden.

Alternativ können die Lipide in einer wässrigen Lösung, die ein Detergenslipid der Klasse IIIA oder HIB, wie Lauryl-sulfat oder Natriumdesoxycholat, enthält, gelöst werden. Das Detergens wird dann entfernt (z.B. durch Dialyse), und es bildet sich die Liposom-Doppelschicht. Enoch und Strittmatter (Proc. Nat. Acad. Sei. 76,145-149) haben die Herstellung von Einzel-Doppelschicht-Liposomen unter Verwendung von Natriumdoxycholat als Detergens, das dann dialy-siert wurde, mit einer Grösse von 1000 x 10-10 m Durchmesser beschrieben.

Nach einem anderen bekannten Verfahren gibt man eine wässrige Lösung zu einem Gemisch aus einem Lipid und einem flüssigen organischen Lösungsmittel und entfernt das Lösungsmittel anschliessend durch Verdampfen unter vermindertem Druck. Szoka und Papahadjopoulos (Proc. Nat. Acad. Sei. 75,4194-4198,1978) haben die Herstellung von Liposomen mit sehr grossem inneren, wässrigen Raum durch Verdampfen von organischen Lösungsmitteln, wie Diethyl-ether oder Isopropylether, beschrieben.

Die physikalischen und Detergensdialyseverfahren sind für die vorliegende Erfindung besonders geeignet, weil diese leicht grosse Bläschen bilden und sehr milde ablaufen und dadurch die Enzyme nicht leicht inaktiviert werden. Wendet man das Verdampfen von organischen Lösungsmitteln an, so ist es erforderlich, dass das zu maskierende Enzym gegenüber dem Lösungsmittel unempfindlich ist. Beispielsweise kann man Bläschen dieser Art herstellen, die Alkaliphosphatase enthalten, denn ein solches Enzym wird nicht durch Diethyl-ether, wie er bei diesem Verfahren verwendet wird, denaturiert.

Für das erfindungsgemässe Verfahren geeignete Enzyme sind alle solche, die niedrige Geräuschniveaus ergeben. Eine grosse Anzahl bekannter Enzyme kann für die Erfindung verwendet werden. Diese variieren erheblich hinsichtlich ihrer Substrate, der Natur der zu katalysierenden Reaktion, der Stabilität, hinsichtlich des Umsatzes und der optimalen Reaktionsbedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur) und dergleichen. Die International Union of Biochemists hat verschiedene Enzyme nach der Natur der zu katalysierenden Reaktion klassifiziert.

Es gibt eine Anzahl von Kriterien, die man bei der Auswahl eines gegebenen Enzyms für die praktische Anwendung

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beachten muss. Solche Enzyme, die derzeit zur Verfügung stehen, jedoch nur in Spurenmengen, sind weniger wünschenswert als solche, die in grossen Mengen vorkommen und die im Handel erhältlich sind. Das Enzym sollte bei Temperaturen, wie sie üblicherweise in technischen Anlagen vorherrschen, z.B. bei 4°C, während wenigstens etwa 3 Monaten stabil sein. Die katalytische Aktivität oder die Umsatzzahl des Enzyms soll ausreichend hoch sein, um eine nachweisbare Reaktion innerhalb einer kurzen Zeit zu ergeben, d.h. innerhalb weniger Sekunden bis zu 120 Minuten. Die katalytische Aktivität des Enzyms sollte leicht für den praktischen Verwerter nachweisbar sein, d.h. dass die katalysierte Reaktion z.B. eine Erhöhung oder Erniedrigung der Lichtabsorption im Ultraviolettbereich oder im sichtbaren Bereich, d.h. im Bereich von 250 bis 750 nm, bewirken soll.

Vorzugsweise soll das Enzym ein solches sein, das nicht in erheblichen Mengen in der zu prüfenden Probe vorhanden ist und das nicht durch solche Substanzen, wie sie üblicherweise in den Proben gefunden werden, inhibiert wird.

Das Enzym sollte nicht durch die bei der Liposomherstel-lung verwendeten Lipide inaktiviert werden, noch während der Liposomherstellung inaktiviert oder denaturiert werden. Das auszuwählende Enzym soll ein solches sein, das vollständig maskiert werden kann. Solche Enzyme werden in der Natur in dem zellulären Cytoplasma gefunden oder zirkulieren frei in extrazellulären Flüssigkeiten. Nicht wünschenswert sind die natürlichen Membranproteine. Diese werden in der Natur zusammen mit zellulären Membranen gefunden und haben eine oder mehrere hydrophobe Oberflächen, durch welche sie an die Doppelschicht (bilayer) verankert werden. Sehr häufig überbrücken solche Enzyme die Doppelschicht, wobei deren katalytische Stellen dem umgebenden wässrigen Medium ausgesetzt sind.

In der nachfolgenden Aufstellung werden Enzyme von besonderem Interesse, die nach der International Union of Biochemists klassifiziert worden sind, genannt:

1. Oxidoreduktasen

1.1 wirken auf die CH-OH-Gruppe eines Donors,

1.1.1. mit NAD oder NADP als Akzeptor.

1. Alkoholdehydrogenase 6. Glyzerindehydrogenase

26. Dioxalatreduktase

27. L-Lactatdehydrogenase 37. Malatdehydrogenase

49. Glukose-6-phosphatdehydrogenase 17. Mannit- 1-phosphatdehydrogenase

1.1.2. mit Cytochrom als Akzeptor

3. L-Lactatdehydrogenase

1.1.3. mit O2 als Akzeptor

4. Glukoseoxidase 9. Galaktoseoxidase

1.2. wirken auf die CH-NH2-Gruppe des Donors,

1.4.3. mit O2 als Akzeptor

2. L-Aminosäureoxidase

3. Deaminosäureoxidase

1.6. wirken auf reduziertes NAD oder NADP als Donor 1.6.99 mit anderen Akzeptordiaphorasen

1.10. wirken auf Diphenole und ähnliche Substanzen als Donor,

1.10.3 .mit O2 als Akzeptor 1. Polyphenoloxidase 3. Ascorbatoxidase

1.11. wirken auf H2O2 als Akzeptor 1.11.1.

6. Katalase

7. Peroxidase

3. Hydrolasen

3.1. wirken auf Esterbindungen 3.1.1. Carbonsäureesterhydrolasen

7. Cholinesterase

3.1.3. Phosphormonoesterhydrolase 1. Alkaliphosphatase

3.1.4. Phosphordiesterhydrolase

3. Phospholipase C

3.2. wirken auf Glykosylverbindungen

3.2.1. Glykosidhydrolasen 1. a-Amylase

4. Zellulase 17. Lysozym

23. ß-Galaktosidase 27. Amyloglukosidase 31. ß-Glukuronidase

3.4. wirken auf Peptidbindungen

3.4.2. Peptidyl-aminosäurehydrolase 1. Carboxypeptidase A

3.4.4. Peptidyl-peptidhydrolase

5. a-Chymotrypsin 10. Papain

3.5. wirken auf C-N-Bindungen, die keine Peptidbindungen sind

3.5.1. in linearen Amiden 5. Urease

3.6. wirken auf Säureanhydridbindungen

3.6.1. in Phosphoryl enthaltenden Anhydriden 1. anorganische Pyrophosphatase

4. Lyasen

4.1. Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen

4.1.2. Aldehydlyasen 7. Aldolase

4.2. Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen 4.2.1. Hydrolasen

1. Karbon-anhydrase

4.3. Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen 4.3.1. Ammoniumlyasen

3. Histidase

Für die Erfindung geeignete Substrate sind solche, die mit dem ausgewählten Enzym reaktiv sind und schliessen beispielsweise ein p-Nitrophenylphosphat und 4-Methylumbelli-ferylphosphat für Alkaliphosphatase; 4-Aminosalicylsäure oder o-Dianisidin und Wasserstoffperoxid für Peroxidase ; und 0- oder p-Nitrophenylglykoside für Glykosidasen. Weitere geeignete Substrate sind solche, wie sie von Bergmeyer, Methods for Encymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965, beschrieben werden. Nicht wünschenswert sind solche Substrate, die leicht durch die intakte Membran-Doppelschicht diffundieren. Im allgemeinen sind solche Substrate kleine Moleküle, die in Lipidlösungsmitteln löslich sind.

Antigene, die zu prüfen sind oder die als Markierung für die Liposome für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind zahlreich vorhanden. Es gibt eine Reihe von Antigenen, deren quantitative Feststellung bei der klinischen Diagnostik von Bedeutung ist. Viele von diesen werden derzeit durch Radioisotopenmethoden nachgewiesen. Nachweise für solche Antigene nach dem erfindungsgemässen Verfahren würden eine beachtliche Verbesserung bedeuten, weil gefährliche und instabile Reagentien nicht verwendet werden müssen.

Die vorliegende Erfindung kann mit Vorteil für den Nachweis und für die Bestimmung von zirkulierenden Hormonen als Indikatoren für endokrine Funktionen verwendet werden. Eine nur teilweise Aufzählung solcher Produkte schliesst folgende ein:

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Thyroidhormone - Thyroxin und Trijodothyoinin, p-Thyroidhormonund Calcitonin.

Pancreashormone- Insulin, Proinsulin und Glukagon.

Hypophysenhormone - Prolaktin, adrenocortiocotropes Hormon, Tyrotropin, Oxytocin und Vasopressin.

Uterus- und Plazentahormone - chorionisches Gonadotropin, Plazentalactogene, chorionisches Thyrotropin und Relaxin.

Steroidhormone - Östradiol, Östron, Östriol, Testosteron und Dihydrotestosteron.

Wachstumsfaktoren - Urogastron, Nervenwachstums-faktor und Somatomedine.

Das Verfahren ist geeignet für intrazelluläre Boten, zyklische Nukleotide und Prostaglandine.

Die Erfindung ist auch anwendbar zum Screening von zirkulierenden Mengen an therapeutischen Arzneimitteln, z.B. von Herzglykosiden, Digoxin, Digitoxin, Antikonvulsantien, Diphenylhydantoin, Mesantoin, Phénobarbital und Mepho-barbital. Von besonderem Interesse sind solche Arzneimittel, die einen engen therapeutischen Index haben, d.h. bei denen ein gewisses minimales zirkulierendes Niveau erforderlich ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen, während etwas höhere Niveaus toxische oder schädliche Reaktionen hervorrufen.

Das Verfahren kann auch für das Screening von Antibiotika, wie Penicillin, Streptomycin und Tetracyclinen, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin sowie Tetracyclin, Chloramphe-nicol, Erytromycin, Caromycin und Polymyxin B angewendet werden. Die aminoglykosidischen Antibiotika Gentamycin, Amikacin, Tobramycin, Kanamycin und Neo-mycin, die zum Bekämpfen von aeroben gram-negativen Bazilleninfektionen verwendet werden, können durch die vorliegende Erfindung leicht untersucht werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch zum Nachweis und für die Bestimmung von schädlichen Drogen, wie den Opiaten Morphin, Heroin, Meperidin und Methadon, Mutterkornalkaloiden, wie Lyserginsäurediethylamid, Marihuana, Barbituraten und Kokain und dessen Derivaten, verwendet werden.

Da die vorliegende Erfindung sehr einfach durchzuführen ist und man keine instabilen oder gefährlichen Reagentien benötigt, kann die Untersuchungsmethode in solchen Umgebungen angewendet werden, die schlechter und weniger gut ausgerüstet sind als Diagnoselaboratorien. Die Untersuchungsmethode kann z.B. für die Untersuchung von Nahrungsmitteln und Umweltgiften angewendet werden. Bei der Untersuchung von Nahrungsmitteln sind wichtige Antigene Mycotoxin und natürliche Gifte. Auf diesem Gebiet kommen als Haupttoxine solche in Frage, wie Aflatoxine, Achratoxin, Patulin, Penicillinsäure, Zearelonon;undTri-cothecentoxine, sowie auch toxische Metaboliten, wie Ipo-meameron, die natürlich in Nahrungsmitteln vorkommen. Neben den natürlichen Giftstoffen gibt es eine grosse Anzahl von umweltverseuchenden Substanzen, deren Anwesenheit in Nahrungsmitteln, selbst in Spurenmengen, erhebliche Gefahren für die Menschheit bringen. Dies können Nebenprodukte der Industrie oder Pestizide sein, z.B. polychlorierte Biphenyle, chlorierte Dibenzo-p-dioxine, chlorierte Dibenzo-furane, Heptachlorepoxid, Dieldrin und DDT 1,1'-(2,2,2-Trichlorethyliden)-bis[3-chlorbenzol] ; 1,1, l-Trichlor-2,2-bis-(p-chlorphenyl)-ethan.

Andere gefährliche nahrungsmittelverseuchende Substanzen sind Antibiotika, wie Penicillin, Chloramphenicol und Tetracyclin.

Das Verfahren ist nicht auf kleine Moleküle beschränkt, denn es wurde von Humpfries und McConnell in Proc. Nat. Acad. Sei., 71,1691-1694,1974, gezeigt, dass makromolekulare Antigene, wie Eialbumin, an die Oberfläche von immu-noreaktiven Liposomen gekuppelt werden können. Das heisst, dass die vorliegende Erfindung auch für den Nachweis von makromolekularen Antigenen, wie Plasmaproteinen, hepatitisassoziierten Antigenen und Histokompatibilitäts-Markierungen, geeignet ist.

Zu analysierende Antigene und antigenische Materialien für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind alle solche, die selbst oder mit anderen Produkten Partner-Antikörper bilden und die durch die Immunreaktion nachweisbar sind. Zum Beispiel kann man Digoxin als Antigen ansehen, da es mit einem anderen Material Antikörper bildet, und zwar derart, dass der Antikörper zu Digoxin in einem Versuch verwendet werden kann mit entweder dem Antikörper oder dem als Markierung verwendeten Digoxin, je nachdem, ob man nach dem Digoxin oder dem Partner-Antikörper sucht. Materialien, wie Rinderserumalbumin, Schlüsselloch-Limpet-heomocyanin (key hole limpet heomoeyanin) oder andere makromolekulare Träger werden kovalent an das Digoxin oder ein anderes «Antigen» unter Ausbildung von Antikörpern gekuppelt. Das Wort «Antigen», wie es hier verwendet wird, soll deshalb alle antigenen Materialien ein-schliessen, unabhängig davon, ob sie selbst Antigene sind oder ob sie in Kombination mit anderen Materialien Partner-Antikörper in Lebewesen, wie bei Menschen, Kaninchen, Gänsen, Schafen, Meerschweinchen, Rindern oder anderen Säugetieren, bilden.

Die Erfindung kann angewendet werden, um spezifische Antikörper, die gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Anwesenheit und auch die Menge solcher Antikörper kann als ein Indikator angesehen werden für eine mögliche Immunität gegen zahlreiche Infektionskrankheiten, für bereits durchgemachte Krankheiten oder für eine aktive Infektion.

Beispielsweise kann man durch die vorliegende Erfindung leicht Syphillis-Antikörper (gerichtet gegen Treponema Palladium) nachweisen, da diese Antikörper reaktiv sind gegen Cardiolipin (das aus Rinderherzen extrahiert wird), das leicht in Liposome inkorporiert wird.

Antikörper, die gegen infektiöse Krankheitserreger gerichtet sind - Viren, Bakterien, Parasiten und dergleichen -kann man nachweisen, indem man die oberflächlichen antigenen Marker von solchen auf die Liposomoberfläche kuppelt.

In einigen Fällen wird durch die Gegenwart von Antikörpern, die gegen spezifische Makromoleküle gerichtet sind, eine autoimmune Störung angezeigt - z.B. sind Antikörper, die gegenüber Nukleinsäuren, Polydeoxyribonukleinsäuren und Polyribonukleinsäuren, Kollagen, Gammaglobulinen, Thyroglobulinen, parathyroiden Antigenen, mitochondri-nalen Antigenen und Antigenen der glatten Muskeln reaktiv sind, alle potentielle Indikatoren für Autoimmun-Krank-heiten.

Antikörper werden gebildet durch Einführen von immu-nogenen Substanzen in den Blutstrom eines lebenden Tieres. Das Tier reagiert mit der Bildung von Antikörpern, die sich an das Immunogen in einer ersten Stufe bei der Entgiftung des Immunogens binden. Viele Antigene sind direkt immu-nogen und bewirken direkt eine Antikörperbildung. Eine Reihe von Substanzen ist jedoch nicht selbst immunogen und benötigt eine Modifizierung (Kupplung an einen geeigneten Träger). Verfahren zur Herstellung von Antikörpern werden sehr ausführlich von Landsteiner in «Specifity of Serological Reactions», Dover Publications N.Y. 1962 und von Weir beschrieben.

Ein Komplement (eine Gruppe aus wenigstens neun verschiedenen Proteinen) ist eine Schlüsselverbindung bei der Immunabwehr eines Wirts gegen eindringende zelluläre

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Pathogene. Ist das Komplement einmal aktiviert (aufnahmefähig für die Anwesenheit von zellulären Eindringlingen), bindet es sich an die äussere Membran und verursacht kleine Verletzungen dieser Membran. Tatsächlich kerbt das Komplement kleine Löcher über die gesamte Oberfläche der Membran. Diese Löcher sind sehr klein und in der Grössen-ordnung von 100 x 10~8 cm im Durchmesser. Sehr kleine Moleküle, wie Wasser oder einfache Salze, können leicht durch diese Verletzungen eindringen. Makromoleküle, wie Proteine, sind im allgemeinen von der gleichen Grösse oder grösser wie diese Läsionen - 40 bis 250 x 10-10 m - so dass Makromoleküle nicht durch diese Läsionen diffundieren können oder nur ausserordentlich langsam, wie Green H., Barrow P. und Goldberg B, (1956) in J. Exp. Med. 110, 699 beschreiben. Bei der vorliegenden Erfindung ermöglicht das verwendete Komplement eine Antigen-Antikörper-Reak-tion, durch welche wirksam Löcher in die das Liposom einkapselnde Schicht gebohrt werden. Man nimmt an, dass dadurch das Substrat in die Liposom-Doppelschicht eindringen kann und mit dem dort befindlichen Enzym reagiert. Dadurch tritt dann eine enzymatische Reaktion ein, und zwar auch, wenn keine vollständige Auflösung der Doppelschicht stattfindet. Das Komplement ermöglicht die Umsetzung entweder, indem es die Auflösung unterstützt oder indem es wirksam Löcher bildet, durch welche die Reaktion, ohne dass eine Auflösung (Lysis) stattfindet, abläuft. Der Ausdruck «Auflösung» bzw. «Lysis» bedeutet den Zusammenbruch oder das vollständige Aufreissen der Liposom-Doppelschicht und auch das Freilegen des eingekapselten Enzyms gegenüber Substrat durch Löcher, die in der Doppelschicht durch die Immunreaktion gebildet wurden.

Ein typischer Test-Satz zum Nachweis von Antigen enthält ein Fläschchen mit Liposomen, die mit einem Antigen markiert sind und durch die ein Enzym maskiert ist und die in einem geeigneten Puffer suspendiert sind. z.B. in einem Volumen von 0,1 bis 10 ml. Die Konzentration des Liposoms in dem Puffer liegt im allgemeinen zwischen etwa 1 und 50 mMol. Geeignete Puffer sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder andere isotonische Puffer. Ein zweites Fläschchen enthält in Form eines lyophilisierten Pulvers oder eines gefrorenen Konzentrats den Partner-Antikörper zu dem Antigen. In dem Fall, wo der Antikörper durch die Direktmethode nachzuweisen ist, würde dieses Fläschchen die positive Kontrolle für die Untersuchung darstellen. Ein drittes Fläschchen enthält lyophilisiertes Pulver oder gefrorenes Konzentrat von Komplement. Übliches Komplement für den zu bildenden Antigen-Antikörper-Komplex, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, wird verwendet. Ein solches Komplement kann z.B. Meerschweinchenserum sein. Ein weiteres Fläschchen enthält das Enzymsubstrat, das flüssig oder pulverförmig oder in einer anderen Form vorliegen kann, und zwar in einer ausreichenden Konzentration, um leicht eine enzymatische Aktivität nachzuweisen, wenn das Enzym, das in dem Liposom enthalten ist, freigegeben wird. Ein weiteres Fläschchen kann einen Puffer enthalten, den man verwendet, um die Materialien während des erfindungsgemässen Tests zu verdünnen.

Im einfachsten Falle und bei dem am meisten bevorzugten Test werden alle Materialien einschliesslich dem Substrat in eine einzige Flasche gegeben, inkubiert und eine Farbänderung oder die Abwesenheit einer Farbänderung wird festgestellt, um zu bestimmen, ob das zu untersuchende Material, das z.B. das Serum eines Individuums sein kann, ein spezifisches Antigen oder einen spezifischen Antikörper enthält oder nicht. In einigen Fällen werden alle Materialien mit Ausnahme des Substrats in eine einzige Flasche gegeben, inkubiert und dann mit den Enzymsubstraten vermischt, und eine Farbänderung oder die Abwesenheit einer Farbänderung wird festgestellt für die Untersuchung, ob das Testmaterial, das z.B. das Serum eines Individuums sein kann, ein spezifisches Antigen oder einen spezifischen Antikörper enthält oder nicht. Besonders geeignete Enzyme sind Alkaliphosphatase und Peroxidase, weil deren Reaktion mit p-Nitrophenyl-phosphat und 4-Aminosalicylsäure Farbreaktionen ergeben, die mit dem Auge leicht erkennbar sind.

In solchen Fällen, wo eine Inhibierung von Komplement-lysis für eine analytische Quantifizierung verwendet wird, liegen gewisse Begrenzungen in der Zugabereihenfolge vor. Dies beruht auf der Tatsache, dass in dem Moment, in dem Liposome, die Antigen oder Antikörper enthalten, Komplement und der Partnerantikörper oder das Partnerantigen zusammengebracht werden, eine Lysis eintritt. Für Zwecke einer genauen Quantifizierung wird es vorgezogen, dass die zu untersuchende Probe in das Fläschchen gegeben wird, bevor das Komplement wirken kann. Eine vernünftige Reihenfolge in der Zugabe würde dann folgende sein: (1) Antikörper, (2) Liposome, (3) Probe, (4) Komplement. Die Zugaben (1), (2) und (4) können variieren, aber die Probe wird immer zugegeben, bevor Antikörper, Komplement und Liposome miteinander vereint werden.

In allen Fällen zieht man es vor, einen bekannten positiven Test als Vergleichstest durchzuführen. Wenn z.B. der Test ein Test für Digoxin ist, so wird eine Ampulle mit einem Standarddigoxin in den Test-Satz eingeschlossen. Wenn die Untersuchung eine quantitative und eine qualitative Untersuchung beinhaltet, dann kann der Test-Satz eine Reihe Proben des zu untersuchenden Materials in verschiedenen Konzentrationen enthalten, so dass eine Farbänderung, sofern eine auftritt, in der Testprobe verglichen werden kann mit der Farbänderung oder einer anderen enzymati-schen Aktivität bei jeder Standardprobe, sofern man die Standards zusammen mit der zu untersuchenden Probe in einem Analysenverfahren untersucht.

Die Bestimmung der Enzymaktivität ist für eine grosse Anzahl von Enzymen bekannt. Solche bekannten Tests können zur Überwachung der Enzymaktivität im Anschluss an die erfindungsgemässe Untersuchung durchgeführt werden. Eine Liste von Untersuchungsmethoden wird für viele Versuche von Bergmeyer in Methods for Enzymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965, beschrieben. Die besonders bevorzugten dieser Untersuchungsmethoden sind solche, bei denen entweder eine hohe Empfindlichkeit vorliegt oder die eine besonders einfache Verpackung ermöglichen.

Zur Bestimmung der Aktivität von Malatdehydrogenase (E.C. 1.1.1.40) wird das Enzym z.B. mit den Substraten L-Apfelsäure und Nikotinamidadenindinukleotid umgesetzt, und das Fortschreiten der Umsetzung wird bei 340 nm z.B. in folgender Weise überwacht.

In Küvetten wird folgendes eingefüllt:

Test Kontrolle

Phosphatpuffer

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2,7 ml

NADH2

0,2 ml

Enzym (verdünnt)

0,1

ml

0,1 ml

Substrat

0,1

ml

—

Enzym: verdünnt mit 0,1-m-Phosphatpuffer, pH 7,4, auf eine Konzentration von 0,1 bis 0,3 Einheiten/ml.

Substrat:0,006-m-0xaloacetat (frisch zubereitet). Man löst 6,7 mg der Säure in 1 ml Phosphatpuffer (1,0-m, pH 7,4), titriert mit NaOH bis zum pH 7,4 und füllt auf ein Volumen von 10 ml auf.

NADH2:0,00375-m. Man verdünnt 50 mg NADH2 und 240

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mg THAM in 15 ml H2O, titriert in HCl auf pH 7,4 und füllt das Volumen auf 20 ml auf.

Phosphatpuffer: 0,1-m, pH 7,4

Vor der Zugabe des Substrats wird das Instrument mit einer Kontrollküvette bei einer Absorption von 0,200 geeicht. Ablesungen werden in 15-Sekunden-Intervallen während 2 Minuten vorgenommen, und die Anfangsgeschwindigkeit der Veränderung der Absorption pro Minute wird bestimmt.

Dieses Enzym hat eine sehr hohe Durchlaufzeit und ergibt deshalb hochempfindliche Untersuchungsergebnisse.

Viele andere Enzymuntersuchungen könnten ausgewählt werden, weil sie sich für geeignete Untersuchungsformen oder Substratverpackungen eignen. Dazu gehören: Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1.). Das synthetische Substrat p-Nitrophenylphosphat wird z.B. verwendet und kann leicht in Kapselform verpackt werden. Man kann wie folgt vorgehen:

Man pipettiert 3,0 ml des Substrats in jeweils zwei 1-cm-Küvetten. Dann wird das Spektrophotometer auf eine Null-Absorption bei 410 mji eingestellt.

Enzym: verdünnt mit Wasser auf annähernd 0,005 mg/ml mg/ml = A278X 1,43 (Plocke et al., 1962),

Substrat: 0,001-m-p-Nitrophenylphosphat in 1,0-m-Tris-Puffer, pH 8,0.

Zur Zeit Null gibt man 0,1 ml der Enzymlösung in die Test-küvette und zeichnet die Absorptionsänderung auf. Der molare Absorptionsindex für p-Nitrophenol in 1,0-m-Tris-Puffer, pH 8,0, ist l,62x 104. Eine Einheit ist die Aktivität, die 1 Mikromol p-Nitrophenol pro Minute unter den angegebenen Bedingungen bei 25°C freigibt. Bei dieser Reaktion wird ein gelbgefärbtes Produkt gebildet, das durch direkte visuelle Untersuchung nachweisbar ist.

Wegen seiner leichten Zugänglichkeit ist auch das Enzym Meerrettichperoxidase (E.C. 1.11.1.7.) geeignet. Eine grosse Anzahl an Substraten und Untersuchungsformen ist für dieses Enzym geeignet. Ein Beispiel dafür ist: Man gibt 0,05 ml eines Farbstoffs zu 6,0 ml Substrat. Man gibt 2,9 ml in eine Testküvette und giesst den Rest in eine Kontrollküvette. Zur Zeit Null gibt man 0,1-ml des verdünnten Enzyms hinzu. Dann füllt man das Enzym in die Küvette aus einer 0,1-ml-Pipette mit der Spitze unter die Oberfläche ein. Dann schüttelt man, indem man die Küvette mit Wachspapier abdeckt und umdreht. Die Absorption wird in 15-Sekunden-Intervallen während 1 bis 2 Minuten aufgezeichnet, und der Grad der Änderung pro Minute wird bestimmt.

Substrat: Vorratslösung: 1 ml 30%iges H2O2 (Merck's Super-oxol) verdünnt mit 100 ml H2O. Für den Gebrauch verdünnt man 1 ml der H2Ch-Vorratslösung auf 100 ml mit 0,1-m-Phos-phatpuffer, pH 6,0 (wird täglich frisch zubereitet).

Farbstoff: 1% o-Dianisidin in Methylalkohol (frisch in einer braunen Flasche).

Enzym: Vorratslösung: 1 mg/ml in Wasser. Unmittelbar vor der Verwendung verdünnt man 0,1 ml auf 250 ml.

Eine Einheit Peroxidaseaktivität ist die Menge an Enzym, die ein Mikromol Peroxid pro Minute bei 25°C zersetzt.

Damit die Liposome in Immunoassays wirksam sind, ist es erforderlich, dass man sie sensibilisiert und an ihrer Oberfläche mit geeigneten Antigenen markiert. Antigene können kovalent gebunden sein oder liegen in anderen Formen an der Oberfläche von vorgebildeten Liposomen vor. Alternativ kann das Antigenkovalent an eine geeignete amphiphile Substanz gebunden sein, und dieser Komplex wird in das Lipid-gemisch, aus dem sich die Liposome bilden, gegeben. Im letzteren Fall wird die amphiphile Substanz in eine Lipid-Dop-pelschicht inkorporiert, und das daran haftende Antigen erstreckt sich in die umgebende wässrige Lösung.

Werden Liposome vorgebildet, so können sie an ihrer äusseren Oberfläche verschiedene chemische Funktionen aufweisen, mittels welcher die Antigene kovalent gebunden werden können. Die wichtigsten solcher Funktionalitäten sind: Aminogruppen aus Phosphatidylethanolamin, Hydroxylgruppen aus Phosphatidylinosit, sowie Carboxylgruppen, die sich von Fettsäuren oder Phosphatidylserin ableiten. Dies sind genau die Funktionalitäten, die an Proteinen zur Verfügung stehen und die man beim Kuppeln von kleinen Antigenen unter Ausbildung von Immunogenen ausnützt. Man kann somit die Antigene an vorgebildete Liposome durch traditionelle chemische Reaktionen unter Verwendung von bifunktionellen Kupplungsmitteln kuppeln, z.B. von Kupplungsmitteln, wie Glutaraldehyd, Diimidestern, aromatischen und aliphatischen Diisocyanaten, Bis-p-nitrophenyl-estern von Dicarbonsäuren, aromatischen Disulfonylchlo-riden und bifunktionellen Arylhalogeniden, wie l,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzol;p,p'-Difluoro-m,m'-dinitro-diphenylsulfon. Geeignete Reaktionen, die man bei solchen Kupplungen anwenden kann, werden von Williams et al. in Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. 1, Aca-demic Press, New York, 1967, beschrieben.

In einigen Fällen kann man Antigene auf den Liposom-oberflächen adsorbieren. Dies ist bei gewissen Lipopoly-sacchariden der Fall, wie Uemura und Kinsky gezeigt haben (Biochemistry 11,4085-4094,1972). Dabei erhält man auch Antigene, die mit amphiphilem Lysolecithin der Klasse III gekuppelt sind.

Die Tatsache, dass man ein Antigen zuerst an ein ausgewähltes Amphiphilin, z.B. ein Phosphatidylethanolamin, -serin oder -inosit binden kann und dann zu der Lipidmi-schung gibt, aus welcher die Liposome gebildet werden, ist insofern äusserst bedeutungsvoll, als diese Kupplungsreaktion in einer Vielzahl von Lösungsmitteln durchgeführt werden kann. Beim Kuppeln von Antigenen an vorgeformte Liposome oder an Proteine (wie bei der Herstellung von Antigen) muss die Umsetzung immer in wässrigen Lösungen durchgeführt werden, weil organische Lösungsmittel die Proteine oder Liposome denaturieren oder zerstören. Wenn man z.B. ein einen Carboxylrest enthaltendes Antigen kuppeln möchte, so kann man das Säurechlorid des Antigens unter Verwendung von Thionylchlorid herstellen. Dieses Säurechlorid kann man dann an Phosphatidylethanolamin in Benzol als Lösungsmittel kuppeln. Diese Flexibilität bei der Auswahl des Lösungsmittels ermöglicht es, dass man einen breiten Bereich von Antigenen an Liposome kuppeln kann.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Zur Herstellung von immunoreaktiven Liposomen, die an ihrer Oberfläche mit Dinitrophenylgruppen markiert sind, stellt man eine Mischung, enthaltend 40 mg L-a-Lecithin (Produkt Nr. P5763, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), 11,6 mg Cholesterin (Produkt Nr. CH-S, Sigma Chemical Co. lot. 57C - 7190), 2,18 mg Dicetylphosphat (Produkt Nr. D 2631 Sigma Chemical Co. lot 28 [0460]) und 2 mg N-Dinitrophenylaminocaproylphosphatidylethanolamin (Avanti Biochemicals of Birmingham, Alabama, lot DCPE 17) in 6 ml Chloroform her. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) in einem 50-ml-Kolben über einem Drehverdampfer unter Bildung eines dünnen Filmes des trockenen Lipids an der Innenoberfläche des Kolbens verdampft. Um eine vollständige Entfernung des Lösungsmittels sicherzustellen, wird das Verdampfen 30 Minuten bis zu dem Punkt fortgesetzt, bei dem der Lipidfilm sichtbar trocken ist. In den Kolben gibt man dann eine Lösung aus 4 mg Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1.) in 4 ml

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0,01M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,3M Glukose, und spült den Kolben mit Argon und versiegelt ihn dann. Der versiegelte Kolben wird zum Dispergieren des Lipid-films vorsichtig geschüttelt. Der Lipidfilm verschwindet langsam von der Oberfläche des Kolbens und die wässrige Phase wird sichtbar trübe. Zu diesem Zeitpunkt wird der Kolben 2 Stunden bei 4°C gehalten. Liposome, die eingefangene Alkaliphosphatase enthalten, werden dann aus dem Enzym durch Zentrifugieren mit 27 000 G während 60 Minuten freigesetzt. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und das Granulat, welches die Liposome enthält, wird in einer isotonischen Kochsalzpufferlösung (0,01M Phosphat, pH 7,5, enthaltend 0,15M Natriumchlorid) wieder suspendiert. Eine weitere Reinigung kann man durch wiederholtes Zentrifugieren und Resuspendieren erreichen.

Das Ausmass, in dem das Enzym innerhalb solcher Liposome eingekapselt ist, wird durch die Detergenzlysisuntersu-chung bestimmt. In Gegenwart des Detergenz Triton X-100, ein Produkt der Rohm & Haas Co., werden die Liposome aufgerissen und der Inhalt freigesetzt. Ein 10 jil Aliquot der gereinigten Liposome wird zu 1 ml von l%igem Triton X-100 in entionisiertem Wasser gegeben. Zur Kontrolle werden 10 (il der Liposome zu 1 ml isotonischer Kochsalzlösung gegeben. Das Enzym wird dann gemessen, indem man 50 bis 100 |i,l Aliquote dieser Verdünnungen zu 1 ml einer Lösung aus 0,4 mg/ml eines Substrates, nämlich p-Nitrophenylpho-sphat in 0,1M Borat bei pH 9,0 gibt. Die Hydrolyse des Substrates wird durch das Auftreten von p-Nitrophenol und eine zunehmende Lichtabsorption bei 410 nm überwacht. Man lässt die Reaktion während 10 Minuten ablaufen und beendet sie dann durch Zugabe von 1 ml 2N NaOH. Die durch die Detergenzlysis verursachte Enzymaktivität wird dann mit einer Kontrolle verglichen, zum Messen der Signal-zu-Geräusch-Charakteristik der Liposome. Für die vorerwähnte Zubereitung beträgt dieses Verhältnis mehr als 150, d.h. dass die Absorptionszunahme, die im Laufe von 10 Minuten durch das mittels des Detergenz gelösten Liposoms, 1,5 betrug, wobei die Kontrolle weniger als 0,01 Einheiten an Absorptionszunahme ergab.

In nachfolgenden Versuchen wurden ähnliche Liposome durch Gelfiltrationschromatografie anstelle durch Zentrifugieren gereinigt. 3 ml der Liposomzubereitung wurden auf eine Säule von 40 x 1 cm von Sephadex G-200, die mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, geschickt. Die Liposome wurden dann aus der Säule nach einem Leervolumen (annähernd 50 ml) eluiert und waren gut getrennt von dem freien Enzym, das bei 30 ml zum Vorschein kam.

Beispiel 2

Liposome werden durch eine Detergenzdialysemethode hergestellt. Ein Trockenfilm aus einem Gemisch aus 50 mg Eilecithin, 3,5 mg Cholesterin und 0,5 mg Dinitrophenylaminocaproylphosphatidylethanolamin in Chloroform wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Zu diesem Film wurden 5,5 ml einer Lösung gegeben, die 1 mg/ml Alkaliphosphatase in 0,05M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt und zusammen mit der Zugabe wurden auch 3,6 ml 10 mM Natriumdeoxycholat in Wasser gegeben. Der dieses Gemisch enthaltende Kolben wurde in ein Sonicatorbad während 5 Minuten bei 35°C eingetaucht und unter Argon beschallt. Man erhielt eine transparente opaleszierende Suspension. Das Deoxycholatdetergenz wurde durch Diafiltration unter Verwendung von Millipore-Immersible-Sepa-rator entfernt. 30 Volumina von 0,05M Phosphat, pH 7,5, wurden in die Suspension ausgetauscht unter Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens von 9,1 ml. Die Liposome wurden weiter durch Gelfiltrationschromatografie gemäss Beispiel 1 gereinigt. In diesem Fall erhielt man ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von 225.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird versucht zu zeigen, dass mit geeignet zubereiteten Liposomen Antikörper, die gegen ein spezifisches Antigen gerichtet sind, durch Freigeben von Enzymaktivität gleichzeitig mit einer immunospezifischen Lysis auftritt, nachgewiesen werden können. Multilamellare Bläschen wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt und mit N-Dinitrophenylamincaprylphosphatidyl-ethanolamin (5%ige Lecithinkonzentration) markiert. 5 jj.1 davon wurden mit 100 jj.1 Komplement (Meerschweinchenserum), 345 (il Puffer aus 50 mM tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7,5, enthaltend 0,15 Mol Natriumchlorid, 0,15 mM Kalziumchlorid und 0,5 mM Magnesiumchlorid, sowie mit 50 (j,l verschiedener Verdünnungen von Kaninchenantiserum bis zu dinitrophenyliertem Rinderserumalbumin vermischt. Als Kontrollen wurden Gemische eingeschlossen, bei denen normales Kaninchenserum durch Immunserum ersetzt worden war. Als weitere Kontrolle wurden Mischungen hergestellt, bei denen das Komplement durch Inkubieren bei 56°C während 30 Minuten inaktiviert worden war. Diese Mischungen wurden 15 Minuten bei 25°C inkubiert und dann wurden 100 jil Aliquote entfernt und zu den Röhrchen gegeben, die 1 ml einer Lösung aus 0,4 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1 M Natriumborat, pH 9,0, enthielten. Diese Röhrchen wurden 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Phosphatasereaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 2M Natriumhydroxid beendet. Die Absorption von verschiedenen Röhrchen bei 410 nm wurde dann spektrophoto-metrisch festgestellt. Je grösser die Absorption ist, um so grösser ist die Menge an freigegebener Phosphatase und um so grösser ist das Ausmass der immunospezifischen Lysis.

Gemisch Absorption bei 410 nm

Kontrolle:

Mischung enthaltend nichtimmunes 0,01 (normales) Kaninchenserum

Kontrolle:

Mischung enthaltend wärmeinaktiviertes 0,01 (normales) Kaninchenserum

Testmischung enthaltend Antiserum 1,2

gegenüber dinitrophenyliertem Rinderserumalbumin

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die immunospezifische Lysis von Liposomen zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von spezifischen Antikörpern verwendet. Alle Bedingungen sind identisch mit denen in Beispiel 3, aber es wurden verschiedene Verdünnungen von DNP-BSA-Antiserum verwendet, um die Wirkung der unterschiedlichen Antikörperkonzentration auf das Ausmass der durch das Komplement hervorgerufenen Lysis zu bestimmen.

Das Ausmass der Absorptionszunahme bei 410 nm in 5 Minuten wurde mit verschiedenen Verdünnungen untersucht und aufgezeichnet:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

659 136

12

Antiserumverdünnung

410 nm

1:50

1,5

1:75

1,4

1:100

1,15

1:200

0,65

1:300

0,30

Man kann somit diese Methode verwenden, um spezifische Antikörperniveaus zu bestimmen.

Beispiel 5

Um festzustellen, ob Antigen durch eine komplementbewirkte Lysis inhibiert wird und ob eine solche Inhibierung zur quantitativen Bestimmung von Antigenmengen in einer Testprobe verwendet werden kann, wurde die Verfahrensweise gemäss Beispiel 3 modifiziert und 50 jo.1 von DNP-Lysin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu dem anfänglichen Inkubierungsgemisch gegeben. Wenn man eine Absorptionszunahme bei 410 nm in Abwesenheit von freiem DNP-Lysin als 100%ige Lysis festlegt, dann wurden mit unterschiedlichen Mengen an freiem Antigen die folgenden Prozentsätze einer Lysis festgestellt:

In ein einzelnes Reagenzglas wurden 2 Mikroliter dieser Liposome (20 Nanomol Phospholipid), 100 Mikroliter Meerschweinchenkomplement (verdünnt 1,8 in Komplementlysis-puffer), 50 Mikroliter Kaninchenantiserum gegenüber DNP, 100 Mikroliter Puffer oder Standardlösung und 1 ml Phos-phatasesubstrat gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann wurde zur Beendigung der Enzymreaktion 1 ml 0,5N Natriumhydroxid zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde spektrophotometrisch gemessen. Das Ausmass, in dem die Reaktion von der Menge an DNP-Lysin abhängig war, wird nachfolgend gezeigt:

15

20

Menge von DNP-Lysin (pmol)

Absorption bei 405 nm

0

0,95

2,0

0,902

2,5

0,811

4

0,573

5

0,430

6

0,311

7

0,257

Freies DNP-Lysin (Picomole)

% Lysis

6

83

9

69

13,5

56

18

48

27

33

36

23

In diesem Bereich besteht eine lineare Beziehung zwischen dem Prozentsatz der Lysis und dem Logarithmus der Anti-genkonzentration. Analysiert durch lineare kleinste Quadratregression (linear least squares régression) wird die lineare Beziehung durch folgende Parameter ausgedrückt:

Steigung = 33,3 y-Abschnitt =143 Korrelationskoeffizient = 0,998 50%iges Auftreten bei 16,2 Picomol

Beispiel 6

Eine quantitative Immunoassay wird nach einem Einstufenverfahren durchgeführt, d.h. dass alle Reagentien einschliesslich dem Enzymsubstrat auf einmal zusammengemischt werden, so dass gleichzeitig die lytische und die enzymatische Reaktion stattfinden. Eine solche Einstufenmethode ist in der Praxis einfach durchzuführen und kann auch leicht automatisiert werden.

25 mg L-a-Lecithin-Dipalmitoyl (Calbiochem-Behring Corp., LaJolla, Kalifornien), 8,6 mg Cholesterin (Sigma), 1,6 mg Dicetylphosphat (Sigma) und 1,5 mg Dinitrophenyl-aminocaproylphosphatidylethanolamin (Avanti) wurden in einem Chloroformlösungsmittel vermischt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer entfernt und dabei bildete sich ein dünner Lipidfilm auf der Innenfläche eines 50-ml-Rundkolbens. Dieser Film wurde dann in einer wässrigen Lösung, enthaltend 5 mg Alkaliphosphatase (Sigma) in 3 ml PBS-Dextrosepuffer dispergiert. Dann wurden die Liposome durch Zentrifugieren wie in den vorhergehenden Beispielen isoliert.

25 Trägt man die 405 nm Absorption gegen den Logarithmus der Menge an DNP-Lysin auf, so erhält man eine gerade Linie mit einer Neigung von 66,8, einem Abschnitt (intercept) bei 143 und einen Korrelationskoeffizienten von 0,995. Eine 50%ige Inhibierung der Lysis wird mit 4 pmol DNP-Lysin 30 erzielt.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird eine kinetische quantitative Bestimmung von Liposomen, wie sie in dem vorhergehenden 35 Beispiel beschrieben wurde, zur quantitativen Bestimmung von Antigenen während der Messung des Grades der Enzymreaktion verwendet. In diesem Fall werden die Reagentien in den in Beispiel 6 angegebenen Mengen in einer Spektro-photometerküvette vermischt. Der Zeitverlauf der Enzymre-40 aktion wird dann direkt überwacht. Nach einer typischen Verzögerungsphase nimmt der Grad der Absorptionszunahme bei 405 nm eine lineare Funktion der freien Antikörperkonzentration an. Typischerweise gibt man in eine Spek-trophotometerküvette 0,75 ml Phosphatasesubstratlösung, 50 45 Mikroliter Antikörper, 0,1 ml Komplement und 5 Mikroliter Liposome. Die Küvette wird dann in einen in einem Thermostat befindlichen Spektrophotometer gegeben und die Absorption bei 405 nm wird aufgezeichnet. Eine charakteristische Verzögerungsphase von 2 bis 3 Minuten wird festge-50 stellt, während der sich die Absorption nur wenig verändert. Nach dieser Verzögerung nimmt die Absorption schnell zu. In weniger als 5 Minuten ist der Grad der Erhöhung einer Funktion der Menge an verfügbarem Antikörper.

Proteine und andere Makromoleküle können an Liposome 55 gekuppelt werden. Solche Liposome mit an deren Aussen-oberfläche anhaftenden Proteinen unterliegen einer durch Komplement bewirkten Lysis in Gegenwart von Antikörpern zu den eingebrachten Proteinen. Liposome lassen sich herstellen, die innerhalb der Membran zweischichtige Lipide 60 haben, die geeignet sind zum Kuppeln mit Proteinen und anderen Makromolekülen. Typischer Lipide, wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin oder Phosphatidylinosit wären geeignet.

65 Beispiel 8

Die in Beispiel 1 angewendete Methode wird zur Herstellung von Alkaliphosphatase enthaltenden Liposomen verwendet. In diesem Fall besteht das Lipidgemisch aus 25 mg

Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 mg Phosphatidylethanolamin und 8,6 mg Cholesterin. Diese Liposome werden durch wiederholtes Zentrifugieren gereinigt und danach werden sie in 2 ml 0,1M Boratpuffer von pH 8,5 resuspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 20 Mikroliter 25%igen Glutaraldehyd. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch über Nacht gegen 21 Boratpuffer dialysiert. Die aktivierten Liposome gibt man dann zu 2,4 mg Rinderserumalbumin in 1 ml Boratpuffer. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C inkubiert und anschliessend werden die Liposome mit dem daran befindlichen Protein von ungebundenem Protein durch 30minütiges Zentrifugieren mit 25 000 G abgetrennt. Arbeitet man nach der Bestimmungsmethode gemäss Beispielen 3 und 4 unter Verwendung von Kaninchenantikörper gegenüber Rinderserumalbumin, so kann man eine Immun-lysisuntersuchung vornehmen, durch welche Albumin quantitativ in Mengen von 0,1 bis 2 jxg/1 ml bestimmt werden können.

Beispiel 9

Zur Bestimmung des Herzglykosids wurde Digoxin an Dipalmitoylphosphatidylethanolamin gekuppelt. Zu diesem Endgemisch, enthaltend 0,5 g (0,64 mM) Digoxin in 20 ml Ethanol/Dioxan (4:1 V/V) wurden 60 ml 0,1M Natrium-metaperjodat gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann wurden 4,5 ml Ethylen-glykol zugegeben. Das Gemisch wurde 1/2 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der zurückgebliebene Feststoff wurde dreimal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegeben (Gesamtvolumen 150 ml) und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft,

wobei man 0,9 g eines öligen Rückstandes erhielt. 25 mg dieses Rohproduktes von Digoxindialdehyd in 1 ml Ethanol/ Chloroform (1:4) wurden zu 20 mg Dipalmitoylphosphatidyl-ethanolamin in 1 ml Ethanol/Chloroform (1:2) gegeben. Dann wurden 4 Tropfen Triethylamin zugegeben und das Reaktionsgemisch (pH 9) wurde über Nacht bei 37°C inkü-biert und schliesslich wurde bis zu einem trockenen Rückstand unter vermindertem Druck eingedampft. Dieser Rückstand wurde in 2 ml Ethanol/Chloroform (1:1) suspendiert und dazu wurden 4 mg Natriumborhydrid gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und dann bis zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethanol trituriert und dann filtriert, wobei man ein Filtrat erhielt, aus dem 45 mg des verbundenen Produktes Dipalmitoylphosphatidyl-Phosphatidylethanolamin-Digoxin erhalten wurden.

Beispiel 10

Das verbundene Produkt aus Digoxin und Dipalmitoyl-phosphatidylethanolamin wird zur Herstellung von Liposomen mit Digoxin verwendet. In diesem Fall werden 22 mg Dimyristoylphosphatidylcholin, 8,6 mg Cholesterin, 1,6 mg Dicetylphosphat und 2,5 mg Digoxin-Dipalmitoylphosphat-idylethanolamin-Konjugat in 3 ml Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft, wobei sich die Lipide als dünner Film auf der Innenwand

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eines 100-ml-Rundkolbens absetzen. Dieser Lipidfilm wird dispergiert, wie in Beispiel 1 und gereinigt wie in Beispiel 1.

Untersuchungen wurden wie in Beispiel 6 vorgenommen. Eine Inhibierung durch Digoxin in Proben wurde im Bereich von 0,5 bis 10 ng/ml Digoxin in der Testprobe beobachtet.

Liposome kann man erfolgreich gefrieren, wenn man sie zuerst in einem isotonischen Medium, wie 0,01 M Phosphatpuffer, enthaltend 0,15M Natriumchlorid, suspendiert. Geeignet sind auch Lösungen, die im Bereich von pH 4 bis pH 10 gepuffert sind und 0,3M Glukose oder ähnliche Kohlehydrate enthalten. Diposome, die in einem proteinhaltigen Medium gefroren sind und die beispielsweise Rinderserumalbumin oder Kaninchen-Gammaglobuline enthalten, werden nicht bevorzugt, weil sie erhöhte Niveaus an Enzymaktivität in Abwesenheit von lytischen Reagentien, wie Detergentien oder Komplement plus Antikörper, ergeben. Die besten Ergebnisse erzielt man durch Schnellgefrieren mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 5°C/min. Vor dem Gefrieren werden die Liposome in einem isotonischen Medium in Konzentrationen von 1 bis 10 mg/ml suspendiert. Beispielsweise kann man die Liposome, wie sie in Beispiel 1 hergestellt wurden, in 0,0IM Natriumphosphatpuffer, enthaltend 0,15M Natriumchlorid, suspendieren. Diese Suspension enthält 2,5 mg Gesamtlipid in 1 ml Flüssigkeit. 0,1 ml Aliquote dieser Mischung werden in eine 5-ml-Ampulle gegeben. Sie werden dann auf -20°C mit einer Geschwindigkeit von 5°C/min gefroren. Die Liposome können aufgetaut werden und auch nach längerer Lagerung verwendet werden.

Es sind zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung hier beschrieben worden, aber für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zahlreiche Änderungen möglich sind. Bestimmte Konzentrationen, Kombinationen oder Materialien können variiert werden, solange das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis-Minimum gemäss der Erfindung aufrechterhalten bleibt, um falsche Ablesungen zu verhindern. Eine grosse Anzahl von Materialien kann in einem weiten Bereich von hochvolumigen Nachweisreaktionen durch verhältnismässig unqualifiziertes Personal untersucht werden.

Die zu untersuchenden Materialien können Körperflüssigkeiten oder Mischungen aller Art sein. Wird Serum getestet, so wird es vorzugsweise chemisch behandelt und/oder auch erhitzt, um eine unerwünschte Inhibierung auszuschliessen. Eine vorherige Behandlung mit Aminogruppen stellt eine solche chemische Methode dar. Typischerweise gibt man 0,1 ml von 2,54M Ammoniak zu 1,9 ml Serum zu und neutralisiert dann durch Zugabe von 0,1 ml 2,54M Chlorwasserstoffsäure. Auch Sulfhydryl-Blockungsmittel können brauchbar sein. In diesem Fall gibt man zu 1 ml Serum 0,1 ml 0,2M mercaptoethanolinphosphatgepufferte Kochsalzlösung. Dann gibt man 1 ml 0,2M Jodoacetamid hinzu.

Ähnlich geeignet ist auch der Sulfonsäureazofarbstoff Chlo-razol-Echtrosa, der selektiv eine Humankomplementaktivierung, jedoch nicht Meerschweinchenkomplement inhibiert. Eine Wärmebehandlung von wenigstens 30 bis vorzugsweise 60 Minuten bei etwa 58°C ist gleichfalls geeignet, um eine unerwünschte Inhibierung der Komplementreaktion zu vermeiden.

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s

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15

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25

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B

Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Immunoreaktives Liposom, markiert mit einem Antigen oder Antikörper, durch welches ein Enzym maskiert ist, mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5.
2. Liposom gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Oxidoreduktase, Hydrolase oder Gemische davon ist.
3. Liposom gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym Alkaliphosphatase, Peroxidase, Malatdehy-drogenase oder Mischungen davon ist.
4. Immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 60 beträgt.
5. Immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
6. Immunologisches Verfahren zur Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Liposom, das mit einem Antigen oder Antikörper markiert ist und das ein Enzym mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 maskiert, mit einem Substrat für das Enzym und dem zu untersuchenden Material und mit einem Mittel, das eine Freilegung des Enzyms gegenüber dem Substrat unter den Testbedingungen ermöglicht, kombiniert, wobei das Liposom mit der zu bestimmenden Substanz oder mit dem Partner der zu bestimmenden Substanz markiert ist.
7. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren ein homogenes Testverfahren ist.
8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Mischung herstellt aus :

(a) einem Liposom, das mit der zu bestimmenden Substanz oder dem Partner der zu bestimmenden Substanz markiert ist und durch welches ein Enzym maskiert ist, mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5,

(b) einem Substrat für das Enzym,

(c) einem auf die spezifische Aktivität des Antigens oder des Antikörpers zu prüfenden Testmaterial und

(d) einem Komplement,

und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Enzymaktivität in dem Gemisch unter solchen Bedingungen bestimmt, bei denen eine Immunreaktion stattfindet und das Enzym gegenüber dem Substrat freigelegt wird.
9. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis durchgeführt wird in homogener Phase, ohne eine mechanische Abtrennungs- oder Reinigungsstufe.
10. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man in die Mischung den Partner des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers zugibt.
11. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis in homogener Phase durchgeführt wird.
12. Verfahren gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Vielzahl von Versuchen durchführt mit unterschiedlichen Konzentrationen des Partners des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers, um dadurch eine quantitative Bestimmung des Antigens oder Antikörpers in dem Testmaterial zu ermöglichen.
13. Verfahren gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
14. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
15. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Gemisch bildet aus:

(a) einem mit einem Antigen oder Antikörper markierten Liposom, durch welches ein Enzym maskiert ist, mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 65, wobei das Liposom mit der zu bestimmenden Substanz oder dem Partner der zu bestimmenden Substanz markiert ist,

(b) einem Substrat für das Enzym,

(c) einem auf spezifische Aktivität des Antigens oder des Antikörpers zu prüfenden Testmaterial,

(d) einem Komplement,

und dass man die Gegenwart oder Abwesenheit einer Enzymaktivität in dem Gemisch in einer homogenen Phase nachweist.
16. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man in das Gemisch den Partner des zu bestimmenden Antigens oder Antikörpers zugibt.
17. Verfahren gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
18. Immunoassay-Test-Satz zum Nachweisen von Antigenen oder Antikörpern in einer Probe, wobei der Test-Satz enthält: einen Behälter, enthaltend Liposome, die mit einem Antigen oder Antikörper markiert sind und ein Enzym maskieren und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 aufweisen.
19. Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass weiterhin ein Behälter für ein Substrat für das Enzym und ein Behälter, enthaltend Komplement für den Antikörper oder das Antigen, vorhanden sind.
20. Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass noch ein Behälter, enthaltend den Partner des Antikörpers oder des Antigens, vorhanden ist.
21. Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass er eine vorbestimmte Konzentration des Partners des Antikörpers oder Antigens enthält und als quantitativer Mechanismus zur Durchführung einer Immu-noassayuntersuchung dient.
22. Immunoassay-Test-Satz gemäss Ansprüchen 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Liposom ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 60 hat.
23. Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Liposom ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht wengier als 10 hat.

Es besteht seit langem ein Bedürfnis für hochvolumige Trennassays (screening assays), um die Gegenwart oder Abwesenheit von antigenen Stoffen, Antikörpern und Analysensubstanzen in einer grossen Zahl unterschiedlicher Probenahmesituationen festzustellen. In der Vergangenheit ist eine Reihe von Versuchsmethoden, einschliesslich Gaschromato-grafie, Massenspektroskopie, Flüssigchromatografie und verschiedene Bioassaymethoden, durchgeführt worden. Diese Methoden sind häufig zeitraubend, teuer und können nicht für in grossem Massstab durchgeführte Untersuchungsprogramme wirksam angewendet werden.

Die US-PS 4 193 983 bezieht sich auf einen Proteinbindungstest unter Verwendung kollodialer Partikel, wobei alle Bindungsstellen an die Partikel sich auf der Aussenseite der Partikel befinden (siehe Spalte 2, «Summary of the Invention»), Die Oberfläche der Partikel hat Bindungsstellen, die jede beliebige Substanz binden, für deren Nachweis der Test bestimmt ist, und die Ablesung erfolgt direkt von den Materialien, die aneinander gebunden sind.

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