KR20070074574A - 단일-가닥 항균성 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용 - Google Patents

단일-가닥 항균성 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용 Download PDF

Info

Publication number
KR20070074574A
KR20070074574A KR1020077009357A KR20077009357A KR20070074574A KR 20070074574 A KR20070074574 A KR 20070074574A KR 1020077009357 A KR1020077009357 A KR 1020077009357A KR 20077009357 A KR20077009357 A KR 20077009357A KR 20070074574 A KR20070074574 A KR 20070074574A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
odn
sequence
rbl
seq
vector
Prior art date
Application number
KR1020077009357A
Other languages
English (en)
Inventor
인 첸
씬 씽 탄
Original Assignee
사이토제닉, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 사이토제닉, 인크. filed Critical 사이토제닉, 인크.
Publication of KR20070074574A publication Critical patent/KR20070074574A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/11—Applications; Uses in screening processes for the determination of target sites, i.e. of active nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/30—Production chemically synthesised
    • C12N2330/31—Libraries, arrays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2330/00—Production
    • C12N2330/50—Biochemical production, i.e. in a transformed host cell

Abstract

본 발명은 미생물을 죽이거나, 그 성장을 저해하거나, 또는 내인성 발현되는 독소의 생산을 방지하는 rbl-1[SEQ ID NO: 19]로 명명된 서열로부터 분리된 올리고뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 스크리닝 방법을 이용하여 확인된 이들 ssDNA 서열은 트리플렉스 형성이나 안티센스 저해의 수준에서 작용하거나, 유전자 기능을 변경하는 앱타머로서 작용할 수 있는 필수 성장 기능의 조정제로서 작용하는 것으로 드러났다. 그 중에서도 특히, 최소 기능 영역 또는 MFR이라고 한 서열이 패혈증 및 패혈증과 같은 미생물에 의해 야기된 병리상태 및/또는 미생물이 기여 인자인 병리상태의 치료를 위한 치료제로서 유용하다.
Figure 112007031171240-PCT00008
항균제, 박테리아, 감염, 패혈증, rbl-1, ssDNA, 앱타머

Description

단일-가닥 항균성 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용{SINGLE-STRANDED ANTIMICROBIAL OLIGONUCLEOTIDES AND USES THEREOF}
새로운 항균 치료법에 대한 수요가 증가하고 있다. 항생제로 치료되는 많은 미생물 감염에서 항생제 내성이 증가하고 있으므로, 이러한 미생물 원인의 병리상태에 저항할 수 있는 새로운 접근법이 필요하다. 상이한 접근법들이 조사되고 있지만, 본 발명은 표적화된 단일-가닥 핵산의 사용을 포함한다. 올리고뉴클레오티드-매개 중재(OMI) 기술이 기지 서열의 어떤 유전자의 활성을 변경하는 강력한 도구를 제공한다. 선택된 세포에서 어떤 서열 및 길이의 단일-가닥 DNA(ssDNA)를 생산하는 능력은 유전자 발현의 표적화된 변경을 가능하게 하는데, 이것은 표적화된 유전자 발현을 위한 트리플렉스 형성 올리고뉴클레오티드를 사용해서는 게놈 수준에서, 안티센스와 DNA 효소 올리고뉴클레오티드를 사용해서는 메신저 RNA(mRNA) 수준에서, 그리고 앱타머(aptamer)로서 ssDNA를 사용해서는 단백질 수준에서 가능하다(Chen Y. 2002, Expert Opin. Biol. Ther. 2(7) 735-740).
어떤 OMI 전략의 효능을 결정하는 한 가지 주요한 변수는 표적 부위 접근성이다. 안티센스 및/또는 DNA 효소 설계와 관련해서 표적 mRNA 상의 접근가능한 부위를 확인하기 위한 여러 접근법들이 개발되었다. 종래에는 리니어 숏건 접근법을 사용하여 안티센스 ODN을 선택했는데, 이 경우 mRNA의 여러 영역에 대해 표적화된 몇 개의 ODN이 개별적으로 합성되고, 이들의 안티센스, DNA 효소 또는 그 외 다른 활성(또는 표적 부위에 대한 결합 친화성)이 측정된다. 그러나, 통상 ODN의 불과 2-5%만이 양호한 안티센스 시약인 것으로 밝혀졌다.
또한, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 활성 OMI 시약을 확인하기도 한다. 예를 들어, MFOLD와 같은 RNA 폴딩 프로그램을 이용하여 표적 RNA의 2차 구조가 예측된다(M. Zuker, 1989, Science, 244, 48-32). 안티센스 ODN은 분자내 염기쌍화로부터 자유로울 것으로 예측된 영역에 결합하도록 설계된다. 그러나, RNA 구조의 에너지-기초 예측법은 안티센스 시약을 설계하는데 매우 불충분하며, 이 접근법을 이용했을 때의 성공률은 제한적이었다.
리보뉴클레아제 H(RNase H)가 안티센스-매개 효과들에 연루된다는 증거가 이 효소를 사용하여 mRNA의 접근가능한 결합 부위를 확인하는 시험관내 과정을 발전시켰다. RNase H는 DNA:RNA 하이브리드에서 RNA의 포스포디에스테르 결합을 특이적으로 가수분해하는 엔도리보뉴클레아제이다. RNase H는 정해진 길이의 모든 가능한 ODN을 포함하는 완전한 세트의 무작위 ODN 라이브러리와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 길이 N에 대해서, 이 라이브러리 세트에는 N4 개의 상이한 ODN들이 있을 수 있으며, 따라서 40-mer ODN에는 약 2.56x106 개의 분자가 있게 된다. 라이브러리 중 표적 RNA 상의 접근가능한 부위에 상보하는 ODN 성분들이 RNA와 하이브리드를 생성하는데, 이것은 겔 전기영동에 의해 RNase H 절단 부위로서 확인된다. 예를 들어 AAAA...AAAA와 같은 ODN처럼, 라이브러리 중 대부분의 ODN들은 관심대상이 아니지만, 라이브러리 세트 구성원들은 만약의 경우를 대비하여 특이적 표적 mRNA에 대한 하향조절 효과를 야기하는지를 조사하기 위해서 시험된다. 원핵생물 세포의 테트라시클린 조절 시스템과 같은 제어된 유전자 발현 시스템이 선택적인 유전자 하향- 또는 상향-조절을 허용하고, 이에 따른 유전자 산물에 대한 정보를 제공한다.
Ji 등은 게놈 DNA를 공유함으로써 유래된 작은 스타필로코카 DNA 단편들(200 내지 800bp)의 라이브러리를 구성했다(Ji 등, 2001, Science, 293:2266-2269). 이 라이브러리를 Staphylococcus aureus로 형질전환함으로써 무작위 안티센스 RNA 분자들이 생성되었다. 이 접근법을 이용하여 Ji 등은 항생제 개발을 위한 표적으로서 사용할 수 있는 중요한 유전자를 확인했다. Forsyth 등에 의해서도 S. aureus에서 유사한 접근법이 사용되었다(Forsyth 등, 2002, Molecular Microbiology, 43: 1387-1400). 그러나, 이 접근법은 필수 유전자의 확인에만 사용될 수 있는데, 이는 1) RNA 분자의 불안정성; 2) 200-800bp 크기의 RNA 분자를 합성하는 어려움; 및 3) RNA를 적합한 세포로 송달하는 문제 때문에, 200-800bp 크기의 안티센스 RNA가 치료 목적에는 유용하지 않기 때문이다.
최근 DNA 서열화 기술의 진보는 병원성 박테리아의 전체 게놈 서열을 밝히는 것을 가능하게 했으며, 따라서 박테리아 및 다른 미생물-기초 질환에 저항할 수 있는 특이적 유전 도구의 설계를 위한 편리한 정보를 제공하는 것이 가능해졌다. 이들 도구는 전통적 항균 치료제에 대한 대안을 제공하며, 또한 바이러스, 원생동물, 진균, 미코플라스마 및 그 외 다른 것들을 포함하는 비-박테리아성 감염원의 효과 적인 치료법을 개발하기 위한 기반을 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 단일-가닥 발현 벡터를 포함하는 무작위 라이브러리를 구성하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 이 단일-가닥 발현 벡터 라이브러리를 이용하여, 발현되었을 때 세포 성장을 조절할 정도로 세포 기능을 충분히 변경할 수 있는 신규 ssDNA 서열 또는 ODN을 확인하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 세포 성장 및/또는 기능을 제어하기 위한 표적으로 사용할 수 있는 필수 박테리아 유전자, RNA 및 단백질을 확인하는 방법을 제공하는 것이다. 다음에, 이들 확인된 표적의 일부는 박테리아 감염에 저항할 수 있는 신규 치료제 개발의 도구가 될 수 있다.
계속해서, 본 발명의 또 다른 목적은 구성적으로 발현될 수 있거나, 또는 선택적 화학적 유도제를 이용한 유도성일 수 있는, 원핵생물 세포 내부에서 새로 확인된 ODN을 발현하는 벡터를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 진핵생물 숙주 내부에서 새로 확인된 ODN의 유사한 발현을 위한 벡터를 제공하는 것이며, 이로써 진핵생물 프로모터는 단일-가닥 ODN의 발현을 조절할 것이고, 이러한 프로모터는 유도성이거나 또는 구성적으로 발현될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 테트라시클린 시스템과 같은 보편적인 선택적-유도성 발현 벡터 시스템을 이용하여 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내부에서 발현을 선택적으로 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 스크리닝 방법을 실시함으로써 확인되는 신규 항균 표적의 확인을 제공하고, 박테리아 기원의 병리상태에 저항하기 위해 표현형 변경된 서열을 이용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 치료 조성물의 유효 활성 성분으로 사용될 수 있는 박테리아 성장 조절 서열로서 확인된 유용한 서열을 제공하는 것이다.
본 발명은 항생제-내성 박테리아에 대한 대안적 치료에 대한 필요성에서 새로운 접근법을 이용하는데, 이것은 원핵생물 숙주에서 ssDNA를 발현하도록 유도될 수 있는 선택적-유도성 단일-가닥 DNA(ssDNA) 발현 라이브러리를 구성하고 이것을 스크리닝하는 것을 수반한다. ssDNA 발현 라이브러리를 구성하는 방법, 및 이 라이브러리를 스크리닝하여, 박테리아 세포 성장 및/또는 독소 생산을 조절할 수 있는 기능적으로 유효한 ssDNA 분자를 확인하는 방법이 개시된다.
이 방법은 한 세트의 무작위 배열된 고정된 길이의 올리고디옥시뉴클레오티드(ODN) 가닥을 구성하는 단계, 및 이들 ODN을 단일-가닥 발현 벡터로 서브-클로닝한 다음, 세포로 형질전환하고 유도하여 세포 내부에서 발현하는 단계를 포함한다. 개별 단일-가닥 ODN(ss-ODN)의 발현을 위한 명령을 함유하는 세포가 콜로니로 성장되고, 대조군과 실험 세트로 따로 나눠진다. 실험 콜로니는 ODN 프로모터의 유도에 특이적인 화학적 유도제에 노출되고, 이로써 ODN이 단일-가닥 전사체로서 발현된다. 다음에, ss-ODN은 그것의 각 세포 표적(DNA, RNA 또는 단백질)과 상호작용할 수 있고, 필수 세포 성분과의 상호작용에 의해 잠재적으로 세포 기능을 변경할 수 있다. 만일 변경된 세포 기능이 원하는 관찰가능한 표현형을 만든다면, 변경된 표현형을 나타내는 콜로니를 DNA 공급원으로 사용하여 해당 표현형을 생산한 ss-ODN의 정확한 뉴클레오티드 서열을 결정할 수 있다.
이 방법은, 전사, 번역 또는 단백질 기능의 수준에서 세포 기능을 조절하는 필수 원핵생물 및 진핵생물 세포 성분을 특이적으로 표적화하는 ss-ODN을 확인하기 위해 사용된다. 박테리아 병원체에 관하여 사용되었을 때, 본 발명의 방법은 모든 종류의 병원성 박테리아의 성장에 저항할 수 있는 항균 치료요법에서 이용되는 새로운 서열을 확인하는 것을 가능하게 한다.
일단 유효한 ss-ODN이 박테리아 성장을 조절하는 것으로 확인되면, 이 ODN은 진핵생물 발현 시스템에 알맞게 설계된 유사한 단일-가닥 발현 벡터로 클로닝된다. 다음에, 이 두 번째 단계의 ODN-진핵생물 발현 벡터를 사용하여 박테리아로 시험감염된 사람, 동물 또는 식물을 처치함으로써, 이 수용자가 ODN-진핵생물 발현 벡터의 일정량에 노출되고, 숙주 세포에 의한 벡터의 내재화에 의해, 숙주 세포는 ODN을 발현하게 된다. 일단 ss-ODN이 발현되면, 그것은 숙주의 세포간 환경으로 분비될 수 있는데, 이때 그것은 표적 박테리아 세포와 접촉하고, 박테리아 세포에 의해 흡수되고, 조절성 박테리아 표적과 상호작용할 수 있으며, 이로써 박테리아 세포의 성장을 저해하거나 박테리아 독소의 생산을 저해할 수 있다.
이제 도면에 관해 설명한다.
도 1. 본 발명의 클로닝 벡터 중 일부의 도식도. (A) 클로닝 벡터 pssXG, 포유동물 ssDNA 발현 벡터 pssXE를 pssXE의 발현 카세트, 박테리아 tet 프로모터, 및 tRNAVal에 의해 초회감작된 원핵생물 PBS 서열(TGGTGCGTCCGAG)를 포함하는 원핵생물 ssDNA 발현 벡터로 변형한 것; (B) 클로닝 벡터 pssXTe, 유도성 진핵생물 tet 프로모터의 제어하에 진핵생물 벡터 pcDNA4/TO/myc-HisA(Invitrogen)로 서브-클로닝된 pssXE의 ssDNA 발현 카세트를 포함함.
도 2. DH5αpro 세포에서 aTc를 이용하여 유도된 역 전사효소(RT)의 발현. 표적화된 DNA 효소 벡터 pssXGb를 지닌 DH5αpro 세포를 0, 100, 또는 200ng/mL의 aTc의 존재하에 1시간(1-3 레인), 2시간(4-6 레인), 또는 3시간(7-9 레인) 동안 성장시켰다. 다음, aTc-처리 세포를 세포용해하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 RT 발현을 측정했다.
도 3. Chen 등, Antisense & Nuc Acid Drug Development, 10:415에 설명된 대로 RT-PCT을 이용하여 분석한 aTc-처리 세포에서 발현된 RT의 활성. RT-PCT 산물을 화살표로 표시한다.
도 4. 박테리아에서 Tet-유도성 무작위 ssDNA 발현 라이브러리의 스크리닝. (A) 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후 34㎍/mL Cm 및 50㎍/mL Spec를 함유하는 LB 평판 상에서 박테리아 형질전환체를 회수했다. 다음, LB 평판을 유도성(200ng/mL aTc) 및 비-유도성(aTc 없음) LB 평판 위에서 평판-복사-배양했다. 비-유도성 LB 평판 상에서는 정상적으로 성장했지만 유도성 평판 상에서는 성장하지 않은 화살표로 표시한 클론 CY01을 선택하여 더 이상 특성화했다. (B) 클론 CY01의 치사 표현형의 확인. LB 배지 중에 세포를 재현탁하고, 유도성 및 비-유도성 평판 상에서의 성장을 재시험하여 클론 CY01 세포 표현형을 확인했다. 대조군 세포는 pssXGb 벡터만을 함유한다.
도 5. 생체내 생성된 rbl-1에 의한 박테리아 세포 성장의 저해. (A) 생육가능한 세포 수를 측정하여, 박테리아 숙주 세포 내부에서 생성된 rbl-1에 의한 유도성 발현 및 박테리아 세포 성장 저해를 측정했다. CY01 세포는 0, 10, 50, 100, 또는 200ng/mL의 aTc의 존재하에 1시간 동안 성장되었다. 1시간 후 샘플 1mL를 취하여 이 배양물을 희석하고, 이들을 적합한 항생제를 함유하는 LB 평판 상에 3회 평판하여 생육가능한 세포 수를 측정했다. 다음, 평판을 37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후, 시각적으로 검사하여 콜로니 수를 세었다. 박테리아 세포 성장을 정사각형(CY01 세포) 또는 원형(대조군 CY01c 세포)으로 나타낸다. (B) 진핵생물 HeLa 숙주 세포 내부에서 rbl-1의 발현에 의한 HeLa 세포 배양물의 박테리아 감염 저해. 왼쪽 칼럼: rbl-1을 발현하는 형질도입 HeLa 세포 배양물, E. coli 감염 없음. 오른쪽 칼럼: rbl-1을 발현하는 형질도입 HeLa 세포 배양물, 105CFU/mL의 CY01 세포로 감염됨. HeLa 세포 배양물은 0, 50, 100, 또는 200ng/mL의 aTc의 존재하에 하룻밤 인큐베이션되었다.
도 6. rbl-1 결합 단백질의 확인. rbl-1 결합 단백질을 아비딘-비오틴 방법에 의해 정제했다. DH5αpro 세포 용해물을 500ng 비오틴화 rbl-1(3 레인) 또는 rbl-1c(2 레인)과 함께, 또는 첨가물 없이(1 레인) 인큐베이션한 후, 스트립토아비딘 아가로스 비드를 첨가했다. 비드에 결합된 단백질을 용출하여(50mM 트리스, pH 7.5, 100mM NaCl, 2M KCl, 및 4% 글리세롤) SDS-PAGE 분석했다. 제조자의 지시에 따라 SilverQuest 키트(Invitrogen, 캘리포니아 칼스배드)로 단백질을 은 염색하여 가시화했다. 약 160kDa(3 레인)의 분자량을 갖는 화살표로 표시한 단백질을 절제하여 서열을 확인했다.
도 7. rbl-1에 의한 RNAP 활성의 시험관내 저해. RNA 산물을 1% 아가로스 겔 상에서 분리했다. 1 레인, rbl-1이 없는 대조군; 2 레인, 0.5μM rbl-1; 3 레인, 0.25μM rbl-1; 4 레인, 0.125μM rbl-1; 5 레인, 0.05μM rbl-1; 6 레인, 0.5μM 대조군 rbl-1c.
더 상세히 말하면, 본 발명은 본원에 참고자료로서 그 전문이 포함되는 국제출원 No. PCT/US03/13593에서 이미 설명된 pssXE 단일-가닥 발현 벡터 시스템에 기초한 단일-가닥 DNA 발현 라이브러리의 구성을 고려한다. 본 발명에서는 박테리아 숙주 세포 내부에서 단일-가닥 올리고디옥시리보뉴클레오티드 서열(ss-ODN)의 발현을 유도하도록 설계된 새로운 단일-가닥 발현 벡터 pssXG가 구성되었다. pssXE 벡터를 사용해서는 진핵생물 숙주 세포에서 ss-ODN을 유도했던 반면, pssXG는 원핵생물 숙주 세포 내부에서 ss-ODN의 유사한 발현을 달성하기 위한 유도성 테트라시클린 프로모터 시스템 및 상이한 프라이머 결합 부위(PBS)를 함유한다.
실시예 1
유도성 원핵생물 ssDNA 발현 벡터의 구성
반전된 반복 서열, 관심 서열(SOI)을 위한 클로닝 부위, 역 전사효소 특이적 프라이머 결합 부위, 및 뮤린 말로니(Murine Maloney) 역 전사효소 유전자를 포함하는 발현 카세트의 PCR 증폭을 플라스미드 pssXE를 PCR 주형으로 사용하여 수행했다. PCR 반응에 사용된 DNA 프라이머,
5'NheIPvuIATG
CTAGCTAGCT AGCGATCGAT GGGACCAATG GGGCAG [SEQ ID NO: 1] 및
3'KpnI
CGGGGTACCA GTATTCCCTG GTC [SEQ ID NO: 2]
를 통합 DNA 기술(Coralville, 아이오와)에 의해서 합성했다. pssXE 벡터를 구성했는데, 이것은 국제출원 No. PCT/US03/13593에 상세히 설명되었고, PCR 증폭 방법은 국제출원 No. PCT/US04/17331에 이미 설명되었으며, 두 출원은 본원에 참고자료로서 그 전문이 포함된다.
PCR 증폭된 DNA 단편을 NheI와 KpnI로 이중 효소절단한 다음, 동일한 효소들로 이중 효소절단한 pssXE 벡터로 서브-클로닝했다. 이 치환으로 인해서 원핵생물 유전자 발현에 불필요한 번역 개시 부위(ATG) 앞의 서열이 제거되고, 새로운 제한 효소 부위 PvuI가 만들어진다. 새로 만들어진 구성물을 PvuI와 XbaI로 효소절단했다. ssDNA 생산을 위한 모든 필수 요소들을 함유하는 PvuI-XbaI 단편은, 1) 말단절단되었지만 충분히 활성인 RT를 코딩하는 마우스 몰로니(Mouse Moloney) 백혈병 바이러스 역 전사효소(MoMuLV RT) 유전자(Tanase & Goff, PNAS, 2000, 85:1777-1781); 2) MoMuLV RT에 의한 역 전사 개시에 필수적인 프로모터의 어떤 측면 영역과 함께 있는 프라이머 결합 부위(PBS)(Shinnick 등, Nature, 1981, 293:543-548); 3) 본원에 포함된 상기 언급된 국제출원 No. PCT/US04/017331에 설명된 모든 역 전사 반응을 종결하도록 설계된 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함한다. 이 DNA 단편을 pPROTet.E233 벡터(BD Bioscience, 캘리포니아 팔로알토)로 서브-클로닝했고, 이 새로 만들어진 구성물을 pssXG로 명명하고 도 1에 도시한다. 그러나, 박테리아 tRNAPro의 서열은 포유동물 세포에서 PBS와 결합하도록 설계된 포유동물 tRNAPro와는 상이하다. 박테리아 tRNAVal을 RT의 프라이머로서 이용할 수 있기 때문에, 새로운 PBS를 설계하여 포유동물 세포에서 사용되는 벡터 pssXE에서 사용된 PBS를 대체했다. 이 신규 PBS의 서열은 TGGTGCGTCCGAG[SEQ ID NO: 3]이며, 이 만들어진 구성물을 pssXGb로 명명했다(도 1B).
pPROTet.E233은 6xHN과의 융합 단백질을 발현하는 테트라시클린-유도성 박테리아 발현 벡터이다. 이것은 신규 프로모터 PLtetO1을 이용하는데, 이것은 매우 특이적인 Tet 억제인자 단백질에 의해 단단히 억제되고, 테트라시클린의 일종인 앤히드로테트라시클린(aTc)에 반응하여 유도되며, 이로써 넓은 범위에 걸친 유도 제어를 허용한다(앤히드로테트라시클린은 테트라시클린의 유도체로, PROTet.E 시스템의 더욱 강력한 유도제로서 작용한다). 34㎍/mL 클로로암페니콜(Cm) 및 50㎍/mL 스펙티노마이신(Spec)의 존재하에 박테리아 균주 DH5αPro(BD Bioscience, 캘리포니아 팔로알토)로 pssXGb 벡터를 형질전환했다. 스펙티노마이신을 사용하여 TetR을 암호화하는 전사 단위를 지닌 DH5αPro 세포들을 선택한다(Lutz & Bujard, Nucleic Acids Res., 1997, 25:1203-1210). 제조자의 지시에 따라 B-PER II 박테리아 단백 질 추출 시약(Pierce, 일리노이 록포드)을 사용하여 세포 용해물을 제조했다. 이 세포 용해물을 사용하여, 도 2에 도시한 Silver 등(Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3593-3594)에 따른 세포 용해물을 이용한 RT 활성 분석 및 도 3에 도시한 6xHN(BD Bioscience, 캘리포니아 팔로알토)에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 역 전사효소(RT)의 발현을 확인했다.
실시예 2
유도성 ssDNA 또는 ODN 발현 라이브러리의 구성
1:20:20의 몰비로 하기 3개의 ODN을 아닐링하여 라이브러리 삽입체를 생성했다:
CY(SacII)-40,
CTCTCACTCC(N)40ACTGTTGAAAGGC [SEQ ID NO: 4]
CY(SacII)-L,
CGGAGAGTGAGG [SEQ ID NO: 5] 및
CY(SacII)-R,
CTTTCAACAGT [SEQ ID NO: 6]
여기서 "N"은 염기 A, T, C, 또는 G 중 어느 것을 나타낸다. 이와 같은 40-mer 서열이 무작위로 합성되며, 이것을 CY(SacII)-40 ODN으로 표시한다. 모든 ODN을 혼합하여 95℃에서 3분간 변성한 다음, 약 1시간에 걸쳐 실온까지 서서히 냉각시켰다. CY(SacII)-L 보체는 CY(SacII)-40의 왼쪽 팔이고, CY(SacII)-R 보체는 동일한 ODN의 오른쪽 팔이므로, 이 아닐링 과정에서는 부분적 이중-가닥 ODN들이 형 성된다. 아닐링된 ODN은 부분적 이중-가닥 DNA를 형성했고, 이들의 나머지 단일-가닥 N들과 섞였으며, I형 DNA 중합효소 Large (Klenow) Fragment(New England Bio labs, 매사츄세츠 비벌리)를 사용하여 블런트 엔드형으로 되었다. 다음에, 이중-가닥 DNA를 pssXGb로 명명한 새로 만들어진 원핵생물 ssDNA 발현 벡터로 서브-클로닝한 후, 전기천공을 이용하여 박테리아 세포 DH5αPRO로 형질전환했다.
실시예 3
ssDNA 발현 라이브러리 스크리닝
37℃에서 하룻밤 인큐베이션한 후에 34㎍/mL Cm 및 50㎍/mL Spec를 함유하는 LB 평판 상에서 형질전환체를 회수했다. 다음에, LB 평판을 유도성(100ng/mL aTc) 및 비-유도성(aTc 없음) LB 평판 위에서 평판-복사-배양했고, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. LB 평판 상에서는 정상적으로 성장했지만 유도성 평판 상에서는 성장하지 못했거나 성장 결함을 나타낸 콜로니를 선택했다. 선택된 콜로니들을 유도성 및 비-유도성 평판 상에서 세포 성장 및 유도성 성장 저해에 대해 재시험하여 유도제-매개 성장 저해 효과를 확인했다. 약 5,000개의 형질전환체를 스크리닝했다. aTc가 존재했을 때 총 12개의 콜로니가 유도성 성장 저해를 갖는 것으로 확인되었다.
이들 콜로니로부터 플라스미드를 분리했고, 이 삽입체들을 다음과 같이 서열화했다:
Figure 112007031171240-PCT00001
aTc의 존재하에 클론 CY01에서는 치사 표현형이 유도되지만, 나머지 11개의 콜로니는 유도성 성장 결함을 나타냈다. 더 나아가, LB 배지 중에 세포를 재현탁하고, 유도성 및 비-유도성 편팡 상에서의 성장을 재시험하여 치사 표현형을 확인했다(도 4). 분리한 플라스미드를 AS080103으로 명명했는데, 이것은 61 뉴클레오티드 rbl-1 삽입체 CYGX080103을 포함하며, 이것의 서열은 다음과 같다:
CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG GGGAGTGAGA G
[SEQ ID NO: 19]
이것은 원래의 라이브러리 올리고머인 SEQ ID NO: 4, 5 및 6에 더하여 상기 SEQ ID NO: 18의 rbl-1로 명명한 무작위 합성된 40-mer ODN을 함유한다.
rbl-1c로 명명한 rbl-1에 상보하는 서열을 암호화하는 서열을 함유하는 것을 제외하고는 동일한 벡터를 포함하는 대조군 벡터 CY01c를 사용하여 rbl-1 서열에 의한 조절을 확인했다. 합성된 2개의 상보성 ODN을 아닐링하여, 아래의 최종 서열을 갖는 대조군 rbl-1c의 이중-가닥 삽입체를 생성했다:
TAACTTTCAA CAGTTTTGAT GACCTTTGCT GACCATACAA TTGCGATATC GTGGGGAGTG AGAGT
[SEQ ID NO: 20]
실시예 4
생체내 생성된 rbl -1에 의한 박테리아 세포 성장의 저해
rbl-1의 항균 효과를 더 특성화하기 위하여, 생체내 생성된 rbl-1에 의한 세포 성장 저해의 aTc 용량 반응을 조사했다. CY01 세포를 여러 농도의 aTc(0, 10, 50, 100, 또는 200ng/mL)의 존재하에 1시간 동안 성장시킨 후, 생육가능한 세포의 수를 세었다. rbl-1의 상보성 서열인 rbl-1c를 생성하도록 구성한 CY01c를 대조군 으로서 사용했다. 도 5는 rbl-1에 의한 세포 성장 저해가 aTc-농도 의존성임을 나타낸다. 그러나, 대조군 CY01c 세포에서 rbl-1c가 생성될 때는 세포 성장의 유의한 저해가 없었는데, 이는 이 저해가 rbl-1 서열 특이적이며, aTc에 의해 일어나는 것이 아님을 암시한다.
생체내 용도에 더욱 적합한 진핵생물 세포의 존재하에 RBL-1의 항균 가능성을 시험하기 위하여, HeLa 세포 배양 배지 중에서 CY01 세포의 성장을 시험했다. HeLa 세포 배양물을 여러 농도의 aTc(0, 50, 100, 또는 200ng/mL)의 존재하에 CY01 세포 105CFU/mL로 감염시켰다. 도 5에 나타낸 대로, 100ng/mL 이상의 aTc를 사용했을 때 충분한 rbl-1 카피가 생성되어 감염된 HeLa 배양물이 완전히 치유되었다.
실시예 5
rbl -1 표적화 분자(들)의 확인
무작위 ssDNA 발현 라이브러리 스크리닝을 통해 rbl-1로 명명한 항균성 ODN을 확인했다. rbl-1 항균 활성의 메카니즘을 이해하기 위하여, 유전자 서열 상동성 분석을 수행했다. RBL-1 서열의 작은 영역들이 공지의 GenBank 서열에 대해 상보성을 갖는 것으로 확인되었는데, 이는 이들이 가능한 표적이며, 이 생체내 확인된 표적 mRNA와의 가능한 혼성화를 통해서 rbl-1에 의해 안티센스 비활성화가 이루어짐을 시사한다. 10개 이상의 염기쌍 상동성을 갖는 이들 작은 ODN의 일부를 표 1에 나타낸다.
Figure 112007031171240-PCT00002
박테리아 세포에서 E. coli 유전자 btuE 및 CaiB에 대한 부분적 rbl-1 서열을 생성하도록 발현 벡터를 구성했지만, 이들 중 어느 것도 유전적 수준에서 어떤 저해 활성도 나타내지 않았으며, 이는 rbl-1이 오히려 중요 단백질이나 다른 구조 분자를 표적화함으로써 저해 효과를 나타낼 수 있음을 시사한다.
가능한 rbl-1 결합 단백질(들)을 확인하기 위하여, 친화성 정제 과정을 개발했다. DH5α 세포 용해물을 비오틴화 rbl-1과 함께 인큐베이션한 후, 스트렙토아비딘 아가로스 비드 위에 고정시켰다. 이 비드 복합체를 세척하고, 결합된 단백질을 용출시킨 후, SDS-PAGE에 의해 분별했다. rbl-1c과 함께 인큐베이션한 세포 용해물이나 아가로스 비드만을 대조군으로서 사용했다. 도 6에 나타낸 대로, rbl-1 결합 단백질의 친화성 프로파일은 두 대조군과는 상이했으며, 약 160kDa의 분자량을 가진 단백질(화살표로 표시)이 rbl-1과 특이적으로 결합한다. 이 단백질 밴드를 절제하여 나노-HPLC/전자분무 질량분광기로 분석했다. 표 2는 확인된 펩티드들 중 34개가 GenBank 데이터베이스의 박테리아 RNAP의 29개 영역에 집중된다는 것을 나타내며, 이는 RNA 중합효소가 가능한 rbl-1 결합 단백질임을 암시한다.
Figure 112007031171240-PCT00003
Figure 112007031171240-PCT00004
실시예 6
rbl -1에 의한 RNA 중합효소 활성의 시험관내 저해
rbl-1 또는 최소 기능 영역이 E. coli RNA 중합효소 활성을 직접 저해하는지를 시험하기 위하여, 중합효소 자체에 대한 40-mer rbl-1 ODN의 저해 효과를 시험관내 전사 분석을 행하여 평가했다. 도 7에 시험관내 RNA 전사 분석의 결과를 나타낸다. 0.05uM의 낮은 농도에서 RNA 산물을 관찰할 수 있었는데, 이는 이 농도에서 RNA 중합효소 활성을 충분히 시험관내 저해하지 못했음을 암시하는 것이다. 그러나, 0.125, 0.25, 및 0.5μM의 농도에서 rbl-1 ODN은 활성을 현저히 저해했다.
실시예 7
rbl -1의 최소 기능 영역( mfr )의 확인
rbl-1 ODN의 활성 저해 부분을 더욱 잘 확인하기 위하여, 일련의 말단절단된 rbl-1 올리고뉴클레오티드를 합성했고(표 3), 이들의 저해 활성을 시험관내 RNA 중합효소 활성 분석을 이용하여 평가했다. 먼저 다양한 길이의 3' 결실을 가진 말단절단된 rbl-1 올리고들을 합성했다. 5μM 농도에서는 rbl-1(1-35)과 rbl-1(1-30)만이 저해 활성을 나타냈고, rbl-1(1-25), rbl-1(1-20) 및 rbl-1(1-15)는 활성을 저해하지 않았다(표 3). 다음에, 5' 결실의 효과를 조사했다. rbl-1(26-40)을 제외한 rbl-1(6-40), rbl-1(11-40), rbl-1(16-40) 및 rbl-1(21-40)을 포함하는 모든 5' 말단절단된 rbl-1 올리고들이 활성이었다(표 3). 이들 시험관내 분석에 기초하면, rbl-1의 최소 기능 영역은, 7 내지 40 뉴클레오티드 길이 범위의 올리고, 바람직하게는 7 내지 15 올리고들을 포함하며, 여기에는 전장 영역이 포함될 뿐만 아니라, 뉴클레오티드 25-31, 바람직하게는 뉴클레오티드 21-32가 포함된다.
Figure 112007031171240-PCT00005
Figure 112007031171240-PCT00006
본 출원인은 rbl-1 및 그것의 활성 최소 기능 영역이 시험관내에서 박테리아 RNA 중합효소에 분명히 결합하여 그것의 활성을 저해한다는 것을 증명했지만, 당업자는 이들 ODN이 이 메카니즘에 의해서만 박테리아 세포의 성장 저해 효과를 발휘한다고 생각해서는 안 된다는 것을 인정할 것이다. 세포 내부에서 rbl-1 및 그것의 mfr들은 또한 다른 필수 핵산, 단백질, 펩티드, 탄수화물, 또는 본원에 설명된 성장 저해 표현형에 기여할 수 있는 다른 필수 성장 조절 화합물을 포함할 수 있는 추가의 세포 성분들과 상호작용할 수 있다.
또한, 당업자는 본원에 개시된 서열과 실질적인 상동성을 갖는 서열이 기능적 동등물일 것이며, 따라서 본 발명의 부분으로서 고려된다는 것을 본 명세서로부터 인정할 것이다. 이와 관련하여, 서열이 70% 이상의 염기-대-염기 뉴클레오티드 일치를 포함하거나, 또는 본원에 개시된 분석에 있어서 유사한 기능적 활성을 가지고, 제한은 없으나 성장 저해 및 시험관내 RNA 중합효소 활성의 저해를 포함하여, 관련된 성장 조절 활성을 가진다면, 이 서열은 상동성으로 간주된다.
실시예 8
pssXTe 진핵생물 ssDNA 발현 벡터의 구성
pssXE 벡터로부터 진핵생물 ssDNA 발현 카세트를 구성하기 위하여, XhoI 부위를 단백질 번역 부위 ATG 앞에 만들었다. pssXE 주형으로부터 PCR 증폭에 의해 DNA 단편을 생성했으며, 이때 사용한 프라이머는 다음과 같다:
5'NheIXhoIXbaIATG,
CTAGCTAGCT AGCGATCGAT GGGACCAATG GGGCAG [SEQ ID NO: 1] 및
3'KpnI,
CGGGGTACCAGTATTCCCTGGTC' [SEQ ID NO: 2]
다음에, 증폭된 PCR DNA 단편을 NheI와 KpnI로 효소절단하여, NheI와 KpnI로 이중 효소절단한 pssXE 벡터로 서브-클로닝했다. 결과의 중간체 플라스미드를 pss XE(NXX)로 명명했다. ssDNA 발현 카세트를 pcDNA4/TO/myc-HisA(Invitrogen에서 구입)로 서브-클로닝하기 위하여 이 벡터의 EcoRI 부위를 소실시켰다. 먼저 BamHI와 EcoRI로 pcDNA4/TO/myc-HisA 벡터를 효소절단한 다음, 하기 서열을 포함하는 이중-가닥 올리고를 이 효소절단한 벡터로 서브-클로닝했다. 이중-가닥 올리고의 서열은 다음과 같다:
5'-BamHI EcoRI(m),
GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGT [SEQ ID NO: 86] 및
3'-BamHI EcoRI(m),
GAATTACACC ACACTGGACT AGTG [SEQ ID NO: 87]
XhoI 효소절단 후 pssXE(NXX)로부터 ssDNA 발현 카세트를 분리하여, 상기 설명한 변형된 pcDNA4/TO/myc-HisA 벡터의 XhoI 부위로 서브-클로닝했다. DNA 서열화에 의해 ssDNA 발현 카세트의 정확한 배향을 확인했고, 이 새로 만들어진 벡터를 pssXTe로 명명했다. pssXTe 벡터는 진핵생물 세포에서 aTc로 유도가능한 ssDNA 발현 벡터이며, 진핵생물 세포에서 ODN의 제어된 유도성 발현을 가능하게 한다. ODN은 진핵생물 표적을 향할 수도 있고, 또는 동물의 진핵생물 숙주 세포에서 생산되어 발현 표적 조직에 따라 혈류나 그 외 체액으로 분비될 수 있는 원핵생물 표적을 향할 수도 있으며, 이로써 항균성 ODN이 병원체와 접촉하여 세포를 죽이거나 비활성화할 수 있거나, 또는 혈류 중에 분비된 박테리아 독소를 중화하는 작용을 할 수 있다.
본 발명은 박테리아 및 진균 병원체에 저항하기 위한 새로운 전략에 관한 것으로, 여기서는 선택 된 ODN 및 이들을 생산하는데 사용된 발현 플라스미드가 치료제로서 사용된다. 본 발명의 ODN 및 발현 플라스미드를 이용하여 성공적으로 치료되는 한 이러한 병원성 상태는 패혈증이다. 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 패혈증을 일으키는 미생물의 예들은, 제한은 없으나 폐, 복부, 혈류, 피부, 연조직의 감염, 혈관내 장치와 관련된 감염, 및 호흡기 감염을 일으키는 것들을 포함한다. 본 발명에 따라서 치료될 수 있는 다른 병원성 미생물의 예들은, 제한은 없으나 그람-음성 박테리아, 예를 들어 박테로이드, 푸소박테리움, 에스체리치아, 클레브시엘라, 살모넬라, 시겔라, 프로테우스, 슈도모나스, 비브리오, 레지오넬라, 헤모필루스, 보르데텔라, 브루셀라, 캄필로박터, 네이세리아, 브란하멜라; 그람-양성 박테리아, 예를 들어 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 펩토코쿠스, 바실루스, 리스테리아, 클로스트리듐, 프로피오네박테리아; 그람 염료로 약간 염색되거나 전혀 염색되지 않는 유기체, 예를 들어 미코박테리아, 트레포네마, 렙토스피라, 보렐리아, 미코플라스마, 클라미디아, 리케챠 및 콕시엘라; 및 진균들, 예를 들어 칸디다, 아스페르길로시스, 블라스토미코시스, 콕시디오이도미코시스, 크립토코코시스, 히스토플라스모시스, 파라콕시디오미코시스, 스포로트리쵸시스, 지고미코시스를 포함한다.
미생물이 원인 인자이거나 기여 인자인 병리상태의 치료 방법에서 이용되었을 때, rbl-1의 MFR들은 특정 병리상태, 원인 인자 또는 기여 인자, 감염된 개체의 종류(사람 대 동물), 감염된 개체의 상태, 및 전술한 명세서로부터 당업자에게 명백한 많은 다른 요인들에 따라 몇 가지 방식 중 어느 것으로 이용될 수 있다. 예를 들어, rbl-1의 MFR은 MFR을 포함하는 플라스미드의 다수 카피를 허용되는 희석제나 담체에 현탁하고, 상처에 분무하거나 상처를 담금으로써 감염된 개방창에 투여될 수 있다. 예를 들어, 폐의 박테리아 또는 진균 감염의 경우, 이 현탁액은 감염된 개체가 흡인하는 에어로졸로서 투여될 수 있다. MFR이 현탁된 서열, 현탁된 플라스미드 또는 다른 발현 벡터로서, 또는 본 분야에 공지된 많은 다른 방식으로 투여되는지와 무관하게, 애쥬번트가 유리하게 이용될 수도 있고, 다른 치료제(항균제나 항진균제 같은)가 희석제나 담체에 포함될 수도 있다.
또한, 당업자는 MFR이 펩티드와 콘쥬게이트될 수 있음을 인정할 것이며, 여기서 펩티드는 미생물 세포의 성장이나 기능을 기능적으로 변경하는 능력에 대해서 선택된 펩티드이다. 예로서, KFFKFFKFFK, FFKFFKFFK, LLKLLLKLLLK, KKFKVKFVVKKC, FFRFFRFFR, LLKLLKLLK와 같은 박테리아 표적화 펩티드 또는 다른 그러한 미생물 표적화 펩티드, 자연발생 또는 변형 아미노산을 포함할 수 있는 이들의 상동체 또는 유도체(Brogden, Nature Online Reviews, doi:10.1038/ nrmicrol098, 2005.2.10; Kaihatsu 등, Biochem 43:14340, 2004; Varra 및 Porro, Antimicrobial Agents and Chemo 40:1801, 1996; 미국특허 No. 5,652,211, 5,864,010, 및 6,548,651; 그리고 WO 2004/024757)가 미생물이 원인 인자이거나 기여 인자인 병리상태의 치료를 위한 콘쥬게이트에 유리하게 이용될 수 있다.
당업자는 본 발명의 구성요소/단계가 의도된 결과를 달성하도록 작용하는 방식을 변화시키지 않으면서, 본 발명의 구성요소 일부 및/또는 단계들이 변화될 수 있음을 본 명세서로부터 인정할 것이다. 모든 그러한 변화와 본 발명의 명세서로부터 당업자에게 명백한 다른 사항들은 하기 청구항의 범위 내에 들어가도록 의도된다.

Claims (56)

  1. rbl-1 삽입체 서열[SEQ ID NO: 19], rbl-1 서열[SEQ ID NO: 18] 또는 rbl-1 또는 rbl-1 삽입체 서열과 상동성인 서열로부터 분리된 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  2. 제 1 항에 있어서, 위치 20-23에서 위치 32-34까지 범위의 위치에 위치한 뉴클레오티드들로 시작하는 rbl-1[SEQ ID NO: 18]의 서열 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  3. 제 1 항에 있어서, 위치 7-40에 위치한 rbl-1[SEQ ID NO: 18]의 서열 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  4. 제 2 항에 있어서, 위치 25-31에 위치한 서열 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  5. 제 1 항에 있어서, 서열은 약 7 내지 약 15 뉴클레오티드 길이인 것을 특징으로 하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  6. 제 2 항에 있어서, 위치 25-31에 위치한 rbl-1의 서열 부분을 포함하는 것을 특징으로 하는 ss-DNA 또는 ds-ODN 서열.
  7. 세포에 도입되었을 때 RNA 중합효소 활성을 저해하는 기능을 하는 rbl-1 삽입체[SEQ ID NO: 19]의 서열에 상응하거나 또는 상동성인 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열을 포함하는 발현 벡터.
  9. 제 8 항에 있어서, 내부에 유도성 프로모터를 갖는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  10. 제 8 항의 발현 벡터가 도입된 세포.
  11. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 ss-ODN 또는 ds-ODN과 펩티드를 포함하는 콘쥬게이트.
  12. 제 11 항에 있어서, 펩티드는 박테리아 표적화 펩티드 또는 그 상동체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  13. 다음의 rbl-1 관련 서열 및 그들에 상동성인 서열들 중 하나 이상을 포함하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
    Figure 112007031171240-PCT00007
  14. 제 13 항의 ODN 또는 ss-ODN 서열 중 하나 이상을 포함하는 발현 벡터.
  15. 제 14 항에 있어서, 유도성 프로모터를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제 14 항에 있어서, 하류 프라이머 결합 부위를 인식하는 역 전사효소를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  17. 제 16 항에 있어서, 프라이머 결합 부위가 tRNAVal의 존재하에 역 전사효소에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  18. 제 14 항의 발현 벡터가 도입된 세포.
  19. 제 13 항의 ODN 또는 ss-ODN과 펩티드를 포함하는 콘쥬게이트.
  20. 제 19 항에 있어서, 펩티드는 박테리아 표적화 펩티드 또는 그 상동체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  21. 제 13 항의 ODN 또는 ss-ODN 서열 중 하나 이상을 포함하는 플라스미드, 플라스미드 유도체 또는 미니서클.
  22. 제 21 항에 있어서, tRNAVal의 존재하에 역 전사효소에 의해 인식되는 프라이머 결합 부위를 암호화하는 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  23. 제 21 항에 있어서, 플라스미드가 숙주 세포에 도입된 때, ODN 또는 ss-ODN 서열은 미생물 성장을 저해하거나, 미생물을 죽이거나, 또는 미생물에 의한 독소의 합성 또는 분비를 저해하는 기능을 하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
  24. 플라스미드 pssXTe.
  25. 제 24 항의 플라스미드가 도입된 세포.
  26. rbl-1 삽입체 SEQ ID NO: 19, rbl-1 SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 71(1-35), SEQ ID NO: 72(1-30), SEQ ID NO: 76(6-40), SEQ ID NO: 77(11-40), SEQ ID NO: 78(16-40), SEQ ID NO: 79(21-40), SEQ ID NO: 82(21-32), SEQ ID NO: 83(21-34), SEQ ID NO: 84(21-36) 및 SEQ ID NO: 85(21-38), 및 이들에 상동성인 서열로부터 선택된 분리된 뉴클레오티드.
  27. 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드와 펩티드를 포함하는 콘쥬게이트.
  28. 제 27 항에 있어서, 펩티드는 박테리아 표적화 펩티드 또는 그 상동체 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  29. 제 26 항의 올리고뉴클레오티드 중 어느 것으로부터 선택된 올리고뉴클레오티드인 rbl-1 삽입체 SEQ ID NO: 19의 단편을 포함하는 벡터.
  30. 제 29 항에 있어서, 벡터는 발현 벡터, 바람직하게는 유도성 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  32. 제 31 항에 있어서, 세포는 병원성 미생물인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  33. 치료요법에서 사용하기 위한 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터.
  34. 제 33 항에 있어서, RNA 중합효소 활성을 저해하기 위한 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드, 콘쥬게이트, 또는 벡터.
  35. 제 33 항에 있어서, 미생물 성장을 저해하거나, 미생물을 죽이거나, 또는 미생물에 의한 독소의 합성 또는 분비를 저해하기 위한 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드, 콘쥬게이트, 또는 벡터.
  36. 제 33 항에 있어서, 항미생물제, 항균제, 또는 항진균제로서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드, 콘쥬게이트, 또는 벡터.
  37. 제 33 항에 있어서, 패혈증의 치료에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드, 콘쥬게이트, 또는 벡터.
  38. 미생물, 박테리아, 또는 진균 병리상태를 포함하는 미생물, 박테리아, 또는 진균 감염 치료용 의약을 제조하기 위한 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터의 사용.
  39. 패혈증 치료용 의약을 제조하기 위한 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터의 사용.
  40. RNA 중합효소와 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하는 RNA 중합효소 활성의 시험관내 저해 방법.
  41. RNA 중합효소와 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터를 접촉시키는 단계를 포함하는 병원성 미생물의 성장을 저해하거나, 병원성 미생물을 죽이거나, 또는 병원성 미생물에 의한 독소의 합성 또는 분비를 저해하는 시험관내 방법.
  42. 미생물이 그람-음성 박테리아, 예를 들어 박테로이드, 푸소박테리움, 에스체 리치아, 클레브시엘라, 살모넬라, 시겔라, 프로테우스, 슈도모나스, 비브리오, 레지오넬라, 헤모필루스, 보르데텔라, 브루셀라, 캄필로박터, 네이세리아, 브란하멜라; 그람-양성 박테리아, 예를 들어 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, 펩토코쿠스, 바실루스, 리스테리아, 클로스트리듐, 프로피오네박테리아; 그람 염료로 약간 염색되거나 전혀 염색되지 않는 유기체, 예를 들어 미코박테리아, 트레포네마, 렙토스피라, 보렐리아, 미코플라스마, 클라미디아, 리케챠 및 콕시엘라; 또는 칸디다, 아스페르길로시스, 블라스토미코시스, 콕시디오이도미코시스, 크립토코코시스, 히스토플라스모시스, 파라콕시디오미코시스, 스포로트리쵸시스, 지고미코시스를 포함하는 진균들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 31 항에 따른 숙주 세포, 또는 제 41 항에 따른 시험관내 방법.
  43. 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터, 및 제약학적으로 허용되는 희석제, 애쥬번트, 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물.
  44. 제 26 항에 따른 올리고뉴클레오티드, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 콘쥬게이트, 또는 제 29 항에 따른 벡터, 및 다른 제약학적 제제 또는 항염제를 포함하는 패혈증 치료 키트.
  45. 제약학적으로 허용되는 희석제, 애쥬번트, 또는 담체 중에 rbl-1[SEQ ID NO: 18] 또는 rbl-1 삽입체[SEQ ID NO: 19]의 MFR을 조제하는 단계, 및 미생물과 MFR을 접촉시키는 단계를 포함하는 감염된 개체에서 패혈증의 치료 방법.
  46. 제 45 항에 있어서, MFR의 발현을 유도적으로 촉진하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 방법.
  47. 박테리아 원인 인자와 rbl-1[SEQ ID NO: 18] 또는 rbl-1 삽입체[SEQ ID NO: 19]의 MFR을 포함하는 발현 벡터를 접촉시키는 단계, 및 MFR의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 박테리아 감염의 치료 방법.
  48. 제 47 항에 있어서, MFR의 발현을 포유동물 또는 바이러스 역 전사효소를 이용하여 유도하는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 박테리아 세포와 RBL-1[SEQ ID NO: 18] 또는 rbl-1 삽입체[SEQ ID NO: 19]를 포함하는 발현 벡터를 접촉시키는 단계, 및 MFR의 발현을 유도하는 단계를 포함하는 박테리아 세포에서 RNA 중합효소 활성의 저해 방법.
  50. 진핵세포 tet 유도성 프로모터, 프로모터의 3'에 위치한 한 세트의 반전된 병렬 반복부, 반전된 병렬 반복부 세트의 3'에 위치한 관심 서열이 삽입되는 클로닝 부위, 클로닝 부위의 3'에 위치한 프라이머 결합 부위(PBS), 및 발현 종결 서열 을 포함하는, 진핵생물 숙주에서 ss-ODN을 발현하기 위한 ssDNA 진핵생물 발현 벡터.
  51. 제 50 항에 있어서, 발현 카세트의 하류에 위치한 프라이머 결합 부위를 인식하는 역 전사효소를 암호화하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 진핵생물 발현 벡터.
  52. 제 51 항에 있어서, 벡터는 pssXTe인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  53. ss-ODN으로서 박테리아 DNA 복제, 전사, 번역, 또는 단백질 또는 독소 활성을 방해하는 ss-ODN 또는 ds-ODN 서열.
  54. 제 53 항에 있어서, 서열은 박테리아 RNA 중합효소의 정상적인 생물학적 활성을 변경하는 것을 특징으로 하는 서열.
  55. 제 53 항에 있어서, 서열은 DNA 전사, RNA 프로세싱, RNA 번역, 또는 단백질 활성을 방해함으로써 박테리아 RNA 중합효소의 정상적인 생물학적 활성을 변경하는 것을 특징으로 하는 서열.
  56. 제 53 항에 있어서, 서열은 단백질 활성을 방해함으로써 박테리아 RNA 중합 효소의 정상적인 생물학적 활성을 변경하는 것을 특징으로 하는 서열.
KR1020077009357A 2004-09-28 2005-09-28 단일-가닥 항균성 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용 KR20070074574A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US61399904P 2004-09-28 2004-09-28
US60/613,999 2004-09-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070074574A true KR20070074574A (ko) 2007-07-12

Family

ID=36119612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077009357A KR20070074574A (ko) 2004-09-28 2005-09-28 단일-가닥 항균성 올리고뉴클레오티드 및 그의 사용

Country Status (10)

Country Link
US (2) US8828958B2 (ko)
EP (1) EP1802754A2 (ko)
JP (1) JP2008514204A (ko)
KR (1) KR20070074574A (ko)
CN (1) CN101076589A (ko)
AU (1) AU2005290337A1 (ko)
BR (1) BRPI0516118A (ko)
CA (1) CA2582814A1 (ko)
IL (1) IL182280A0 (ko)
WO (1) WO2006037127A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016072653A1 (ko) * 2014-11-06 2016-05-12 충북대학교 산학협력단 비브리오 피셔리 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050020526A1 (en) * 2003-06-03 2005-01-27 Cytogenix, Inc. Oligodeoxynucleotide intervention for prevention and treatment of sepsis
CN101991864B (zh) * 2010-10-29 2012-10-17 中国人民解放军第二军医大学 一种问号钩端螺旋体dna疫苗及其构建方法和应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5512435A (en) * 1993-02-05 1996-04-30 Renschler; Markus F. Receptor-binding antiproliferative peptides
AUPN178995A0 (en) * 1995-03-16 1995-04-13 University Of Melbourne, The Antigen composition
AU6298899A (en) * 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
BR9914772A (pt) * 1998-10-09 2001-12-11 Ingene Inc Conjunto de elementos genéticos, vetor, célulahospedeira, conjunto para a produção de umasequência de ácido nucléico, método para aprodução in vivo ou in vitro de uma sequência deácido nucléico, transcrição de cdna, molécula deácido nucléico inibidor, transcrição de mrna,molécula heteroduplex e composiçãofarmacêutica
BR0014814A (pt) * 1999-10-04 2002-09-17 Cytogenix Inc Método para alterar a expressão de uma seq ência alvo de ácido nucléico endógeno em uma célula alvo, transcrição de cdna e célula alvo
EP1383886B1 (en) * 2001-04-03 2008-07-30 Bristol-Myers Squibb Company D-hydantoinase from ochrobactrum anthropi
US20050020526A1 (en) * 2003-06-03 2005-01-27 Cytogenix, Inc. Oligodeoxynucleotide intervention for prevention and treatment of sepsis

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016072653A1 (ko) * 2014-11-06 2016-05-12 충북대학교 산학협력단 비브리오 피셔리 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CA2582814A1 (en) 2006-04-06
US20080206154A1 (en) 2008-08-28
WO2006037127A2 (en) 2006-04-06
IL182280A0 (en) 2008-03-20
CN101076589A (zh) 2007-11-21
JP2008514204A (ja) 2008-05-08
US20140371440A1 (en) 2014-12-18
WO2006037127A3 (en) 2006-08-24
EP1802754A2 (en) 2007-07-04
BRPI0516118A (pt) 2008-08-26
AU2005290337A1 (en) 2006-04-06
US8828958B2 (en) 2014-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1552018B1 (en) Methods and compositions relating to gene silencing
KR100235792B1 (ko) 트랜스-스플라이싱 리보자임
US10508276B2 (en) Methods and compositions for the production of siRNAs
JP2019030328A (ja) 非複製的形質導入粒子及び形質導入粒子に基づくレポーターシステム
WO2008140126A1 (ja) １本鎖環状ｒｎａおよびその製造方法
WO2000022114A1 (en) PRODUCTION OF ssDNA $i(IN VIVO)
RU2410431C2 (ru) Днк-конструкции для специфического ингибирования экспрессии генов посредством рнк-интерференции
Wang et al. Splice variants of the SIP1 transcripts play a role in nodule organogenesis in Lotus japonicus
US20140371440A1 (en) Single-stranded antimicrobial oligonucleotides and uses thereof
KR20060065580A (ko) 박테리아 및 진균 병리상태의 예방 및 치료를 위한뉴클레오티드
EP1384783A1 (en) Novel maxizyme
Braun et al. RNA processing
US20040248101A1 (en) Identification of novel antibacteria agents by screening the single-stranded DNA expression library
Pratte et al. Role of RNA secondary structure and processing in stability of the nifH1 transcript in the cyanobacterium Anabaena variabilis
US20080108109A1 (en) Biosynthesis of TA antibiotic
US20050136393A1 (en) Oligodoxynucleotide (ODN) libraries, their use in screening for antibacterial agents, and catalytic ODN sequence for use as an antibacterial agent
MX2007003664A (en) Single-stranded antimicrobial oligonucleotides and uses thereof
AU2004205192B2 (en) Production of ssDNA in vivo
EP1119615B1 (en) Production of ssdna inside a cell
US20070160581A1 (en) Production of ssDNA in vivo
AU2007249158A1 (en) Production of ssDNA in vivo
KR100469139B1 (ko) 엑디손 유도 발현 체계를 이용한 Ｃｄｃ25Ｂ2 또는Ｃｄｃ25Ｂ3을 과발현하는 형질전환 ＥｃＲ-293 세포주

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application