JP6826048B2 - 配列特異的検出及び表現型決定 - Google Patents
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Description
細胞レポーターシステムは、非標的生物との交差反応及び微生物干渉を示すことがある。例えば糞便試料中の大腸菌(E. coli)を検出するために腸内細菌科細菌(Enterobacteriaceae)のレポーターが使用される場合、肺炎桿菌(K. pneumoniae)のような腸内細菌科の他の種は、交差反応性シグナルを生成して偽陽性の結果をもたらすことがある。さらに試料中に存在し得る緑膿菌(P. aeruginosa)、アシネトバクター・バウマンニ(A.baumannii)、及びステノトロホモナス・マルトフィリア(S. maltophilia)などの他の細菌科の種は、微生物の干渉をもたらして偽陰性結果を与え得る。
抗菌剤感受性表現型の機序を決定するための方法が本明細書に開示され、この方法は以下の工程を含む:
少なくとも1つの抗菌剤に対して感受性でない少なくとも1つの微生物を含む試料を提供する工程;
前記試料に抗菌剤を接触させる工程であって、前記抗菌剤は1つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる、前記工程;
前記試料に、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも1つの特定核酸配列(specific nucleic acid sequence)を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物を接触させる工程であって、任意選択的に、オリゴヌクレオチド分子が核酸配列を阻害する、前記工程;及び
前記微生物が抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているときに、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、微生物の抗菌剤感受性表現型の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連していることを示す、前記工程。
他の方法、組成物、システム、培養物、分子、及びキットも、本明細書において同様に記載される。
少なくとも1つの抗菌剤に対して感受性でない少なくとも1つの微生物を含む試料を提供する工程であって、前記試料はさらに、1つ以上の微生物の生存能力を殺滅し、その増殖を阻害し、又はその生存能力を弱めることができる抗菌剤と、抗菌剤に対する感受性のない表現型に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物とを含む、前記工程;及び
微生物が抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているときに、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、微生物の非感受性表現型の機序を決定する工程であって、検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連しないことを示し、検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連していることを示す、前記工程。
カルバペネムに対して感受性でない腸内細菌科微生物を含む試料を提供する工程;
前記試料に腸内細菌科微生物を接触させる工程;
前記試料を、カルバペネム耐性に関連する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド分子と接触させる工程;
腸内細菌科微生物がカルバペネム及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているとき、腸内細菌科微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、腸内細菌科微生物のカルバペネム非感受性の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連しないことを示し、検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連していることを示す、前記工程。
目的の少なくとも1つの生物を含む可能性のある試料を提供する工程;
前記試料を、生物体の生存能力に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物と接触させる工程であって、前記特定核酸配列が前記生物に対して固有である、前記工程;及び
前記生物が前記オリゴヌクレオチド分子と接触している場合に、前記生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて前記生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示す、前記工程。
目的の少なくとも1つの生物を含む可能性のある試料と、前記生物の生存活性に関連する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1種の化合物とを提供する工程であって、前記特定核酸配列は前記生物に対して固有である、前記工程;及び;
前記生物が前記オリゴヌクレオチド分子と接触している場合に、前記生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて前記生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示す、前記工程。
目的の少なくとも1つの生物を含む可能性のある試料を提供する工程;
前記試料の第1の部分に、生物の生存能力に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物を接触させる工程であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である、前記工程;
前記生物がオリゴヌクレオチド分子と接触している場合に、前記生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて前記試料の第1の部分中の前記生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示す、前記工程;及び
前記生物に関連する生存活性の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、前記オリゴヌクレオチド分子を含まない試料の第2の部分における生物の存在を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が前記試料中に存在し得ることを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が前記試料中に存在しないことを示す、前記工程。
標的生物を検出するように設計されたアッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である少なくとも1つの生物を含む可能性のある試料を得る工程;
前記交差反応性又は干渉性である生物に、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物を接触させる工程であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である、前記工程;及び
生物の生存能力を失わせる工程。
いくつかの態様において、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する前記少なくとも1つの特定核酸配列は、murA遺伝子である。
いくつかの態様において、化合物はPNA(ペプチド核酸)である。いくつかの態様において、化合物はペプチド−PNAである。いくつかの態様において、前記ペプチドは、微生物へのオリゴヌクレオチド分子の取り込みを促進する。いくつかの態様において、PNAは遺伝子の翻訳開始領域(TIR)を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−PNAは、β−ラクタム耐性遺伝子又はバンコマイシン耐性遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−PNAは、blaKPC-3遺伝子、blaNDM-1遺伝子、blaSHV-18遺伝子、vanC遺伝子を標的とする。
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第1の核酸構築体(first nucleic acid construct)であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、NRTP内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第1の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第1の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、NRTPへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第2の核酸構築体であって、ここで、前記第2の核酸構築体上の機能性の第2のパッケージング開始部位配列は、前記第1の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第2の核酸構築体と
を含む、細菌細胞パッケージングシステムから製造される。
1つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めるcことができる抗菌剤;
抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む化合物;及び
微生物が抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子と接触している場合、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、抗菌剤に対して感受性ではない微生物の非感受性表現型の機序を決定するために、抗菌剤及びオリゴヌクレオチド分子を使用するための説明書であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的化された特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的化された特定核酸配列が、抗菌剤に対する非感受性表現型の機序に関連することを示す、前記説明書。
前記生物の生存能力に関与する特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む化合物であって、前記特定核酸配列が前記生物に固有である上記化合物;及び
前記生物がオリゴヌクレオチド分子と接触している場合、生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如基づいて生物の存在を決定するためにオリゴヌクレオチド分子を使用するための説明書であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、目的の生物が試料中に存在しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、目的の生物が試料中に存在し得ることを示す、前記説明書。
1つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる抗菌剤;
抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物;及び
任意選択的に、レポーターは、マーカー、検出可能なシグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)である、レポーター。
1つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる抗菌剤;
前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物;及び
レポーター、任意選択的に、レポーターは、マーカー、検出可能シグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)である上記レポーター。
生物の生存能力に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である、前記化合物;及び
レポーター、任意選択的にレポーターは、マーカー、検出可能シグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)である。
生物の生存能力に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物であって、前記特定核酸配列は前記生物に固有である前記化合物;及び
レポーター、任意選択的にレポーターは、マーカー、検出可能シグナル、レポーター分子をコードするレポーター核酸分子、又はレポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)である前記レポーター。
いくつかの態様において、化合物はPNA(ペプチド核酸)である。いくつかの態様において、化合物はペプチド−PNAである。いくつかの態様において、ペプチドは、オリゴヌクレオチド分子の微生物への取り込みを促進する。いくつかの態様において、PNAは遺伝子の翻訳開始領域(TIR)を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−PNAは、β−ラクタム耐性遺伝子又はバンコマイシン耐性遺伝子を標的とする。いくつかの態様において、ペプチド−PNAは、blaKPC-3遺伝子、blaNDM-1遺伝子、blaSHV-18遺伝子、vanC遺伝子を標的とする。
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第1の核酸構築体であって、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、NRTP内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第1の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第1の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、NRTPへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第2の核酸構築体であって、ここで、第2の核酸構築体上の機能性の第2のパッケージング開始部位配列は、前記第1の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第2の核酸構築体と
を含む、細菌細胞パッケージングシステムから製造される。
特許請求の範囲及び明細書で使用される用語は、特に明記しない限り、以下に示すように定義される。
非複製性形質導入粒子(NRTP)及びNRTPを製造する方法は、国際公開第2014/160418号パンフレット及びUS2015/0104787号に記載されている。いくつかの実施態様においてNRTPは、破壊/補完に基づく方法を用いて細菌細胞パッケージングシステムで製造される。この非複製性形質導入粒子パッケージングシステムは、ウイルス/ファージ製造中にそこからゲノムパッケージングが開始される要素として、ウイルス/ファージパッケージング機序によって認識されるウイルス/バクテリオファージのゲノムの成分中に、突然変異、サイレント突然変異、挿入、又は欠失を導入することに基づく。そのような要素の例としては、pac型バクテリオファージのpac部位配列及びcos型バクテリオファージのcos部位配列が挙げられる。
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第1の核酸構築体であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、NRTP内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第1の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にありかつ前記第1の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、NRTPへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第2の核酸構築体であって、ここで、前記第2の核酸構築体上の機能性の第2のパッケージング開始部位配列は、前記第1の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第2の核酸構築体とを、含む。
本明細書には、生物の本体、及び生物に抗菌剤耐性又は感受性を付与する機序を決定するための方法が開示される。これらの方法は、生物の生存能力及び/又は選択可能な又は生存可能なマーカー/シグナルを生成する能力に連結された生物の特定の機能を抑制することにより、細胞−レポーターシステム中の生物の特定の株及び種から生成されるシグナル、生存能力、及び/又は増殖を抑制することを含む。
腸内細菌科微生物のレポーター中の大腸菌由来シグナルの排除
この実施例では、腸内細菌科微生物のレポーターシステムを、大腸菌を標的とするペプチド−PNAと共に使用した。ペプチド−PNAを使用しない場合、腸内細菌科のレポーターシステムは、腸内細菌科(肺炎桿菌と大腸菌の両方を含む)からの検出可能なシグナルを生成する。ペプチド−PNAを添加すると、腸内細菌科のレポーターシステムは、大腸菌を除く腸内細菌科微生物からシグナルを生成した。このシステムは、オリゴヌクレオチドの有無にかかわらず使用することができ、標的生物の存在は、ペプチド−PNAが無い場合シグナルが存在し、ペプチド−PNAがある場合にはシグナルが存在しないという結果によって決定することができる。あるいは、大腸菌及び肺炎桿菌の両方を含み得る試料では、オリゴヌクレオチドの存在下でのアッセイの実行は、肺炎桿菌が試料中に存在するかどうかの決定を可能にする。この例では、肺炎桿菌のみを含む試料は、大腸菌も試料中に存在するか否かにかかわらずシグナルを生成し、一方大腸菌のみを含む試料はシグナルを生成しない。このようにして、ペプチド−PNAを使用して、種特異的細菌検出を達成することができる。
大腸菌及び肺炎桿菌の増殖に対するmurA PNAの作用を調べた。murA PNAの存在下で大腸菌及び肺炎桿菌を培養した場合、大腸菌の増殖は弱められたが、肺炎桿菌の増殖は弱められなかった。
大腸菌及び肺炎桿菌の分離株をLB中で37℃にて一晩増殖させ、翌日1:100希釈で新鮮なLBに継代培養し、OD600が0.2になるまで増殖させた。各細菌種の約104CFUの各菌株の接種材料を、50μLのLB又は4.5μMの最終濃度のmurA PNAを含むLBを含むマイクロプレートの別々のウェルに添加した。次に、PCT/US2014/026536号の実施例1に記載されているように、全てのウェルに100uLの腸内細菌科微生物の発光レポーター非複製性形質導入粒子を加え、試料を30℃で2時間インキュベートした。インキュベーション時間後、プレートを、Molecular Devices SpectraMax L マイクロプレートルミノメーターを用いて発光についてアッセイし、発光測定値を読み取りながら、トリデカナールの溶液を各ウェルに注入した。
ペプチド−PNAを用いたAST抗菌ディスク拡散試験によるCRE表現型に連結した特異的カルバペネマーゼの測定
この実施例では、CRE表現型に連結した特異的機序を決定するために、CRE株にペプチド−PNAを添加してAST抗菌ディスク拡散試験を行った。ペプチド−PNAを使用しない場合、CREはカルバペネム耐性の結果を示す。特定のカルバペネマーゼ遺伝子を標的とするように設計されたペプチド−PNAを添加し、AST結果がカルバペネム感受性(CSE)表現型に変化する場合、これはペプチド−PNAによって標的とされるカルバペネマーゼ遺伝子が、CRE表現型に連結した機序であることを示す。このようにして、ペプチド−PNAを用いて、細菌の抗菌剤耐性表現型に連結した特異的機序を決定することができる。
ディスク拡散試験は、CLSI−M02(12)に従って行われ、M100−S22(13)に従って解釈される。簡単に説明すると、各細菌をメロペネムに対する感受性について試験するために、ミューラー・ヒントン寒天培地(MHA)プレートを細菌培養物の懸濁液に浸漬した滅菌綿棒を使用して、0.5マクファーランド(McFarland)標準で接種して、MHAの全表面がカバーされるようにした。接種したプレートの表面に10μgのメロペネムディスクを適用し、35℃にて周囲空気中で16〜18時間インキュベートする。メロペネムディスクの周りの阻害ゾーンの直径が23mm以上の場合、細菌株はメロペネムに対して感受性であり、ゾーン直径が19mm以下である場合、メロペネムに対して耐性であると判定される。
ペプチド−PNAを用いたAST細胞レポーター試験によるCRE表現型に連結した特異的カルバペネマーゼの測定
この例では、実施例2に記載されたAST技術が、細胞レポーターアッセイに基づくAST試験に拡張される。PCT/US2014/026536号の実施例1に記載されている腸内細菌科の細胞レポーターを用い、アッセイを以下のように行う。簡単に説明すると、大腸菌1289011,1289012,1289014、及び1289018の培養物を調製し、50μLのLBを含むマイクロウェルプレートのウェルに接種試料50μLを接種して、各ウェルが104CFUの細菌の各株を受けるようにする。ウェルのセットは追加の添加物を含まず、別のウェルのセットは5μg/mLのメロペネムを含み、別のウェルのセットは5μg/mLのメロペネムとblaKPC-3−ペプチド−PNAを含み、別のウェルのセットは5μg/mLのメロペネムとblaNDM-1ペプチド−PNAを含み、別の2セットのウェルはそれぞれblaKPC-3又はblaNDM-1ペプチド−PNAのみを含む。またすべてのウェルには腸内細菌科のレポーター100μLも加える。次に、試料を30℃で2時間インキュベートし、次に試料を実施例1に記載したように発光についてアッセイする。
CRISPR/Cas9を用いたAST細胞レポーター試験による非感受性表現型に連結した特異的β−ラクタマーゼの測定
この実施例では、実施例3に記載のAST技術を改変して、プラスミドにコードされたβ−ラクタマーゼ遺伝子を標的とするように設計されたCRISPR/Cas9システムを用いて、CRE表現型に連結した特異的β−ラクタマーゼを測定する。
バンコマイシン耐性腸球菌アッセイ
別の実施態様において、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)の検出のためのアッセイを開発することができる。
VREは、vanA及びvanB遺伝子を含む耐性遺伝子を介してバンコマイシン耐性を獲得した腸球菌属菌種からなる。腸球菌属菌種は、他のバンコマイシン耐性遺伝子を担持し、他のバンコマイシン耐性表現型(VanC−1、vanC−2、及びvanC−3を含む遺伝子によってコードされるVanC表現型)を発現するが、そのような生物はVREとはみなされない。
第1列は、腸球菌レポーターが腸球菌属菌種の全てについて陽性シグナルを与えることを示す。第4列は、ペプチド−PNAがいずれの菌株においても陽性結果を阻害しないことを証明する。第2列は、van遺伝子を発現する全ての菌株が、陽性シグナルを与え続け、一方、van遺伝子を持たない菌株は陽性シグナルを与えないことを示す。第3列は、vanA又はvanB遺伝子を発現する菌株のみが陽性シグナルを与え続けていることを示している。
カンジダレポーターアッセイ
別の実施態様において、カンジダの同定のための菌学的アッセイを開発することができる。
Claims (12)
- 抗菌剤感受性表現型の機序を決定するための方法であって、
− 少なくとも1つの抗菌剤に対して感受性でない少なくとも1つの微生物を含む試料を提供する工程と;
− 前記試料に抗菌剤を接触させる工程であって、前記抗菌剤は1つ以上の微生物を死滅させるか、その増殖を阻害するか、又はその生存能力を弱めることができる、前記工程と;
− 前記少なくとも1つの微生物を、前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物と接触させる工程と、
− レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)が微生物内に前記レポーター核酸分子を挿入し、かつ前記レポーター分子が生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、前記試料をNRTPと接触させる工程と;
− 前記微生物が前記抗菌剤及び前記オリゴヌクレオチド分子と接触しているときに、微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、微生物の抗菌剤感受性表現型の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、前記オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、前記抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連しないことを示し、生存能力の検出可能な指標の欠如は、前記オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる特定核酸配列が、前記抗菌剤に対する抗菌剤感受性表現型の機序に関連していることを示す、前記工程と
を含む、方法。 - 非感受性表現型に関与する機序を決定するための方法であって、
− カルバペネムに対して感受性でない腸内細菌科微生物を含む試料を提供する工程と;
− 前記試料をカルバペネムと接触させる工程と;
− 前記腸内細菌科微生物を、カルバペネム耐性に関連する遺伝子を標的とするオリゴヌクレオチド分子と接触させる工程と;
− レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)が腸内細菌科微生物内に前記レポーター核酸分子を挿入し、かつ前記レポーター分子が生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、前記試料をNRTPと接触させる工程と;
− 前記腸内細菌科微生物がカルバペネム及びオリゴヌクレオチド分子と接触しているとき、前記腸内細菌科微生物に関連する生存能力の検出可能な指標の存在又は欠如に基づいて、前記腸内細菌科微生物のカルバペネム非感受性の機序を決定する工程であって、生存能力の検出可能な指標の存在は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連しないことを示し、検出可能な指標の欠如は、オリゴヌクレオチド分子によって標的とされる遺伝子が、カルバペネム非感受性の機序に関連していることを示す、前記工程と
を含む、方法。 - 標的生物の生存能力の検出可能な指標を検出するように設計されたアッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の量を低下させる方法であって、
− 標的生物の生存能力の検出可能な指標を検出するように設計された前記アッセイにおいて、潜在的に交差反応性又は干渉性である少なくとも1つの生物を含む試料を提供する工程と;
− 前記交差反応性又は干渉性である生物を、潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する少なくとも1つの特定核酸配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を含む少なくとも1つの化合物と接触させる工程であって、潜在的に交差反応性又は干渉性の前記特定核酸配列は前記生物に固有であり、前記潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力を失わせる、前記工程と;
− レポーター分子をコードするレポーター核酸分子を含む非複製性形質導入粒子(NRTP)が標的生物内に前記レポーター核酸分子を挿入し、かつ前記レポーター分子が標的生物の生存能力の検出可能な指標を提供するような条件下で、前記試料をNRTPと接触させる工程と;
− レポーター分子が介在する反応の存在又は欠如を検出することにより標的生物の生存能力の検出可能な指標を検出する工程と;
を含む、前記方法。 - 前記標的生物が腸内細菌科の生物である、請求項3に記載の方法。
- 前記潜在的に交差反応性又は干渉性である生物の生存能力に関与する前記少なくとも1つの特定核酸配列がmurA遺伝子である、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記抗菌剤に対する非感受性表現型に関与する前記少なくとも1つの特定核酸配列が、blaKPC-3遺伝子、blaNDM-1遺伝子、blaSHV-18遺伝子、及びvanC遺伝子からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物が、腸内細菌科(family Enterobacteriaceae)、エンテロコッカス属(genus Enterococcus)、又はカンジダ属(genus Candida)の微生物である、請求項1又は6に記載の方法。
- 前記抗菌剤がβ−ラクタム又はバンコマイシンである、請求項1、6、及び7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド分子が配列番号2又は配列番号3からなる群より選択される、あるいは、前記オリゴヌクレオチド分子が配列番号4又は及び配列番号5を含むCRISPR/Casシステムである、請求項2に記載の方法。
- 前記レポーター核酸分子が発光分子をコードする遺伝子である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記NRTPは、
宿主細菌細胞と、
前記宿主細菌細胞内にあり、非機能性パッケージング開始部位配列を有するバクテリオファージゲノムを含む第1の核酸構築体であって、ここで、前記非機能性パッケージング開始部位配列は、NRTP内へのバクテリオファージゲノムのパッケージングを防止する、前記第1の核酸構築体と、
前記宿主細菌細胞内にあり、かつ前記第1の核酸構築体から離れて存在し、レポーター遺伝子を有するレポーター核酸分子と、NRTPへの前記レポーター核酸分子のレプリコンのパッケージングを促進する機能性パッケージング開始部位配列とを含む第2の核酸構築体であって、ここで、第2の核酸構築体上の機能性の第2のパッケージング開始部位配列は、前記第1の核酸構築体上のバクテリオファージゲノム内の非機能性パッケージング開始部位配列を補完する、前記第2の核酸構築体と、
を含む細菌細胞パッケージングシステムから製造される、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。 - 前記化合物が、ペプチド核酸(PNA)、ペプチド−PNA、CRISPR RNA(crRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及び二本鎖RNA(dsRNA)からなる群より選択される、請求項1、3〜8、10、及び11のいずれか1項に記載の方法。
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