JP2008514204A - 一本鎖抗菌オリゴヌクレオチド、及びその利用 - Google Patents
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Abstract
本発明は、微生物を殺傷又はその生育を阻害、または内在性に発現される微生物の毒素合成を阻止する、rbl−1と命名された配列[配列番号19]から単離されたオリゴヌクレオチド配列に関する。スクリーニング法を用いて同定されたこれらのssDNAは、三量体形成、アンチセンス鎖による阻害、又はアプタマーのレベルで働いて遺伝子の機能を変化させ、必須の成長機能を調節していると推測される。最小機能領域、またはMFRと呼ばれる配列は、敗血症及びその他の微生物が一因となり引き起こされる疾患の治療薬として、特に有用である。
Description
本発明は、一本鎖抗菌オリゴヌクレオチド、及びその利用などに関する。
新規の抗菌治療法への需要が高まっている。多くの微生物感染は抗生物質治療を受けると、抗生物質耐性を増大させるため、新しい治療法が必要とされている。
様々な治療法が研究されているが、現在の開発は標的一本鎖DNA(ssDNA)の利用も含まれる。オリゴヌクレオチドを介した治療技術は、あらゆる配列既知の遺伝子の活性を変化させる、強力な手段である。選択された細胞において、あらゆる配列・長さの一本鎖DNA合成が可能であることから、遺伝子発現をゲノムレベルで、メッセンジャーRNAレベルで、そしてタンパクレベルで改変することが可能となった。
様々な治療法が研究されているが、現在の開発は標的一本鎖DNA(ssDNA)の利用も含まれる。オリゴヌクレオチドを介した治療技術は、あらゆる配列既知の遺伝子の活性を変化させる、強力な手段である。選択された細胞において、あらゆる配列・長さの一本鎖DNA合成が可能であることから、遺伝子発現をゲノムレベルで、メッセンジャーRNAレベルで、そしてタンパクレベルで改変することが可能となった。
OMI治療法の効率を決定する主要なパラメーターの一つは、標的部位へのアクセシビリティである。これまで、標的mRNAにおいてアクセス可能な部位を決定する様々な方法が開発されている。通常、リニアショットガン法がアンチセンスオリゴヌクレオチドを選択するために利用されてきた。この方法では、mRNAの様々な領域を標的としたいくつかのオリゴヌクレオチドを個々に合成し、そのアンチセンス、DNAエンザイム、またはそのほかの活性(または標的部位に対する結合親和性)を測定する。しかしながら、通常適したアンチセンス試薬として認められるものは2〜5%に過ぎない。
活性のあるOMI試薬を同定するため、コンピューター・プログラムも利用される。MFOLDのようなRNAフォールディング・プログラムを用いたRNAの二次構造予測などが例に挙げられる。アンチセンスODNは、分子内ペアリングが無いと予想される部分に結合するように設計される。しかしながら、エネルギー計算に基づくRNAの立体構造予測は、概してアンチセンス試薬を設計するには不十分であり、このような方法を用いた成功例は限られている。
リボヌクレアーゼH( RNaseH )がアンチセンスにより触媒される効果にかかわるという証拠から、この酵素をmRNAにおいてアクセス可能な結合部位のin vitroでの同定に用いる方法が開発された。RNaseは、DNA:RNAハイブリッド中のRNAのホスホジエステル結合を特異的に加水分解するエンドヌクレアーゼである。RNAseHは、規定の長さの、あらゆるODN一式で構成される無作為のODNライブラリーと組み合わせて利用可能である。
例えば、40塩基長のODNについて約2.56×106分子というように、長さNのオリゴヌクレオチドについて、ライブラリーセットには、互いに異なるNの4乗のODNが存在しうる。ライブラリーを構成するODNのうち、標的RNAのアクセス可能な部位に相補的であるものは、RNAとハイブリッドを形成し、ゲル電気泳動によってRNAse H切断部位として同定される。ライブラリーセット中のほとんどのODNは、AAAA…AAAAのように、全く重要性が無いものであるが、ライブラリーセットを構成するODNは、特定の標的mRNAに対し、少しでも下方制御の効果を示すか検定される。原核生物におけるテトラサイクリンシステムのように、制御された遺伝子発現系によって、選択的な遺伝子の発現抑制又は促進が可能となり、そのため遺伝子産物に関する情報を提供することが可能となる。
Jiらは小ブドウ球菌のゲノムDNAを切断して得られたDNA断片(200〜800塩基長)のライブラリーを構築した。ライブラリーを黄色ブドウ球菌に形質転換することで、無作為のアンチセンスRNA分子が生じた。この方法を用いて、Jiらは抗生物質の開発のための標的となりうる、重要な遺伝子を同定した。同様の方法はForsythらによって黄色ブドウ球菌で用いられている。しかしながら、この方法は必須遺伝子の同定にのみ有効である。200〜800塩基長のRNAは、以下の理由により医療目的には有用でないためである。すなわち、1)RNA分子の不安定性 、2)200から800塩基長のサイズのRNA分子の合成が困難であること、及び 3)適切な細胞にRNAを届けるという問題点がその理由である。
最近のDNA塩基配列決定技術の進歩によって、病原性バクテリアの全ゲノム配列を解明することが可能となった。また、それによって、バクテリアやその他の微生物が原因となって起こる病気を治療する特異的な遺伝的手段のデザインに有益な情報を提供することが可能となった。これらの手段は従来の抗菌療法の代替手段を与えるものであり、また、ウイルス、原虫、真菌類、マイコプラズマ、及びその他のバクテリア以外の感染体に対しても、同様に効果的な治療法の開発のための基礎を与えるものである。
そのため、本発明の目的は、一本鎖発現ベクターを含む無作為ライブラリーを構築する方法を提供することにある。
この一本鎖発現ベクターのライブラリーを発現することで細胞機能を改変し、細胞増殖が制御可能となるような新規ssDNA配列又はODN同定に利用することも、本発明の目的である。
本発明の他の目的は、細胞増殖、又は機能を制御するうえで標的となる、バクテリアの遺伝子、RNA、タンパク質を同定する方法を提供するものである。これら同定された標的のうちには、バクテリア感染に対する新規の治療法開発の助けとなるものもある。
結果として、本発明の別の目的は、原核細胞内で新しく同定されたODNを恒常的、又は選択的な化学物質による誘導により発現できるベクターを提供するものである。
新規に同定されたODNを、同様に真核細胞の宿主においても発現できるベクターを提供することも、本発明の目的である。この場合には真核細胞のプロモーター一本鎖DNAの発現を制御する。このようなプロモーターは、誘導性のものでも、または恒常的に発現されるものでも可能である。
本発明の更なる目的は、テトラサイクリンシステムのように、普遍的かつ選択的誘導が可能な発現ベクターを用いて、原核細胞又は真核細胞において選択的な発現制御の方法を提供するものである。
本発明のもうひとつの目的は、本発明のスクリーニング法を行うことで同定された新規の抗バクテリア標的を検証し、表現型を改変する配列を、バクテリアに由来する疾患を治療する目的で利用することである。
本発明の別の目的は、バクテリアの生育を制御すると同定された有用な配列を、治療薬の効果的な有効成分として利用されることを目的とし、提供することにある。
本発明は、抗生物質耐性バクテリアに対する代替療法の需要に対して、選択的に誘導可能な一本鎖DNA(ssDNA)発現ライブラリーの構築とスクリーニングを伴う新規の方法を提供するものである。この発現ライブラリーは、原核細胞の宿主中において、ssDNAを発現するよう誘導可能なものである。開示される情報はssDNA発現ライブラリーを構築する方法、及びライブラリーのスクリーニング法、機能的に有効な、バクテリア細胞生育、又は毒素の合成を制御できるssDNA分子を同定する方法である。
本方法は、一定の長さの、無作為に並べられた一連のオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)鎖を構築する過程と、一本鎖発現ベクターにこれらのODNをサブクローニングする過程を含む。この発現ベクターは細胞へと形質転換され、細胞内で発現を誘導される。個々の一本鎖ODNを発現できる細胞は、コロニーを形成するまで培養され、別個のコントロールと実験群に分離される。実験コロニー群はODNプロモーターの誘導に特異的な化学誘導物質を投与されODNを一本鎖の転写物として発現する。ss−ODNは細胞内の標的物質(DNA,RNA,又はタンパク質)と相互作用可能となり、必須の細胞構成物質との作用によって、細胞機能を改変する可能性がある。改変された細胞機能が目的とする表現型をもたらしていれば、改変された表現型を示すコロニーのDNAから、問題となる表現型を形成するss−ODNのヌクレオチド配列そのものを同定することができる。
本方法は、転写、翻訳、又はタンパク機能のレベルにおいて、細胞機能を制御するために必須の原核・真核細胞構成物質を標的とするss−ODNを同定するために用いられる。病原体バクテリアに対して用いられた場合、本発明の方法によって、すべての病原性バクテリアの増殖を阻害する目的で抗菌療法での利用が可能となる。
一旦バクテリアの増殖制御に有効なss−ODNが同定されれば、そのODNは、真核細胞の発現系用に設計された、同様の一本鎖発現ベクターにクローニングされる。この二段階の真核細胞ODN発現ベクターは、バクテリアに感染した患者、動物、又は植物の治療に用いられる。接種者は、真核細胞ODN発現ベクターを投与され、宿主細胞にベクターが取り込まれると、宿主細胞がODNを発現する。一旦ss−ODNが発現されると、ホストの細胞間にODNが分泌され、標的バクテリア細胞に接触する。バクテリア細胞にODNが取り込まれ、バクテリアの細胞機能を制御する標的に作用して、バクテリア増殖、又はバクテリア毒素の合成を阻害する。
図1は、本発明のクローニングベクターの模式図である。図1(A)に示されるクローニングベクターであるpssXGは、哺乳類のssDNA発現ベクターpssXEを、pssXEの発現カセット、バクテリアtetプロモーター、及びtRNAValにより結合される原核細胞のPBS配列(TGGTGCGTCCGAG)を含む原核細胞のssDNA発現ベクターとなるよう改変したものである。図1(B)に示されるように、クローニングベクターpssXTeは、誘導可能な真核細胞tetプロモーター下に、pssXEのssDNA発現カセットをサブクローニングして入れ込んだ真核細胞ベクターpcDNA/TO/myc−HisA(Invitrogen) を含む。
図2は、DH5αpro細胞内のaTcによる逆転写酵素(RT)の発現誘導を示す。標的となるDNAエンザイムベクターであるpssXGbを保持しているDH5αpro細胞は、0,100,又は200ngのaTc存在下で一時間(レーン1−3)、二時間(レーン4−6)、又は三時間(レーン7−9)培養された。aTc処理された細胞は、溶解され、ウエスタンブロット解析によってRTの発現を同定した。
図3は、aTc処理細胞において発現されたRTの活性を示す。この図3に示される活性は、ChenらによってAntisense & Nuc Acid Drug Development, 10: 415.に記述されているように、RT−PCRによって測定された。RT−PCR産物を矢印で示す。
図4は、バクテリアにおけるTet誘導を受けるssDNA発現ライブラリーのスクリーニングを示す。図4(A)に示されるように、形質転換されたバクテリアは34μg/ml Cm及び50μg/ml Spec含有LB培地にて37℃で一晩培養したのち回収された。このLBプレートは、誘導条件(200ng/ml aTc)及び非誘導条件(aTcなし)のLBプレートにレプリカ培養された。矢印で示されたクローンCY01は、非誘導条件のLBプレートでは普通に生育する。しかし、誘導条件のプレートにおいては増殖しないため、更なる解析対象として選ばれた。図4(B)は,クローンCY01の致死表現型の確認を示す。クローンCY01細胞の表現型はLB液体培地に細胞を再懸濁後、誘導条件、及び非誘導条件のプレートでの生育を再試験することで確認された。コントロール細胞はpssXGbベクターのみを持つ。
図5は、in vivoにおいて生成されたrbl−1によるバクテリア細胞増殖の阻害を示す。図5(A)に示されるように、rbl−1の発現誘導、及びバクテリア宿主細胞内で合成されたrbl−1によるバクテリア細胞増殖阻害効果は生存細胞数を測定することによって決定された。CY01細胞は0,10,50,100又は200ng/mlのaTc存在下で一時間培養された。サンプル1mlが一時間後採取、希釈され、生存細胞数を測定される。三通りの適切な抗生物質を含むLBプレートプレートは37℃で一晩培養したのち、目視検査によってコロニー数が数えられる。バクテリア細胞生育を四角で(CY01細胞)、又は円で(コントロールCY01c細胞)示す。図5(B)は、真核HeLa宿主細胞内におけるrbl−1の発現による、HeLa培養細胞へのバクテリア感染の阻害を示す。図5(B)の左に示されるように、rbl−1を導入され、発現するHeLa培養細胞はE.coliに感染しない。図5(B)の右は、rbl−1を導入され、発現するHeLa培養細胞105CFU/mlのCY01細胞に感染したものを示す。HeLa培養細胞として、0,50,100又は200ng/mlのaTc存在下で一晩培養され他者を用いた。
図6は、rbl−1結合タンパクの同定を示す。rbl−1結合タンパクはアビジン-ビオチン法によって精製された。DH5αpro細胞の溶解物を500ngビオチン化rbl−1、rbl−1c存在下、又は何も無い条件で培養した後、ストレプトアビジンアガロースビーズを添加した。ビーズに結合したタンパクを溶出し(50mM トリス、pH7.5、100mM NaCl、2M KCl、及び4%グリセロール)、SDS−PAGE解析を行った。製造者の使用説明書に従いSilverQuest kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用い、銀染色法によってタンパク質を可視化した。矢印で示した分子量〜160kDaのタンパク質について配列決定を行った。
図7は、rbl−1による、in vitroでのRNAP活性の阻害を示す。RNA産物は1%アガロースにて分離された。レーン1、rbl−1を含まないコントロール;レーン2、0.5μM rbl−1;レーン3、0.25μM rbl−1; レーン4、0.125μM rbl−1;レーン5、0.05μM rbl−1;レーン6、0.5μM コントロール rbl−1c。更に詳細には、本発明は、pssXE一本鎖発現ベクターシステムに基づき、一本鎖DNAの発現ライブラリーの構築することを意図している。
本発明においては、バクテリア宿主細胞内において一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド配列(ss−ODN)の発現を誘導する新規の一本鎖発現ベクター、pssXGが構築された。pssXEベクターはss−ODNを真核の宿主細胞において発現誘導する目的で利用されていたが、同様のss−ODNの発現を原核の宿主細胞内でも達成するため、pssXGは誘導性のテトラサイクリンプロモーター系、異なるプライマー結合部位(PBS)を保持している。
実施例1 誘導性原核ssDNA発現ベクターの構築
逆方向反復配列、興味の対象となる配列部位(SOI)、逆転写酵素特異的プライマー結合部位、マウスマロニー逆転写酵素遺伝子を含む発現カセットのPCR増幅を、プラスミドpssXEをPCR鋳型として用いて行った。PCR反応に用いたDNAプライマー、5’NheIPvuIATG
CTAGCTAGCTAGCGATCGATGGGACCAATGGGGCAG [配列番号;1]
及び3’KpnI
CGGGGTACCAGTATTCCCTGGTC [配列番号; 2]
を、総合DNA技術(Coralvilleら、IA)に基づいて合成した。pssXEベクターに関しては、国際出願番号PCT/US03/13593にその構成と詳細な記述がなされている。また、PCR増幅法に関しては、国際出願番号PCT/US04/17331に既に記述されている。どちらの出願書類も、参照することにより全体が本書のうちに組み込まれる。
逆方向反復配列、興味の対象となる配列部位(SOI)、逆転写酵素特異的プライマー結合部位、マウスマロニー逆転写酵素遺伝子を含む発現カセットのPCR増幅を、プラスミドpssXEをPCR鋳型として用いて行った。PCR反応に用いたDNAプライマー、5’NheIPvuIATG
CTAGCTAGCTAGCGATCGATGGGACCAATGGGGCAG [配列番号;1]
及び3’KpnI
CGGGGTACCAGTATTCCCTGGTC [配列番号; 2]
を、総合DNA技術(Coralvilleら、IA)に基づいて合成した。pssXEベクターに関しては、国際出願番号PCT/US03/13593にその構成と詳細な記述がなされている。また、PCR増幅法に関しては、国際出願番号PCT/US04/17331に既に記述されている。どちらの出願書類も、参照することにより全体が本書のうちに組み込まれる。
PCRにより増幅されたDNA断片に、NheI及びKpnIによる二重切断を行い、同様の酵素で二重切断したpssXEベクターにサブクローニングした。原核細胞の遺伝子発現に必須ではない翻訳開始部位(ATG)上流の配列を置換し、新規にPvuIの制限酵素サイトを入れ込んだ。新規に構築されたコンストラクトをPvuI及びXbaIにより切断した。ssDNA合成に必須の因子すべてを含むPvuI−XbaI断片は、1)不完全長かつ完全なRT活性を有するマウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素(MoMuLV RT)をコードする遺伝子(Tanase、Goff、PNAS,2000、85:1777−1781);2)プライマー結合部位(PBS)に加え、MoMuLV RTによる逆転写開始に必須の、プロモーター近傍部位(Shinnickら、Nature,1981、293:543−548);及び3)逆転写反応の終了のために設計されたステムループ構造を含む。これらすべては、本書に組み込まれた先述の国際出願番号PST/US04/017331に記述されている。このDNA断片はpPROTet.E 233ベクター(BD Bioscience, Palo Alto, CA)にサブクローニングされ、図1に示す新規に構築されたコンストラクトをpssXGと定めた。しかしながら、バクテリアtRNAProの配列は、哺乳類PBSと結合するよう設計された哺乳類tRNAProの配列と異なる。バクテリアtRNAValはRTのプライマーとして利用できるため、哺乳類細胞で用いられたpssXEベクターのPBSと置換する新規のPBSを設計した。
新規PBSの配列は
TGGTGCGTCCGAG [配列番号; 3]
であり、構築されたコンストラクトをpssXGbとした。(図1B)
pPROTet.E233はテトラサイクリン誘導性に6xHNと融合タンパクを発現するバクテリア発現ベクターである。このベクターは新規プロモーターPLtetO1を利用している。このプロモーターは高度に特異的なTetリプレッサータンパク質により厳密に抑制される。テトラサイクリンの一種であるアンヒドロテトラサイクリン(aTc)によって誘導され、広範囲にわたる誘導を操作できる(アンヒドロテトラサイクリンはPROTet.Eシステムにおいてより強力な誘導剤として働く、テトラサイクリンの誘導体である)。pssXGbベクターを、34μg/mlのクロラムフェニコール(Cm)と、50μg/mlのスペクチノマイシン(spec)存在下において、バクテリア株DH5αPro(BD Bioscience, Palo Alto, CA)に形質転換した。
TGGTGCGTCCGAG [配列番号; 3]
であり、構築されたコンストラクトをpssXGbとした。(図1B)
pPROTet.E233はテトラサイクリン誘導性に6xHNと融合タンパクを発現するバクテリア発現ベクターである。このベクターは新規プロモーターPLtetO1を利用している。このプロモーターは高度に特異的なTetリプレッサータンパク質により厳密に抑制される。テトラサイクリンの一種であるアンヒドロテトラサイクリン(aTc)によって誘導され、広範囲にわたる誘導を操作できる(アンヒドロテトラサイクリンはPROTet.Eシステムにおいてより強力な誘導剤として働く、テトラサイクリンの誘導体である)。pssXGbベクターを、34μg/mlのクロラムフェニコール(Cm)と、50μg/mlのスペクチノマイシン(spec)存在下において、バクテリア株DH5αPro(BD Bioscience, Palo Alto, CA)に形質転換した。
スペクチノマイシンを、TetR(Lutz、Bujard、Nucleic Acids Res.,1997,25:1203−1210)をコードする転写ユニットを有するDH5αPro細胞を選択するために用いた。DH5αPro細胞は、限られた量のTetリプレッサーを発現する。細胞の溶解物を、B−PER II Bacterial Protein Extraction Reagent(Pierce, )Rockford, IL)を用い、メーカーの使用説明書に従って調整した。逆転写酵素(RT)の発現を、細胞溶解物を用いて、図2に示すようにSilverら(Nucleic Acids Res., 1993,21:3593−3594)によるRT活性測定、及び図3に示す、抗6xHN抗体(BD Bioscience, Palo Alto, CA)を用いたウエスタンブロット解析によって確認した。
実施例2. 誘導性ssDNA又はssODN発現ライブラリーの構築
ライブラリーのインサートを、以下の3つのODNのアニーリングによって生成した。
CY(SacII)−40,
CTCTCACTCC(N)40ACTGTTGAAAGGC [配列番号: 4]
CY(SacII)−L,
CGGAGAGTGAGG [配列番号: 5]
及びCY(SacII)−R,
CTTTCAACAGT [配列番号: 6]
モーラー比は1:20:20で行った。
ライブラリーのインサートを、以下の3つのODNのアニーリングによって生成した。
CY(SacII)−40,
CTCTCACTCC(N)40ACTGTTGAAAGGC [配列番号: 4]
CY(SacII)−L,
CGGAGAGTGAGG [配列番号: 5]
及びCY(SacII)−R,
CTTTCAACAGT [配列番号: 6]
モーラー比は1:20:20で行った。
ここで、“N”はA,T,C,又はGの任意の塩基を表す。すなわち、40塩基長の、無作為に合成された配列がCY(SacII)−40ODNと表される。すべてのODNを混合し、95℃3分で変性したのち、ゆっくりとおよそ一時間、室温まで冷却した。CY(SacII)−L がCY(SacII)−40の左端に相補的であり、CY(SacII)−Rは同一のODNの右端に相補的であることから、アニーリング過程において、部分的に二本鎖ODNが形成される。アニールしたODNは部分的な二本鎖DNAを形成し、DNAポリメラーゼI、ラージ(クレノー)フラグメント(New England Biolabs, Beverly , MA)を用いて残りの一本鎖のN塩基が埋められ、平滑末端化された。二本鎖DNAを新規に構築された原核ssDNA発現ベクター、pssXGbにサブクローニングし、バクテリア細胞DH5αProにエレクトロポレーションによって形質転換した。
実施例3.ssDNA発現ライブラリーのスクリーニング
形質転換体を34μg/mlCm及び50μg/mlのSpecを含むLBプレートで37℃一晩培養することにより回収した。このLBプレートをレプリカプレート法によって誘導条件(100ng/ml aTc)及び非誘導条件(aTc無し)のLBプレート上に写し取り、37℃において一晩培養した。LBプレート上で通常に生育し、なおかつ誘導条件のプレートでは生育しない、又は生育異常を示すコロニーを選択した。誘導剤による生育阻害効果は、選択されたコロニーの細胞増殖をと誘導による生育阻害を誘導条件、非誘導条件のプレート上で再試験することで確認された。およそ5000の形質転換体についてスクリーニングを行った。総合で12のコロニーがaTc存在下で誘導性の生育阻害を持つものとして同定された。
それらのコロニー由来のプラスミドを分離した。そのインサートの配列は以下のとおりである。
形質転換体を34μg/mlCm及び50μg/mlのSpecを含むLBプレートで37℃一晩培養することにより回収した。このLBプレートをレプリカプレート法によって誘導条件(100ng/ml aTc)及び非誘導条件(aTc無し)のLBプレート上に写し取り、37℃において一晩培養した。LBプレート上で通常に生育し、なおかつ誘導条件のプレートでは生育しない、又は生育異常を示すコロニーを選択した。誘導剤による生育阻害効果は、選択されたコロニーの細胞増殖をと誘導による生育阻害を誘導条件、非誘導条件のプレート上で再試験することで確認された。およそ5000の形質転換体についてスクリーニングを行った。総合で12のコロニーがaTc存在下で誘導性の生育阻害を持つものとして同定された。
それらのコロニー由来のプラスミドを分離した。そのインサートの配列は以下のとおりである。
なお,表中,「SEQ ID NO」は,配列番号を意味する。致死表現型はaTc存在下において、クローンCY01で誘導されたが、残りの11コロニーについては、生育異常が誘導された。致死表現型はLB液体培地に細胞を再懸濁し、誘導条件、非誘導条件のプレートにおいて細胞の生育を再試験することによって確認された(図4)。61ヌクレオチドのrbl−1インサート、CYGX080103から構成される、単離されたプラスミドをAS080103と命名した。このインサートは以下の配列を有する。
CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG
GGGAGTGAGA G [配列番号19]
この配列はもともとのライブラリーオリゴマー、配列番号4,5及び6に加えて、さらに無作為に合成され、rbl−1と命名された前述の40塩基長ODN、配列番号18を含む。
コントロールベクターであるCY01cは、同一のベクターから成るが、rbl−1に相補的な配列をコードする配列を有する。コントロールrbl−1cの二本鎖インサートは二つの相補的に合成されたODNをアニーリングすることで得られた。このODNの最終的な配列は
TAACTTTCAA CAGTTTTGAT GACCTTTGCT GACCATACAA TGCGATATC
GTGGGGAGTG AGAGT [配列番号20]
である。
CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG
GGGAGTGAGA G [配列番号19]
この配列はもともとのライブラリーオリゴマー、配列番号4,5及び6に加えて、さらに無作為に合成され、rbl−1と命名された前述の40塩基長ODN、配列番号18を含む。
コントロールベクターであるCY01cは、同一のベクターから成るが、rbl−1に相補的な配列をコードする配列を有する。コントロールrbl−1cの二本鎖インサートは二つの相補的に合成されたODNをアニーリングすることで得られた。このODNの最終的な配列は
TAACTTTCAA CAGTTTTGAT GACCTTTGCT GACCATACAA TGCGATATC
GTGGGGAGTG AGAGT [配列番号20]
である。
実施例4.in vivoで合成されたrbl−1による、バクテリア細胞の生育阻害
rbl−1の抗菌効果を更に解析するため、in vivoにおいて合成されたrbl−1による生育阻害のaTc投与量反応を調べた。CY01細胞を様々な濃度のaTc存在下(0,10,50,100,又は200ng/ml)において一時間培養し、生存可能な細胞を数えた。rbl−1の相補鎖rbl−1cを発現するよう構築されたベクターであるCY01cをコントロールとして用いた。図5から、rbl−1による細胞の生育阻害はaTc濃度依存であることが示される。しかしながら、rbl−1cがコントロールのCY01c細胞において合成された場合には有意な生育阻害が見られないことから、rbl−1による阻害は配列特異的であり、aTc投与によるものではないことが示唆される。
真核細胞存在下におけるRBL−1の抗バクテリア能力を検討するため、CY01細胞のHeLa細胞培地における生育をテストした。真核細胞存在下での抗菌能力はより生体への応用に関わるものである。HeLa細胞培養液を、様々な濃度(0,10,50,100,又は200ng/ml)のaTc存在下で105CFU/mlのCY01細胞に感染させた。図5に示されるように、100ng/ml、又はそれ以上の濃度のaTcを投与した場合、感染したHeLa培養液を完全に回復するために充分なコピー数のrbl−1が合成された。
rbl−1の抗菌効果を更に解析するため、in vivoにおいて合成されたrbl−1による生育阻害のaTc投与量反応を調べた。CY01細胞を様々な濃度のaTc存在下(0,10,50,100,又は200ng/ml)において一時間培養し、生存可能な細胞を数えた。rbl−1の相補鎖rbl−1cを発現するよう構築されたベクターであるCY01cをコントロールとして用いた。図5から、rbl−1による細胞の生育阻害はaTc濃度依存であることが示される。しかしながら、rbl−1cがコントロールのCY01c細胞において合成された場合には有意な生育阻害が見られないことから、rbl−1による阻害は配列特異的であり、aTc投与によるものではないことが示唆される。
真核細胞存在下におけるRBL−1の抗バクテリア能力を検討するため、CY01細胞のHeLa細胞培地における生育をテストした。真核細胞存在下での抗菌能力はより生体への応用に関わるものである。HeLa細胞培養液を、様々な濃度(0,10,50,100,又は200ng/ml)のaTc存在下で105CFU/mlのCY01細胞に感染させた。図5に示されるように、100ng/ml、又はそれ以上の濃度のaTcを投与した場合、感染したHeLa培養液を完全に回復するために充分なコピー数のrbl−1が合成された。
実施例5.rbl−1の標的となる分子の同定
無作為に構築されたssDNA発現ライブラリーのスクリーニングを通して、抗バクテリアODN、及びrbl−1が同定された。このrbl−1の抗菌活性の機構を理解するため、遺伝子配列の相同性解析を行った。RBL−1のより小さな領域が既知のGenBank配列に相補性を持つと同定され、生体内において、rbl−1 ODNが標的mRNAにハイブリダイズして、アンチセンスの不活性化を行う標的の候補と考えられた。これらの、10、又はそれ以上の塩基対相同性を持つより小さなODNを表1に示す。
無作為に構築されたssDNA発現ライブラリーのスクリーニングを通して、抗バクテリアODN、及びrbl−1が同定された。このrbl−1の抗菌活性の機構を理解するため、遺伝子配列の相同性解析を行った。RBL−1のより小さな領域が既知のGenBank配列に相補性を持つと同定され、生体内において、rbl−1 ODNが標的mRNAにハイブリダイズして、アンチセンスの不活性化を行う標的の候補と考えられた。これらの、10、又はそれ以上の塩基対相同性を持つより小さなODNを表1に示す。
表1 既知の標的mRNAに対し相補的なrbl−1のサブ配列
発現ベクターはバクテリア細胞内において、E.coliの遺伝子btuE,CaiBに対して部分的なrbl−1配列を合成するように構築されたが、いずれも遺伝子レベルでばいかなる阻害効果も示さなかった。このことから、rbl−1は重要なタンパク質、又はその他の構造分子を標的として阻害効果を示す可能性がある。rbl−1の標的となる可能性があるタンパク質を同定するため、アフィニティー精製手順が開発された。DH5α細胞溶解物をビオチン化rbl−1とともにインキュベートし、ストレプトアビジンアガロースビーズ上に固定した。ビーズ複合体を洗浄し、結合したタンパク質溶出し、SDS−PAGEによって分画した。コントロールとして、rbl−1c又はアガロースビーズのみとインキュベートした細胞溶解物を用いた。図6に示すように、rbl−1結合タンパク質のアフィニティープロファイルは、どちらのコントロールとも異なっており、分子量〜160kDaのタンパク質(矢印で示す)が特異的にrbl−1に結合する。このタンパク質のバンドはNano−HPLC/エレクトロスプレー質量分析法によって解析された。表2は同定された3タンパク質のうち、34個がGenBankデータベースにおいてバクテリアRNAPの29箇所に局在しており、このことからRNAPが、rbl−1に結合する可能性を持つタンパク質であることが示唆される。
表2 rbl−1結合タンパク、RNAPのペプチド配列
実施例6.In vitroにおける、rbl−1によるRNAポリメラーゼ活性阻害
E.coli RNAポリメラーゼ活性を、rbl−1又は最小機能領域が直接阻害するか検討するため、in vitro転写アッセイを行い、40塩基長のrbl−1−ODNのRNAポリメラーゼそのものに対する阻害効果を評価した。0.05μMより低い濃度では、RNA産物は観察されたことから、この濃度では完全にin vitroでのRNAポリメラーゼ活性を阻害するは出来ないことが示唆される。しかしながら、0.125,0.25,0.5μMでは、rbl−1−ODNは著しく活性を阻害した。
E.coli RNAポリメラーゼ活性を、rbl−1又は最小機能領域が直接阻害するか検討するため、in vitro転写アッセイを行い、40塩基長のrbl−1−ODNのRNAポリメラーゼそのものに対する阻害効果を評価した。0.05μMより低い濃度では、RNA産物は観察されたことから、この濃度では完全にin vitroでのRNAポリメラーゼ活性を阻害するは出来ないことが示唆される。しかしながら、0.125,0.25,0.5μMでは、rbl−1−ODNは著しく活性を阻害した。
実施例7.rbl−1の最小機能領域の同定
さらにrbl−1−ODNの活性阻害部分を同定するため、一連の不完全長rbl−1オリゴヌクレオチドを合成し(表3)、その阻害活性を、in vitro RNAポリメラーゼ活性測定によって評価した。様々な長さの3’側欠損不完全長rbl−1オリゴが始めに合成された。5μMの濃度においては、rbl−1(1〜35)及びrbl−1(1〜30)のみが阻害活性を示し、rbl−1(1〜25),rbl−1(1〜20),及びrbl−1(1〜15)は阻害活性を示さなかった(表3)。つづいて5’側欠損の効果について検討した。rbl−1(26〜40)を除き、全ての不完全長rbl−1オリゴはrbl−1(6〜40),rbl−1(11〜40),rbl−1(16〜40),及びrbl−1(21〜40)を含め、活性型であった(表3)。これらのin vitroアッセイに基づき、rbl−1の最小機能領域は7から40のヌクレオチド長の範囲であり、ヌクレオチド25〜31、及びに好ましくはヌクレオチド21〜32全域を含む7から15オリゴを含む。
さらにrbl−1−ODNの活性阻害部分を同定するため、一連の不完全長rbl−1オリゴヌクレオチドを合成し(表3)、その阻害活性を、in vitro RNAポリメラーゼ活性測定によって評価した。様々な長さの3’側欠損不完全長rbl−1オリゴが始めに合成された。5μMの濃度においては、rbl−1(1〜35)及びrbl−1(1〜30)のみが阻害活性を示し、rbl−1(1〜25),rbl−1(1〜20),及びrbl−1(1〜15)は阻害活性を示さなかった(表3)。つづいて5’側欠損の効果について検討した。rbl−1(26〜40)を除き、全ての不完全長rbl−1オリゴはrbl−1(6〜40),rbl−1(11〜40),rbl−1(16〜40),及びrbl−1(21〜40)を含め、活性型であった(表3)。これらのin vitroアッセイに基づき、rbl−1の最小機能領域は7から40のヌクレオチド長の範囲であり、ヌクレオチド25〜31、及びに好ましくはヌクレオチド21〜32全域を含む7から15オリゴを含む。
表3 RBL−1の最小機能領域(MFR)の同定
RNAポリメラーゼに対するODNの阻害活性は、ゲル中のバンドの強度を可視化することで決定された。
++++,100%;+++,〜75%;++〜50%;+,〜25%; -, 検出不可能
++++,100%;+++,〜75%;++〜50%;+,〜25%; -, 検出不可能
表4 rbl−1断片配列
当業者ならば、我々はrbl−1及び活性型最小機能領域が、in vitroにおいて明らかにバクテリアRNAポリメラーゼに結合し、その活性を阻害することを証明してはいるが、この機構のみによって、これらODNがバクテリア細胞生育阻害効果を与えていると推測するべきではないと評価するだろう。細胞内においては、rbl−1及び最小機能領域は、その他の必須の核酸、タンパク質、ペプチド、炭水化物、又はここに記述された生育阻害表現型の一因となる、他の必須成育制御化合物を含め、更なる細胞構成因子と相互作用している可能性がある。
当業者は、また、この開示から、ここに公開された配列に、実質的な相同性をもつ配列は同等の機能を持ち、そのため本発明の一部と見なされると認めるであろう。これに関して、配列が70%もしくはそれ以上の塩基対塩基ヌクレオチド一致からなっている、又はここに記述されたアッセイに同様の機能活性を示す、また生育阻害とin vitroにおけるRNAポリメラーゼ活性の阻害に限らず、生育制御活性に関わる活性を示すならば、相同であると考えられる。
実施例8.真核細胞ssDNA発現ベクターpssXTeの構築
真核細胞ssDNA発現カセットをpssXEベクターから構築するため、タンパク質翻訳部位、ATGの上流にXhoIサイトが作られた。DNA断片はPCR増幅によりpssXEベクターを鋳型として合成された。用いたプライマーは、
5’NheI XhoI XbaI ATG,
CTAGCTAGCT AGCGATCGAT GGGACCAATG GGGCAG [配列番号1]
及び3’KpnI,
CGGGGTACCAGTATTCCTGGTC [配列番号2]
であった。増幅されたPCR断片をNheI及びKpnIで切断し、NheI及びKpnIで二重に切断されたpssXEベクターにサブクローニングした。得られた中間体プラスミドをpssXE(NXX)とした。ssDNA発現カセットをpcDNA4/TO/myc-HisA(Invitrogenより購入した)にサブクローニングするため、ベクター中のEcoRIサイトを破壊した。pcDNA4/TO/myc−HisAベクターを最初にBamHI及びEcoRIにて切断し、二本鎖オリゴを切断されたベクターにサブクローニングした。用いたオリゴは、5’BamHIEcoRI(m),
GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGT [配列番号86]
及び3’−BamHIEcoRI(m),
GAATTACACC ACACTGGACT AGTG [配列番号87]
の配列から構成される。
真核細胞ssDNA発現カセットをpssXEベクターから構築するため、タンパク質翻訳部位、ATGの上流にXhoIサイトが作られた。DNA断片はPCR増幅によりpssXEベクターを鋳型として合成された。用いたプライマーは、
5’NheI XhoI XbaI ATG,
CTAGCTAGCT AGCGATCGAT GGGACCAATG GGGCAG [配列番号1]
及び3’KpnI,
CGGGGTACCAGTATTCCTGGTC [配列番号2]
であった。増幅されたPCR断片をNheI及びKpnIで切断し、NheI及びKpnIで二重に切断されたpssXEベクターにサブクローニングした。得られた中間体プラスミドをpssXE(NXX)とした。ssDNA発現カセットをpcDNA4/TO/myc-HisA(Invitrogenより購入した)にサブクローニングするため、ベクター中のEcoRIサイトを破壊した。pcDNA4/TO/myc−HisAベクターを最初にBamHI及びEcoRIにて切断し、二本鎖オリゴを切断されたベクターにサブクローニングした。用いたオリゴは、5’BamHIEcoRI(m),
GATCCACTAG TCCAGTGTGG TGT [配列番号86]
及び3’−BamHIEcoRI(m),
GAATTACACC ACACTGGACT AGTG [配列番号87]
の配列から構成される。
ssDNA発現カセットはpssXE(NXX)よりXhoI切断後に単離され、前述のように改変されたpcDNA4/TO/myc−HisAベクターのXhoIサイトにサブクローニングされた。ssDNA発現カセットの正しい方向はDNA配列決定により確認され、新規に構築されたベクターはpssXTeと命名された。pssXTeベクターは真核細胞においてaTcによって誘導されるssDNA発現ベクターであり、従って真核細胞内でコントロールされたODNの誘導性発現が可能となる。ODNは真核細胞の標的に向けたものにも、又は動物宿主の真核細胞内で合成される原核細胞の標的物に向けたものにもなりうる。原核細胞の標的物は、血流中、又は発現の対象となる組織により、その他の体液中に分泌される。ここで抗菌ODNは病原体と接触し、細胞を殺傷又は不活性化、または血流に分泌されたバクテリア毒素を中和するために作用しうる。
本発明は、バクテリア及び真菌性病原体に対処する新規戦略に関連し、選択されたODNと、それを合成するために用いられる発現プラスミドを治療薬として利用するものである。本発明のODNと発現プラスミドを利用してうまく治療される病気の一例に、敗血症が挙げられる。本発明に従って治療されうる、敗血症の原因となる微生物の例は、肺、腹部、血流、皮膚、軟組織、への感染を引き起こすもの、血管内組織に関わる感染、呼吸器感染を引き起こすものを含み、これらのみに限らず本発明に従って治療可能である。本発明にしたがって治療可能なその他の微生物の例は、バクテロイデス、フゾバクテリウム、腸管出血性大腸菌、肺炎桿菌、サルモネラ、赤痢菌、プロテウス、シュードモナス、ビブリオ、レジオネラ、ヘモフィルス、ボルデテラ、ブルセラ菌、カンピロバクター、ナイセリア、ブランハメラ等のグラム陰性菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ペプトコッカス、桿菌、リステリア、クロストリジウム、プロピオン酸菌等のグラム陽性菌、マイコバクテリア、トレポネーマ、レプトスピラ、ボレリア、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチア、コクシエラ等の、グラム染色ではほとんど、又は全く染まらない生物、また、カンジダ、アスペルギルス、ブラストミセス、コクシジオイデス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、パラコクシジウム、スポロトリクム、接合菌等の真菌を含み、またこれらのみに限らない。微生物が原因である、又は一因となって起こる病状の治療法として用いられる場合、rbl−1の最小機能領域は、特定の病状、原因、又は一因となっている病原体、感染した個体のタイプ(人間対動物)、感染した個体の病状、また前述の開示から、当業者には明らかな他の因子にしたがって、次に挙げられる様々な方法に持ちられるだろう。例として、rbl−1の最小機能領域は、感染した開放創に好ましい希釈液又は担体に含まれる多コピーの最小機能領域からなるプラスミドを噴霧、又は浸して投与できる。
例えばバクテリア又は真菌の肺感染の場合、懸濁液はエアロゾル、又は感染個体による吸入により投与されうる。最小機能領域が、懸濁された配列、懸濁されたプラスミド又は他の発現ベクターとして、または技術的に既知のその他多くの方法で投与されるかに関わらず、補助薬剤、及び他の治療薬(抗バクテリア、又は抗真菌性のような)も、希釈液、又は担体中に効果を向上させるため利用することができる。
当業者は、また最小機能領域は微生物細胞の増殖、または機能を改変する能力により選択されたペプチドと共役させて用いることも可能であると認めるであろう。例として、微生物が原因、または一因となる病気の治療のために、バクテリア標的ペプチドKFFKFFKFFK, FFKFFKFFK, LLKLLLKLLLK, KKFVKFVVKKC, FFRFFRFFR, LLKLLKLLK 、その他の微生物標的ペプチド、自然発生的な、又は改変されたアミノ酸からなるそれらのホモログ、派生物(Brogden,NatureOnlineReviews,doi:10.1038/nrmicrolO98,Feb.10,2005;Kaihatsu,ら.,Biochem43:14340,2004;Varra、Porro, Antimicrobial Agents and Chemo 40:1801,1996;U.S.PatentNos・5,652,211,5,864,010,及び6,548,651;及びWO
2004/024757)を共役させて有効に利用できる。
2004/024757)を共役させて有効に利用できる。
当業者は、この開示から、意図した結果を達成するために構成要素又は過程が機能する様式を変更することなく、本発明の構成部分または過程に変更を加えることが可能であると認識するであろう。このようなすべての改変、またはこの発明に関する記述から当業者に明らかなものは、以下の請求の範囲に含まれる。
本発明は、一本鎖抗菌オリゴヌクレオチド、及びその利用などに関する。
Claims (56)
- 配列番号19で示されるrbl−1インサート配列、配列番号18で示されるrbl−1配列、又は前記rbl−1若しくは前記rbl−1インサート配列と相同な配列、から単離されたヌクレオチド配列を含むss−ODN又は ds−ODN配列。
- 配列番号18で示される前記rbl−1配列の20〜23番目から始まり32〜34番目までの部分を含む、請求項1に記載のss−ODN又はds−ODN配列。
- 配列番号18で示される前記rbl−1配列の7〜40番目の位置の部分を含む、請求項1に記載のss−ODN又はds−ODN配列。
- 25〜31番目の位置にあたる配列部分を含む、請求項2に記載のss−ODN又はds−ODN配列。
- 7〜15ヌクレオチド長の範囲にある請求項1に記載のss−ODN又はds−ODN配列。
- 前記rbl−1の配列の25〜31番目の部分を含む、請求項2に記載のss−ODN又はds−ODN配列。
- 細胞に導入された場合、RNAポリメラ−ゼを阻害するように機能する、配列番号19で示される前記rbl−1インサート、又はその相同配列であるss−ODN又はds−ODN配列。
- 請求項1〜7いずれかに記載のss−ODN又はds−ODN配列を含む発現ベクター。
- 誘導性プロモーターを有する請求項8に記載の発現ベクター。
- 請求項8に記載の発現ベクターを導入され、前記ベクターを保持する細胞。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のss−ODN又はds−ODNと、ペプチドを含む接合体(conjugate)。
- 前記ペプチドは、バクテリアを標的物とするペプチド、そのホモログ又はその誘導体である、請求項11の接合体。
- 以下のrbl−1関連配列及びそれらの相同配列のうち一つ、又はそれ以上の配列を含むss−ODN又はds−ODN配列。
(rbl−1インサート) CTTTCAACAG TTTTGATGAC CTTTGCTGAC CATACAATTG CGATATCGTG
GGGAGTGAGA G [配列番号:19],
(rbl−1) TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC GATATCGTGG [配列番号: 18],
(01-35) TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC GATAT [配列番号: 71],
(01-30) TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACAATTGC [配列番号: 72],
(01-25) TTTGATGACC TTTGCTGACC ATACA [配列番号: 73],
(01-20) TTTGATGACC TTTGCTGACC [配列番号: 74],
(01-15) TTTGATGACC TTTGC [配列番号: 75],
(06-40) TGACCTTTGC TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG [配列番号: 76],
(11-40) TTTGC TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG [配列番号: 77],
(16-40) TGACCATACA ATTGCGATAT CGTGG [配列番号: 78],
(21-40) ATACA ATTGCGATAT CGTGG [配列番号: 79],
(26-40) ATTGCGATAT CGTGG [配列番号: 80],
(21-30) ATACA ATTGC [配列番号: 81],
(21-32) ATACA ATTGC GA [配列番号: 82],
(21-34) ATACA ATTGC GATA [配列番号: 83],
(21-36) ATACA ATTGC GATATC [配列番号: 84],又は
(21-38) ATACA ATTGC GATATCGT [配列番号: 85]。 - 請求項13に記載の前記ODN又はss−ODNのひとつ、又はそれ以上を含む発現ベクター。
- さらに誘導性のプロモーターを有する請求項14に記載の発現ベクター。
- 下流の結合部位を認識する逆転写酵素をコードする遺伝子をさらに含む請求項14に記載の発現ベクター。
- プライマー結合部位がtRNAValの存在下に逆転写酵素によって認識される請求項16に記載の発現ベクター。
- 請求項14に記載の発現ベクターが導入され、前記ベクターを保持する細胞。
- 請求項13に記載の前記ODN又はss−ODNと、ペプチドとを含む接合体。
- 前記ペプチドがバクテリアを標的物としたもの、そのホモログ、又はその誘導体である請求項19に記載の接合体。
- 請求項13に記載される前記ODN又はss−ODN配列のひとつ又はそれ以上を含む、プラスミド、プラスミド誘導体、又はミニサークル。
- さらにtRNAVal存在下で、逆転写酵素に認識されるプライマー結合部位をコードする配列を有する請求項21に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドが宿主細胞に導入された場合、前記ODN又はss−ODN配列が微生物の生育を阻害、微生物を殺傷、又は微生物による毒素の分泌阻害に機能する請求項21に記載のプラスミド。
- プラスミドpssXTe。
- 請求項24に記載のプラスミドが導入され、前記プラスミドを保持する細胞。
- 配列番号19で示されるrbl−1インサート、配列番号 18で示されるrbl−1、配列番号71(1−35), 配列番号72(1-30), 配列番号76(6-40), 配列番号77(11-40), 配列番号78(16-40), 配列番号79(21-40), 配列番号82(21-32), 配列番号83(21-34), 配列番号84(21-36),配列番号85(21-38), 及びそれらに相同な配列から選択される、単離されたヌクレオチド。
- 請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、及びペプチドを含む接合体。
- 前記ペプチドがバクテリアを標的物としたもの、そのホモログ、又はその誘導体である、請求項27に記載の接合体。
- 請求項26に記載のオリゴヌクレオチドから選ばれたオリゴヌクレオチドであって、前記配列番号19のrbl−1インサートの断片を含むベクター。
- 前記ベクターが、発現ベクター、好ましくは誘導性の発現ベクターである、請求項29に記載のベクター。
- 請求項29又は請求項30のベクターを含む宿主細胞。
- 細胞が病原性の微生物である請求項31に記載の宿主細胞。
- 治療目的に用いられる、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は請求項28に記載の接合体,又は請求項29に記載のベクター。
- RNAポリメラーゼ活性を阻害する請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
- 微生物の生育を阻害、微生物を殺傷、または微生物による毒素の阻害又は分泌を阻害する、請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
- 抗菌、抗バクテリア、または抗真菌の目的に利用される請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
- 敗血症の治療に用いられる請求項33に記載のオリゴヌクレオチド、接合体、又はベクター。
- 微生物、バクテリア、真菌による病気を含め、微生物、バクテリア、真菌の感染の治療を目的とした薬剤製造のための、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクターの利用。
- 敗血症治療を目的とした薬剤製造のための、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクターの利用。
- RNAポリメラーゼと、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、又は請求項29に記載のベクターとの接触によるRNAポリメラーゼ活性のin vitroにおける阻害法。
- RNAポリメラーゼと、請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、又は請求項29に記載のベクターとの接触による、in vitroにおける病原性微生物の生育阻害、病原性微生物の殺傷、又は病原性微生物による毒素合成又は分泌の阻害方法。
- 前記微生物がバクテロイデス、フゾバクテリウム、腸管出血性大腸菌、肺炎桿菌、サルモネラ、赤痢菌、プロテウス、シュードモナス、ビブリオ、レジオネラ、ヘモフィルス、ボルデテラ、ブルセラ菌、カンピロバクター、ナイセリア、ブランハメラ等のグラム陰性菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、ペプトコッカス、桿菌、リステリア、クロストリジウム、プロピオン酸菌等のグラム陽性菌、マイコバクテリア、トレポネーマ、レプトスピラ、ボレリア、マイコプラズマ、クラミジア、リケッチア、コクシエラを含めた、グラム染色ではほとんど、又は全く染まらない生物、また、カンジダ、アスペルギルス、ブラストミセス、コクシジオイデス、クリプトコッカス、ヒストプラズマ、パラコクシジウム、スポロトリクム、接合菌を含む真菌から選択される請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項31に記載の宿主細胞、又は請求項41に記載のin vitroにおける方法。
- 請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクター、及び薬理学的に許容される希釈剤、補助薬、または担体を含む医薬組成物。
- 請求項26に記載のオリゴヌクレオチド、請求項27又は28に記載の接合体、または請求項29に記載のベクター、及び、医薬剤又は抗炎症剤を含む敗血症治療用キット。
- 薬理学的に許容される希釈剤、補助薬、又は担体中にrbl−1[配列番号18]又はrbl−1インサート[配列番号19]の最小機能領域を処方する過程、及び微生物が最小機能領域と接触する過程からなる、敗血症に感染した個体の治療法。
- さらに最小機能領域の発現を促進する過程を含む請求項45の治療法。
- バクテリア病原体とrbl−1[配列番号18]又はrbl−1インサート[配列番号19]の最小機能領域を含む発現ベクターの接触過程、及び最小機能の発現誘導の過程からなる、バクテリア感染に対する治療法。
- 最小機能領域の発現が哺乳類、又はウイルスの逆転写酵素を用いて誘導される請求項47における方法。
- バクテリア細胞と、rbl−1[配列番号18]又はrbl−1インサート[配列番号 19]の最小機能領域を持つ発現ベクターとの接触過程、及び最小機能領域の発現誘導過程を含む、バクテリア細胞中でRNAポリメラーゼ活性を阻害する方法。
- 真核細胞のtet誘導性プロモーター、前記プロモーターの3’側に位置する逆方向タンデム反復セット、前記逆方向タンデム反復セットの3’側に位置する、対象となる配列を挿入するためのクローニングサイト、クローニング際との3’側に位置するプライマー結合部位(PBS)、及び発現終結配列を持つ発現カセットを含む、真核生物の宿主中において、ss−ODNを発現するための、真核細胞ssDNA発現ベクター。
- さらに発現カセットの下流に位置するプライマー結合部位を認識する逆転写酵素をコードする遺伝子を含む請求項50に記載の真核細胞発現ベクター。
- 前記ベクターがpssXTeである請求項51に記載の発現ベクター。
- バクテリアDNA複製、転写、翻訳、又はタンパク質活性若しくは毒素の活性を阻害することにss−ODNとして関与する、ss−ODN又はds−ODN配列。
- バクテリアRNAポリメラーゼの通常の生物学的な活性を改変する請求項53に記載の配列。
- バクテリアRNAポリメラーゼの通常の生物学的活性を、DNA転写、RNAプロセシング、又はRNA翻訳、またはタンパク質活性を妨げることにより改変する請求項53に記載の配列。
- タンパク質の活性を阻害することでバクテリアRNAポリメラーゼの通常の生物学的活性を改変する請求項53に記載の配列。
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