DE3103826A1

DE3103826A1 - Immunoassayprodukte und deren anwendung in immunoassays

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Publication number: DE3103826A1
Application number: DE19813103826
Authority: DE
Inventors: Francis Xavier 02175 Stow Mass. Cole
Original assignee: Collaborative Research Inc
Current assignee: Oscient Pharmaceuticals Corp
Priority date: 1980-02-04
Filing date: 1981-02-04
Publication date: 1981-12-03
Anticipated expiration: 2001-02-05
Also published as: AU6785981A; FR2485038B1; DE3103826C2; CH659136A5; GB2069133B; US4342826A; CA1175740A; SE8105827L; FR2485038A1; AU551950B2; GB2069133A; DK436781A; WO1981002344A1

Description

PATENTANWÄLTE

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . Dl PL.-I N G. W. EITLE · DR. RER. N AT. K. H O FFMAN N . Dl PL.· I N G. W. LE H N

DIPL.-ING. K.FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 MO NCH EN 81 · TELE FON (089) 911087 · TE LE X 05-29619 (PATH E)

34 524 o/wa

COLLABORATIVE RESEARCH, INC., WALTHAM, MASS. / USA

Immunoassayprodukte und deren Anwendung in Iiranunoassays

Es besteht seit langem ein Bedürfnis für hochvolumige Trennassays (screening assays), um die Gegenwart oder Abwesenheit von antigenen Stoffen, Antikörpern und Analysensubstanzen in einer grossen Zahl unterschiedlicher Probenahmesituationen festzustellen. In der Vergangenheit ist eine Reihe von Versuchsmethoden, einschliesslich Gaschromatografie, Massenspektroskopie, Flüssigchromatografie und verschiedene Bioassaymethoden, durchgeführt worden. Diese Methoden sind häufig zeitraubend, teuer und können nicht für in grossem Massstab durchgeführte Untersuchungsprograrnrne wirksam angewendet werden.

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Man hat schon vorgeschlagen, für solche Trennverfahren Immunoassaymethoden anzuwenden, weil Immunoassays bekanntlich sehr speziell und hochempfindlich sind und leicht durchgeführt werden können. Radioimmunoassays finden z.B. bei der klinischen Diagnostik weite Anwendung. RIA-Verfahren sind jedoch häufig nicht mit Untersuchungsprogrammen im grossen Masstab verträglich. Radiotracer haben von Haus aus eine limitierte Stabilität und spezielle Entsorgungsverfahren und Personalauswahl sind erforderlich. Ausserdem benötigt man häufig hochkomplizierte Instrumente. Bei gewissen Anwendungen stellt RIA auch eine potentielle Gefahr dar, z.B. bei nahrungsmittelverarbeitenden Betrieben.

Andere Verfahren sind schon entwickelt worden, z.B. Fluoreszenz- oder enzymatische Immunoassayverfahren, die deshalb brauchbar sind, weil man potentiell gefährliche Reagentien vermeiden kann. Bei diesen Verfahren muss man jedoch Trennverfahren in Filtrationsoder Zentrifugationsstufen anwenden. Solche Trennverfahren verlangsamen das Testverfahren und sind auch nur schwer zu automatisieren.

Gemäss einer jüngeren Entwicklung verwendet man enzymmarkierte Antigene, die keine Abtrennung in gebundene und freie Spezies benötigen und die man deshalb schnell und mit einer hohen Empfindlichkeit durchführen kann. Ein solches System kann man automatisieren und für hochvolumige Untersuchungen anwenden, wie in dem EMIT-System von Rosenthal A. F.,Vargas M. G., und Klass CS. (1976) Clin. Chem. 22, 1899. Bei diesem

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Verfahren wird ein Antigen an ein Enzym gekuppelt, wobei dieses Verfahren sehr kritisch ist und dazu führen kann, dass das System nicht ausreichend für verschiedene Analysenmethoden angepasst ist, sofern man nicht für jedes neue System sorgfältige Entwicklungen vornimmt.

Kürzlich wurde von Liposomen berichtet, die Enzyme oder Substrate tragen können und die mit Antigenen oder Antikörpern markiert sind. Liposome die mit Antigenen an ihrer äusseren Oberfläche markiert sind und die in ihrem inneren Volumen ein Enzym eingefangen enthalten, werden mit verwandten Antikörpern und Komplementen vermischt, um zu entscheiden, ob die Liposome die Freilassung des eingefangenen Enzyms ermöglichen oder nicht. Diese Entscheidung wird durch den Nachweis der Enzymaktivität getroffen, welche physikalisch aus den Liposomen nach der Abtrennung der Liposome aus dem umgebenden Medium freigegeben wird (siehe Uemura K. und Kinsky S. .C, 1972, Biochemistry, 11, 4085-4094 und Kataoka Τ», Williamson J. und Kinsky S., 1973, Biochemies et Biophysica Acta 298, 158-179). Es ist jedoch nicht erkannt worden, dass solche Liposome, wenn sie in geeigneter Weise mit einem geeigneten hohen Signal-zu-Geräusch-Verhältnis gebildet werden, für Immunoassayverfahren geeignet sind, bei denen man Abtrennstufen vermeidet und man den Test in Reaktionen in homogener Phase durchführen kann. Ausserdem wird über Schwierigkeiten bei der Herstellung von immunospezifischen Liposomen berichtet (siehe G.H. Strejan, P. M. Smith, C. W. Grant und D. Surlan, "Naturally Occurring Antibodies

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To Liposomes", The Journal of Immunology, Bd. 123, Nr. 1, Juli 1979, 370-378. Ausserdem ist seit langem bekannt, dass die Diffusion von Makromolekülen, wie Enzymen, durch Läsionen, die durch Komplement in zweischichtigen Membranen gebildet werden, sehr viel langsamer ist als von kleinen Molekülen (Green H., Barrow P. und Goldberg B, 1959, J. Exp. Med., 110, 699) .

Aufgabe der Erfindung ist es, Immunoassayprodukte und -methoden zur Verfügung zu stellen, die ein schnelles und einfaches Testverfahren ermöglichen und mit deren Hilfe man quantitativ und/oder qualitativ die Gegenwart oder die Abwesenheit von antigenen Stoffen oder Antikörpern bestimmen kann.

Eine weitere Aufgabe besteht darin, ein Verfahren in Übereinstimmung mit der vorhergehenden Aufgabe zur Verfügung zu stellen, das durch verhältnismässig untrainiertes Personal durchgeführt werden kann und bei dem man Ergebnisse in einer einzigen Stufe durch einfaches Ablesen erzielt, ohne dass irgendeine Trennstufe nach der Testreaktion erforderlich ist.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin eine homogene-Phasen-Reaktion, bei welcher antigen- oder antikörpergebundene, enzymbeladene Liposome immunospezifisch veranlasst werden, Enzym in Gegenwart von verwandten Antigenen oder Antikörpern und aktivem Komplement freizugeben, zur Verfügung zu stellen.

Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, Liposome,

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die mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert sind und ein Enzym tragen und ausserdem ein Signal-zuGeräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 aufweisen und die vorzugsweise eine Stabilität von wenigstens etwa 60 Tagen bei Aufbewahrung in einer Flüssigkeit aufweisen, zur Verfügung zu stellen.

Erfindungsgemäss wird ein Liposom mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert und trägt ein Enzym, wobei es ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 hat. Das Enzym ist innerhalb des Liposoms eingekapselt. Vorzugsweise wird das Liposom in einem flüssigen Medium gehalten und ist während eines Zeitraumes von wenigstens 60 Tagen stabil. Vorzugsweise ist das Liposom-Signal-zu-Geräusch-Verhältnis hoch und oberhalb 60 und die Stabilität beträgt in einer Inertgasatmosphäre bei 4°C mehr als 6 Monate. In Form eines Test-Satzes wird das erfindungsgemässe Liposom zusammen mit Ampullen von verwandten Antikörpern oder Antigenen, die für das Antigen .oder den Antikörper, der an der Oberfläche des Liposoms befindlich ist, immunospezifisch ist und mit einer Ampulle für das Komplement zusammen verkauft.

Nach dem erfxndungsgemässen Verfahren besteht eine Immunoassaymethode darin, dass man ein Gemisch aus (a) Liposomen, die mit einem Antigen oder einem Antikörper markiert sind, der ein Enzym trägt und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 hat, (b) einem Substrat für das Enzym, (c) einem' Testmaterial, das auf spezifische Antigene oder Antikörper untersucht wird, und (d) Komplement bildet.

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Das Gemisch wird untersucht und die Gegenwart einer Enzymaktivität kann durch für das Auge sichtbare Veränderung der Farbe _t spektroskopisch oder in ähnlicher Form nchgewiesen werden. Vorzugsweise gibt man zusätzliches, verwandtes Antigen oder Antikörper, wie sie an die Liposomen gebunden sind, zu dem Gemisch und die Untersuchung wird dann für die gleichen Antigene oder Antikörper durchgeführt, wie sie an die Liposome gebunden sind. Wenn die gesuchten immunospezifischei Antigene oder Antikörper, in dem Untersuchungsmaterial vorhanden sind, dann reagiert der Antikörper oder das Antigen in dem Gemisch mit dem Antigen bzw. Antikörper, der intakt das Liposom verlässt und verhindert dadurch einen Komplementangriff, während in dem Fall, dass artverwandte Antikörper bzw. Antigene nicht in dem Testmaterial vorhanden sind, die Liposommarkierung reagiert und die Enzymaktivität nachweisbar wird. Die Menge an artverwandtem Antigen bzw. Antikörper in der Testprobe, sofern sie vorhanden ist, ermöglicht einen gewissen Komplementangriff, wenn sie nicht ausreicht, mit den gesamten freien verwandten Antikörpern oder Antigenen in dem Testgemisch zu reagieren und ein Teil der Enzymaktivität kann dann nachgewiesen werden.

In einigen Fällen kann die Immunoassaymethode direkt angewendet werden, um alle Elemente aus der Gruppe Antigen, Antikörper und Komplement nachzuweisen. Bei dieser direkten Methode wird eine unvollständige Mischung die alle bis auf ein Element aus der Gruppe Antigen, Antikörper oder Komplement enthält, hergestellt und die Gegenwart des nicht vorhandenen Elementes in

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einer zu untersuchenden Probe wird dadurch nachgewiesen, in welchem Ausmass man bei der Zugabe der Probe zu der unvollständigen Mischung eine Lysis des Liposoms durch immunspezifischen Angriff auf die Liposommembranen oder das Freilegen von eingekapseltem Enzym zu der Flüssigkeit um das Liposom beschleunigt. Wenn das zu untersuchende Testmaterial auf Antikörper oder Antigene untersucht wird, die verwandt sind zu denen, die als Markierung des Liposoms dienen, muss man kein Antigen oder keinen Antikörper zu dem Gemisch zugeben. Eine direkte Immunoassaymethode für Antigene oder Antikörper würde ein Gemisch der folgenden Zusammensetzung umfassen:

(a) mit einem Antigen oder dessen verwandten Antikörper markierte Liposome, die ein Enzym tragen und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 haben,

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) das auf ein Antigen oder einen verwandten Antikörper zu untersuchende Testmaterial und

(d) Komplement.

Wenn man eine direkte Immunoassay durchfürht, um das aktive Komplement in der Probe festzustellen, so würde man für ein solches Verfahren eine Mischung benötigen aus:

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(a) mit einem Antigen oder dessen verwandtem Antikörper markierte Liposome, die ein Enzym tragen und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 haben,

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) ein auf Komplement zu untersuchendes Testmaterial , und

(d) freier Artverwandter zu dem anderen des Antigens oder Antikörpers.

Eine bevorzugte Immunoassaymethode würde vorzugsweise folgende Mischung umfassen:

(a) Liposome, die mit einem Antigen oder dessen artverwandtem Antikörper markiert sind und ein Enzym tragen und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 haben,

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) das auf ein Antigen oder einen artverwandten Antikörper zu untersuchende Testmaterial,

(d) Komplement und

(e) freies Artverwandtes zu dem anderen des Antigens oder Antikörpers,

wobei man die Gegenwart oder Abwesenheit von Enzymaktivität in dem Gemisch nachweisen würde. Bei diesem

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Verfahren kann das nachzuweisende Antigen zum markieren der verwendeten Liposome oder der freien Artverwandten verwendet werden. Alternativ kann der nachzuweisende Antikörper zum Markieren des verwendeten Liposoms und des freien artverwandten Antikörpers verwendet werden.

Vorzugsweise wird das Verfahren als Einstufenverfahren durchgeführt und alle Stoffe werden in ein einziges Pläschchen gegeben, in dem eine Inkubierung unter standardimmunologisehen Bedingungen, z.B. bei 37°C oder in einem Bereich von 4 bis 45°C,in Zeiträumen zwischen etwa 1 Sekunde und 120 Minuten, durchgeführt wird. Alternativ kann man alle Stoffe bis auf das Enzymsubstrat abmischen und 5 bis etwa 120 Minuten oder langer inkubieren und dieses Gemisch gibt man dann zu dem Enzymsubstrat und stellt das Ergebnis fest.

Ein Test-Satz zum Nachweis von entweder einem Anti~ gen oder dessen artverwandtem Antikörper besteht vorzugsweise aus einem ersten Behälter, in dem sich das Liposom befindet, welches mit entweder dem Antigen oder dessen artverwandtem Antikörper markiert ist, und das in einem geeigneten Puffer suspendiert ist. Ein zweiter Behälter enthält pulverisierten lyophilisierten oder gefrorenen, konzentrierten Antikörper oder Antigen, die artverwandt zu dem des Liposoms sind. Ein drittes Fläschchen trägt pulverisiertes oder gefrorenes konzentriertes Komplement, das in Form von Meerschweinchenserum vorliegen kann,und ein vierter Behälter enthält ein Enzymsubstrat für das Enzym, das in flüssiger oder Pulverform vorliegen kann. In

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einem weiteren Behälter befindet sich Puffer.

Eine Einstufenmethode kann man anwenden, wenn alle Komponenten abgemischt und inkubiert sind. In einigen Fällen kann man das Verfahren jedoch in zwei oder mehr Stufen durchführen, wobei einige der Materialien zusammen inkubiert werden, bevor man das Mischen vervollständigt. In allen Fällen wird keine Trennung nach der Immunreaktion oder in Abwesenheit davon durchgeführt, und eine direkte Ablesung wird an den Reaktionsmaterialien durchgeführt, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Antigen oder Antikörper in der Testprobe festzustellen, indem man die Enzymaktivität oder -reaktion mit dem Substrat nachweist.

Es ist ein Merkmal der Erfindung, dass die Untersuchung schnell durch untrainiertes Personal mit verhältnismässig niedrigen Kosten durchgeführt werden kann. Die Ablesung kann subjektiv erfolgen, beispielsweise visuell durch Farbänderung, wenn qualitative Ablesungen gewünscht werden. Halbqualitative Ablesungen kann man subjektiv erhalten, wenn Farbänderungen von stark nach schwach eintreten. Spektrofotometrische Methoden und dergleichen kann man anwenden, um die Gegenwart oder Abwesenheit von Enzymaktivität in der Gegenwart von Substrat, durch welche die Freigabe von Liposom oder ein immunspezifischer Angriff auf die Liposommembrane und dadurch die Freisetzung des Enzyms gegenüber dem Substrat erfolgt, nachzuweisen. Die Freigabe der Enzymaktivität findet statt, wenn eine Immunreaktion abläuft, unter Bildung eines Immunkomplexes und die Doppelschicht oder die enzymumgebende Membran der

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Liposome beeinträchtigt. Wenn der Antikörper oder das Antigen, je nachdem was hier vorliegt, in dem System mit dem jeweilig anderen, mit dem das Liposom markiert ist, in Gegenwart von aktivem Komplemet reagiert, so wird Enzym freigegeben. Wenn jedoch die Testprobe das nachzuweisende Antigen oder den nachzuweisenden Antikörper enthält, wird die Reaktion des Artverwandten in dem Medium mit der artverwandten Markierung verhindert oder vermindert und dadurch wird der Nachweis des aufzufindenden Enzyms in dem Substrat verhindert, was ein positives Anzeichen für das nachzuweisende Antigen oder den Antikörper darstellt.

Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Liposome werden machnmal als smektische Mesophase oder synthetische Bläschen bezeichnet. Sie sind tatsächlich trockene Lipidfilme, suspendiert in einem wässrigen Medium, entsprechend der Beschreibung von Uemura K. und Kinsky S. C. (1972) Biochemistry 11, 4085-4094. Liposome bestehen wahrscheinlich aus Lipid-Zweischichten (lipid bilayers), die ein3 innere wässrige Abteilung von einem äusseren wässrigen Medium abtrennen und sind tatsächlich Prototypen biologischer Membranen. Die Liposome haben ähnliche Eigenschaften wie biologische Membranen. Bekanntlich kann man sie so herstellen, dass sie entweder Enzymsubstrate oder Enzyme enthalten. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthalten die Liposome Enzym und haben eine äussere Oberfläche, die im wesentlichen frei von Enzym ist, wobei diese äussere Oberfläche das Enzym einschliesst, so dass die katalytische Wirkung des Enzyms nicht nachweisbar wird, bis die die Membran einkapselnde äussere Oberfläche aufreisst und mit einem Antigen oder einem

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artverwandten Antikörper, je nach der Art des durchzuführenden Tests, markiert ist. Wenn man den Antikörper sucht, dann wird das Liposom vorzugsweise mit dem Antikörper markiert, und wenn man das Antigen sucht, so wird das Liposom vorzugsweise mit den Antigen markiert.

Liposome sind schon beschrieben worden. Jedoch ist bisher kein Schrifttum bekannt, nach dem man Liposome erhalten hat, die Enzyme enthalten und bei denen die Liposome ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 haben. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass man bisher nicht die Vorteile solcher Liposome für deren Verwendung in Immunoassayverfahren erkannt hat.

Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis soll 10 oder mehr und vorzugsweise wenigstens 60 betragen und kann auch 1000 oder mehr betragen, so dass die Liposome das Enzym aus dem Substrat enthalten und maskieren. In Abwesenheit des Antigen-Antikörper-Komplexes oder eines Immunkomplexes, der sich beim Aufreissen oder Poröswerden der Liposommembran bildet, findet keine nachweisbare Enzymaktivität statt. In einigen Fällen kann das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis 5 oder mehr betragen bei den erfindungsgemässen Liposomen, solange keine nachweisbare Enzymaktivität in Abwesenheit eines gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes oder eines Immunkomplexes stattfindet. Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis ist als solches bekannt und wird erhalten, indem man ein erstes Fläschchen oder ein Geräuschfläschchen, das ein mit einem Antigen oder

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einem artverwandten Antikörper markiertes Liposom, suspendiert in einem isotonischen Puffer, in Gegenwart eines Enzymsubstrates enthält, mit einem zweiten oder einem Signalfläschchen vergleicht, das Enzymsubstrat, Liposom der vorerwähnten Art und ein bekanntes Freigabemittel, z.B. ein starkes Detergenz, enthält. Das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis ist das Testergebnis der beobachteten Enzymreaktion, Vorzugsweise ist das Geräusch in dem Gefäss, in dem sich kein Freigabemittel befindet, so niedrig wie möglich, wodurch wenig oder gar keine Enzymaktivität angezeigt wird.

Vorzugsweise wird das Geräusch niedrig oder nichtexistent während einer möglichst langen Zeit gehalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt das Geräuschniveau bei Null oder in der Nähe davon nach einer Lagerung von wenigstens 60 Tagen, oder das Signalzu-Geräusch-Verhältnis ist nicht kleiner als 10. Dies ergibt eine gute Lagerfähigkeit, die dann wünschenswert ist, wenn man Test-Sätze für die Anwendung der vorliegenden Erfindung verkauft.

Bei einer erfindungsgemassen Immunoassaymethode markiert das Liposom das Enzym von dem Substrat und durch die Vermittlung eines immunospezifisch aktivierten Komplements wird eine ansonsten latente (verborgene) Enzymaktivität augenscheinlich. Das Liposom kapselt das Enzym ein, d.h. dass das Enzym physikalisch eingefangen ist innerhalb eines Raumes, der durch eine zweischichtige Membran umgrenzt ist. Die physikalische Einkapselung dient auch dazu, die Enzymaktivität zu

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maskieren. p-Nitrophenylphosphat (pNPP) ist ein Substrat für das Enzym Alkaliphosphatase (AP). Unter alkalischen Bedingungen (pH grosser als 7) wird durch AP die Phosphatgruppe von pNPP (das farblos ist) abgeschnitten und es bildet sich p-Nitrophenol, das unter alkalischen Bedingungen eine intensive Gelbfärbung aufweist Wenn man daher eine wässrige Lösung von pNPP herstellt, so ist diese Lösung farblos. Gibt man AP zu dieser Lösung, so erhält man sehr schnell eine intensive Gelbfärbung. Die erfindungsgemäss verwendeten Liposome sind derart, dass sie AP einkapseln und dieses AP von dem pNPP in der umgebenden wässrigen Lösung maskieren. Auf diese Weise können die Liposome mit dem eingekapselten AP in pNPP-Lösungen dispergiert werden, wobei nur in geringem Masse eine Gelbfärbung erfolgt, wogegen in dem Fall, dass die gleiche Menge an AP, die eingekapselt wurde, direkt eingeführt würde, eine beachtliche Farbtönung sich sehr schnell entwickeln würde.

Aus obigem Grund werden für den Aufbau der Liposome Enzyme ausgewählt, deren Aktivität wirksam durch die intakte Lipid-Doppelschicht abgeschirmt wird, und bei denen man ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von mehr als 5 erhält. Vorzugsweise werden solche Enzyme nicht verwendet, die

(a) an der äusseren Oberfläche der Liposommembran absorbiert würden und auf diese Weise immer gegenüber dem Substrat in dem umgebenden Medium frei vorlagen,

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(b) die in die Doppelschicht selbst eingeschlossen sind und auf diese Weise sowohl das innere wie das äussere Medium überbrücken würden und daher in gleicher Weise gegenüber dem Substrat in dem umgebenden Medium frei vorlägen,

(c) die mit dem Substrat, das leicht durch die intakte Lipid-Doppelschicht diffundieren kann, reagieren (diese Lipid-Doppelschicht ist typischerweise unpolar, lipidlöslich und hat eine kleine MolekülgrÖsse). In diesem Fall könnte, obwohl das Enzym eingekapselt sein kann, dessen Aktivität nicht abgeschirmt wird, weil das Substrat in dem umgebenden Medium durch die Diffusion durch die Lipid-Doppelschicht zu demeingekapselten Enzym Zutritt erhielte.

Der Aufbau der Maskierung ist wichtig im Zusammenhang mit der erfindungsgemässen Immunoassaymethode. Weil diese Maskierung immunospezifisch aufgebrochen werden kann, kann man eine homogene Assay erhalten, d.h. dass es nicht erforderlich ist, eine physikalische Trennung der gebundenen von der signalfreien Form durch Zentrifugieren, Chromatografieren, Filtrieren, Festphasenimmobilisierung und dergleichen, vorzunehmen. Solche Trennungen sind zeitraubend, machen spezielle Instrumente oder Vorrichtungen erforderlich und lassen sich nur schwierig automatisieren.

Liposome werden aus amphiphilischen Lipiden hergestellt. Lipide kann man allgemein als Moleküle mit mittlerem Molekulargewicht (150 bis 3000 Daltons), die hauptsächlich aus gesättigten oder ungesättigten

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und/oder aromatischen oder aliphatischen Kohlenwasserstoff resten bestehen, bezeichnen. Amphilische Lipide sind solche, die sowohl wasserlösliche als auch wasserunlösliche Regionen aufweisen.

Small (J. Am. Oil Chem. Soc. , 4J5, 108-117, 1968) hat eine Klassifizierung der Lipide aufgestellt, die auf deren Reaktion mit Wasser und zwar sowohl in Substanz als auch an der Oberfläche beruht. Für die vorliegende Erfindung geeignete Lipide werden nachfolgend angegeben:

Klasse I ~ unlösliche, nichtguellende amphiphilische Lipide: Di- und Triflyzeride, langkettige protonierte Fettsäuren, Sterolester, langkettige Alkohole, Phytole, Retinale, Vitamin A, Vitamin K, Vitamin E und viele Sterole, wie Cholesterin, Desmosterol, Vitamin D und eine Anzahl von Hormonen.

Klasse II - unlösliche, quellende amphiphilische Lipide : Lecithine, Phosphatidylethanolamine, Phosphatidylinosit, Sphingomyelin. Cerebroside, phosphatidische Säuren, Plasmalogene, phosphatidylisches Serin, Cardiolipine und gewisse Pflanzensulfolipide.

Klasse IIIA - lösliche Amphiphile, Typ A: bilden flüssige kristalline Phasen bei der Zugabe von geringen Mengen Wasser (lyotropischer Mesomorphismus). Schliesst zahlreiche klassische anionische, kationische und nichtionische Detergentien ein.

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Klasse IIIB - lösliche Amphiphile, Typ B: bilden keine Flüssigkristalle, haben keine ausgesprochene Polarität - Gallensalze.

Klasse II-Lipide sind besonders für die Bildung von Liposomen geeignet und die letzteren kann man häufig aus solchen Lipiden allein herstellen. Recht grosse Bläschen erhält man aus Phosphatidylethanolamin oder Phosphatidylserin nach Papahadjopoulus, Annals N. Y. Acad. of Sei. 308, 1978. In einigen Fällen ist es jedoch nützlich, Lipide der Klasse I oder III in die Bläschendoppelschicht aus Strukturgründen zuzugeben, um weniger flüssige Doppelschichten zu bilden, z.B. durch Inkorporieren von Cholesterin oder um einen grösseren Abstand zwischen anliegenden Doppelschichten zu bewirken, z.B. durch elektrostatische Abstossung, die durch die Inkorporierung von anionische Diacetylphosphat-oder kationischen Stearylaminlipiden in die Zwischenschicht erfolgt. Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Bläschenstrukturen sind beschrieben worden (Szoka und Papahadjopouols Proc. Nat. Acad. Sei. 75, 4194-4198-, 1978). Viele dieser Strukturen mit entsprechenden Abänderungen können für die vorliegende Erfindung angewendet werden. Bei der Auswahl von geeigneten Herstellungsverfahren werden vorzugsweise Kriterien der folgenden Art angewendet:

(1) Durch die Art der Inkorporierung der Enzyme in die Liposome sollte keine Inaktivierung oder Denaturierung der Enzyme erfolgen. Deshalb muss ein längeres Aussetzen bei erhöhten Temperaturen oder gegenüber denaturisierenden organischen Lösungsmitteln vermieden werden.

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(2) Die Liposome sollen ausreichend gross ein, um eine Enzymaktivität zu inkorporieren. Strukturen, die weniger als 50 bis 100 S Durchmesser haben, können nur einige wenige Enzymmoleküle einkapseln und sind deshalb in den meisten Fällen nicht bevorzugt.

(3) Die liposomische Doppelschicht soll stabil und verhältnismässig undurchdringlich sein. Von Kitigawa T. und Inoue K., Nature 254, 254-6 (1975), wurde gezeigt, dass durch die Inkorporierung von Lipiden der Klasse I, wie Sterolen, eine Kondensierung der Zwischenschicht erfolgt mit einer sich daraus ergebenden grösseren Härte und Stabilität, die einer durch Komplement hervorgerufenen Lysis zugänglicher sind.

Bei der Herstellung von Liposomen ist es erforderlich, dass Lipide, wie solche der Klasse II, die wasserunlöslich sind, in eine wässrige Umgebung eingeführt werden. Dies kann durch eine Vielzahl von Verfahren erreicht werden.

Nach einem bekannten Verfahren werden Lipide physikalisch in einer wässrigen Lösung dispergiert. Ein trockener, dünner Lipidfilm wird auf die innere Oberfläche eines geeigneten Gefässes aufgebracht. Die wässrige Lösung, welche die in die Liposome einzuschliessenden Substanzen enthält, wird dann in das Gefäss eingebracht und kommt in Kontakt mit dem Lipidfilm. Der Lipidfilm wird dann durch kräftiges Rühren in dem Gefäss (Glasperlen von ungefähr 0,1 mm Durchmesser können zur Beschleunigung der Dispergierung

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zugegeben werden) in die wässrige Lösung dispergiert. Die Dispergierung des Lipidfilms kann auch durch Beschallen, durch Eintauchen eines Beschallers in das Gefäss oder durch Einführen einer Sonde eines Beschallers in die wässrige Lösung beschleunigt werden. Eine zu starke Beschallung kann das Enzym inaktivieren und kann sehr kleine Liposome bilden.

Alternativ können die Lipide in einer wässrigen Lösung, die ein Detergenzlipid der Klasse IIIA oder IIIB, wie Laurylsulfat oder Natriumdeoxycholat, enthält, gelöst werden. Das Detergenz wird dann entfernt (z.B. durch Dialyse) und es bildet sich die Liposom-Doppelschicht. Enoch und Strittmatter (Proc. Nat, Acad. Sei. 7j[' 145-149) haben die Herstellung von Einzel-Doppelschicht-Liposomen unter Verwendung von Doxycholat als Detergenz, das dann dialysiert wurde, mit einer Grosse von 1000 8 Durchmesser beschrieben.

Nach einem anderen bekannten Verfahren gibt man eine wässrige Lösung zu einem Gemisch aus einem Lipid und einem flüssigen organischen Lösungsmittel und entfernt das Lösungsmittel anschliessend durch Verdampfen unter vermindertem Druck. Szoka und Papahadjopoulos (Proc. Nat. Acad. Sei. 7JL' 4194-4198, 1978) haben die Herstellung von Liposomen mit sehr grossem inneren, wässrigen Raum durch Verdampfen von organischen Lösungsmitteln, wie Diethylether oder Isopropylether, beschrieben.

Die physikalischen und Detergenzdialyseverfahren sind für die vorliegende Erfindung besonders geeignet, weil

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diese leicht grosse Bläschen bilden und sehr milde ablaufen und dadurch die Enzyme nicht leicht inaktiviert werden. Wendet man das Verdampfen von organischen Lösungsmitteln an, so ist es erforderlich, dass das einzukapselnde Enzym gegenüber dem Lösungsmittel unempfindlich ist. Beispielsweise kann man Bläschen dieser Art herstellen, die Alkaliphosphatase enthalten, denn ein solches Enzym wird nicht durch Diethylether, wie er bei diesem Verfahren verwendet wird, denaturiert.

Für das erfindungsgeinässe Verfahren geeignete Enzyme sind alle solche, die niedrige Geräuschniveaus ergeben. Eine grosse Anzahl bekannter Enzyme kann für die Erfindung verwendet werden. Diese variieren erheblich hinsichtlich ihrer Substrate, der Natur, der zu katalysierenden Reaktion, der Stabilität, hinsichtlich des Umsatzes und der optimalen Reaktionsbedingungen (pH, Ionenstärke, Temperatur) und dergleichen. Die International Union of Biochemists haben verschiedene Enzyme nach der Natur der zu katalysierenden Reaktion klassifiziert.

Es gibt eine Anzahl von Kriterien, die man bei der Auswahl eines gegebenen Enzyms für die praktische Anwendung beachten muss. Solche Enzyme, die derzeit zur Verfügung stehen, jedoch nur in Spurenmengen, sind weniger wünschenswert als solche, die in grossen Mengen vorkommen und die im Handel erhältlich sind. Das Enzym sollte bei Temperaturen, wie sie üblicherweise in technischen Anlagen vorherrschen, z.B. bei 4 C, während wenigstens etwa 3 Monaten stabil sein. Die

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katalytische Aktivität oder die Umsatzzahl des Enzyms soll ausreichend hoch sein, um eine nachweisbare Reaktion innerhalb einer kurzen Zeit zu ergeben, d.h. innerhalb weniger Sekunden bis zu 120 Minuten. Die katalytische Aktivität des Enzyms sollte leicht für den praktischen Verwerter nachweisbar sein, d.h. dass die katalysierte Reaktion z.B. eine Erhöhung oder Erniedrigung der Lichtabsorption im Ultraviolettbereich oder im sichtbaren Bereich, d.h. im Bereich von 250 bis 750 nm, bewirken soll.

Vorzugsweise soll das Enzym ein solches sein, das nicht in erheblichen Mengen in der zu prüfenden Probe vorhanden ist und das nicht durch solche Substanzen, wie sie üblicherweise in den Proben gefunden werden, inhibiert wird.

Das Enzym sollte nicht durch die bei der Liposomherstellung verwendeten Lipide inaktiviert werden, noch während der Liposomherstellung inaktiviert oder denaturiert werden. Das auszuwählende Enzym soll ein solches sein, das vollständig eingekapselt ist. Solche Enzyme werden in der Natur in dem zellularen Cytoplasma gefunden oder zirkulieren frei in extrazellularen Flüssigkeiten. Nicht wünschenswert sind die natürlichen Membranproteine. Diese werden in der Natur zusammen mit zellularen Membranen gefunden und haben eine oder mehreren hydrophobe Oberflächen, durch welche sie an die Doppelschicht (bilayer) verankert werden. Sehr häufig überbrücken solche Enzyme die Doppelschicht, wobei deren katalytische Stellen dem umgebenden wässrigen Medium ausgesetzt sind.

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In der nachfolgenden Aufstellung werden Enzyme von besonderem Interesse, die nach der International Union of Biochemists klassifiziert worden sind, genannt:

1.' Oxidoreduktasen 1.1 wirken auf die CH-OH-Gruppe eines Donors,

1.1.1. mit NAD oder NADP als Akzeptor.

1. Alkoholdehydrogenase 6. Glyzerindehydrogenase

26. Dioxalatreduktase

27. L-Lactatdehydrogenase 37. Malatdehydrogenase

49. Glukose-6-phosphatdehydrogenase 17. Mannit-1-phosphatdehydrogenase

1.1.2. mit Cytochrom als Akzeptor

3, L-Lactatdehydrogenase

1.1.3. mit O₂ als Akzeptor

4. Glukoseoxidase 9. Galaktoseoxidase

1.2. wirken auf die CH-NH₂-Gruppe des Donors, 1.4.3. mit O₂ als Akzeptor

2. L-Aminosäureoxidase

3. Deaminosäureoxidase

1.6. wirken auf reduziertes NAD oder NADP als Donor 1.6.99 mit anderen Akzeptordiaphorasen 1.1O. wirken auf Diphenole und ähnliche Substanzen

als Donor,
1.10.3. mit O₂ als Akzeptor

1. Polyphenoloxidase

3. Ascorbatoxidase

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1.11. wirken auf H₂O₂ als Akzeptor

1.11.1.

6. Katalase

7. Peroxidase 3. Hydrolasen

3.1. wirken auf Esterbindungen 3.1.1. Carbonsäureesterhydrolasen

7. Cholinesterase

3.1.3. Phosphormonoesterhydrolase 1. Alkaliphosphatase

3.1.4. Phosphordiesterhydrolase

3. Phospholipase C

3.2. wirken auf Glykosylverbindungen

3.2.1. Glykosidhydrolasen 1. *>£· -Amylase

4. Zellulase 17. Lysozyrn

23. ß-Galaktosidase 27. Amyloglukosidase 31. ß-Glukuronidase ^:' 3*4. wirken auf Peptidbindungen

3.4.2. Peptidyl-aminosäurehydrolase 1. Carboxypeptidase A

3.4.4. Peptidyl-peptidhydrolase

5. dj -Chymotrypsin 10. Papain

3.5. wirken auf C-N-Bindungen, die keine Peptidbindungen sind

3.5.1. in linearen Amiden 5. Urease

3.6. wirken auf Säureanhydridbindungen 3.6.1. in Phosphoryl enthaltenden Anhydriden

1. anorganische Pyrophosphatase

-

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4.	Lyasen
4.1.	Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen
4.1.2.	Aldehydlyasen
	7. Aldolase
4.2.	Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen
4.2.1.	Hydrolasen
	1. Karbon-anhydrase
4.3.	Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen
4.3.1.	Ammoniumlyasen
	3. Histidase

Erfindungsgemäss geeignete Substrate sind solche, die mit dem ausgewählten Enzym reaktiv sind und schliessen beispielsweise ein p-Nitrophenylphosphat und 4-Methylumbelliferylphosphat als Alkaliphosphatase; 4-Aminosalicylsäure oder o-Dianisi und Wasserstoffperoxid für Peroxidase; und o- oder p-Nitrophenylglykoside für Glykosidasen. Weitere geeignete Substrate sind solche, wie sie von Bergmeyer, Methods for Encymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965, beschrieben werden. Nicht wünschenswert sind solche Substrate, die leicht durch die intakte Membran-Doppelschicht diffundieren. Im allgemeinen sind solche Substrate kleine Moleküle, die in Lipidlösungsmitteln löslich sind.

Antigene, die zu prüfen sind oder die als Markierung für die Liposome für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind zahlreich vorhanden. Es gibt eine Reihe von Antigenen, deren quantitative Feststellung bei der klinischen Diagnostik von Bedeutung ist. Viele von diesen werden derzeit durch Radioisotopenmethoden nachgewiesen. Nachweise für solche Antigene nach dem

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erfindungsgemässen Verfahren würden eine beachtliche Verbesserung bedeuten, weil gefährliche und instabile Reagentien nicht verwendet werden müssen.

Die vorliegende Erfindung kann mit Vorteil für den Nachweis und für die Bestimmung von zirkulierenden Hormonen als Indikatoren für endokrine Funktionen verwen et werden. Eine nur teilweise Aufzählung solche Produkte ist schliess folgende ein:

Thyro idho rmone

- Thyroxin und Trijodothyoinin, p-thyroidhormon und Calcitonin.

Pancreashormone

- Insulin, Proinsulin und Giukagon.

Hypophysenhormone - Prolaktin, adrenocortiocotropes

Hormon, Tyrotropin, Oxytocin und Vasopressin.

Uterus- und PIazentahormone

chorionisches Gonadotropin, PIazentalactogene, chorionisches Thyrotropin und Relaxin.

Steroidhormone

östradiol, östron, östriol, Testosteron und Dihydrotestosteron.

Wachstumsfaktoren -

ürogastron, Nervenwachstumsfaktor und Somatomedine.

Das Verfahren ist geeignet für intrazellulare Boten, zyklische Nukleotide und Prostaglandine.

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Die Erfindung ist auch anwendbar zur Aufgliederung von zirkulierenden Mengen an therapeutischen Arzneimitteln, z.B. von Herzglykosiden, Digoxin, Digitoxin, Antikonvulsantien, Diphenylhydantoin, Mesantoin, Phenobarbital und Mephobarbital. Von besonderem Interesse sind solche Arzneimittel, die einen engen therapeutischen Index haben, d.h. bei denen ein gewisses minimalzirkulierendes Niveau erforderlich ist, um eine therapeutische Wirkung zu erzeugen, während etwas höhere Niveaus toxische oder schädliche Reaktionen hervorrufen.

Das Verfahren kann auch für die Überprüfung von Antibiotika, wie Penicillin, Streptomycin und Tetracyclinen, Chlortetracyclin, Oxytetracyclin, sowie Tetracyclin, Chloramphenicol, Erytromycin, Caromycin und Polymyxin B angewendet werden. Die aminoglykosidischen Antibiotika Gentamycin, Amikacin, Tobramycin, Kanamycin und Neomycin , die zum Bekämpfen von aeroben gram-negativen Bazilleninfektionen verwendet werden, können durch die vorliegende Erfindung leicht untersucht werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren kann auch zum Nachweis und für die Bestimmung von schädlichen Drogen, wie den Opiaten Morphin, Heroin, Meperidin und Methadon, Mutterkornalkaloiden, wie Lyserginsäurediethylamid, Marijuana, Barbituraten und Kokain und dessen Derivaten verwendet werden.

Da die vorliegende Erfindung sehr einfach durchzuführen ist und man keine instabilen oder gefährlichen Reagentien benötigt, kann die Untersuchungsmethode

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in solchen Umgebungen angewendet werden, die schlechter und weniger gut ausgerüstet sind, als Diagnoselaboratorien. Die Untersuchungsmethode kann z.B. für die Untersuchung von Nahrungsmitteln und Umgebungsgiften angewendet werden. Bei der Untersuchung von Nahrungsmitteln sind wichtige Antigene Mycotoxin und natürliche Gifte. Auf diesem Gebiet kommen als Haupttoxine solche in Frage, wie Aflatoxine, Achratoxin, Patulin, Penicillinsäure, Zearelonon; und Tricothecentoxine, sowie auch toxische Metaboliten, wie Ipomeameron, die natürlich in Nahrungsmitteln vorkommen. Neben den natürlichen Giftstoffen gibt es eine grosse Anzahl von umgebungsverseuchenden Substanzen, deren Anwesenheit in Nahrungsmitteln, selbst in Spurenmengen, erhebliche Gefahren für die Menschheit bringen. Dies können Nebenprodukte der Industrie oder Pestizide sein, z.B. polychlorierte Biphenyle, chlorierte Dibenzo-p-dioxine, chlorierte Dibenzofurane, Heptachlorepoxid, Dieldrin und DDT 1,1'-2,2,2-Trichlorethyliden)-bis^3-chlorbenzol7; 1,1,1-Trichlor-2,2-bis-(p-chlorphenyl)-ethan.

Andere gefährliche nahrungsmittelverseuchende Substanzen sind Antibiotika, wie Penicillin/ Chloramphenicol und Tetracyclin.

Das Verfahren ist.nicht auf kleine Moleküle beschränkt, denn es wurde von Humpfries und McConnell in Proc. Nat. Acad. Sei., 7_1_' 1691-1694, 1974, gezeigt, dass makromolekulare Antigene, wie Eialbumin, an die Oberfläche von immunoreaktiven Liposomen gekuppelt werden können. Das heisst, dass die vorliegende'Erfindung auch für den Nachweis von markomolekularen Antigenen, wie Plasmaproteinen, häpatitisassoziierten Antigenen und Histokompatibilitäts -Markierungen geeignet ist.

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Antigene und antigenische Materialien die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zu analysieren sind, sind alle solche, die seihst oder mit anderen Produkten artverwandte Antikörper bilden und die durch die Immunreaktion nachweisbar sind. Zum Beispiel kann man Digoxin als Antigen ansehen, da es mit einem anderen Material Antikörper bildet und zwar derart, dass der Antikörper zu Digoxin in einem Versuch verwendet werden kann mit entweder dem Antikörper oder dem als Markierung verwendeten Digoxin, je nachdem, ob man nach dem Digoxin oder dem artverwandten Antikörper sucht. Materialien, wie Rinderserumalbumin, Schlüsselloch-Limpet-heomocyanin (key hole limpet heomocyanin) oder andere makromolekulare Träger werden kovalent an das Digoxin oder ein anderes "Antigen" unter Ausbildung von Antikörpern gekuppelt. Das Wort "Antigen" wie es hier verwendet wird, soll deshalb alle antigenen Materialien einschliessen, unabhängig davon, ob sie selbst Antigene sind oder ob sie in Kombination mit anderen Materialien artverwandte Antikörper in Lebewesen, wie bei Menschen, Kaninchen, Gänsen, Schafen, Meerschweinchen, Rindern oder anderen Säugetieren, bilden.

Die Erfindung kann angewendet werden, um spezifische Antikörper, die gegen verschiedene Antigene gerichtet sind, nachzuweisen und zu quantifizieren. Die Anwesenheit und auch die Menge solcher Antikörper kann als ein Indikator angesehen werden für eine mögliche Immunität gegen zahlreiche Infektionskrankheiten, für bereits durchgemachte Krankheiten oder für eine aktive Infektion.

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Beispielsweise kann man durch die vorliegende Erfindung leicht Syphillis-Antikörper (gerichtet gegen Treponema Palladium ) nachweisen, da diese Antikörper reaktiv sind gegen Cardiolipin (das aus Rinderherzen extrahiert wird), das leicht in Liposome inkorporiert wird.

Antikörper, die gegen infektiöse Krankheitserreger gerichtet sind - Virus, Bakterien, Parasiten und dergleichen - kann man nachweisen, indem man die oberflächlichen antigenen Markierungen von solchen auf die Liposomoberflache kuppelt.

In einigen Fällen wird durch die Gegenwart von Antikörpern, die gegen spezifische Makromoleküle gerichtet sind, eine autoimmune Störung angezeigt - z.B. sind Antikörper, die reaktiv gegenüber Nukleinsäuren, Polydeoxyribonukleinsäuren und Polyribonukleinsäuren, Kollagen, Gammaglobulinen, Thyroglobulinen, parathyroiden Antigenen, mitochondrinalen Antigenen und Antigenen der glatten Muskeln reaktiv sind, alle potentiale Indikatoren für artoimmune Krankheiten.

Antikörper werden gebildet durch Einführen von immunogenen Substanzen in den Blutstrom eines lebenden Tieres. Das Tier reagiert mit der Bildung von Antikörpern, die sich an das Immunogen in einer ersten Stufe bei der Entgiftung des Immunogens bilden. Viele Antigene sind direkt immunogen und bewirken direkt eine Antikörperbildung. Eine Reihe von Substanzen ist jedoch nicht selbst immunogen und benötigt eine Modifizierung (Kupplung an einen geeigneten Träger). Verfahren zur Herstellung von Antikörpern werden sehr

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ausführlich von Landsteiner in "Speficity of Serological Reactions", Dover Publications N.Y. 1962 und von Weir beschrieben.

Ein Komplement (eine Gruppe aus wenigstens neun verschiedenen Proteinen) ist eine Schlüsselverbindung
bei der Immunverteidigung eines Wirts gegen eindringende zellulare Pathogene. Ist das Komplement einmal aktiviert (aufnahmefähig für die Anwesenheit von zellularen Eindringlingen), bindet es sich an die äussere
Membran und verursacht kleine Verletzungen dieser
Membran. Tatsächlich kerbt das Komplement kleine Löcher über die gesamte Oberfläche der Membran. Diese Löcher sind sehr klein und in der Grössenordnung von 100 A

— 8
(100 χ 10" cm) im Durchmesser. Sehr kleine Moleküle, wie Wasser oder einfache Salze, können leicht durch
diese Verletzungen eindringen. Makromoleküle, wie
Proteine, sind im allgemeinen von der gleichen Grosse oder grosser wie diese Läsionen - 40 bis 2 50 8 - so
dass Makromoleküle nicht durch diese- Läsionen diffundieren können oder nur ausserordentlich langsam,
wie Green H., Barrow P. und Goldberg B, (1956) in
J. Exp. Med. 110, 699 beschreiben. Bei der vorliegenden Erfindung ermöglicht das verwendete Komplement eine Antigen-Antikörper-Reaktion, durch welche wirksam
Löcher in die das Liposom einkapselnde Schicht gebohrt werden. Man nimmt an, dass dadurch das Substrat in
die Liposom-Doppelschicht eindringen kann und mit dem dort befindlichen Enzym reagiert. Dadurch tritt dann eine enzymatisch^ Reaktion ein und zwar auch, wenn keine vollständige Auflösung der Doppelschicht stattfindet. Das Komplement ermöglicht die Umsetzung entweder indem

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es die Auflösung unterstützt oder indem es wirksam Löcher bildet, durch welche die Reaktion, ohne dass eine Auflösung (Lysis) stattfindet, abläuft. Der Ausdruck "Auflösung" bzw. "Lysis" bedeutet den Zusammenbruch oder das vollständige Aufreissen der Liposom-Doppelschicht und auch das Freilegen des eingekapselten Enzyms gegenüber Substrat durch Löcher, die in der Doppelschicht durch die Immunreaktion gebildet wurden.

Ein typischer Test-Satz zum Nachweis von Antigen enthält ein Fischchen mit Liposomen, die mit einem Antigen markiert sind und in einem geeigneten Puffer suspendiert sind, z.B. in einem Volumen von 0,1 bis 10 ml. Die Konzentration des Liposoms in dem Puffer liegt im allgemeinen zwischen etwa 1 bis 50 mMol. Geeignete Puffer sind phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder andere isotonische Puffer. Ein zweites Fläschchen enthält in Form eines lyophilisierten Pulvers oder eines gefrorenen Konzentrats den artverwandten Antikörper zu dem Antigen. In dem Fall, wo der Antikörper durch die Direktmethode nachzuweisen ist, würde dieses Fläschchen die positive Kontrolle für die Untersuchung darstellen. Ein drittes Fläschchen enthält lyophilisiertes Pulver oder gefrorenes Konzentrat von Komplement. Übliches Komplement für den zu bildenden Antigen-Antikörper-Komplex, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, wird verwendet. Ein solches Komplement kann z.B. Meerschweinchenserum sein. Ein weiteres Fläschchen enthält das Enzymsubstrat, das flüssig oder pulverförmig oder in einer anderen Form vorliegen kann, und zwar in einer ausreichenden

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Konzentration, um leicht eine enzymatische Aktivität nachzuweisen, wenn das Enzym, das in dem Liposom enthalten ist, freigegeben wird. Ein weiteres Fläschchen kann einen Puffer enthalten, den man verwendet, um die Materialien während des erfindungsgemässen Tests zu verdünnen.

Im einfachsten Falle und bei dem am meisten bevorzugten Test werden alle Materialien einschliesslich dem Substrat in eine einzige Flasche gegeben, inkubiert und eine Farbänderung oder die Abwesenheit einer Farbänderung wird festgestellt, um zu bestimmen, ob das zu untersuchende Material, das z.B. das Serum eines Individuums sein kann, ein spezifisches Antigen oder einen spezifischen Antikörper enthält oder nicht. In einigen Fällen werden alle Materialien mit Ausnahme des Substrats in eine einzige Flasche gegeben, inkubiert und dann mit den Enzymsubstraten vermischt, und eine Farbänderung oder die Abwesenheit einer Farbänderung wird festgestellt für die Untersuchung, ob das Testmaterial, das z.B. das Serum eines Individuums sein kann, ein spezifisches Antigen oder einen spezifischen Antikörper enthält oder nicht. Besonders geeignete Enzyme sind Alkaliphosphatase und Peroxidase weil deren Reaktion mit p-Nitrophenylphosphat und 4-Aminosalicylsäure Farbreaktionen ergeben, die mit dem Auge leicht erkennbar sind.

In solchen Fällen, wo eine Inhibierung von Komplementlysis für eine analytische Qualifizierung verwendet wird, liegen gewisse Begrenzungen in der Zugabereihenfolge vor. Dies beruht auf der Tatsache, dass in dem

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Moment in dem Liposome, die Antigen oder Antikörper enthalten, Komplement und der Partnerantikörper oder das Partnerantigen zusammengebracht werden, eine Lysis eintritt. Für Zwecke einer genauen Quantifizierung wird es vorgezogen, dass die zu untersuchende Probe in das Fläschchen gegeben wird, bevor das Komplement wirken kann. Eine vernünftige Reihenfolge in der Zugabe würde dann folgende sein: (1) Antikörper, (2) Liposome, (3) Probe, (4) Komplement. Die Zugaben (1), (2) und (4) können variieren, aber die Probe wird immer zugegeben, bevor Antikörper, Komplement und Liposome miteinander vereint werden.

In allen Fällen zieht man es vor, einen bekannten positiven Test als Vergleichstest durchzuführen. Wenn z.B. der Test ein Test für Digoxin ist, so wird eine Ampulle mit einem Standarddigoxin in den Test-Satz eingeschlossen. Wenn die Untersuchung eine quantitative und eine qualitative Untersuchung beinhaltet, dann kann der Test-Satz eine P>eihe Proben des zu untersuchenden Materials in verschiedenen Konzentrationen enthalten, so dass eine Farbänderung, sofern eine auftritt, in der Testprobe verglichen werden kann mit der Farbänderung oder einer anderen enzymatischen Aktivität bei jeder Standardprobe, sofern man die Standards zusammen mit der zu untersuchenden Probe in einem Analysenverfahren untersucht.

Die Bestimmung der Enzymaktivität ist für eine grosse Anzahl von Enzymen bekannt. Solche bekannten Tests können zur Überwachung der Enzymaktivität im Anschluss an die erfindungsgemässe Untersuchung durchgeführt

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werden. Eine Liste von Untersuchungsmethoden wird für viele Versuche von Bergmeyer in Methods for Enzymatic Analysis, Academic Press N.Y. 1965, beschrieben. Die besonders bevorzugten dieser Untersuchungsmethoden sind solche, bei denen entweder eine hohe Empfindlichkeit vorliegt oder die eine besonders einfache Verpackung ermöglichen.

Zur Bestimmung der Aktivität von Malatdehydrogenase (E.C. 1.1.1.40) wird das Enzym mit den Substraten L-Apfelsäure, Nikotinamidadenindinukleotid umgesetzt und das Fortschreiten der Umsetzung wird bei 3 40 nm in folgender Weise überwacht.

In Küvetten wird folgendes eingefüllt:

Test

Kontrolle

Phosphatpuffer	2,6	ml	2,	7	ml
NADH₂	0,2	ml	0,	2	ml
Enzym (verdünnt)	0/1	ml	0,	1	ml
Substrat	0,1	ml

Enzym: verdünnt mit 0,1M Phosphatpuffer, pH 7,4, auf eine Konzentration von 0,1 bis 0,3 Einheiten/ml.

Substrat: 0,006M Oxaloacetat (frisch zubereitet).

Man löst 6,7 mg der Säure in 1 ml Phosphatpuffer (1,OM pH 7,4), titriert mit NaOH bis zum pH 7,4 und füllt auf ein Volumen von 10 ml auf.

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NADH₂: 0,00375M. Man verdünnt 50 mg NADH₂ und 240 mg THAM mit 15 ml H₃O, titriert in HCl auf pH 7,4 und füllt das Volumen auf 20 ml auf.

Phosphatpuffer: 0,1M, pH 7,4

Vor der Zugabe des Substrats wird das Instrument mit einer Kontrollküvette bei einer Absorption von 0,200 geeicht. Ablesungen werden in 15 Sekunden-Intervallen während 2 Minuten vorgenommen und die Anfangsgeschwindigkeit der Veränderung der Absorption pro Minute wird bestimmt.

Dieses Enzym hat eine sehr hohe Durchlaufszeit und ergibt deshalb hochempfindliche Untersuchungsergebnisse.

Viele andere Enzymuntersuchungen könnten ausgewählt werden, weil sie sich für geeignete Untersuchungsformen oder Substratverpackungen eignen. Dazu gehören: Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1.). Las synthetische Substrat p-Nitrophenylphosphat wird verwendet und kann leicht in Kapselform verpackt werden.

Man pipettiert 3,0 ml des Substrats in jeweils zwei 1 cm-Küvetten. Dann wird das Spektrophotometer auf eine Null-Absorption bei 410 mu eingestellt.

Enzym: verdünnt mit Wasser auf annähernd 0,005 mg/ml
mg/ml = ^A278 ^{x 1}'⁴³ (^{plocke et a1}' ¹⁹62),

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Substrat: O,OO1M p-Nitrophenylphosphat in 1,OM tris-Puffer, pH 8,0

Zur Zeit Null gibt man 0,1 ml der Enzymlösung zu der Testküvette und zeichnet die Absorptionsänderung auf. Der molare Absorptionsindex für p-Nitrophenol in 1,0M

4
tris, pH 8,0, ist 1,62 χ 10 . Eine Einheit ist die Aktivität, die 1 Mikromol p-Nitrophenol pro Minute unter den angegebenen Bedingungen bei 25°C freigibt. Bei dieser Reaktion wird ein gelbgefärbtes Produkt gebildet, das durch direkte visuelle Untersuchung nachweisbar ist.

Wegen seiner leichten Zugänglichkeit ist auch das Enzym Meerrettichperoxxdase (E.C. -1.11.1.7.) geeignet. Eine grosse Anzahl an Substraten und Untersuchungsformen ist für dieses Enzym geeignet. Ein Beispiel dafür ist: Man gibt 0,05 ml eines Farbstoffs zu 6,0 ml Substrat. Man gibt 2,9 ml in eine Testküvette und giesst den Rest in eine Kontrollküvette. Zur Zeit Null gibt man 0,1 ml des verdünnten Enzyms hinzu. Dann füllt man das Enzym in die Küvette aus einer 0,1 ml Pipette mit der Spitze unter die Oberfläche ein. Dann schüttelt man, indem man die Küvette mit Wachspapier abdeckt und umdreht. Die Absorption wird in 15 Sekunden-Intervallen während 1 bis 2 Minuten aufgezeichnet und der Grad der Änderung pro Minute wird bestimmt.

Substrat: Vorratslösung: 1 ml 30 %-iges H₃O₃ (Merck's Superoxol) verdünnt mit 100 ml H₂O. Für den Gebrauch verdünnt man 1 ml der H₂O₃-Vorratslösung auf 100 ml mit 0,1M

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Phosphatpuffer, pH 6,0 (wird täglich frisch zubereitet).

Farbstoff: 1 % o~Dianisidin in Methylalkohol (frisch in einer braunen Flasche).

Enzym: Vorratslösung: 1 mg/ml in Wasser. Unmittelbar vor der Verwendung verdünnt man 0,1 ml auf 250 ml.

Eine Einheit Peroxidaseaktivitat ist die Menge an Enzym, die ein Mikromol Peroxid pro Minute bei 25°C zersetzt.

Damit die Liposome in Immunoassays wirksam sind, ist es erforderlich, dass man sie sensibilisiert und an ihrer Oberfläche mit geeigneten Antigenen markiert. Antigene können kovalent gebunden sein oder liegen in anderen Formen an der Oberfläche von vorgebildeten Liposomen vor. Alternativ kann das Antigen kovalent an eine geeignete amphiphile Substanz gebunden sein und dieser Komplex wird in das Lipidgemisch, aus dem sich die Liposome bilden, gegeben. Im letzteren Fall wird die amphiphile Substanz in eine Lipid-Doppelschicht inkorporiert und das daran haftende Antigen erstreckt sich in die umgebende wässrige Lösung.

Werden Liposome vorgebildet, so können sie an ihrer äusseren Oberfläche verschiedene chemische Funktionen aufweisen, mittels welcher die Antigene kovalent gebunden werden können. Die wichtigsten solcher Funktionalitäten sind: Aminogruppen aus Phosphatidylethanolamin, Hydroxylgruppen aus Phosphatidylinosit, sowie Carboxylgruppen die sich von Fettsäuren oder Phosphatidylserin ableiten. Dies sind genau die

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Funktionalitäten, die an Proteinen zur Verfügung stehen und die man beim Kuppeln von kleinen Antigenen unter Ausbildung von Immunogenen ausnützt. Man kann somit die Antigene an vorgebildete Liposome durch traditionelle chemische Reaktionen unter Verwendung von bifunktionellen Kupplungsmitteln kuppeln, z.B. von Kupplungsmitteln, wie Glutaraldehyd, Diimidester, aromatische und aliphatische Diisocyanate, Bis-pnitrophenylester von Dicarbonsäuren, aromatische Disulfonylchloride und bifunktionelle Arylhalogenide, wie 1,5-Difluoro-2,4-dinitrobenzol; ρ,ρ¹-Difluorom,m'-dinitrodiphenylsulfon. Geeignete Reaktionen, die man bei solchen Kupplungen anwenden kann, werden von Williams et al in Methods in Immunology and Immunochemistry, Bd. 1, Academix Press, New York, 1967, beschrieben.

In einigen Fällen kann man Antigene auf den Liposomoberflachen adsorbieren. Dies ist bei gewissen Lipo-> polysacchariden der Fall, wie Uemura und Kinsky gezeigt haben (Biochemistry 11, 4Ο85-4Ο94, 1972). Dabei erhält man auch Antigene, die mit amphiphilem Lysolecithin der Klasse III gekuppelt sind.

Die Tatsache, dass man ein Antigen zuerst an ein ausgewähltes Amphiphilin, z.B. ein Phosphatidylethanolamin, Serin oder Inosit binden kann und dann zu der Lipidmischung gibt, aus welcher die Liposome gebildet werden, ist insofern äusserst bedeutungsvoll, als diese Kupplungsreaktion in einer Vielzahl von Lösungsmitteln durchgeführt werden kann. Beim Kuppeln von Antigenen an vorgeformte Liposome oder an Proteine (wie bei

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§103826

der Herstellung von Antigen) muss die Umsetzung immer in wässrigen Lösungen durchgeführt werden, weil organische Lösungsmittel die Proteine oder Liposome denaturieren oder zerstören. Wenn man z.B. ein einen Carboxylrest enthaltendes Antigen kuppeln möchte, so kann man das Säurechlorid des Antigens unter Verwendung von Thionylchlorid herstellen. Dieses Säurechlorid kann man dann an Phosphatidylethanolamin in Benzol als Lösungsmittel kuppeln. Diese Flexibilität bei der Auswahl des Lösungsmittels ermöglicht es, dass man einen breiten Bereich von Antigenen an Liposome kuppeln kann.

Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

Zur Herstellung von immunoreaktiven Liposomen, die an ihrer Oberfläche mit Dinitrophenylgruppen markiert sind, stellt man eine Mischung, enthaltend 40 mg L-°C-Lecithin (Produkt Nr.P5763, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), 11,6 mg Cholesterin (Produkt Nr. CH-S, Sigma Chemical Co.. lot. 57C - 7190), 2,18 mg Dicetylphosphat (Produkt Nr. D 2631 Sigma Chemical Co. lot 28 /Ö46q7) und 2 mg N-Dinitrophenylaminocaproylphosphatidylethanolamin (Avanti Biochemicals of Birmingham, Alabama, lot DCPE 17) in 6 ml Chloroform her. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck (Wasserstrahlpumpe) in einem 50 ml Kolben über einem

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Drehverdampfer unter Bildung eines dünnen Filmes des trockenen Lipids an der Innenoberfläche des Kolbens verdampft. Um eine vollständige Entfernung des Lösungsmittels sicherzustellen, wird das Verdampfen 30 Minuten bis zu dem Punkt fortgesetzt, bei dem der Lipidfilm sichtbar trocken ist. In den Kolben gibt man dann eine Lösung aus 4 mg Alkaliphosphatase (E.C. 3.1.3.1.) in 4 ml 0,01M Phosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 0,3M Glukose, und spült den Kolben mit Argon und versiegelt ihn dann. Der versiegelte Kolben wird zum Dispergieren des Lipidfilms vorsichtig geschüttelt. Der Lipidfilm verschwindet langsam von der Oberfläche des Kolbens und die wässrige Phase wird sichtbar trübe. Zu diesem Zeitpunkt wird der Kolben 2 Stunden bei 4°C gehalten. Liposome, die eingefangene Alkaliphosphatase enthalten, werden dann aus dem Enzym durch Zentrifugieren mit 27.000 G während 60 Minuten freigesetzt. Die überstehende Flüssigkeit wird dekantiert und das Granulat, welches die Liposome enthält, wird in einer isotonischen Kochsalzpufferlösung (0,01M Phosphat, pH 7,5, enthaltend 0,15M Natriumchlorid) wieder suspendiert. Eine weitere Reinigung kann man durch wiederholtes Zentrifugieren und Resuspendieren erreichen.

Das Ausmass, in dem das Enzym innerhalb solcher Liposome eingekapselt ist, wird durch die Detergenzlysisuntersuchung bestimmt. In Gegenwart des Detergenz Triton X-100, ein Produkt der Rohm & Haas Co., werden die Liposome aufgerissen und der Inhalt freigesetzt. Ein 10ul Aliquot der gereinigten Liposome wird zu 1 ml von 1 %-igem Triton X-100 in entionisiertem Wasser gegeben. Zur Kontrolle werden 10ul der Liposome zu

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1 ml isotonischer Kochsalzlösung gegeben. Das Enzym wird dann gemessen, indem man 50 bis 100 ul Aliquote dieser Verdünnungen zu 1 ml einer Lösung aus 0,4 mg/ml eines Substrates, nämlich p-Nitrophenylphosphat in 0,1M Borat bei pH 9,0 gibt. Die Hydrolyse des Substrates wird durch das Auftreten von p-Nitrophenol und eine zunehmende Lichtabsorption bei 410 nm überwacht. Man lässt die Reaktion während 10 Minuten ablaufen und beendet sie dann durch Zugabe von 1 ml 2N NaOH. Die durch die Detergenzlysis verursachte Enzymaktivität wird dann mit einer Kontrolle verglichen, zum Messen der Signal-zu-Geräusch-Charakteristik der Liposome. Für die vorerwähnte Zubereitung beträgt dieses Verhältnis mehr als 150, d.h. dass die Absorptionszunahme, die im Laufe von 10 Minuten durch das mittels des Detergenz gelösten Liposoms, 1,5 betrug, wobei die Kontrolle weniger als 0,01 Einheiten an Absorptionszunahme ergab.

In nachfolgenden Versuchen wurden ähnliche Liposome durch GeIfiltrationschromatografie anstelle durch Zentrifugieren gereinigt. 3 ml der Liposomzubereitung wurden auf eine Säule von 40 χ 1 cm von Sephadex G-200, die mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung ins Gleichgewicht gebracht worden war, geschickt. Die Liposome wurden dann aus der Säule nach einem Leervolumen (annähernd 50 ml) eluiert und waren gut getrennt von dem freien Enzym, das bei 30 ml zum Vorschein kam.

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Beispiel 2

Liposome werden durch eine Detergenzdialysemethode hergestellt. Ein Trockenfilm aus einem Gemisch aus 50 mg Eilecithin, 3,5 mg Cholesterin und 0,5 mg Dinitrophenylaminocaproylphosphatidylethanolamin in Chloroform wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Zu diesem Film wurden 5,5 ml einer Lösung gegeben, die 1 mg/ml Alkaliphosphatase in 0,05M Natriumphosphatpuffer, pH 7,5, enthielt und zusammen mit der Zugabe wurden auch 3,6 ml 10 mM Natriumdeoxycholat in Wasser gegeben. Der dieses Gemisch enthaltende Kolben wurde in ein Sonicatorbad während 5 Minuten bei 35 C eingetaucht und unter Argon beschallt. Man erhielt eine transparente opaleszierende Suspension. Das Deoxycholatdetergenz wurde durch Diafiltration unter Verwendung von Millipore-Immersible-Separator entfernt. 30 Volumina von 0,05M Phosphat, pH 7,5, wurden in die Suspension ausgetauscht unter Aufrechterhaltung eines konstanten Volumens von 9,1 ml. Die Liposome wurden weiter durch GeIfiltrationschromatografie gemäss Beispiel 1 gereinigt. In diesem Fall erhielt man ein Signal-zuGeräusch-Verhältnis von 225.

Beispiel 3

In diesem Beispiel wird versucht zu zeigen, dass mit geeignet zubereiteten Liposomen Antikörper, die gegen ein spezifisches Antigen gerichtet sind, durch Freigeben von Enzymaktivität gleichzeitig mit einer

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immunospezifischen Lysis auftritt, nachgewiesen werden können. Multilamellare Bläschen wurden in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise hergestellt und mit N-DinitrophenylamincaprylphosphatidyIethanolamin (5 %-ige Lecithinkonzentration) markiert- 5 ul davon wurden mit 100 ul Komplement (Meerschweinchenserum), 34 5 ul Puffer aus 50 mM tris-(Hydroxymethyl)-aminomethan, pH 7,5, enthaltend 0,15 Mol Natriumchlorid, 0,15 mM Kalziumchlorid und 0,5 mM Magnesiumchlorid, sowie mit 50 ul verschiedener Verdünnungen von Kaninchenantiserum bis zu dinitrophenyliertem Rinderserumalbumin vermischt. Als Kontrollen wurden Gemische eingeschlossen, bei denen normales Kaninchenserum durch Immunserum ersetzt worden war. Als weitere Kontrolle wurden Mischungen hergestellt, bei denen das Komplement durch Inkubieren bei 56 C während 30 Minuten inaktiviert worden war. Diese Mischungen wurden 15 Minuten bei 25°C inkubiert und dann wurden 100 ul Aliquote entfernt und zu den Röhrchen gegeben, die 1 ml einer Lösung aus 0,4 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 0,1M Natriumborat, pH 9,0, enthielten. Diese Röhrchen wurden 5 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Phosphatasereaktion wurde durch Zugabe von 1 ml 2M Natriumhydroxid beendet. Die Absorption von verschiedenen Röhrchen bei 410 nm wurde dann spektrophotaaetrisch festgestellt. Je grosser die Absorption ist, umso grosser ist die Menge an freigegebener Phosphatase und umso grosser ist das Ausmass der immunospezifischen Lysis.

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- 52 Gemisch Absorption bei 410 nm

Kontrolle:

Mischung enthaltend nichtimmunes (normales) Kaninchenserum 0,01

Kontrolle:

Mischung enthaltend wärmeinaktiviertes (normales) Kaninchenserum 0,01

Testmischung enthaltend Anti-

serum gegenüber dinitrophe-

nyliertem Rinderserumalbumin 1,2

Beispiel 4

In diesem Beispiel wird die immunospezifische Lysis von Liposomen zur Bestimmung der relativen Konzentrationen von spezifischen Antikörpern verwendet. Alle Bedingungen sind identisch mit denen in Beispiel 3, aber es wurden verschiedene Verdünnungen von DNP-BSA-Antiserum verwendet, um die Wirkung der unterschiedlichen Antikörperkonzentration auf. das Ausmass der durch das Komplement hervorgerufenen Lysis zu bestimmen.

Das Ausmass der Absorptionszunahem bei 410 nm in 5 Minuten wurde mit verschiedenen Verdünnungen untersucht und aufgezeichnet:

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Antiserumverdünnung 410 nm

1:50 1,5

1:75 1,4

1 :10O 1,15

1:200 0,65

1:300 0,30

Man kann somit diese Methode verwenden, um spezifische Antikörperniveaus zu bestimmen.

Beispiel 5

Um festzustellen, ob Antigen durch eine komplementbewirkte Lysis inhibiert wird und ob eine solche Inhibierung zur quantitativen Bestimmung von Antigenmengen in einer Testprobe verwendet werden kann, wurde die Verfahrensweise gemäss Beispiel .3 modifiziert und 50ul von DNP-Lysin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu dem anfänglichen Inkubierungsgemäsch gegeben. Wenn man eine Absorptionszunahme bei 410 nm in Abwesenheit von freiem DNP-Lysin als 100 %-ige Lysis festlegt, dann wurden mit unterschiedlichen Mengen an freiem Antigen die folgenden Prozentsätze einer Lysis festgestellt:

Freies DNP-Lysin (Picomole) % Lysis

6	83
9	69
13,5	56

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Freies DNP-Lysin (Picomole) % Lysis

18 48

27 33

36 23

In diesem Bereich besteht eine lineare Beziehung zwischen dem Prozentsatz der Lysis und dem Logarithmus der Antigenkonzentration. Analysiert durch lineare kleinste Quadratregression (linear least squares regression) wird die lineare Beziehung durch folgende Parameter ausgedrückt:

Steigung =33,3

y-Abschnitt ·- 143

Korrelationskoeffizient = 0,998
50 %-iges Auftreten bei 16,2 Picomol

Beispiel 6

Eine quantitative Immunoassay wird nach einem Einstufenverfahren durchgeführt, d.h. dass alle Reagentien einschliesslich dem Enzymsubstrat auf einmal zusammengemischt werden, so dass gleichzeitig die lytische und die enzymatische Reaktion stattfinden. Eine solche Einstufenmcthodo ist in der Praxis einfach durchzuführen und kann auch leicht automatisiert werden.

25 mg L-oC-Lecithin-Dipalmitoyl (Calbiochem-Behring Corp., LaJoIIa, Kalifornien), 8,6 mg Cholesterin (Sigma), 1,6 mg Dicetylphosphat (Sigma) und 1,5 mg Dinitrophenylaminocaproylphosphatidylethanolamin (Avanti) wurden in

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einem Chloroformlösungsmittel vermischt. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer entfernt und dabei bildete sich ein dünner Lipidfilm auf der Innenfläche eines 50 ml Rundkolbens. Dieser Film wurde dann in einer wässrigen Lösung, enthaltend 5 mg Alkaliphosphatase (Sigma) in 3 ml PBS-Dextrosepuffer dispergiert. Dann wurden die Liposome durch Zentrifugieren wie in den vorhergehenden Beispielen isoliert.

In ein einzelnes Reagenzglas wurden 2 Mikroliter dieser Liposome (20 Nanomol Phospholipid), 100 Mikroliter Meerschweinchenkomplement (verdünnt 1,8 in Komplementlysispuffer), 50 Mikroliter Kaninchenantiserum gegenüber DNP, 100 Mikroliter Puffer oder Standardlösung und 1 ml Phosphatasesubstrat gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert und dann wurde zur Beendigung der Enzymreaktion 1 ml 0,5N Natriumhydroxid zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde spektrophotometrisch gemessen. Das Ausmass, in dem die Reaktion von der Menge an DNP-Lysin abhängig war wird nachfolgend gezeigt:

Menge von DNP-Lysin (pmol) Absorption bei 405 nm

0	0,95
2,0	0,902
2,5	0,811
4	0,573
5	0,430
6	0,311
7	0,257

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Trägt man die 405 nm Absorption gegen den Logarithmus der Menge an DNP-Lysin auf, so erhält man eine gerade Linie mit einer Neigung von 66,8, einem Abschnitt (intercept) bei 143 und einen Korrelationskoeffizienten von 0,995. Eine 50 %-ige Inhibierung der Lysis wird mit 4 pmol DNP-Lysin erzielt.

Beispiel 7

In diesem Beispiel wird eine kinetische quantitative Bestimmung von Liposomen, wie sie in dem vorhergehenden Beispiel beschrieben wurde, zur quantitativen Bestimmung von Antigenen während der Messung des Grades der Enzymreaktion verwendet. In diesem Fall werden die Reagentien in den in Beispiel 6 angegebenen Mengen in einer Spektrophotometerküvette vermischt. Der Zeitverlauf der Enzymreaktion wird dann direkt überwacht. Nach einer typischen Verzögerungsphase nimmt der Grad der Absorptionszunahme bei 405 nm eine lineare Funktion der freien .Antikörperkonzentration an. Typischerweise gibt man in eine Spektrophotometerküvette 0,75 ml Phosphatasesubstratlösung, 50 Mikroliter Antikörper, 0,1 ml Komplement und 5 Mikroliter Liposome. Die Küvette wird dann in einen in einem Thermostat befindlichen Spektrophotometer gegeben und die Absorption bei 405 nm wird aufgezeichnet. Eine charakteristische Verzögerungsphase von 2 bis 3 Minuten wird festgestellt, während der sich die Absorption nur wenig verändert. Nach dieser Verzögerung nimmt die Absorption schnell zu. In weniger als 5 Minuten ist der Grad der Erhöhung

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einer Funktion der Menge an verfügbarem Antikörper.

Proteine und andere Makromoleküle können an Liposome gekuppelt werden. Solche Liposome mit an deren Aussenoberfläche anhaftenden Proteinen unterliegen einer durch Komplement bewirkten Lysis in Gegenwart von Antikörpern zu den eingebrachten Proteinen. Liposome lassen sich herstellen, die innerhalb der Membran zweischichtige Lipide haben, die geeignet sind zum Kuppeln mit Proteinen und anderen Makromolekülen. Typische Lipide, wie Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin oder Phosphatidylinosit wären geeignet.

Beispiel 8

Die in Beispiel 1 angewendete Methode wird zur Herstellung von Alkaliphosphatase enthaltenden Liposomen verwendet. In diesem Fall besteht das Lipidgemisch aus 25 mg Dipalmitoylphosphatidylcholin, 10 mg Phosphatidylethanolamin und 8,6 mg Cholesterin. Diese Liposome werden durch wiederholtes Zentrifugieren gereinigt und danach werden sie in 2 ml 0,1 M Boratpuffer von pH 8,5 resuspendiert. Zu dieser Suspension gibt man 20 Mikroliter 25 %-igen Glutaraldehyd. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch über Nacht gegen 2 Boratpuffer dialysiert. Die aktivierten Liposome gibt man dann zu 2,4 mg Rinderserumalbumin in 1 ml Boratpuffer. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C inkubiert und anschliessend werden die Liposome mit dem daran befindlichen Protein von ungebundenem Protein durch

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30-minütiges Zentrifugieren mit 25.000 G abgetrennt. Arbeitet man nach der Bestimmungsmethode gemäss Beispielen 3 und 4 unter Verwendung von Kaninchenantikörper gegenüber Rinderserumalbumin, so kann man eine Immunlysisuntersuchung vornehmen, durch welche Albumin quantitativ in Mengen von 0,1 bis 2ug/1 ml bestimmt werden können.

Beispiel 9

Zur Bestimmung des Herzglykosids wurde Digoxin an Dipalmitoylphosphatidylethanolamin gekuppelt. Zu diesem Endgemisch, enthaltend 0,5 g (0,64 iriM) Digoxin in 20 ml Ethanol/Dioxan (4:1 V/V) wurden 60 ml 0,1M Natriummetaperjodat gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann wurden 4,5 ml Ethylenglykol zugegeben. Das Gemisch wurde 1/2 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft. Der zurückgebliebene Feststoff wurde dreimal mit 50 ml Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden zusammengegeben (Gesamtvolumen 150 ml) und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft, wobei man 0,9 g eines öligen Rückstandes erhielt. 25 mg dieses Rohproduktes von Digoxindialdehyd in 1 ml Ethanol/Chloroform (1:4) wurden zu 20 mg Dipalmitoylphosphatidylethanolamin in 1 ml Ethanol/Chloroform (1:2) gegeben. Dann wurden 4 Tropfen Triethylamin zugegeben und das Reaktionsgemisch (pH 9) wurde über Nacht bei 37 C inkubiert und schliesslich wurde bis zu einem trockenen Rückstand unter vermindertem Druck eingedampft. Dieser Rückstand wurde in 2 ml Ethanol/Chloroform

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(1:1) suspendiert und dazu wurden 4 mg Natriumborhydrid gegeben. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und dann bis zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethanol trituriert und dann filtriert, wobei man ein FiItrat erhielt, aus dem 45 mg des verbundenen Produktes Dipalmitoylphosphatidyl-Phosphatidylethanolamin-Digoxin erhalten wurden.

Beispiel 10

Das verbundene Produkt aus Digoxin und Dipalmitoylphosphatidylethanolamin wird zur Herstellung von Liposomen mit Digoxin verwendet. In diesem Fall werden 22 mg Dimyristoylphosphatidylcholin, 8,6 mg Cholesterin, 1,6 mg Dicetylphosphat und 2,5 mg Digoxin-Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-Konjugat in 3 ml Chloroform gelöst. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft, wobei sich die Lipide als dünner Film, auf der Innenwand eines 100 ml Rundkolbens absetzen. Dieser Lipidfilm wird dispergiert, wie in Beispiel 1, und gereinigt wie in Beispiel 1.

Untersuchungen wurden wie in Beispiel 6 vorgenommen. Eine Inhibierung durch Digoxin in Proben wurde im Bereich von 0,5 bis 10 ng/ml Digoxin in der Testprobe beobachtet.

Liposome kann man erfolgreich gefrieren, wenn man sie zuerst in einem isotonischen Medium, wie 0,01M Phosphatpuffer, enthaltend 0,15M Natriumchlorid, suspendiert.

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Geeignet sind auch Lösungen, die im Bereich von pH

4 bis pH 10 gepuffert sind und O,3M Glukose oder ähnliche Kohlehydrate enthalten. Diposome, die in einem proteinhaltigen Medium gefroren sind und die beispielsweise Rinderserumalbumin oder Kaninchen-Gammaglobuline enthalten, werden nicht bevorzugt, weil sie erhöhte Niveaus an Enzymaktivität in Abwesenheit von lytischen Reagentien, wie Detergentien oder Komplement plus Antikörper, ergeben. Die besten Ergebnisse erzielt man durch Schnellgefrieren mit einer Geschwindigkeit von wenigstens 5°C/min. Vor dem Gefrieren werden die Liposome in einem isotonischen Medium in Konzentrationen von 1 bis 10 mg/ml suspendiert. Beispielsweise kann man die Liposome, wie sie in Beispiel 1 hergestellt wurden, in 0,01M Natriumphosphatpuffer, enthaltend 0,15M Natriumchlorid, suspendieren. Diese Suspension enthält 2,5 mg Gesamtlipid in 1 ml Flüssigkeit. 0,1 ml Aliquote dieser Mischung werden in eine

5 ml Ampulle gegeben. Sie werden dann auf -20 C mit einer Geschwindigkeit von 5°C/min gefroren. Die Liposome können aufgetaut werden und auch nach längerer Lagerung verwendet werden.

Es sind zahlreiche Ausführungsformen der Erfindung hier beschrieben worden, aber für den Fachmann ist es ersichtlich, dass zahlreiche Änderungen möglich sind. Bestimmte Konzentrationen, Kombinationen oder Materialien können variiert werden, solange das Signalzu-Geräusch-Verhältnis-Minimum gemäss der Erfindung aufrechterhalten bleibt, um falsche Ablesungen zu verhindern. Eine grosse Anzahl von Materialien kann in einem weiten Bereich von hochvolumigen Nachweisreaktionen

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durch verhäl'cnismässicj unqualifiziertes Personal untersucht werden.

Die zu untersuchenden Materialien können Körperflüssigkeiten oder Mischungen aller Art sein. Wird Serum getestet, so wird es vorzugsweise chemisch behandelt und/oder auch erhitzt,, um eine unerwünschte Inhibierung auszuschliessen. Eine vorherige Behandlung mit Aminogruppen stellt eine solche chemische Methode dar. Typischerweise gxbt man 0,1 ml von 2,54M Ammoniak zu 1,9 ml Serum zu und neutralisiert dann durch Zugabe von O,1 ml 2,54M Chlorwasserstoffsäure. Auch Sulfhydryl-Blockungsmittei können brauchbar sein. In diesem Fall gibt man zu 1 mi Serum 0,1 ml O,2M mercaptoethanolinphosphatgepufferte Kochsalzlösung. Dann gibt man 1 ml 0,2M Jodoacetamid hinzu. Ähnlich geeigner ist auch der Suifonsäureazofarbstoff Chlorazol-Echtrosa, der selektiv eine Humankomplementaktivierung, jedoch nicht Meerschweinchenkomplement inhibiert. Eine Wärmebehandlung von wenigstens 30 bis vorzugsweise 60 Minuten bei etwa 58°C ist gleichfalls geeignet, um eine unerwünschte Inhibierung der Komplementreaktion zu vermeiden.

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Claims

HOFFMANN · EfTKK & PARTNER

PATE NTAN WALTK 3 1 0 3 8 2 §

DR. ING. E. HOFFMANN (1930-1976) . DIPl.-l N G. W. EITLE · D R. R ER. NAT. K.H OFFMAN N · DIPL.-ING.W. LEHN

DIPL.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAl. B. HANSEN ARABELLASTRASSE 4 · D-8000 MO NCH EN Bl . TELEFON (089) 911087 · TELEX 05-29619 (PATH E)

34 524 o/wa

COLLABORATIVE RESEARCH, INC., WALTHAM, MASS. / USA

Immunoassayprodukte und deren Anwendung in Immunoassays

PATENTANSPRÜCHE

1^ Immunoreaktives Liposom, markiert mit einem Antigen oder dessen artverwandten Antikörper, durch welche ein Enzym abgeschirmt wird, mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5.
2. Immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 1, kombiniert mit dem Anderen des Antigen oder Antikörper .
3. Die Liposomkombination von Anspruch 2, bei der eine Mehrzahl von solchen Liposomen in Gegenwart

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eines Substrates für das Enzym vorliegen und gleichmässig darin verteilt sind.
4. Ein in Kombination gemäss Anspruch 3 vorliegendes Liposom, dadurch gekennzeichnet , dass die Liposome mit einem Antigen markiert sind.
5. Ein Liposom gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass die Liposome mit dem Antikörper markiert sind.
6. Ein Liposom gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zuGeräusch-Verhältnis im Bereich von 5 zu 1000 liegt.
7. Ein Liposom gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass das Antigen für klinische Diagnostik geeignet ist.
8. Ein Liposom gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe,bestehend im wesentlichen aus Oxidoreduktasen, Hydrolasen oder Gemischen davon.
9. Ein Liposom gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend im wesentlichen aus Alkaliphosphatase, Peroxidase, Malatdehydrogenase oder Mischungen davon.
10. Ein Liposom gemäss dem Liposom von Anspruch 1,

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dadurch gekennzeichnet , dass das Liposom aus einem Lipid gebildet wurde, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend im wesentlichen aus wasserunlöslichen, quellbaren Amphiphilen der Klasse II mit einem Sterol oder ähnlichen Klasse I-nichtquellenden Amphiphilen.
11. Ein Immuno-Testverfahren, dadurch gekennzeichnet , dass man eine Mischung herstellt aus:

(a) einem Liposom, das mit einem Antigen

oder dessen artverwandten Antikörper markiert ist, durch welches ein Enzym maskiert ist und ein Signal-zuGeräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 hat,

(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) ein auf die spezifische Aktivität des Antigens oder des Antikörpers dazu zu prüfendes Testmaterial, und

(d) Komplernent,

und die Anwesenheit oder Abwesenheit einer Enzymaktivität in dem Gemisch unter solchen Bedingungen bestimmt, bei denen eine Immunreaktion stattfindet und das Enzym gegenüber dem Substrat freigelegt wird.
12. Testverfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis

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durchgeführt wird in homogener Phase, ohne dass eine mechanische Abtrennungs- oder Reinigungsstufe erforderlich ist.
13. Testverfahren gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet , dass man in das Gemisch den anderen Partner aus dem Antigen oder dem artverwandten Antikörper dazu zugibt, um die Gegenwart oder Abwesenheit eines der artverwandten Produkte festzustellen.
14. Testverfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass der Nachweis in homogener Phase durchgeführt wird.
15. Testverfahren gemäss dem Verfahren von Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet , dass man eine Vielzahl von Versuchen durchführt mit unterschiedlichen Konzentrationen des zuletzt erwähnten artverwandten Stoffes, um dadurch eine quantitative Bestimmung des artverwandten Stoffes in dem Testmaterial zu ermöglichen.
16. Ein Immuno-Testverfahren, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Gemisch bildet aus:

(a) einem mit einem Antigen oder dessen artverwandtem Antikörper markiertes Liposom, enthaltend ein Enzym und mit einem Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 65,

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(b) ein Substrat für das Enzym,

(c) ein auf spezifische Aktivität des anderen Partners als dem Antigen oder dem artverwandten Antikörper zu prüfendes Testmaterial,

(d) Komplement,

und dass man die Gegenwart oder Abwesenheit einer Enzymaktivität in dem Gemisch in einer homogenen Phase nachweist.
17. Testverfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass man in das Gemisch den anderen Partner des Antigens oder des artverwandten Antikörpers zugibt, um die Gegenwart oder Abwesenheit des einen artverwandten Stoffes zu bestimmen.
18. Ein Immunoassay-Test-Satz zum Nachweisen von Antigen oder des artverwandten Antikörpers in einer Probe, wobei der Test-Sat2 enthält: einen Behälter, enthaltend Liposome, die mit einem Antigen oder einem artverwandten Antikörper dazu markiert sind und die zu bestimmen sind und ein Enzym markieren, und ein Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 5 aufweisen.
19. Ein Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , dass weiterhin ein Behälter für ein Substrat für das Enzym und ein Behälter, enthaltend Komplement für den Antikörper oder das Antigen, vorhanden sind.

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20* Ein Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass noch ein Behälter, enthaltend den artverwandten Stoff zu dem Antikörper oder dem Antigen, vorhanden ist.
21. Ein Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass er eine vorbestimmte Konzentration des artverwandten zu dem Antikörper oder Antigen (cognate of said antibody or antigen) enthält und als quantitativer Mechanismus zur Durchführung einer Immunoassayuntersuchung dient.
22. Ein Immunoassay-Test-Satz gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet , dass er ein Substrat für das Enzym enthält.
23. Ein Immunoassay-Test-Satz gemäss Ansprüchen 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 60 beträgt.
24. Ein immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet., dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 60 beträgt.
25. Ein immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.

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26. Ein immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
27. Ein immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
28. Ein immunoreaktives Liposom gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
29. Ein Immuno-Testverfahren gemäss Anspruch 11/ dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
30. Ein Immuno-Testverfahren gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
31. Ein Immuno-Testverfahren gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet , dass das Signal-zu-Geräusch-Verhältnis nicht weniger als 10 beträgt.
32. Ein Immuno-Test-Satz gemäss Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet , dass das Enzym ein

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Signal-zu-Geräusch-Verhältnis von nicht weniger als 10 hat.
33. Ein Immuno-Testverfahren zur Bestimmung von Antigen oder dessen artverwandten Antikörpers, dadurch gekennzeichnet , dass man ein Liposom, das mit dem Antigen oder dessen artverwandtem Antikörper markiert ist und das ein Enzym mit einem hohen Signal~zu-Geräusch-Verhältnis maskiert, mit einem Substrat und dem zu untersuchenden Material und mit einem Mittel, das eine Freilegung des Substrates gegenüber dem Enzym unter gewissen Testbedingungen ermöglicht, kombiniert.
34. Testverfahren gemäss Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet , dass das Verfahren ein homogenes Testverfahren ist.

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