CN1696282A - 羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基，它由蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、Na2HPO4·12H2O、粗糊精、硫代乙醇酸钠、葡萄糖、ZnSO4·7H2O、亚硫酸钠和水组成。本发明培养基的特点是：成本低廉、质量稳定，可用于产气荚膜梭菌和腐败梭菌加热培养，生产羊梭菌病疫苗。
Description
一、技术领域
本发明涉及微生物培养基，具体涉及羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基。
二、背景技术
梭菌性疾病是由厌气梭菌属中多种梭菌引起的一类各种动物的传染病，如快疫、猝狙、痢疾、肠毒血症、气肿疽、黑疫、肉毒梭菌中毒症、破伤风等。该类疾病以发病急速、病程短促、来不及治疗和病死率高为特征。病原菌多为土壤性细菌，广泛存在于世界各地，造成很大的经济损失。梭菌性疾病的免疫主要是通过灭活梭菌培养过程中所产生的毒素而实现，毒素为疫苗的主要有效免疫抗原。因此，培养这类细菌，使它们大量繁殖生长，并且分泌表达高效价的毒素，可以制作出免疫效果优良的疫苗。羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症三联灭活疫苗就是其中一种，它可以预防羊的快疫、猝狙、羔羊痢疾和肠毒血症四种传染病，称为羊梭菌病三联四防疫苗，在我国广大农牧区用量很大。除此之外，羊梭菌病多联干粉灭活疫苗的全国用量也很大，它可以预防羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症、黑疫、肉毒梭菌中毒症和破伤风等。其生产厂家主要有兰州中牧(原兰州生物药品厂)、内蒙金宇(原内蒙古生物药品厂)、西藏生物药品厂和新疆天康畜牧生物技术股份有限公司(原新疆生物药品厂)，疫苗种类包括常规苗、浓缩苗和干粉苗。
《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)中规定，用于厌氧菌培养生产疫苗的培养基主要有以下几种：厌氧肉肝汤、多蛋白胨牛心汤培养基、厌氧肉肝胃酶消化汤I或II、鱼肉胃酶消化汤肉肝汤、豆肝汤、鱼肉胃酶消化汤、胰酶消化牛肉汤、破伤风培养基、肉渣培养基、蛋白胨肉肝汤等。培养基类型复杂，制造工艺繁琐，成本高，并且使用的牛肉会因为肉的质量影响到培养基的优劣，牛肉中残留药物可能导致抑制细菌生长而使培养基质量降低甚至报废，质量不稳定，不利于生产与检验。
目前，羊梭菌病疫苗均用厌气肉肝胃酶消化汤培养基，由于过去牛肉价格较低，对疫苗的生产成本影响不大。但近十几年来，牛肉价格不断上升，生产成本的增加和疫苗销售价格的下降使得原有的利润空间进一步减少，牛肉价格在很大程度上决定疫苗生产的经济效益。另一方面，用大量牛肉、肝、胃蛋白酶等动物源性成分来制备，其工艺繁琐，要剔除脂肪、筋、膜，用绞肉机绞碎，在65℃条件下加胃蛋白酶，再在53--55℃条件下消化24小时(期间需不断搅拌)，最后，加入其它成份加热、过滤等程序制成。配制一批生产用的培养基需要6人3天才能完成，成本高，经济效益差。同时还会受到肉品质的影响(如抗生素的残留等)，使得培养基品质不稳定和质量不宜控制。
三、发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术之不足，提供一种成本低廉、质量稳定的羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基。
本发明羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基是由下述重量配比的原料制成(按生产1000ml培养基成品计算)：
蛋白胨 15-30g 酵母浸出粉 2-3g
NaCl 1-3g Na2HPO4·12H2O 5-10g
粗糊精 5-10g 硫代乙醇酸钠 0.01-0.08g
葡萄糖 3-10g ZnSO4·7H2O 0.01-0.1g
亚硫酸钠 0.1-0.5g
其余为蒸馏水。
本发明培养基的最佳重量配比是(按生产1000ml培养基成品计算)：
蛋白胨 15g 酵母浸出粉 2.5g
NaCl 2.5g Na2HPO4·12H2O 10g
粗糊精 10g 硫代乙醇酸钠 0.05g
葡萄糖 5g ZnSO4·7H2O 0.04g
亚硫酸钠 0.5g
其余为蒸馏水。
本发明培养基的配方依据是：根据厌氧菌自身的生长代谢理论，设计成本较低的、含有促进其生长和产毒素因子成分的市售原材料(化学和生物试剂)为基础的规模化生产梭菌疫苗用培养基。将细菌产毒培养基设计分为三个系统，即厌氧系统(提供较低的氧化还原电势)、营养系统(提供促进生长代谢的基础物质，碳源、氮源、生长因子等)和辅助系统(即维持良好的厌氧环境，又提供营养成分)。厌氧系统用添加还原剂亚硫酸钠、硫乙醇酸盐、葡萄糖(厌氧与营养双重作用)等，使培养基保持较低的氧化还原电势，以保证厌氧生长的良好环境；营养系统采用添加蛋白胨、酵母浸出粉和矿物质等，使培养基含有较丰富的胨、肽、氨基酸、维生素等营养成分，利于细菌生长；辅助系统采用添加糊精起到增加培养基的粘稠度、减少液体培养基中氧的传递、并可作为碳源而被利用的作用。所选原料虽为成本较低的市售试剂，完全可以保证其质量的稳定性。
使用本发明培养基和厌气肉肝胃酶消化汤培养基生产羊梭菌病疫苗经济效益比较：
| 原本发明培养基 | 厌气肉肝胃酶消化汤培养基 | |
| 原料费用 | 13.6元/万毫升 | 50.5元/万毫升 |
| 工序 | 无 | 选肉、剔肉、保鲜、碎肉、保温消化、提清过滤、 |
| 人工消耗 | 2人半天 | 6人3天 |
| 生产周期 | 缩短2天 | |
| 经济效益 | 提高5倍 |
本发明的优点是：成本低廉、质量稳定。
为了证明本发明培养基可用于羊梭菌病疫苗的生产，现将实验的情况介绍如下：
1.1菌种 产气荚膜梭菌B型(C58-2)、D型(C60-2)，腐败梭菌(C55-1)由中国兽医药品监察所提供。
1.2培养基 按本发明本配方自行配制。
1.3实验动物 昆明(KM)小鼠，16-20g，由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生物制品事业部动物室自繁自养；新西兰白兔，1.5-2.0kg，购于新疆地方病研究所动物中心。
1.4试验方法
1.4.1细菌的培养，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》(2000版)介绍的方法接种于本发明培养基，产气荚膜梭菌B型、D型接种量为1％，置35℃温室静止培养，B型菌培养10-20h，D型菌培养16-24h。腐败梭菌接种量为2％，37℃静止培养20-24h。
1.4.2毒素或毒力测定 按《规程》介绍的方法进行。产气荚膜梭菌的培养菌液离心取上清液，用明胶缓冲溶液稀释，尾静脉注射KM小鼠测其毒力，其最小致死量应不低于下列标准：B型0.001-0.002ml；D型(经胰酶活化)0.0005-0.00075ml。腐败梭菌培养菌液0.01ml直接肌肉注射KM小鼠。观察24h，记录小鼠死亡情况。
1.4.3疫苗配制 按《规程》介绍的方法将培养测毒合格的菌液加入各菌液量0.5-0.8％的甲醛溶液密封，37-38℃灭活脱毒5-8d，经灭活、脱毒检验合格后配制疫苗，分装、检验。
1.4.4成品检验 按《规程》进行。
1.4.4.1无菌检验 取制备的疫苗1ml接种50ml硫乙醇酸盐培养基(T.G)小瓶，37℃培养3天后，分别取0.2ml移植T.G小管和酪胨琼脂(G.A)斜面各2支，1支置37℃；1支置25℃；另取0.2ml接种1支葡萄糖蛋白胨汤(G.P)小管，置25℃，每天观察2次，连续观察5天。
1.4.4.2安全检验 用体重1.5-2.0kg新西兰白兔4只，各肌肉注射疫苗5ml。每天观察2次，观察10天。
1.4.4.3效力试验 将每批疫苗接种1.5-2.0kg的新西兰白兔4只，每只肌肉注射3ml，注射后14-21天进行检验。产气荚膜梭菌采用中和试验方法测定免疫动物血清效价；腐败梭菌采用直接攻毒法。中和法是家兔免疫14-21天后采血，分离血清，将4只兔血清等量混合，分别取0.1ml与被检疫苗相应的毒素混合，B型和C型中和1个致死量毒素(1MLD)，D型中和3MLD，置37℃中和40分钟，然后静脉注射体重16-20g KM小鼠各2只；同时各用同批KM小鼠2只，分别注射1MLD相同的毒素作对照，观察24h，记录小鼠死亡情况。直接攻毒法是家兔免疫14-21天采血以备中和检验后，连同条件相同的2只空白对照家兔，直接肌肉注射致死量的腐败梭菌菌液，观察14天，记录结果，判定菌苗效力。
使用本发明培养基培养的毒力合格的细菌菌液按《规程》配制3批疫苗，并进行检验，3批疫苗的无检、安检和效检均达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》[2]的标准。检验结果详见表1。
2结论 本发明培养基对产气荚膜梭菌B型、D型和腐败梭菌的培养试验证明，所有培养物所产毒素结果均达到规程规定的0.0005ml致死KM小鼠的高标准，完全可以达到厌气肉肝胃酶消化汤的培养水平，而成本仅为其21％。实验试制的三批疫苗经检验，均达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准，本发明培养基培养的产气荚膜梭菌和腐败梭菌所产毒素等抗原成分的免疫原性良好。
表1 本发明培养基培养细菌菌液配制的三联四防苗效力检验结果：
| 疫苗批号 | 无菌检验 | 安全检验 | 效力检验0.1ml免疫兔血清中和效价腐败梭菌菌液攻毒 | 检验结论 | |||
| B型毒素(MLD) | C型毒素(MLD) | 型毒素(MLD) | 保护数/攻毒数 | ||||
| 试01批试02批试03批 | 无菌生长无菌生长无菌生长 | 家兔健活4/4家兔健活4/4家兔健活4/4 | ≥1≥1≥1 | ≥1≥1≥1 | ≥3≥3≥3 | 2/22/22/2 | 苗合格苗合格苗合格 |
注：中和试验动物为KM小鼠，攻毒试验动物为家兔，对照均2/2死亡；腐败梭菌1MLD为0.6ml
四、具体实施方式
生产1000ml本发明培养基选取
蛋白胨 20g 酵母浸出粉 3g
NaCl 2g Na2HPO4·12H2O 8g
粗糊精 8g 硫代乙醇酸钠 0.05g
葡萄糖 5g ZnSO4·7H2O 0.04g
亚硫酸钠 0.2g
其余为蒸馏水
制作方法是：将蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、Na2HPO4·12H2O、粗糊精、硫代乙醇酸钠、葡萄糖、亚硫酸钠和ZnSO4·7H2O，加适量的蒸馏水依次混合溶解，121℃灭菌30分钟，即得到本发明培养基。
Claims (2)
1、羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基，其特征在于它由下述重量配比的原料制成(按生产1000ml培养基成品计算)：
蛋白胨 15-30g 酵母浸出粉 2-3g
NaCl 1-3g Na2HPO4·12H2O 5-10g
粗糊精 5-10g 硫代乙醇酸钠 0.01-0.08g
葡萄糖 3-10g ZnSO4·7H2O 0.01-0.1g
亚硫酸钠 0.1-0.5g
其余为蒸馏水。
2、如权利要求1所述的羊梭菌病疫苗生产用厌氧产毒培养基，其中各原料重量配比是(按生产1000ml培养基成品计算)：
蛋白胨 15g 酵母浸出粉 2.5g
NaCl 2.5g Na2HPO4·12H2O 10g
粗糊精 10g 硫代乙醇酸钠 0.05g
葡萄糖 5g ZnSO4·7H2O 0.04g
亚硫酸钠 0.5g
其余为蒸馏水。
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