CN102876620B - 一株无毒st28猪链球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株无毒ST28猪链球菌及其应用，属生物技术领域。采集健康屠宰猪的扁桃体样品，增菌处理后提取细菌的DNA，应用聚合酶链式反应鉴定cps2j基因，随后经过细菌平板分离获得纯培养细菌，对纯培养细菌进行革兰氏染色、血清凝集和聚合酶链式反应、多位点序列分型，确定分离到猪链球菌2型菌株及其序列型；经过Balb/c小鼠、新西兰兔、长白仔猪的动物实验，证实该菌HA0609为无毒菌株。该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，能用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
Description
技术领域
本发明涉及到一株无毒ST28猪链球菌及其应用，具体说是一株无毒ST28猪链球菌（Streptococcus suis）的分离、鉴定方法，以及该菌在猪链球菌病疫苗研制中的应用，属生物技术领域。
背景技术
猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，S. suis 2）是一种重要的人畜共患病病原体，可以引起猪发生脑膜炎、败血症、关节炎等症状，病死率高达40%，如与猪呼吸与繁殖综合征并发，死亡率更高，即使病后能够存活的猪，其生长缓慢，料肉比增加，给养猪业带来极大的经济损失，故该菌对全球的养猪生产是一个潜在的威胁。S. suis 2可以通过伤口、消化道感染人，1998年和2005年分别在我国江苏和四川发生猪链球菌病的暴发，并且均发生人感染死亡的病例，引起人们的高度关注。目前针对猪链球菌病，尚无适用人群的疫苗，所以预防猪发生猪链球菌病，不仅仅是对猪的保护，更是对人的保障。
依据动物疫病“以防代治”的理念，免疫疫苗是猪链球菌病防控的关键，传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗，灭活疫苗是将细菌通过灭活处理获得的全菌体死疫苗，灭活疫苗优点是生产方便，稳定、易保存，缺点是需要多次免疫、免疫剂量大并且免疫部位出现损伤。减毒活疫苗的优点是只需接种一次，接种剂量少，且免疫保护期长，缺点是不稳定、难保存，并且有可能出现毒力返强。上述两类疫苗是菌体疫苗，抗原成份比较复杂，除了保护抗原外，可能含有更多的无效抗原，而无效抗原的存在会干扰机体对保护性抗原的应答，有时会引起严重的副作用。
发明内容
技术问题
针对上述传统疫苗的不足，本发明提供一株无毒ST28猪链球菌的分离、鉴定及应用，从健康屠宰猪群中分离一株无毒ST28猪链球菌，为S. suis 2毒力因子研究及猪链球菌保护性抗原筛选奠定基础。
技术方案
本发明经过聚合酶链式反应、革兰氏染色、血清凝集试验和多位点序列分型（MLST），证实所分离的猪链球菌为ST28猪链球菌，命名该菌为HA0609。
通过Balb/c小鼠、新西兰兔、长白仔猪的动物实验，结果HA0609不引起上述试验动物发病，并且接种长白仔猪不引起组织病理变化，而以05年四川分离的强毒株ZY05719为对照，等量接种实验动物后，均能引发动物发病、死亡，证实HA0609菌株为无毒菌株。
细菌特征：该菌属于球菌科、链球菌属，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，呈卵圆形，排列成链状或成双，5%绵羊血THB琼脂平板上37℃培养18～24小时，可长成直径1～2毫米，灰白色，表面光滑，边缘整齐的小菌落，不溶血。
该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，可用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
有益效果
本发明的突出优点：
1. HA0609对多种实验动物均无致病力，且对长白仔猪不造成病理损伤；
2. HA0609分离自健康猪的扁桃体组织，能够定植于猪扁桃体组织，持续刺激机体的免疫系统，使机体应答产生抗体。
3．该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，可用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
生物保藏
该菌株HA0609分类命名：猪链球菌（Streptococcus suis），2012年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012394。
附图说明
图1为免疫HA0609新西兰兔静脉注射强毒株ZY05719后存活率分析图，1为免疫PBS对照组，2为免疫HA0609组，﹡表示存在统计学显著差异；
图2为免疫HA0609的CD1小鼠腹腔注射强毒株SS2-1后存活率分析图，1为免疫PBS对照组，2为免疫HA0609组，﹡﹡表示存在统计学极显著差异。
具体实施方式
材料：
PCR Mix（广州东盛生物科技有限公司）
DNA胶回收试剂盒（Axygen公司）
猪链球菌2型强毒株ZY05719（沈艳，华修国，崔 立 ，朱建国，杨志彪，猪链球菌2型两代表性分离株感染小型猪后对部分免疫指标的影响，畜牧兽医学报2008，39(12)：1721—1730，分离自四川资阳发病猪，由南京农业大学预防兽医微生物组惠赠）
BactoTM Todd Hewitt Broth（THB）培养基（BD公司）
THB液体培养基：称取30g THB，溶解于1000mL去离子水，121℃高压灭菌20分钟
THB固体培养基：每1000mL THB加入15g琼脂粉，121℃高压灭菌20分钟，适量倾入平皿中凝固
（一）本发明从健康屠宰猪群中分离获得一株无毒ST28猪链球菌：
1）增菌培养
采集健康屠宰猪的扁桃体组织，切割约0.05立方厘米的扁桃体，放入5mL THB（BactoTM Todd Hewitt Broth）液体培养基，37℃静置培养16～18小时；
2）细菌的纯培养
对上述培养的菌液进行离心，常规方法提取菌体的总DNA作为模板，设计荚膜多糖2J位点编码基因（cps2j）的特异性引物，对上述模板进行聚合酶链式反应（PCR）鉴定，将反应阳性的菌液经过平板划线法分离到纯培养的细菌，再次增菌培养、革兰氏染色、PCR、凝集实验，确定分离到猪链球菌2型菌株；
3）细菌的序列型（Sequence Type，ST）鉴定
提取上述纯培养的猪链球菌2型菌株的总DNA，聚合酶链式反应（PCR）扩增7个管家基因（aroA、cpn、dpr、gki、mutS、recA、thrA），并对扩增片段进行测序，多位点序列分型（Multi Locus Sequence Type，MLST）鉴定分离菌株为ST28，命名为HA0609；
（二）动物实验
（1）Balb/c小鼠致病力试验
选用6周龄清洁级Balb/c小鼠16只，随机分为2组，8只/组，体外培养所述的HA0609，采用1.0×109CFU剂量对1组Balb/c小鼠进行腹腔注射，同时培养2005年四川分离的猪链球菌强毒株ZY05719，相同剂量腹腔注射另外1组Balb/c小鼠作为对照，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的小鼠精神、饮食正常，而ZY05719注射组小鼠24小时内全部死亡；
（2）新西兰兔致病力试验
选用10只3公斤体重清洁级新西兰兔，随机分成2组，5只/组，其中1组耳缘静脉注射1.0×109CFU剂量HA0609，同时给予另1组耳缘静脉注射同等剂量ZY05719，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的实验兔精神、饮食正常，而ZY05719注射组实验兔24小时内全部死亡；
（3）长白仔猪致病力试验
选用6头长白仔猪，随机分成2组，3头/组，其中1组颈部肌肉注射1.0×109CFU剂量HA0609，同时给予另1组颈部肌肉注射同等剂量ZY05719，攻毒后连续观察10天，发现HA0609注射的仔猪精神、体温、饮食正常，剖检未见组织病理变化，而ZY05719注射的仔猪饮食废绝、直肠温度超过40.5℃、部分出现划水神经症状，3头仔猪于攻毒后24～72小时发生死亡，剖检发现部分猪发生脑膜炎，肺脏坏死、心包积液、多发性浆膜炎等现象；
上述结果表明，分离的HA0609为无毒ST28猪链球菌。
（三）应用前景
HA0609以2×108 CFU剂量肌肉注射4只新西兰兔，同时以PBS（8mM Na2HPO4·12H2O、1.5mM KH2PO4、2.7mM KCl、136.7 mM NaCl，pH 7.4）注射作对照，免疫后40天静脉注射2×106 CFU剂量ZY05719，观察免疫组及对照组的存活率，并进行统计分析免疫组与对照组存活率差异，发现免疫HA0609能够显著推迟新西兰兔的死亡时间（图1）；HA0609以1×109 CFU剂量腹腔注射9只CD1小鼠（吴 涛等，猪链球菌2型srtA基因缺失菌株的构建及生物学特性，中国兽医学报，2009年1O月 第29卷第1O期），进行两次注射，之间间隔14天，同时以PBS注射作对照，末次注射后10天，对免疫组小鼠和对照组小鼠腹腔注射1×109 CFU剂量强毒株SS2 -1(倪艳秀等，猪链球菌2型SS2-1和SS2-H株的培养稳定性检测，中国兽医科技 第32卷 第4期 2002年)，发现免疫组小鼠存活率为87.5%，而对照组小鼠全部死亡，两组之间的存活率统计学差异极显著（图2）。
综上，该菌1次肌肉注射新西兰兔、2次腹腔注射CD1小鼠后，能够提供受免动物一定的免疫能力，对HA0609免疫保护性抗原的分析，可用于猪链球菌病亚单位疫苗的研制。
Claims (3)
1.一株无毒ST28猪链球菌，该菌株HA0609分类命名：猪链球菌（Streptococcus suis），2012年10月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2012394。
2. 权利要求1所述的无毒ST28猪链球菌在猪链球菌病亚单位疫苗研制中的应用。
3.用权利要求1所述的无毒ST28猪链球菌制备的猪链球菌病亚单位疫苗。
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| CN102876620A (zh) | 2013-01-16 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Lv Lixin Inventor after: Wen Libin Inventor after: Li Bin Inventor after: Guo Rongli Inventor after: Wang Xiaomin Inventor after: Wang Wei Inventor after: Zhou Ping Inventor after: Shen Jiangping Inventor after: Zhou Junming Inventor after: Zhang Xuehan Inventor after: Mao Aihua Inventor after: He Kongwang Inventor after: Ni Yanxiu Inventor after: Yu Feng Inventor after: Zhu Haodan Inventor after: Yu Zhengyu Inventor before: Zhou Junming Inventor before: Wen Libin Inventor before: Li Bin Inventor before: Guo Rongli Inventor before: Wang Xiaomin Inventor before: Wang Wei Inventor before: Zhou Ping Inventor before: Shen Jiangping Inventor before: He Kongwang Inventor before: Yu Feng Inventor before: Ni Yanxiu Inventor before: Lv Lixin Inventor before: Zhang Xuehan Inventor before: Zhu Haodan Inventor before: Yu Zhengyu Inventor before: Mao Aihua |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: ZHOU JUNMING HE KONGWANG YU FENG NI YANXIU LV LIXIN ZHANG XUEHAN ZHU HAODAN YU ZHENGYU MAO AIHUA WEN LIBIN LI BIN GUO RONGLI WANG XIAOMIN WANG WEI ZHOU PING SHEN JIANGPING TO: LV LIXIN ZHOU JUNMING ZHANG XUEHAN MAO AIHUA HE KONGWANG NI YANXIU YU FENG ZHU HAODAN YU ZHENGYU WEN LIBIN LI BIN GUO RONGLI WANG XIAOMIN WANG WEI ZHOU PING SHEN JIANGPING |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140108 |